UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE...

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA

DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES

CUAUTITLÁN

DETERMINACIÓN DE DL50 Y EVALUACIÓN DE LA TOXICIDAD MEDIANTE

LA PRUEBA DE MICRONÚCLEOS DE LOS COMPUESTOS

MONOTIOMORFOLÍNICOS LQM318, 339 Y LOS COMPUESTOS

MONOPIPERIDÍNICOS LQM336, 334.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE:

QUÍMICA FARMACÉUTICA BIÓLOGA

PRESENTA:

ANAI WENDOLIN GÓMEZ AGUILAR

ASESORA:

DRA. SANDRA DÍAZ BARRIGA ARCEO

CUAUTITLÁN IZCALLI, ESTADO DE MÉXICO. 2012

UNAM – Dirección General de Bibliotecas

Tesis Digitales

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F'A CU X-TAD ts E E S'[' Utr} Tü S S {-iI}E,RIORES CIJA UT'ITLANUNH)AT} DE AB]\{INISTRACTÓN ESCOLATT

E}E,PART'AMtrF{T& BE, EXÁft4trNE,S PROFESIÜIqALES'.t_','...

A SIJ N TO :,VCIlll{},APROBATCI{I G

DRA. SUEMI RODRIGT]EZ ROMÜDIRECTORA DE LA FES CUAUTNTLÁNPRESENTE

ATN: L.A. ARACELI HE ANDEZJefa del DepÉl#fiÉffitQI$e Exámenes

P rofesioriál§§üd{XfFES' Cuautitlán

Con base en el Art. 28 del Reglamento de Exámenes Profesic'nales nos permitimos comunicar a

usted que revisamos la: TESIS

Determinación de DL50 y evaluación de la toxicidad mediante la prueba de micronúcleos

de los compuestos monotiomorfolínicos LQM318,339 y los compuestos rnonopiperidínicosLOM336.334

Que presenta la pasante: Anai Wendolin Gómez AguilarCon número de cuenta 30327504-6 para obtener el Título de: Ouímica Farmacéutica Bióloga

Considerando que dicho trabajo reúne los requisitos necesarios para ser discutido en el EXAMENPROFESIONAL correspondiente, otorgamos nuestro VOTO APROBATORIO.

ATENTAMENTE"POR MI RAZA HABLARA EL ESPÍRITU"Cuautitlán fzcalli, Méx. a 01 de Octubre de 2012.

PROFESORES QUE INTEGRAN EL JURADO

NOMBRE

Dra. Luisa Martínez Aguilar

,,*.11 iÉ¿-;

.fl.$lJ}Ij'ji;-;r-,."

PRESIDENTE

VOCAL

SECRETARIO

ler SUPLENTE

2do SIJPLENTE

Dra. SandraDíaz Barriga Arceo

QFB. Rosalba Bonilla Sánchez

Dra. Patricia Ramírez Noguera

QFB. Sara Hemández Matilde

NOTA: los sinodales suplentes están obligados a presentarse el día y hora del Exarnen Profesiorral (art. 120)

HHA/pm

Este trabajo se realizó gracias al apoyo del proyecto PAPIIT IN224310 “Estudios Farmacológicos de los

compuestos con clave LQM300s en la hipertensión arterial, arritmias cardiacas e infarto miocárdico”.

La investigación teórica y experimental de éste trabajo se realizó en el Laboratorio 9 Toxicología y Genética de

la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de la FES Cuautitlán Campo 4 y el análisis de las laminillas se

realizó en el Laboratorio de Citogenética L- 521 a cargo de la Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo.

AGRADECIMIENTOS

La presente tesis es un esfuerzo en el cual de forma directa o indirecta participaron varias personas leyendo,

opinando y dándome sugerencias para que todo quedara de la mejor manera posible; por lo tanto, debo

agradecer a mis sinodales: Dra. Luisa Martínez Aguilar, QFB. Rosalba Bonilla Sánchez, Dra. Patricia Ramírez

Noguera y por último, pero no menos importante, QFB. Sara Hernández Matilde que tuvieron la paciencia y la

confianza para darme su opinión acerca de lo que podía modificar o incluir en éste trabajo de investigación

con el fin de mejorarlo.

Principalmente, agradezco a mi Asesora: Dra. Sandra Díaz Barriga Arceo por confiar en mí y darme la

oportunidad de realizar éste trabajo bajo su dirección y, además, al tratarla me dí cuenta de que es un gran ser

humano digna de mi admiración y mi respeto.

Agradezco también a mis padres Jose Luis y Patricia, a mis abuelos Joaquín, Felipe y Sara; ustedes fueron el

principal motor para concluir mi carrera y titularme, ya que ésta, al ser mi mayor ilusión, la hicieron suya

también y me apoyaron sobremanera para hacerla realidad; a mi mejor amiga; prácticamente mi hermana:

Maggie, a mis hermanos Sara, Luis y Lili, mis tios, mis primos y demás familiares que me acompañaron y me

dieron la mano no sólo mientras realizaba mi tesis, sino durante todo el camino recorrido para poder concluir

una licenciatura; porque de una u otra forma me apoyaron moralmente, emocionalmente, económicamente;

comprendiendo mis ausencias en momentos especiales; de verdad muchas gracias. Los amo.

Tio Carlitos, yo sé que desde el cielo celebras conmigo éste gran logro, te quiero muchísimo y te recuerdo con

mucho mucho cariño, y aunque vives en mi corazón siempre, me haces mucha falta, te extraño.

Te agradezco a tí Iván, mi amor, por todo tu amor, por toda la paciencia que me tuviste en los momentos en

que me encontraba alterada, por acompañarme cuando y donde fuera necesario; por apostar por mí hasta

cuando me sentía débil y desesperada, gracias por todo tu apoyo, en todas las formas en que me lo das: moral,

emocional, económicamente, etc.; gracias por ser mi apoyo, mi gran apoyo tan incondicional como siempre.

Tus brazos siempre son mi abrigo, te amo.

Finalmente, a todos mis amigos de la Universidad con los que viví tantas cosas muy bonitas, los quiero mucho y

siempre vivirán en mi corazón, son muy importantes en mi vida; Fer, Wera, May, Tony, Naty, Betito, Nava,

Cindy, Oliva, Mónica, le agradezco a la vida porque coincidimos en éste mundo y tuve la fortuna de conocerlos.

1

ÍNDICE

ÍNDICE DE TABLAS............................................................................................................. ...............................3

RESUMEN..............................................................................................................................................................4

1. Marco teórico............................................................................................................. ................................5

1.1 Compuestos de la serie LQM300.................................................................................................5

1.1.1 Compuestos monotiomorfolínicos LQM318 y LQM339..............................................6

1.1.2 Compuestos monopiperidínicos LQM336 y LQM344.................................................7

1.2 Enfermedades cardiovasculares..................................................................................................8

1.2.1 Hipertensión arterial.......................................................................................................8

1.2.2 Arterioesclerosis...............................................................................................................9

1.2.3 Angina de pecho.............................................................................................................10

1.2.4 Infarto al miocardio.......................................................................................................12

1.2.5 Accidentes vasculares cerebrales..................................................................................12

1.2.6 Arritmias........................................................................................................................13

1.3 Toxicología genética...................................................................................................................15

1.4 Índice terapéutico o márgen de seguridad...............................................................................16

1.5 Relación Dosis-Respuesta...........................................................................................................17

1.6 Dosis Letal 50 DL50....................................................................................................................18

1.6.1 Transformación Probit.................................................................................................19

1.6.2 Transformación Logit...................................................................................................19

1.6.3 Transformación Anglit ó Angular................................................................................19

1.7 Método de Lorke para calcular DL50......................................................................................20

1.8 Ensayos de toxicidad..................................................................................................................22

1.8.1 Pruebas para la detección de genotoxicidad...............................................................22

1.9 Ensayo de Micronúcleos.............................................................................................................24

2. Justificación.............................................................................................................................................27

3. Hipótesis...................................................................................................................................................27

2

4. Objetivo general......................................................................................................................................28

4.1 Objetivos particulares................................................................................................................28

5. Materiales y Método................................................................................................................................29

5.1 Material biológico.......................................................................................................................29

5.2 Compuestos problema................................................................................................................29

5.3 Reactivos......................................................................................................................................29

5.4 Equipo y otros materiales..........................................................................................................30

6. Metodología............................................................................................................................ .................30

7. Diagrama de flujo....................................................................................................................................32

8. Resultados................................................................................................................... .............................33

8.1 Cálculos realizados para determinar la DL50 de los diferentes compuestos........................33

8.2 Tabla de DL50 con efectos de toxicidad...................................................................................33

8.3 Tablas Eritrocitos policromáticos micronucleados para evaluar genotoxicidad..................34

8.3.1 Tabla de Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM318...........................34




8.4 Tablas Porcentaje de Eritrocitos Policromáticos para evaluar citotoxicidad.......................36

8.4.1 Tabla de porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM318.........36




8.5 Tabla de efectos secundarios de los diferentes compuestos de la serie LQM300.................38

9. Discusión..................................................................................................................................................39

10. Conclusiones............................................................................................................... .............................43

11. Glosario de abreviaturas........................................................................................................................44

12. Referencias..............................................................................................................................................45

3

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla1. Estructuras de los compuestos de la serie LQM300....................................................................7

Tabla 2. Diferentes dosis para la determinación de la toxicidad aguda (método de Lorke)........................21

Tabla 3. Dosis administradas en la segunda etapa del método de Lorke........................................................30

Tabla 4. DL50 con efectos de toxicidad...............................................................................................................33

Tabla 5. Eritrocitos policromáticos micronucleados en LQM318..................................................................34




Tabla 9. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM318................................................36

Tabla 10. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM336..............................................36



Tabla 13. Efectos secundarios de los diferentes compuestos de la serie LQM300.........................................38

4

RESUMEN

Las enfermedades cardiovasculares, las cuales se refieren tanto a patologías del corazón como de vasos

sanguíneos; son el problema más importante en la sociedad mexicana no solo por su frecuencia sino por la

gravedad de muchas de ellas y las complicaciones que traen consigo; aunado a esto, debemos considerar que día

con día, los hábitos de la población son menos favorables para la salud y de éste modo, este problema se hace

más serio. No obstante que hay muchos fármacos con los que se intenta minimizar este problema, se continúa en

busca del fármaco ideal que tenga la capacidad de combatir diferentes patologías cardiovasculares y que además

sea seguro para la población, es decir, cause el menor daño posible al organismo; razón por la cual, el

Laboratorio de Química Medicinal a cargo del Doctor Enrique Ángeles Anguiano se ha dedicado ya por un

largo tiempo al estudio minucioso de compuestos con clave LQM300 que han demostrado, en diferentes

estudios llevados a cabo en el Laboratorio de Farmacología del Miocardio a cargo de la Doctora Luisa Martínez

Aguilar, que son efectivos para tratar diferentes cardiopatías.

Como parte de la caracterización de dichos compuestos, es importante también realizar estudios toxicológicos

para poder determinar de éste modo, sí son fármacos seguros, razón por la cual, se llevó a cabo este trabajo de

investigación en el cual se determinó la Dosis Letal 50 (DL50) y se estudió la genotoxicidad y citotoxicidad a

través del ensayo de Micronúcleos “in vivo” de cuatro compuestos de la serie LQM300 los cuales fueron: dos

compuestos monopiperidínicos (LQM336 y LQM344) y dos compuestos monotiomorfolínicos (LQM318 y

LQM339). De ésta manera, ahora se tiene el conocimiento de otras características importantes de algunos de

estos compuestos.

Las DL50 obtenidas fueron: 177. 48 mg/Kg para LQM336, 288.53 mg/Kg para LQM339. Finalmente, 471.16

mg/Kg para los compuestos LQM344 y LQM318. De este modo, se logró determinar, que los compuestos que

muestran menor toxicidad son los compuestos LQM344 y LQM318, ya que se necesitó una mayor cantidad de

compuesto para producir la muerte del 50% de la población.

En cuanto a la evaluación de citotoxicidad, ninguno de los compuestos mostró modificaciones en el número de

eritrocitos policromáticos en relación al tiempo o dosis administrada, por lo que se llegó a la conclusión de que

no son tóxicos en médula ósea.

Tampoco se observó un aumento en el número de eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN), ya que

el número de éstos se mantuvo entre 0 y 3 que es el rango normal, por lo que también se consideró que estos

compuestos no son genotóxicos porque no inducen a la formación de micronúcleos en eritrocitos de sangre

periférica de ratón.

5

1. MARCO TEÓRICO

1.1 COMPUESTOS DE LA SERIE LQM300

Como parte de una estrategia por conseguir nuevos fármacos capaces de ofrecer un mayor número de efectos

benéficos con un mínimo de efectos adversos se han desarrollado técnicas basadas en el diseño de nuevos

fármacos asistidos por computadora pretendiendo su síntesis y evaluación para la obtención de nuevas

moléculas con actividad terapéutica (Díaz y Tlapalmatl, 2008).

En 1979, un grupo de investigadores chinos mientras examinaban propiedades antimalariales de derivados de la

febrifugina, notaron que un compuesto, la changrolina, era efectivo como agente antiarrítmico (Montes, 2005).

Stout y su equipo de investigación introdujeron una nueva serie de compuestos antiarrítmicos realizando algunas

variaciones en la estructura de la changrolina, encontraron que ésta puede ser conceptualmente dividida en tres

regiones: 1) Región heteroatómica que contiene quinazolina, 2) Región aromática con el bis(pirrolidinilmetil)

fenol y 3) Región enlazante entre las dos primeras regiones (Montes, 2005).

Posteriormente encontraron las regiones responsables de la actividad biológica, mostrando que la región 2 del

bis(pirrolidinilmetil) fenol era importante para mostrar una buena actividad antiarrítmica, además que en la

región 1, la quinazolina podía ser reemplazada por una variedad de anillos heteroatómicos sin que disminuya su

actividad, y que la región que une las dos primeras regiones tiene una mayor actividad y una menor toxicidad

cuando contenía un grupo carbonilo (Montes, 2005).

Otro equipo de investigadores, Codding y colaboradores determinaron el análisis conformacional de la serie

bis(pirrolidinilmetil) fenol antiarrítmicos de la clase I por métodos de difracción de rayos X . Encontraron que

cada estructura tiene un puente de hidrógeno intramolecular entre el grupo OH del fenol y el átomo de N de uno

de los anillo de la pirrolidina, sugiriendo también que el anillo libre del puente de hidrógeno intramolecular

define la forma activa de las moléculas (Montes, 2005).

Años después, se inició el estudio de la relación estructura química-actividad biológica, la cual consistía en

cambiar los sustituyentes de la región 2 y 3, encontrando que los anillos pirrolidinicos podían sustituirse por

otros anillos heterocíclicos, como la morfolina, tiomorfolina y piperidina (Díaz y Tlapalmatl, 2008).

6

El grupo de investigación del Laboratorio de Química Medicinal de la Unidad de Investigación de Posgrado de

la Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán Campo-1 a cargo del Dr. Enrique Ángeles Anguiano, retomó la

investigación de éstos compuestos procediendo a sus síntesis mediante la reacción

química entre un fenol sustituido formaldehido y una molécula de morfolina o tiomorfolina, obteniendo así una

serie de compuestos morfolínicos, tiomorfolínicos, piperidínicos y de cobre, con clave LQM300, a los cuales se

estudió su actividad biológica dentro del Laboratorio de Farmacología del Miocardio, a cargo de la Dra. Luisa

Martínez Aguilar, de la misma instancia académica, encontrándose que estos compuestos mostraban una

actividad antihipertensiva mediante el modelo de rata consciente (Díaz y Tlapalmatl, 2008).

La síntesis de estos compuestos tiomorfolínicos, morfolínicos y piperidínicos, se fundamenta en la reacción

química entre un fenol sustituido, un formaldehido mas una molécula de morfina, tiomorfina o piperidina, con

lo cual se obtiene una serie de compuestos con la clave LQM300. (BRIONES. 2009). Los compuestos de la

serie LQM300 son solubles en soluciones ácidas, por lo cual, se encuentran disueltos a pH=2 (Martínez, 2010).

Mediante la determinación de área Bajo la Curva, los compuestos LQM318, LQM339, LQM344 y LQM336

presentan efecto antihipertensivo tanto en presión arterial sistólica, presión arterial diastólica y frecuencia

cardiaca en comparación con Captopril y Losartán (Pérez, 2012).

Los compuestos morfolínicos y tiomorfolínicos son posibles candidatos para el desarrollo de nuevos

medicamentos en el tratamiento de la hipertensión arterial, lo que trae consigo la continuación de los estudios

farmacodinámicos con los que se podrá determinar su mecanismo de acción, principalmente en músculo liso

vascular sobre los sistemas renina-angiotensina-aldosterona y sistema adrenérgico (Díaz y Tlapalmatl, 2008).

1.1.1 Compuestos monotiomorfolínicos LQM318 Y LQM339

El compuesto LQM318 presenta un antagonismo no competitivo al receptor adrenérgico α1 en el modelo de

órgano aislado de aorta torácica y abdominal de rata hipertensa espontánea (Mondragón, 2009); en rata

hipertensa espontánea en el modelo de rata consciente, mostró efectividad en la disminución de presión sistólica

y frecuencia cardiaca (López y Hernández, 2008).

Mediante la determinación del Área Bajo la Curva, el LQM318 mostró una mayor eficacia sobre la presión

sistólica, presión diastólica y frecuencia cardiaca que el LQM339 (Pérez, 2012).

7

1.1.2 Compuestos monopiperidínicos LQM336 Y LQM344

El LQM344 presenta una piperidina. Mediante un modelo de presión arterial invasiva en ratas Wistar macho

muestra un efecto hipotensor significativo en la Presión Arterial Diastólica, Presión Arterial Media, Presión

Arterial Sistólica y en Frecuencia Cardiaca (Briones, 2009).

El LQM336 presenta un aldehído, un éter y una piperidina. Mediante un modelo de presión arterial invasiva en

ratas Wistar macho no muestra efecto hipotensor significativo en Presión Arterial Media, Presión Arterial

Diastólica, Presión Arterial Sistólica y Frecuencia Cardiaca (Briones, 2009), muestra tendencia a un

antagonismo de tipo no competitivo en modelo de órgano aislado de aorta torácica y abdominal de rata

hipertensa espontánea (Mondragón, 2009).

Con base al Área Bajo la Curva, en comparación con Captopril y Losartán, muestra mayor eficacia sobre la

Presión Arterial Sistólica, Presión Arterial Diastólica y Frecuencia Cardiaca el compuesto LQM344 que el

LQM336 (Pérez, 2012).

Tabla1. Estructuras de los compuestos de la serie LQM300.

Compuestos Monopiperidínicos Compuestos Monotiomorfolínicos

LQM336

LQM318

LQM344

LQM339

8

1.2 ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES

Las enfermedades cardiovasculares se refieren a patologías del corazón y vasos sanguíneos; son la primera

causa de morbimortalidad en los países industrializados, determinando más del 45% de todos los fallecimientos

acaecidos después de los 65 años. Son, además, la segunda causa de deterioro funcional (Sáeza y colaboradores,

1998).

En las últimas décadas se ha producido en numerosos países desarrollados una disminución de las tasas de

mortalidad cardiovascular para todos los grupos de edad, menos importante en los ancianos y

proporcionalmente mayor en las mujeres, que ha contribuido al aumento en la esperanza de vida (Sáeza y

colaboradores, 1998).

Las tasas de mortalidad son siempre mayores en los grupos de mayor edad. Se sabe que el riesgo relativo

asociado a la mayoría de los factores de riesgo cardiovascular disminuye con la edad, pero su riesgo absoluto

aumenta (Sáeza y colaboradores, 1998).

Se calcula que en 2004 murieron por ésta causa 17,3 millones de personas, lo cual representa un 30% de todas

las muertes registradas en el mundo; 7,3 millones de esas muertes se debieron a la cardiopatía coronaria, y 6,2

millones a los accidentes cerebrovasculares (OMS, 2011).

Las muertes por enfermedades cardiovasculares afectan por igual a ambos sexos, y más del 80% se producen en

países de ingresos bajos y medios (OMS, 2011).

Se calcula que en 2030 morirán cerca de 23,6 millones de personas por enfermedades cardiovasculares, sobre

todo por cardiopatías y accidentes cerebrovasculares, y se prevé que sigan siendo la principal causa de muerte

(OMS, 2011).

Las enfermedades cardiovasculares más comunes se presentan a continuación.

1.2.1 Hipertensión arterial

La hipertensión se define como un aumento sostenido de la presión arterial ≥140/90 mmHg, criterio que

caracteriza a un grupo de pacientes cuyo riesgo de afección cardiovascular relacionada con la hipertensión es lo

bastante alto para ameritar atención médica. El riesgo de una enfermedad cardiovascular tanto letal como no

letal en adultos es más bajo con presiones arteriales sistólicas menores de 120 mmHg y presión arterial

9

diastólica inferior a 80 mmHg; estos riesgos aumentan de manera progresiva con presiones sistólicas y

diastólicas más altas (Goodman y Gilman, 2007).

La hipertensión arterial es la enfermedad cardiovascular más común. Su prevalencia aumenta con la edad;

alrededor de 50% de las personas entre 60 y 69 años de edad tiene hipertensión, y la prevalencia es mayor

después de los 70 años de edad (Goodman y Gilman, 2007).De acuerdo con las estadísticas reportadas por la

Secretaría de Salud sobre las diez principales causas de mortalidad en hombres en México durante el año 2007,

las Enfermedades Hipertensivas ocupan el décimo lugar, mientras que en el caso de las mujeres este tipo de

padecimientos ocupan el quinto lugar (Fauci y Braunwald, 2008).

La presión vascular alta genera cambios en la vasculatura e hipertrofia del ventrículo izquierdo. Como

consecuencia, la hipertensión constituye la principal causa de apoplejía, conduce a enfermedad coronaria con

infarto de miocardio y muerte súbita de origen cardiaco, y es un contribuyente importante de insuficiencias

cardiaca y renal, así como aneurisma disecante de la aorta (Goodman y Gilman, 2007).

El tratamiento farmacológico de pacientes con hipertensión arterial reduce la morbilidad y mortalidad por

afección cardiovascular. La terapéutica antihipertensora eficaz disminuye notablemente el riesgo de apoplejías,

insuficiencia cardiaca e insuficiencia renal debidas a hipertensión, además de la disminución del riesgo de

infarto al miocardio (Goodman y Gilman, 2007).

1.2.2 Arterioesclerosis

Es la pérdida de elasticidad y el estrechamiento de las arterias que se produce como consecuencia de la

acumulación de grasa en sus paredes, que empieza a producirse ya desde los primeros años de vida, hasta

convertirse en placas de ateroma, que son las lesiones principales de esta enfermedad, dichas placas están

compuestas por colesterol y derivados. La distribución de la arteriosclerosis en la red arterial no es homogénea.

Afecta sobre todo a la aorta, a las arterias de las piernas, las coronarias y las arterias que conducen la sangre

hacia el cerebro. Las placas de ateroma se desarrollan en zonas de gran turbulencia de flujo sanguíneo, sobre

todo donde hay bifurcaciones. Estas placas provocan una reducción del diámetro en la zona de arteria donde se

sitúan, esto hace que la sangre circule con más dificultad, pudiendo tener como consecuencia la falta de

oxigenación en el área que depende de esas arterias (OCU, 2011).

Las placas también pueden sufrir un proceso de ulceración y dar lugar a que se formen trombos, los cuales

pueden obstruir por completo la zona de la arteria donde se forman, produciendo una trombosis. El trombo

puede desprenderse y entrar en la circulación sanguínea. Dependiendo de sus dimensiones podrían provocar la

obstrucción de una arteria y una embolia en el organismo. La arteriosclerosis como tal no produce manifestación

10

alguna hasta que tiene lugar, como consecuencia de la misma, la disminución o la interrupción del aporte de

sangre a algún tejido. Es entonces cuando tiene lugar, por ejemplo, la angina de pecho, el infarto de miocardio o

el accidente vascular cerebral (OCU, 2011).

1.2.3 Angina de pecho

Se produce cuando hay un aporte insuficiente de sangre y, por tanto, oxígeno al músculo cardiaco debido a un

estrechamiento o a una obstrucción de una arteria coronaria, lo que indica que el músculo cardiaco está

afectado, y que precisa un tratamiento (OCU, 2011). Es la forma más común de manifestarse la cardiopatía

isquémica y la menos grave. Uno de los aspectos clave del tratamiento de un paciente con Angina de Pecho

Estable o Inestable, es conocer el nivel de riesgo y de acuerdo al mismo, indicar los procedimientos terapéuticos

más apropiados para mejorar los síntomas, la calidad de vida y sobre todo para evitar sus complicaciones.

(Navarro y Fábregas, 2006).

ANGINA ESTABLE: Dolor opresivo o malestar, generalmente torácico, atribuible a isquemia miocárdica

transitoria, cuyas características no han variado en el último mes. Generalmente causada por estenosis coronaria

fija, y se desencadena siempre por el aumento de la demanda de oxígeno al miocardio, ya sea por el ejercicio u

otra causa como el estrés. También puede producirse por vasoespasmo coronario (Navarro y Fábregas, 2006).

Clasificación de la Canadian Cardiovascular Society (CCS) para la angina estable (Navarro y Fábregas, 2006).

• Grado I. La actividad física ordinaria no causa dolor, este aparece debido a esfuerzos extenuantes rápidos o

prolongados, durante el trabajo o con actividades recreativas.

• Grado II. Hay ligera limitación a la actividad física ordinaria. Hay dolor al caminar, subir escaleras

rápidamente, subir pendientes. Puede ser postpandrial o en las primeras horas del día.

• Grado III. Hay limitación importante a la actividad física ordinaria, por ejemplo: Subir escaleras rápidamente,

caminar dos manzanas.

• Grado IV. Incapacidad para llevar a cabo cualquier actividad física sin angina, aparece dolor incluso en el

reposo relativo (esfuerzo mínimo).

ANGINA INESTABLE. Síndrome coronario agudo que agrupa a pacientes con angina de pecho cuyo

comportamiento clínico ha variado en el último mes (frecuencia, duración, intensidad, umbral de aparición y

respuesta a la nitroglicerina). También se incluye a la de aparición reciente, la que surge sin causa aparente y la

que sigue a un infarto del miocardio. (Navarro y Fábregas, 2006.)

11

Formas clínicas (Navarro y Fábregas, 2006.).

Angina de comienzo reciente: tiene menos de 30 días de evolución, puede ser desencadenada por el esfuerzo

(sólo la que corresponde con los grados III y IV), en reposo o ambos (mixta).

Angina de empeoramiento progresivo: mayor frecuencia, duración o intensidad de las crisis, que generalmente

coincide con disminución del umbral del dolor.

Angina post infarto: surge después que el paciente con un infarto agudo del miocardio (IAM) lleve 24 horas sin

dolor y durante el primer mes de evolución (el dolor no debe estar en relación a extensión del IAM).

Angina variante (Prinzmetal): angina espontánea asociada a supradesnivel del ST durante el dolor, en su

patogenia prima el vaso espasmo focal sobre coronarias sanas o con lesiones desde mínimas a subtotales.

Angina de reposo prolongada: de duración inusual mayor de 20 min. y requiere de un perfil bioquímico

minucioso para descartar un IAM.

Se diagnostica a partir de los síntomas descritos por el paciente. En principio, se recurre a los medicamentos.

Además de los fármacos para reducir los niveles de colesterol, la hipertensión o la diabetes, hay otros

específicos contra la angina. Son los nitratos (que actúan dilatando las arterias coronarias y pueden

administrarse por vía oral, como comprimidos que se colocan bajo la lengua, con parches en la piel o en

inyecciones), los betabloqueantes, que al reducir la frecuencia cardiaca reducen también las necesidades de

oxígeno del corazón, o los antagonistas del calcio, que inducen a la dilatación de las arterias coronarias y las

venas periféricas, reduciendo así la tensión arterial y la frecuencia cardiaca (OCU, 2011).

El ácido acetilsalicílico suele usarse como tratamiento complementario, ya que reduce la posibilidad de que las

plaquetas sanguíneas se agrupen formando trombos. Cuando la medicación no basta, es necesario recurrir a un

tratamiento quirúrgico. Hay varias alternativas, pero es muy frecuente la angioplastia, que consiste en dilatar

mecánicamente los vasos coronarios. Se suele realizar con anestesia local y no requiere hospitalización. Otra

alternativa es sustituir la arteria afectada por un injerto de un vaso localizado en otra zona del cuerpo, con la

técnica denominada “by-pass”. Otra técnica que se utiliza mucho en la actualidad es introducir un dispositivo,

que se llama stent y es parecido a una espiral, dentro del vaso estrechado, para de esta forma mantenerlo

"abierto". Estas técnicas tienen diferentes indicaciones: la elección de una u otra se hace de forma

individualizada, según el paciente (OCU, 2011).

12

1.2.4 Infarto al miocardio

La palabra infarto significa "zona de necrosis", es decir, muerte de los tejidos de un determinado órgano, debido

a una importante disminución de la circulación. En el infarto de miocardio, esa necrosis afecta al propio

músculo cardiaco o miocardio (OCU, 2011).

El infarto de miocardio se divide en infarto transmural, que corresponde a lo que desde el punto de vista clínico

se denomina infarto con onda Q, e infarto no transmural, infarto subendocárdico o infarto sin onda Q (Zarco,

2006).

El infarto transmural es una necrosis por coagulación del territorio de distribución de una arteria coronaria

afectada de aterosclerosis, generalmente con dehiscencia de una placa y trombosis sobreañadida (Zarco, 2006).

El subendocardio es la zona del corazón más susceptible al infarto de miocardio. Esta susceptibilidad se puede

deber a un mayor requerimiento metabólico, a mayor grado de isquemia tras la oclusión coronaria completa o a

una combinación de ambas. En efecto, la reserva coronaria del subendocardio está disminuida en condiciones

normales (Zarco, 2006).

El infarto de miocardio se manifiesta, la mayoría de las veces, con un dolor, peso u opresión en el pecho, una

sensación semejante a la de la angina de pecho, pero más intensa y/o más duradera. La sensación puede

extenderse al brazo izquierdo, y también al cuello, costado, estómago, etc. y puede prolongarse durante varias

horas. Los medicamentos que se usan en la fase aguda son analgésicos especiales, combinados con nitratos y

betabloqueantes y también con fármacos que actúan sobre la coagulación, como los fármacos fibrinolíticos,

capaces de disolver los trombos intracoronarios y que son muchos más eficaces si se aplican en las primeras

horas siguientes al infarto (OCU, 2011).

1.2.5 Accidentes vasculares cerebrales

Hay un conjunto de lesiones en las arterias cerebrales que pueden producir un accidente cerebral, que puede ser:

Una embolia cerebral, es una obstrucción brusca de un vaso cerebral por un trombo originado en otro punto de

la circulación sanguínea; una trombosis cerebral, es una obstrucción brusca de una arteria cerebral por un

trombo que se ha producido en esa misma arteria; una hemorragia cerebral, se debe normalmente a la ruptura de

un vaso cerebral dañado. Los síntomas dependen de la zona del cerebro afectada y pueden consistir en

alteraciones de la fuerza o de la sensibilidad, dificultad para hablar, dificultad para tragar, inestabilidad al

13

caminar, etc., suelen ocurrir bruscamente y en ocasiones duran solo unos minutos (accidente isquémico

transitorio) lo que puede constituir un aviso de que algo más grave puede ocurrir (OCU, 2011).

En algunas ocasiones es posible el uso de fármacos fibrinolíticos que contribuyen a disolver un posible trombo.

En cualquier caso, la intervención precoz, controlando la oxigenación, la temperatura y los niveles de glucemia

(azúcar en sangre) ayuda a minimizar las posibles secuelas (OCU, 2011).

1.2.6 Arritmias.

Una arritmia es una alteración del ritmo cardiaco. Las arritmias cardiacas aparecen por alguno de estos tres

motivos (Fundación, 2012):

a) Uno de los mecanismos eléctricos falla por falta de generación del impulso eléctrico.

b) El impulso eléctrico se origina en un sitio erróneo.

c) Los caminos para la conducción eléctrica están alterados.

Hay diferentes clasificaciones de las arritmias (Fundación, 2012):

Por su origen

a) Supraventriculares: Se localizan por encima de los ventrículos: en las aurículas o en el nodo aurículo-

ventricular.

b) Ventriculares: Se originan en los ventrículos

Por su frecuencia cardiaca

a) Taquicardias: Frecuencia superior a los 100 Impulsos por minuto (lpm).

b) Bradicardias: Frecuencia por debajo de los 60 lpm.

Por su causa

a) Fisiológicas: Originadas por una alteración orgánica o de otro nivel (anemia, taquicardia en el ejercicio,

bradicardia sinusal producida en el entrenamiento deportivo, etc.).

b) Patológicas: No atribuibles a causa secundaria alguna.

14

Por su repetición

a) Crónicas: De carácter permanente.

b) Paroxísticas: Se presentan en ocasiones puntuales.

Cuando el paciente tiene síntomas, el diagnóstico se hace generalmente por medio de un electrocardiograma.

Otro método es el Holter de 24 horas, que consiste en un registro electrocardiográfico ambulatorio que capta los

latidos del corazón durante uno o más días. En casos excepcionales, cuando los especialistas sospechan que la

arritmia puede ser peligrosa, al paciente se le coloca un Holter implantable que detecta las arritmias durante un

año (Fundación, 2012).

Si las arritmias tienen relación con el ejercicio físico es necesario realizar una prueba de esfuerzo. Cuando el

electrocardiograma no es suficiente, en ocasiones puede ser necesario realizan un estudio electrofisiológico de la

conducción intracardiaca mediante catéteres que se introducen por una vena o una arteria (Fundación, 2012).

Los fármacos antiarrítmicos sólo se emplean para tratar los síntomas, ya que no tienen efecto beneficioso sobre

el pronóstico. La ablación percutánea consiste en la introducción de un catéter para quemar pequeñas zonas del

corazón donde se generan arritmias. Los dispositivos implantables son aparatos electrónicos capaces de analizar

el ritmo del corazón y tratar las arritmias mediante estímulos eléctricos. Los más usados son los marcapasos y

los desfibriladores automáticos implantables (DAI) (Fundación, 2012).

15

1.3 TOXICOLOGÍA GENÉTICA

Paracelso, el padre de la Toxicología, dijo: “La diferencia entre lo que cura y lo que mata es la dosis”. Es decir,

toda sustancia, sin excepción es un veneno, la cantidad administrada hace la diferencia entre un veneno y un

remedio (Silva, 2005).

La Toxicología es el estudio de los efectos adversos de sustancias químicas sobre los organismos vivos. Los

principios de Toxicología son esenciales para el uso apropiado de la ciencia en el proceso que suele

denominarse “valoración de riesgo”, por el cual se hacen estimados cuantitativos de los efectos potenciales

sobre la salud humana y la importancia ambiental de varios tipos de exposiciones a sustancias químicas

(Klaasen y Watkins, 2001).

En todas las ramas de la Toxicología, se estudian los mecanismos por los cuales las sustancias químicas

producen efectos adversos en sistemas biológicos (Klaasen y Watkins, 2001):

Mecanismos de acción y exposición a agentes químicos como una causa de enfermedad aguda y

crónica.

Fenómenos fisiológicos.

Exposición ocupacional a sustancias químicas.

Aspectos de salud pública de sustancias químicas que se encuentran en el ambiente, y los

fármacos.

Descubrimiento y creación de nuevos fármacos y plaguicidas.

Creación de estándares y reglamentos.

Efectos de sustancias químicas en la flora y la fauna.

Mecanismos por los cuales los tóxicos regulan el crecimiento de las células y la diferenciación

de las mismas, y las células muestran respuesta a los tóxicos a nivel de gen.

Creación de antídotos y regímenes de tratamiento para aliviar intoxicaciones y lesiones de

origen xenobiótico.

La Toxicología tiene cuatro áreas especializadas (Klaasen y Watkins, 2001):

1. Toxicología forense: Estudia principalmente los aspectos médico-legales de los efectos dañinos de

sustancias químicas sobre seres humanos y animales, establece la causa de muerte, y determina sus

circunstancias en una investigación post mortem.

16

2. Toxicología clínica: Estudia la enfermedad causada por sustancias tóxicas, o relacionada de manera

singular con estas últimas. Los esfuerzos se dirigen a atender pacientes intoxicados con fármacos u

otras sustancias químicas y a la creación de nuevas técnicas para tratar esas intoxicaciones.

3. Toxicología ambiental: Se enfoca en el impacto de contaminantes químicos que se encuentran en

el ambiente sobre organismos biológicos, con mayor frecuencia en organismos no humanos, como

peces, aves y animales terrestres.

4. Ecotoxicología: Es un área especializada dentro de la toxicología ambiental que se enfoca de

manera más específica en el impacto de las sustancias tóxicas sobre la dinámica de población en un

ecosistema.

El espectro de efectos indeseables de las sustancias químicas es amplio. Algunos efectos son nocivos, otros no.

En terapéutica, cada fármaco produce diversos efectos, pero por lo general, no sólo un efecto se relaciona con el

objetivo primario de la terapéutica; todos los otros efectos se denominan indeseables o secundarios de ese

fármaco, para ésta indicación terapéutica. Aún así, algunos de estos efectos secundarios pueden ser deseables

para otra indicación terapéutica. Algunos nunca son deseables y siempre son nocivos para el bienestar de seres

humanos. Estos se denominan efectos adversos, nocivos o tóxicos del fármaco (Klaasen y Watkins, 2001).

1.4 ÍNDICE TERAPÉUTICO O MÁRGEN DE SEGURIDAD

El índice terapéutico es el cociente entre la Concentración Mínima Tóxica (CMT) y la Concentración Mínima

Eficaz (CME) (CMT/CME). Cuanto mayor sea ésta relación, mayor es el márgen seguridad ofrece la

administración del fármaco y es más fácil conseguir efectos terapéuticos sin producir efectos tóxicos

(Velázquez, 2008).

El márgen de seguridad se determina para todos los fármacos en la fase experimental preclínica y permite juzgar

acerca de la seguridad de su empleo (Figueroa, 1999).

La Concentración Mínima Eficaz (CME) se define como la concentración por encima de la cual suele

observarse el efecto terapéutico; mientras que la Concentración Minima Tóxica (CMT) es la concentración a

partir de la cual suelen aparecer efectos tóxicos (Velázquez, 2008).

17

1.5 RELACIÓN DOSIS-RESPUESTA

Las características de la exposición y la gama de efectos se unen en la relación entre la dosis y la respuesta: a la

respuesta de un individuo a dosis variables se le llama gradual porque el efecto medido es continuo en una

gama de dosis. La relación puede describir la distribución de respuestas a diferentes dosis en una población de

individuos. Las relaciones entre dosis y respuesta individuales se caracterizan por un incremento (relacionado

con la dosis) de la gravedad de la respuesta. En general, la respuesta observada a dosis variable de una sustancia

química en el organismo entero suele complicarse por el hecho de que la mayor parte de las sustancias tóxicas

tienen múltiples sitios o mecanismos de toxicidad, cada uno con su propia relación entre “dosis y respuesta” y

efecto adverso subsiguiente (Klaasen y Watkins, 2001).

Al deducir la relación entre dosis y respuesta es necesario considerar diversas suposiciones antes que las

relaciones entre dosis y respuesta puedan usarse de manera apropiada (Klaasen y Watkins, 2001):

La respuesta se debe a la sustancia química que se administra.

La magnitud de la respuesta está relacionada con la dosis.

Hay uno o varios sitios moleculares o receptores con los cuales la sustancia química interactúa

para producir la respuesta.

La producción de una respuesta y el grado de respuestas se relacionan con la concentración del

agente en el sitio receptor.

La concentración en el sitio se relaciona, a su vez con la dosis.

Las propiedades fisicoquímicas del agente xenobiótico.

Hay tanto un método cuantificable de medición como un medio preciso de expresar la toxicidad.

El vínculo entre el grado de respuesta del sistema biológico y la cantidad de tóxico administrado adopta una

forma que ocurre de manera tan constante como para considerarla clásica y fundamental y se denomina la

relación entre dosis y respuesta (Klaasen y Watkins, 2001).

18

1.6 DOSIS LETAL 50 (DL50)

La determinación de la dosis letal media (DL50) regularmente es el primer experimento que se efectúa con una

nueva sustancia química. La DL50 es la dosis única de una sustancia, que puede esperarse que produzca la

muerte en 50% de los animales probados.

Si se utiliza un gran número de dosis con un gran número de animales por dosis, se observa una curva de dosis-

respuesta sigmoidea (Klaasen y Watkins, 2001).

La determinación de la DL50 se ha convertido en un tema público debido a la preocupación cada vez mayor por

el bienestar de los animales de laboratorio y la protección de los mismos. La DL50 no es una constante

biológica. Muchos factores influyen sobre la toxicidad y, así, pueden alterar la estimación de la DL50 en

cualquier estudio particular. Se ha demostrado que los factores como la cepa del animal, edad y peso, tipo de

alimentación, tipo de alojamiento en jaula, tiempo de ayuno antes del estudio, método de administración,

volumen, tipo de medio de suspensión, y duración de la observación, influyen sobre las respuestas adversas a

sustancias tóxicas (Klaasen y Watkins, 2001).

Varios métodos tradicionales determinan la DL50 y su límite de confianza de 95%, así como la pendiente de la

línea de probit (Klaasen y Watkins, 2001).

En la actualidad, la Toxicología alcanza enorme trascendencia social debido al importante número de sustancias

químicas comercializadas y su posible impacto sobre la salud pública y ambiental. Ello ha conducido al

desarrollo de estrategias de evaluación de riesgos con fines normativos: es el caso de la llamada "Toxicología

Reguladora" (Vinardell, 2007).

Existen protocolos de los diferentes ensayos toxicológicos que se realizan “in vivo”, de acuerdo con los criterios

de la Organization for Economic Co-operation and Development (OECD). En éstos se han introducido

diferentes criterios de reducción del número de animales y de refinamiento de las técnicas, si bien existen pocos

métodos de reemplazo que hayan sido aceptados en el plano legislativo (Vinardell, 2007).

La armonización de los protocolos utilizados en todo el mundo ha reducido de forma significativa el uso de

animales con estos fines. Desde 1982 la OECD fue la primera organización internacional en establecer unos

criterios de armonización de los ensayos realizados en animales, siendo aceptados por todos los países

19

miembros de dicha organización. De manera similar, existe desde 1990 una armonización en los ensayos de

seguridad realizados con fármacos (Vinardell, 2007).

1.6.1 Transformación Probit

Probit es una palabra que viene de la contracción de probability unit; a pesar de ello, no son unidades de

probabilidad, sino unidades de desviación estándar incrementadas en cinco con la finalidad de evitar el uso de

números negativos.

Esta transformación asume que la respuesta de los individuos se distribuye en forma normal, correspondiendo la

curva de respuesta a una sigmoidea o función de distribución normal acumulativa. Esta curva normal sólo se

diferencia de la tradicionalmente usada, en que tiene una media de 5 y no de 0, valor que corresponde a un

umbral proporcional de respuesta del 50%. (Silva, 2005)

1.6.2 Transformación Logit

Algunos autores sostienen que la respuesta no se distribuye de forma normal sino de forma sigmoide o logística,

por lo que sugieren que se utilice la siguiente ecuación (Silva, 2005).

P= 1/(1+e-(a+bx)

)

1.6.3 Transformación Anglit o Angular

La transformación angular se usa principalmente cuando los valores obtenidos experimentalmente se expresan

en términos de una proporción (p), cuyo valor oscila entre 0 y 1. Esta transformación presenta el problema que

puede sobrevalorar los datos extremos de la evaluación (Silva, 2005).

Los probit son unidades derivadas a partir de una transformación matemática que linealiza la curva de dosis-

respuesta. Estos métodos tradicionales para determinar la DL50 exigen un número relativamente grande de

animales (40 a 50). Se dispone de otras técnicas estadísticas que requieren menos animales, como el método de

“mover promedios” pero no proporcionan límites de confianza para la DL50 y la pendiente de la línea de probit.

En casi todas las circunstancias, un estimado adecuado de la DL50 y una aproximación de los intervalos de

confianza del 95% pueden obtenerse con apenas 6 a 9 animales por medio del método “incremento-

disminución” (up-and-down method) (Klaasen y Watkins, 2001).

20

1.7 MÉTODO DE LORKE PARA CALCULAR DL50.

Se ha propuesto que la toxicidad aguda debe ser probada en dos pasos (Lorke, 1983):

1. En las investigaciones iniciales de los rangos de dosis, la producción de efectos tóxicos serán

establecidos.

2. Serán administradas dosis aún más específicas para el cálculo de la DL50.

Esta experimentación se llevó a cabo tomando en cuenta un método para la investigación de la toxicidad aguda

de una sustancia química desconocida con una estimación de la DL50, usando la mínima cantidad de animales de

experimentación; obteniendo adecuada información sobre la toxicidad aguda y la DL50. Éste método no ha

tenido limitaciones y se aplica a fármacos, industria química y agricultura. Puede ser usado por todas las vías de

administración. Tal método se conoce como Método de Lorke (Lorke, 1983).

En principio, es necesario determinar el rango aproximado de la toxicidad aguda. Esto es logrado dando

diferentes dosis a los animales, por ejemplo 10, 100 y 1000 mg/kg de peso corporal. Los resultados muestran si

una sustancia es muy tóxica, tóxica, poco tóxica o sólo ligeramente tóxica (Lorke, 1983).

Debido a que el uso de un solo animal en cada grupo puede dar un resultado falso cuando por casualidad el

animal en el rango no tóxico muere o el del rango tóxico sobrevive, se propone usar tres animales en cada grupo

para determinar el rango tóxico. Los resultados de esta prueba son usados como una base para seleccionar las

dosis subsecuentes (Lorke, 1983).

De lo anterior, se hicieron las siguientes declaraciones con respecto a las pautas de dosificación posteriores

(Lorke, 1983):

1. Las sustancias más tóxicas que las de 1 mg/kg son tan altamente tóxicas que no es tan importante

calcular la DL50 exactamente.

2. Las DL50 de más de 5000 mg/kg no son de interés práctico.

3. Una cifra aproximada de la DL50 generalmente es adecuada para estimar el riesgo de toxicidad aguda.

Con base en estas consideraciones y en investigaciones anteriores, los nuevos compuestos se administran a los

animales en la primera y segunda etapa como lo marca la siguiente tabla:

21

Tabla 2. Diferentes dosis para determinar la toxicidad aguda (Lorke,1983).

Dosis en mg/Kg de peso. Resultados de la

investigación inicial.

Dosis elegidas por la segunda prueba.

10 100 1000

0/3 0/3 0/3 1600 2900 5000

0/3 0/3 1/3 600 1000** 1600 2900

0/3 0/3 2/3 200 400 800 1600

0/3 0/3 3/3 140 225 370 600

0/3 1/3 3/3 50 100** 200 400

0/3 2/3 3/3 20 40 80 160

0/3 3/3 3/3 15 25 40 60

1/3 3/3 3/3 5 10** 20 40

2/3 3/3 3/3 2 4 8 16

3/3 3/3 3/3 1 2 4 8

**: Éstas dosis son tomadas de los resultados de la primera prueba.

El método anterior demuestra que no hay ninguna ventaja en el uso de más de cinco animales por dosis. De

hecho tres animales por grupo de ensayo son totalmente adecuados. Sin embargo, tres animales por grupo de

dosis es tres veces más que un solo animal por grupo. El ahorro en los animales mediante el uso de un animal

por cada grupo tiene que ser equilibrado contra la falta de fiabilidad en sólo el 7% de las determinaciones de

toxicidad aguda. Puede ser necesario repetir aproximadamente cada 14 investigaciones. Es recomendable

equilibrar las ventajas y las desventajas en un grupo de un animal, ya que proporciona información adecuada

acerca de la toxicidad aguda. El ahorro en animales de experimentación con este método es excepcional.

Cuando las dosis estén debidamente seleccionadas, la información sobre la toxicidad aguda generalmente se

obtiene con 13 animales solamente, independientemente de la sustancia, de todas las vías de administración y

todos los rangos de dosis (Lorke, 1983).

22

1.8 ENSAYOS DE TOXICIDAD

La mutagénesis se refiere a la inducción de cambios permanentes y transmisibles en la estructura del material

genético, afectando a un único gen o a varios. Genotoxicidad es la capacidad de una sustancia para interaccionar

con al ADN. Los ensayos de genotoxicidad y mutagénesis son importantes para evaluar el riesgo de los

productos. Debido a que son fenómenos complejos, no existe un único ensayo capaz de detectar estas

alteraciones (Vinardell, 2007). La evaluación toxicológica de una sustancia química incluye las pruebas de

toxicología genética, que tienen dos propósitos principales: 1) reconocer los agentes mutágenos y 2) caracterizar

la relación dosis-respuesta y los mecanismos mutagénicos (Bello, 2001)

Toda mutación producida en una célula germinal puede ser transmitida a la descendencia, pero sí se produce en

una célula somática puede ser orígen de diversos trastornos, entre los que se encuentran la teratogénesis y las

neoplasias, la gran mayoría de los compuestos químicos carcinogénicos son genotóxicos, es decir, tienen la

capacidad de provocar daños sobre el ADN (Bello, 2001). Las alteraciones del ADN van desde las rupturas

mono o bicatenarias, pasando por los entrecruzamientos entre bases del ADN y entre bases y proteínas del ADN

hasta la adición de compuestos químicos a las bases del ADN (Klassen y Watkins, 2005).

Se han venido utilizando diferentes métodos con animales y evaluando las alteraciones genéticas observadas,

como en el ensayo de mutación genética en células de mamífero (preferentemente linfoma de ratón). El ensayo

del micronúcleos en eritrocitos de mamíferos determina si un producto provoca o no cambios en la estructura y

número de cromosomas (Vinardell, 2007).

1.8.1 Pruebas para la detección de genotoxicidad

Generalmente se exige un “panel mutagénico” consistente en diferentes determinaciones que pueden

ser (Rojas, 2008):

In vitro: Se utilizan células bacterianas, o de mamífero que se incuban con el producto en

presencia o ausencia de la fracción microsomal.

In vivo: Se observan posibles efectos en el organismo vivo, principalmente en ratón.

La Toxicología genética dispone de una amplia gama de análisis para identificar el potencial

genotóxico de una sustancia, de las cuales las más usuales son las siguientes:

Aberraciones cromosómicas: En citogenética se utiliza el análisis de la metafase para detectar

anomalías cromosómicas. Las células se exponen durante un periodo sensible del ciclo celular (Fase

S), y las aberraciones se generan en la primera división mitótica después del tratamiento. Es

23

fundamental que el número de células analizadas sea suficiente, además hay que registrar los

resultados por clases específicas de aberraciones. En el momento de interpretar los resultados en

cultivos celulares se han observado resultados positivos dudosos con dosis citotóxicas, es por eso que

las pruebas deben llevarse a cabo con dosis intermedias y ampliarse hasta una dosis con la que se

observe cierto grado de citotoxicidad. Las pruebas “in vivo” consisten en exponer a los animales

íntegros y posteriormente disponer de un tejido, a partir del cual se prepara un gran número de células

para su análisis (Klassen y Watkins, 2005).

Intercambio de Cromátides Hermanas: Se observan intercambios de segmentos aparentemente

recíprocos entre las dos cromátidas de un cromosoma, secundarios a errores en la replicación,

mediante la tinción diferencial que es característica de ésta prueba. Requiere de al menos dos procesos

de síntesis y división celular después del tratamiento. Sirve como indicador general de las exposiciones

a mutágenos y detecta agentes clastogénicos y citotóxicos (Hernández, 1999).

Micronúcleos: Cuerpos de cromatina que representan fragmentos acéntricos de cromosomas, o

cromosomas enteros, que no se incorporaron al núcleo en la mitosis. Se emplean como indicadores de

agentes clastogénicos y citotóxicos, aunque éstos también requieren al menos una fase de división

celular después de la exposición al agente en estudio (Márquez, 1997). Éste tema se revisará con más

detalle en el siguiente apartado, ya que fué el método utilizado en éste trabajo de investigación.

Ames: Prueba in vitro para la mutagenicidad que usa cepas de mutantes de la bacteria Salmonella

typhimurium, que no puede crecer en un medio con deficiencia de histidina: los agentes positivos

causan mutaciones que facilitan el crecimiento de la bacteria en el medio. La prueba se puede realizar

en presencia de una fracción microsómica de hígado de ratas para permitir la transformación

metabólica de precursores mutagénicos a derivados activos (Rojas. 2008).

Ensayo cometa: (o Electroforesis Celular en Gel): Ésta prueba permite la detección de daño directo al

ADN, sin necesidad de la fase de replicación ni expresión del ADN. Ésta técnica permite el

seguimiento de reparación del ADN o el monitoreo de poblaciones expuestas a agentes mutagénicos,

por tanto, se utiliza para cuantificar la toxicidad de diversos compuestos con un mecanismo

clastogénico tales como inductores de daño oxidativo, radiaciones y agentes alquilantes entre otros

(Rojas, 2008).

24

1.9 ENSAYO DE MICRONÚCLEOS

La prueba de micronúcleos fue desarrollada por W. Schmid en 1975, quien originalmente la propuso para

practicarse en la médula ósea del ratón; posteriormente, la técnica se ha instrumentado en una gran variedad de

tejidos y especies, y en la actualidad se le utiliza ampliamente (Zúñiga y Gómez, 2006).

Las aberraciones cromosómicas estructurales pueden ser el resultado de varios eventos, entre los principales, se

encuentran: el rompimiento del ADN, la replicación del ADN sobre un molde dañado y la inhibición de la

síntesis de ADN (Cervantes, 2006).

Los micronúcleos son fragmentos de cromosomas o cromosomas completos que espontáneamente o por causa

de agentes que rompen cromosomas (clastógenos), como las radiaciones o que afectan la división celular,

causando pérdida o ganancia de cromosomas enteros (anéugenos), como la vincristina; y quedan fuera del

núcleo durante la mitosis. Los micronúcleos son conocidos en el campo de la hematología como cuerpos de

Howell-Jolly y su forma es generalmente redonda o almendrada, con un diámetro que varía desde 0.4 a 1.6

micras. Su formación se basa en que en la anafase cualquier fragmento cromosómico que no posea centrómero

no podrá integrarse a un núcleo por carecer del elemento indispensable para orientarse en el huso acromático.

Después de la telofase, los cromosomas normales, así como los fragmentos que posean centrómeros, dan origen

a los núcleos de las células hijas; sin embargo, los elementos rezagados –que pueden ser fragmentos o

cromosomas completos– quedan incluidos en el citoplasma de las células hijas, y una proporción de ellos se

transforma en uno o varios núcleos secundarios. Tales núcleos son mucho más pequeños que el núcleo principal,

y de ahí su nombre de “micronúcleos”. Entonces, sí el compuesto estudiado es un clastógeno, se formarán

micronúcleos pequeños, pero sí es un aneúgeno, se formarán micronúcleos grandes (Zúñiga y Gómez, 2006).

El ensayo “in vivo” de micronúcleos en mamíferos está especialmente indicado para evaluar el riesgo

mutagénico, ya que permite tomar en consideración factores del metabolismo “in vivo”, de la farmacocinética y

de los procesos de reparación del ADN, si bien, dichos factores pueden variar según la especie, el tejido y el

aspecto genético considerado. Los ensayos “in vivo” también resultan útiles para profundizar en el estudio de

los efectos mutagénicos detectados en ensayos “in vitro” (Domínguez, 2009).

Para la realización de la prueba de Micronúcleos “in vivo”, es indispensable utilizar un tejido en constante

división, pero debe considerarse que en las células con poco citoplasma los micronúcleos no son fácilmente

distinguibles de los lóbulos o proyecciones del núcleo normal. La prueba se realiza en diferentes tipos celulares:

eritrocitos policromáticos de la médula ósea, cultivos de linfocitos de sangre periférica, eritrocitos jóvenes y

maduros de la sangre periférica, queratinocitos, células de la mucosa bucal, hepatocitos de rata, células

germinales y células de descamación de la vagina de la rata, entre otros (Zúñiga y Gómez, 2006).

25

El ensayo de Micronúcleos “in vivo” puede realizarse de dos maneras (Domínguez, 2009):

a) Se administra la sustancia de prueba a los animales en una sola ocasión. Se extraen muestras de la

médula ósea o de sangre periférica al menos dos veces.

b) Si se efectúan dos o más administraciones a intervalos de 24 horas, ha de tomarse una muestra

transcurridas de 18 a 24 horas desde la última administración si se trata de médula ósea y de 36 a 48

horas desde la última administración en el caso de sangre periférica.

El estudio de micronúcleos “in vivo” se puede realizar utilizando eritrocitos jóvenes (Eritrocitos Policromáticos)

obtenidos de sangre periférica, los cuales son considerados los más convenientes para dicho estudio, ya que

facilitan la identificación de micronúcleos debido a que permanecen jóvenes en un periodo de 24 a 48 horas

aproximadamente, carecen de núcleo y se tiñen de manera diferente a los eritrocitos maduros en circulación ya

que contienen una mezcla de hemoglobina y ARN presentando así una coloración mezclada de basofilia y

eosinifilia por lo que se tiñen de azul violáceo. Son un poco más grandes que los eritrocitos maduros (Eritrocitos

Normocrómicos), los cuales se tiñen de naranja rosado debido a que están constituidos principalmente de

hemoglobina (Rocha, 2008).

El mecanismo de formación de micronúcleos se lleva a cabo en la médula ósea junto con la eritropoyesis, el cual

constituye un desarrollo continuo iniciando con la célula totipotencial seguida de la progresión normoblástica

hasta llegar al eritrocito maduro. La replicación del pronormoblasto permite el desarrollo potencial de 16

eritrocitos maduros mediante cuatro divisiones mitóticas en un periodo de 72 horas. El pronormoblasto tiene la

función de producir, acumular y proteger a las moléculas de hemoglobina, la cual deja de sintetizarse después

de que la célula sufre tres primeras divisiones mitóticas originando la expulsión del núcleo y la diapédesis al

interior de los capilares medulares donde el normoblasto ortocromático se transforma en el reticulocito, que

conserva las mitocondrias, pequeñas cantidades de ribosomas, el centriolo y vestigios del aparato de Golgi

(Rocha, 2008).

Los reticulocitos sintetizan el 20% restante de la hemoglobina para la formación del glóbulo rojo maduro el cual

obtiene la energía por la glucólisis. El ATP cumple la función de captar glucosa del plasma, conservar las

concentraciones adecuadas de calcio y potasio, mantiene la forma bicóncava conservando la hemoglobina en

estado reducido (Rocha, 2008).

El tiempo de vida de un eritrocito en ratón es de 30 días y considera que el ciclo celular es de 10 a 20 horas. El

lapso que transcurre de la división a la enucleación es de 6 horas y el tiempo de los EPC en médula ósea es de

24 horas (Domínguez, 2009).

26

Si se emplea médula ósea, se recomienda el uso de ratones o ratas, pero también pueden utilizarse otras especies

de mamíferos adecuadas. Si se emplea sangre periférica, se recomienda el uso de ratones. Deben usarse

animales jóvenes y sanos de cepas utilizadas habitualmente en el laboratorio. La variación del peso de los

animales al empezar el estudio debe ser mínima y no exceder de + 20% del peso medio de cada sexo

(Domínguez, 2009).

Las células de la médula suelen tomarse del fémur o la tibia, de los animales recién sacrificados, se preparan

laminillas y se tiñen según métodos establecidos. La sangre periférica se extrae de la vena caudal o de otro vaso

sanguíneo adecuado. Las células hemáticas se someten inmediatamente a una tinción supravital; o bien, se

extienden en frotis y se les realiza una tinción diferencial con colorante Giemsa, por ejemplo, o mediante

tinciones fluorescentes (Domínguez, 2009).

Para cada animal se determina la relación entre los eritrocitos inmaduros y el total de eritrocitos (inmaduros +

maduros) en un recuento de al menos 200 eritrocitos si se trata de médula ósea y de 1000 si se trata de sangre

periférica (Domínguez, 2009).

El ensayo de micronúcleos es un método sensible que permite identificar agentes que causan la formación de

estas estructuras como resultado de fragmentos de cromosomas o cromosomas completos, “in vivo” es

especialmente útil para caracterizar el poder genotóxico de factores del metabolismo, de fármacos y de los

procesos involucrados en la reparación del ADN (Cervantes, 2006). Dentro de las ventajas de la técnica de

micronúcleos se incluyen la facilidad y rapidez, la posibilidad de probar un sólo químico sin otros compuestos,

la abundancia de células analizables en diferentes periodos del ciclo celular y el que los micronúcleos formados

durante la división celular persisten al menos durante la siguiente interfase; además, la prueba no deja lugar a

dudas sobre el daño producido, pues lo que se observa como micronúcleos es claramente una pérdida de ADN.

Por otro lado, la prueba no detecta agentes que no producen pérdidas de material genético o rezagos anafásicos,

y tampoco es útil en poblaciones celulares que no se dividen (Zúñiga y Gómez, 2006).

27

2. JUSTIFICACIÓN

Las enfermedades cardiovasculares son muy comunes en México y son un problema serio debido a las

complicaciones que pueden llegar a tener, ya que éstas pueden ser letales, es, por ésta razón, que el Laboratorio

de Química Medicinal a cargo del Dr. Enrique Ángeles Anguiano retomó investigaciones pasadas acerca de

derivados de la changrolina para desarrollar nuevos fármacos que combatan dichas enfermedades y que tengan

una mayor potencia, eficacia y un margen de seguridad más amplio que los fármacos antihipertensivos de uso

común, acercándonos cada vez más al concepto del fármaco ideal.

El principal objetivo de éste trabajo de investigación es estimar la DL50 y con la población de animales que

sobreviva, determinar la genotoxicidad de cuatro compuestos derivados de la serie LQM; dos compuestos

monotiomorfolínicos y dos compuestos monopiperidínicos, por medio de el Ensayo de Micronúcleos “in vivo”

para después compararlos entre sí y con otros fármacos antihipertensivos de mecanismo de acción conocido y

poder de ésta forma, comenzar a caracterizar a cada grupo de LQM’s, ya que por tratarse de nuevos fármacos,

aún se desconocen muchos aspectos de ellos.

3. HIPÓTESIS

Sí los compuestos de la serie LQM300 a dosis menores a la DL50 tienen propiedades clastogénicas (inducen la

ruptura de cromosomas), o aneugénicas (afectan la división celular y estructuras asociadas a la segregación

cromosómica) que induzcan el rezago cromosómico, producirán un aumento en la frecuencia de micronúcleos

en eritrocitos de sangre periférica de ratón.

28

4. OBJETIVO GENERAL.

Evaluar la genotoxicidad y determinar la DL50 de los compuestos monotiomorfolínicos LQM318, LQM339 y

los compuestos monopiperidínicos LQM336, LQM344 en ratones macho de la cepa CD1 mediante el ensayo de

Micronúcleos “in vivo” y el Método de Lorke, respectivamente; para contribuir en el establecimiento de la

seguridad toxicológica de estos nuevos compuestos de acción cardiovascular.

4.1 OBJETIVOS PARTICULARES

Determinar la toxicidad aguda de los compuestos LQM318, LQM339, LQM336 y LQM344 mediante el

método de la DL50 de Lorke y realizar la evaluación genotóxica de los mismos.

Evaluar la genotoxicidad de los compuestos LQM318, LQM339, LQM336 y LQM344 mediante la

prueba de Micronúcleos “in vivo” en ratones macho de la cepa CD1 a las dosis de 140, 225, 370 y 600

mg/Kg de peso.

29

5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1 Material biológico

Para la realización de éste trabajo, se utilizaron 48 ratones macho cepa CD1 provenientes del bioterio de

FES Iztacala, con un peso aproximado de 25g + 5g; jóvenes, todos de la misma edad, se mantuvieron

en las mismas condiciones de alimentación, temperatura y habitación; ya que el trabajo experimental se

llevó a cabo en la Unidad de Aislamiento y Bioterio de la Unidad de Investigación Multidisciplinaria de

la FESC Campo 4, a cargo del M. en C. Crisóforo Mercado Márquez.

5.2 Compuestos problema

• Compuestos LQM318, LQM336, LQM339 y LQM344.

Los compuestos LQM336, LQM339 y LQM344, se preparó su sal en HCl concentrado, obteniendo así su

clorhidrato; sin embargo, el compuesto LQM318, no se logró disolver en HCl concentrado, por lo cual, se tuvo

que solubilizar en DMSO 70%.

5.3 Reactivos

• HCl concentrado (J.T. Baker).

• Colorante Giemsa (SIGMA).

• KH2PO4 (J.T. Baker).

• NaH2PO4 (J.T. Baker).

• Metanol absoluto (J.T. Baker).

• Agua destilada .

DMSO 70% (SIGMA).

30

5.4 Equipos y otros materiales

• Microscopio óptico (Leica).

• Balanza analítica (Scaltec).

• Potenciómetro (Conductronic).

• Pipetas volumétricas de 5 y 10 mL

(PYREX) .

• Piseta.

• Probeta 50 Ml (PYREX).

• Micropipetas de volúmen variable en

rangos de 10 a 500 µL (Orange Scientific).

• Estuche de disección.

• Jeringas de 1 mL.

• Viales.

• Portaobjetos.

6. METODOLOGÍA

a) Determinación de la DL50 del compuesto mediante el método de Lorke (Lorke, 1983).

1. El método consiste en dos etapas. En la primera, se administraron dosis de 10, 100 y 1000

mg/Kg, teniendo como sobrevivientes a las 24 h. a los animales de las dosis 10 y 100 mg. De

tal manera, que siguiendo el método (ver Tabla 1.), se eligieron las dosis de prueba de las

siguiente etapa.

2. Distribución de los ratones de la cepa CD1 en 4 lotes de 3 ratones para cada compuesto.

Administración del clorhidrato de los compuestos vía intraperitoneal en las dosis siguientes:

Tabla 3. Dosis administradas en la segunda etapa del método de Lorke.

LOTE DOSIS (mg/Kg)

1 140 2 225 3 370 4 600

31

3. Observación de los animales durante 24 hrs, registrar signos y dosis a la cual los animales

vivieron o murieron.

a) Obtención de la media geométrica de las dosis para calcular la DL50.

b) Prueba de Micronúcleos. Determinación de la genotoxicidad de los compuestos.

1. Antes de la administración (T0), a cada ratón, realizar un frotis sanguíneo, cortando la

porción terminal de la cola, después realizar el tratamiento con una sola administración

intraperitoneal. Tomar muestras de sangre periférica; obtenida de la cola del ratón a (T24),

(T48) y (T72) después de la administración.

2. Fijación de los frotis sumergiéndolos en metanol absoluto por tres minutos y teñir con el

colorante correspondiente (Giemsa (1:10) en buffer de fosfatos a pH=6.8)

3. Determinación de la frecuencia de eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en

2000 eritrocitos policromáticos (EPC).

4. Determinación del índice de citotoxicidad por la frecuencia de eritrocitos policromáticos en

2000 eritrocitos totales (EPC + ENC). Realizar el conteo con el microscopio óptico

utilizando el objetivo de inmersión (1000X).

5. Realización del análisis estadístico ANOVA por medio del software creado GraphPad

Instant tm. Con un α = < 0.05.

32

7. DIAGRAMA DE FLUJO

33

8. RESULTADOS

8.1 CÁLCULOS REALIZADOS PARA DETERMINAR LA DL50 DE LOS DIFERENTES COMPUESTOS:

La media geométrica (DL50) se obtiene calculando la raíz cuadrada del producto de la última dosis en la

que sobrevivieron todos por la primera dosis donde hubo decesos.

LQM 336 = = 117.48

LQM 339 = = 288.53

LQM 344 = = 471.16

LQM 318 = = 471.16

8.2. Tabla 4. DL50 con efectos de toxicidad

COMPUESTO DL50 EFECTOS DE TOXICIDAD

LQM318

471.16 mg/Kg

Aletargados, dificultad para

moverse, pelo erizado y seco.

LQM336

177.48 mg/Kg

Aletargamiento, incapacidad

de movimiento, excitación

exagerada, convulsiones.

LQM339

288.53 mg/Kg

Aletargamiento, dificultad de

movimiento.

LQM344

471.16 mg/Kg

Aletargamiento, debilidad,

respiración lenta, dificultad

para moverse menos severa

que en los demás compuestos

34

8.3 Tablas Eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) para evaluar Genotoxicidad.

Eritrocitos policromáticos micronucleados en 2000 eritrocitos policromáticos.

8.3.1. Tabla 5. Eritrocitos policromáticos micronucleados (EPCMN) en LQM318.

L = Lote R = Ratón


L1R1 L1R2 L1R3 L2R1 L2R2 L2R3 L3R1 L3R2 L3R3 L4R1 L4R2 L4R3

H ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS/ 2000 ERITROCITOS POLICROMÁTICOS

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0

24 0 0 0 0 ------ ---- ------ ---- 0 ------ ---- ------

48 0 0 0 0 ------ ---- ------ ---- 0 ------ ---- ------

72 0 0 0 0 ------ ---- ------ ---- 1 ------ ---- ------

0 0 0 0 0 0 0 0 0.333 0 0.333 0

SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577 0 0.577 0

L = Lote R = Ratón


h ERITROCITOS POLICROMÁTICOS MICRONUCLEADOS/2000 ERITROCITOS POLICROMÁTICOS

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24 ---- ---- ----- ---- ------ ---- ------ 0 ---- 0 ---- -----

48 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 0 ---- 1 ---- ------

72 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 0 ---- 0 ---- ------

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.333 0 0

SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577 0 0

35




0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

24 0 0 0 0 0 0 ------ ---- 1 0 0 0

48 0 0 0 0 0 0 ------ ---- 0 0 0 0

72 0 0 0 0 0 0 ------ ---- 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0.333 0 0 0

SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577 0 0 0

L = Lote R = Ratón

8.3.4. Tabla 8. Eritrocitos policromáticos micronuleados (EPCMN) en LQM344.



0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1

24 0 ----- 0 0 ----- 0 ----- 0 ---- ---- ---- 0

48 0 ----- 0 ----- ----- 0 ----- 0 ---- ---- ---- 0

72 0 ----- 0 ----- ----- 0 ----- 0 ---- ---- ---- 0

0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.333

SD 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0.577

L = Lote R = Ratón

No se pudo realizar el análisis de ANOVA para ninguno de los 4 compuestos debido a que todos presentaron por lo

menos para una columna, sólo un dato y para poder realizar el análisis de ANOVA se requieren mínimo 2 datos en cada

columna.

Dosis Administradas a cada lote: Ver tabla 2.

36

8.4 Tablas de porcentaje de eritrocitos policromáticos para evaluar Citotoxicidad.

Eritrocitos policromáticos (EPC) divididos entre 2000 eritrocitos totales (eritrocitos policromáticos más eritrocitos

normocrómicos (EPC+ENC)).

EPC/2000 (EPC+ENC) =%EPC EN 2000 ERITROCITOS

8.4.1. Tabla 9. Porcentaje de eritrocitos policromáticos en el compuesto LQM318.

L= Lote R=Ratón



H %ERITROCITOS POLICROMÁTICOS /2000 ERITROCITOS TOTALES

0 0.85 0.55 0.55 0.65 0.7 0.8 0.75 0.75 0.9 0.95 0.9 0.65

24 1.85 2.05 1.85 2.65 ------ ---- ------ ---- 2 ------ ---- ------

48 2.85 2.05 2.25 2.9 ------ ---- ------ ---- 2.1 ------ ---- ------

72 2.2 1.15 2.0 3.1 ------ ---- ------ ---- 2.1 ------ ---- ------

1.9375 1.45 1.6625 2.325 0.7 0.8 0.75 0.75 1.775 0.95 0.9 0.65

SD 0.835 0.7348 0.7598 1.132 0 0 0 0 0.5852 0 0 0

L=Lote R=Ratón


h % ERITROCITOS POLICROMÁTICOS /2000 ERITROCITOS TOTALES

0 0.7 0.75 0.8 0.55 0.7 0.8 0.6 0.6 0.75 0.65 0.65 0.75

24 ---- ---- ----- ---- ------ ---- ------ 1.15 ---- 1.4 ---- -----

48 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 2 ---- 2.15 ---- ------

72 ----- ---- ------ ----- ------ ---- ------ 1 ---- 1.6 ---- ------

0.7 0.75 0.8 0.55 0.7 0.8 0.6 1.1875 0.75 1.45 0.65 0.75

SD 0 0 0 0 0 0 0 0.5893 0 0.6205 0 0

37




0 0.9 0.65 0.9 0.7 0.55 0.45 0.8 0.6 0.8 1 0.3 0.7

24 2.25 1.35 1.15 1.8 1.2 1.7 ------ ---- 2.45 1.8 0.9 2.05

48 1.55 1.15 1.15 1.3 1.1 1.65 ------ ---- 2 1.6 1.2 1.2

72 1 0.85 0.85 0.95 0.65 1.6 ------ ---- 0.9 1.75 1.55 ----

1.425 1 1.0125 1.1875 0.875 1.35 0.8 0.6 1.5375 1.5375 0.9875 1.31666667

SD 0.6198 0.3109 0.1601 0.4768 0.3227 0.6014 0 0 0.8159 0.3683 0.5297 0.6825

L=Lote R=Ratón




0 0.6 0.7 0.7 0.75 0.5 0.55 0.65 0.6 0.75 0.65 0.75 0.5

24 1.2 ----- 1.45 1.95 ----- 1.65 ----- 1 ---- ---- ---- 0.6

48 1.25 ----- 1.75 ----- ----- 1.8 ----- 1.4 ---- ---- ---- 0.7

72 1.05 ----- 1.55 ----- ----- ----- ----- 0.85 ---- ---- ---- 0.6

1.025 0.7 1.3625 1.35 0.5 1.33333333 0.65 0.9625 0.75 0.65 0.75 0.6

SD 0.2958 0 0.4589 0.8485 0 0.6825 0 0.3351 0 0 0 0.08165

L=Lote R=Ratón

No realizó el análisis de ANOVA para ninguno de los 4 compuestos debido a que todos presentaron por lo menos para

una columna, sólo un dato y para poder realizar el análisis de ANOVA se requieren mínimo 2 datos por columna.

Dosis Administradas a cada lote: Ver tabla 2.

38

8.5. TABLA 13. EFECTOS SECUNDARIOS DE LOS DIFERENTES COMPUESTOS DE LA SERIE LQM300

COMPUESTO Al momento de la administración (0h) T0 24h(T24) 48h(T48) 72h(T72)

LQM 318

Aletargados, pelo erizado y seco, dificultad de

movimiento. Muere el único administrado de la dosis de

140 mg/kg a las 12h después de ser administrado. Mueren 2 ratones de la dosis de 225 mg/Kg, 2 de la dosis

de 370 mg/Kg y 2 de la dosis de 600 mg/Kg. Estos

últimos 6 murieron aproximadamente 2 h después de la

administración.

Los 3 sobrevivientes continúan

aletargados, con el pelaje erizado y

seco, sin embargo, ya pueden moverse un poco más. Muere el sobreviviente

de la dosis de 225 mg/Kg,

aproximadamente 4 horas después de

haber tomado la muestra de las 24 h.

Sobreviven 1 ratón de la dosis de

370 mg/Kg y 1 de la dosis de 600

mg/Kg. El pelaje no cambia, el aletargamiento ha disminuido y

cada vez recuperan más la

capacidad de moverse.

Los únicos 2

sobrevivientes, se

han recuperado, ya no presentan

aletargamiento y sus

movimientos ya son

normales; sin embargo, el pelaje

continuó erizado y

seco.

LQM 339

En general, presentaron aletargamiento y dificultad de

movimiento, no se observó ningún cambio en el pelaje,

la mayoría se recuperó del aletargamiento y de la dificultad de movimiento antes de la siguiente toma de

muestra.

De los tres que no lograron

recuperarse del aletargamiento ni de la

dificultad de movimiento, se encontraron 2 muertos antes de

realizar esta toma de muestra y fueron

de la dosis de 370 mg/Kg.

Los 10 sobrevivientes se

encuentran bien, cada vez más

recuperados. Sólo un ratón de la dosis de 600 mg/ Kg aún se

encuentra con cierto letargo y

dificultad de movimiento.

El ratón de la dosis

de 600 mg/Kg que

estaba aletargado, se encontró muerto

antes de realizar la

toma de muestra. Los

9 sobrevivientes se encontraban ya

totalmente

recuperados.

LQM 336

Todos los ratones de la dosis de 140 mg/Kg se

encuentran sin signos ni afección alguna. Murieron 2 de

la dosis de 225mg/Kg, 2 de la dosis de 370 mg/Kg y todos los de la dosis de 600 mg/Kg. Todos murieron en

cuestión de minutos presentando enseguida de la admón.

constantes espasmos, después entraban en un estado de

aletargamiento, enseguida sufrían episodios de excitación exagerada, en la cual, se observaban

taquicardias, las cuales duraron un poco más, después

sufrieron una convulsión y finalmente, murieron. Se

realizó una disección en la cual se observaron los órganos muy retraídos y una rigidez muscular bastante

notable. La intensidad de los signos fue proporcional a la

dosis.

El sobreviviente de la dosis de 225

mg/Kg sólo presentó aletargamiento y

episodios de leve excitación, al igual que el sobreviviente de la dosis de 370

mg/Kg.

Los 5 ratones sobrevivientes han

salido ya del aletargamiento, ya no

se encuentran excitados, al parecer, se han pasado totalmente

los efectos del fármaco.

Los 5 cinco

sobrevivientes se

encuentran normales.

LQM 344

Presentan el aletargamiento común, ligeras taquicardias

y la dificultad de movimiento aunque no son tan

marcados como con los compuestos anteriores. Murieron 1 ratón de la dosis de 140 mg/Kg, 1 de la

dosis de 225 mg/Kg, 1 de la dosis de 370 mg/Kg y 1 de

la dosis de 600 mg/Kg. Antes de morir, mostraron severa

debilidad, pérdida de fuerza en las extremidades y bradicardias.

En los 8 sobrevivientes continúa el

aletargamiento aunque se notaba más

en los dos restantes de la dosis de 370 mg/Kg. Un poco de tiempo después,

uno de ellos murió, al igual que uno de

la dosis de 225 mg/Kg. Éstos

fallecieron antes de hacer la toma de muestra de las 48 horas.

Los 6 que sobrevivieron se notan

con menos aletargamiento, ya

pueden apoyarse en sus patas y moverse, sólo el ratón que

quedaba de la dosis de 225 mg/Kg

no se recuperó de ese

aletargamiento y murió aproximadamente 4 horas después

de la toma de muestra.

Los 5 sobrevivientes

se encuentran ya

recuperados y se observan normales.

39

9. DISCUSIÓN

Estudios anteriores a éste, llevados a cabo en el Laboratorio de Farmacología del Miocardio a

cargo de la Doctora Luisa Martínez han revelado que los compuestos de la serie LQM300 tienen

propiedades antihipertensivas, antiarrítmicas y cardiotónicas, y se han perfilado como fármacos

alternativos a los convencionales para el tratamiento de ciertas enfermedades cardiovasculares; sin

embargo, para que éstos fármacos puedan ser utilizados en la terapéutica, se deben hacer antes

estudios minuciosos que revelen más información acerca de ellos, como son la Dosis Letal Media

(DL50) y la determinación de la genotoxicidad y citotoxicidad como parte de los estudios preclínicos

que prueban que son fármacos seguros y efectivos; dichos estudios fueron el objetivo de éste trabajo

de investigación, específicamente de los Compuestos Monotiomorfolínicos LQM318, LQM339 y

los Compuestos Monopiperidínicos LQM336, LQM344.

En primera instancia, se determinó la DL50 de los 4 compuestos (ver tabla 4), la cual nos revela que

el compuesto que tuvo una DL50 menor, es el compuesto LQM336, ya que produjo la muerte del

50% de la población con una dosis de 177.48 mg/Kg y los compuestos que muestran una DL50

mayor son los compuestos LQM344 y LQM318, necesitándose una dosis de 471.16 mg/Kg para

que se produzca la muerte del 50% de la población. Finalmente, del compuesto LQM339 se obtuvo

una DL50 de 288.53 mg/Kg. De ésta forma, se establecieron las dosis de toxicidad aguda de los

diferentes compuestos, que tomando en cuenta los criterios según el método utilizado, el órden de

toxicidad aguda de los cumpuestos quedó como sigue: LQM336>LQM339>LQM344=LQM318.

Los compuestos se solubilizaron al obtener su clorhidrato, siendo de esta manera más fácil su

administración. Sin embargo, para el compuesto LQM318 fue necesario solubilizarlo en DMSO al

70%, lo cual suponemos que no necesariamente modifica su capacidad tóxica.

Los compuestos LQM336 y LQM344 son monopiperidínicos; anteriormente, en el marco teórico,

se hizo mención de que el compuesto LQM344 muestra mayor eficacia sobre la Presión Arterial

Sistólica, Presión Arterial Diastólica y Frecuencia Cardiaca que el compuesto LQM336 (Pérez,

2012); sin embargo, entre los cuatro compuestos hubieron bastantes similitudes en cuanto a la

reacción de los ratones a la cantidad de fármaco administrada, generalmente manifestaron las

mismas reacciones, la diferencia fue la intensidad y algunas particularidades observadas en cada

fármaco, por lo cual podemos decir que entre los compuestos monopiperidínicos, el compuesto de

elección es el LQM344, ya que es menos tóxico según los resultados obtenidos en esta

experimentación, con base en el método de Lorke y, es eficaz como antihipertensivo.

40

Se intentaron comparar con Losartán, el cual tiene una DL50 de 1257 mg/Kg administrado por vía

oral (Merck, 2012), sin embargo, no hubo comparación alguna debido a que la dosis terapéutica de

Losartán oscila entre 25 y 100 mg (Vademecum, 2012) y que las dosis utilizadas de algunos

compuestos LQM morfolínicos, tiomorfolínicos y piperidínicos ha sido de 1x10-3

M, para evaluar

el efecto vasodilatador (Sánchez y Mena, 2010); se partió de una dosis de 1 mg/Kg para realizar

diluciones 1:10 obteniendo concentraciones de 10-1

, 10-2

, 10-3

y 10-4

mg/Kg para evaluar la

actividad hipotensora de algunos compuestos morfolínicos y piperidínicos (Briones, 2009); 1

mg/Kg para la realización de un estudio comparativo del área bajo la curva del efecto temporal

antihipertensivo de compuestos morfolínicos, tiomorfolínicos y piperidínicos comparados con

Captopril y Losartán (Pérez, 2010); por mencionar algunos experimentos realizados con éstos

compuestos, además de que todos se han administrado por vía intraperitoneal o se han colocado

directamente sobre la parte del organismo donde se desea ver su efecto, ya que aún no se han hecho

pruebas clínicas donde se determinen dosis terapéuticas por vía oral y en humanos, las cuales serían

lo ideal y de esta forma podríamos comparar tanto las dosis tóxicas como las terapéuticas con

Losartán o cualquier otro fármaco indicado para tratar otras enfermedades cardiovasculares,

actualmente, determinar dosis tanto tóxicas como terapéuticas por vía intraperitoneal está cayendo

en desuso, debido a que ningún fármaco está indicado para ser utilizado por vía intraperitoneal en

humanos; sin embargo, si comparamos las dosis terapéuticas utilizadas de los LQM300 y sus DL50,

entonces podría haber un margen amplio de seguridad en tales compuestos.

Por otro lado, al igual que los compuestos de la serie LQM300 aquí analizados, la exposición a altas

concentraciones de Losartán provocaron taquicardias (Merck, 2012); como el Losartán es un

Bloqueador del Receptor de Angiotensina II (Goodman y Gilman, 2007), entonces pudiera ser que

los compuestos monopiperidínicos interactúan con el Receptor de Angiotensina II, ya que tuvieron

en común ese efecto adverso.

Se ha sugerido que los antagonistas de los Receptores Adrenérgicos α1 presentan como efecto

secundario el llamado fenómeno de primera dosis, en el que ocurre hipotensión ortostática

sintomática en el transcurso de 90 minutos de la dosis inicial del medicamento o después de

aumentarla (Goodman y Gilman, 2007), este dato es reportado en humanos a dosis terapéuticas, la

experimentación se realizó en ratones administrando dosis mayores a las terapéuticas, entonces cabe

la posibilidad de que el aletargamiento observado se halla debido a una potente hipotensión

provocada por la interacción de los compuestos LQM300 evaluados con el receptor adrenérgico α1;

lo cual nos hace pensar que los compuestos monopiperidínicos o algún metabolito de éstos , pueden

estar interactuando tanto con estos receptores como con los Receptores de Angiotensina II.

41

El receptor adrenérgico α1, entre otros mecanismos, origina vasoconstricción en arteria coronaria

epicárdica (Goodman y Gilman, 2007); en el marco teórico, se mencionaba que el compuesto

LQM318 presenta un antagonismo no competitivo al receptor adrenérgico α1 en el modelo de

órgano aislado de aorta torácica y abdominal de rata hipertensa espontánea (Mondragón, 2009),

dichos estudios no se han hecho en el LQM339, sin embargo, al ser un compuesto

monotiomorfolínico al igual que el LQM318, cabe la posibilidad de que también se trate de un

antagonista no competitivo del receptor adrenérgico α1, ya que en cuanto a la toxicidad, se

observaron los mismos efectos que para el LQM318 pero con menor intensidad, en cuanto a la

toxicidad; la DL50 del LQM318 es de 417.16 mg/Kg, siendo ésta más amplia que para el LQM339,

la cual fue de 228.53 mg/Kg, por lo cual, podemos decir que el LQM339 es más tóxico que el

LQM318; cabe mencionar también que por medio de la determinación del Área Bajo la Curva, el

LQM318 posee mayor eficacia sobre la presión sistólica, presión diastólica y frecuencia cardiaca

que el LQM339 (Pérez, 2012). Con base en estos resultados se podría decir que de los compuestos

monotiomorfolínicos, el compuesto de elección es el LQM318, ya que tiene mayor eficacia y menor

toxicidad que el LQM339.

La determinación de genotoxicidad y citotoxicidad a través del ensayo de Micronúcleos “in vivo”

se realizó en las laminillas hechas en el tiempo 0 (antes de la administración) y posteriormente, en

los ratones sobrevivientes a la administración de dosis cercanas a la DL50.

En el estudio del potencial genotóxico (Tablas 8.3), el cual se llevó a cabo contando eritrocitos

policromáticos micronucleados observados en 2000 eritrocitos policromáticos, los resultados para

los compuestos LQM318 y LQM339; LQM336 y LQM344 fueron favorables, ya que ninguno

presentó un aumento en la frecuencia de micronúcleos en eritrocitos en sangre periférica de ratón,

hablando de los ratones que sobrevivieron a las dosis administradas durante los tres días de

experimentación, ya que la mayoría fallecían sí no en el momento de administración, en el

transcurso de las 24 horas como en el caso del LQM318, en el cual, fallecieron todos los de las

dosis de 140 mg/Kg y 225 mg/Kg; sobrevivieron uno de la dosis de 370 mg/Kg y uno de la dosis de

600 mg/Kg, pero en ninguno de éstos se observaron micronúcleos, los demás compuestos

permitieron una mejor evaluación de la presencia de micronúcleos, ya que sobrevivieron más

ratones de las diferentes dosis y en algunos casos las 72 horas. La ausencia de genotoxicidad no se

logró demostrar mediante el análisis estadístico ANOVA, debido a que para los cuatro compuestos

hubo por lo menos un deceso en una de las dosis y por lo tanto, en varias columnas, se tenía sólo un

dato y para poder realizar el análisis de ANOVA se requieren mínimo 2 datos en cada columna. Sin

embargo, los resultados de EPCMN en todos los animales sobrevivientes se observaron en

promedio de 0 a 1 micronúcleos por 2000 células durante los 4 días de experimentación para cada

42

compuesto, por lo tanto, por la ausencia de cambios en la relación EPC/ENC se presume que los

compuestos LQM300 monopiperidínicos y monotiomorfolínicos que en la medula ósea de los

animales y sus células sanguíneas circulantes no se manifiestan los efectos tóxicos, pero está claro

que a otros tipos celulares si les causaron un grave efecto, debido a las reacciones observadas en los

ratones.

La evaluación de la citotoxicidad (Tablas 8.4), la cual se llevó a cabo contando los eritrocitos

policromáticos en 2000 eritrocitos totales (policromáticos y normocrómicos), reveló que ninguno

de los 4 compuestos es mielotóxico a dosis cercanas a la DL50, ya que no hubo variación entre el

número de Eritrocitos Policromáticos y el Número de Eritrocitos Normocrómicos en relación a los

días transcurridos después de la administración del compuesto (tiempo 0 con los demás tiempos

analizados) que por falta de datos no pudo ser tratado estadísticamente. Sin embargo, tomando en

cuenta que murieron varios ratones es lógico pensar que se presentaron efectos de citotoxicidad en

otros tipos celulares, diferente a la estirpe sanguínea, que llevaron al deceso de los animales, pero

que no se pusieron de manifiesto con esta evaluación.

Se ha obtenido ya la patente de éstos compuestos, cuyo número es MX2005PA1263520051123.

Aún falta realizarles estudios preclínicos como la toxicidad subaguda y la farmacocinética; sin

embargo, como han demostrado ser una buena opción para el tratamiento de ciertas enfermedades

cardiovasculares, algunas empresas farmacéuticas están interesadas en ellos y posiblemente,

realicen dichos estudios preclínicos.

43

10. CONCLUSIONES

Se estudió la toxicidad aguda de los compuestos monotiomorfolínicos LQM318, LQM339 y

los compuestos monopiperidínicos LQM336 y LQM344; determinando la DL50 de cada

compuesto.

Mediante la prueba de Micronúcleos “in vivo”, se realizó la evaluación de la genotoxicidad

de los compuestos LQM318, LQM339, LQM336 y LQM344, encontrando que éstos

compuestos no son genotóxicos a dosis mayores a las terapéuticas.

Se determinó que ninguno de los compuestos LQM318, LQM339, LQM336 y LQM344 son

citotóxicos a dosis mayores a las terapéuticas a través del ensayo de Micronúcleos “in

vivo”.

Con base en el método de Lorke para determinar DL50, se puede afirmar que, de los

compuestos monopiperidínicos, el compuesto LQM344 es menos tóxico que el compuesto

LQM336.

De los compuestos monotiomorfolínicos, evaluados a través del método de Lorke para

determinar DL50, se obtuvo que el compuesto LQM318 resultó ser menos tóxico que el

compuesto LQM339, .

En general, de todos los compuestos analizados, los compuestos menos tóxicos fueron los

compuestos LQM344 (monopiperidínico) y el LQM318 (monotiomorfolínico) con una

DL50 de 471.16 mg/Kg y el compuesto más tóxico fue el LQM336 (monopiperidínico) con

una DL50 de 177.48 mg/Kg, todos ellos evaluados utilizando el método de Lorke para

determinar DL50.

El propósito principal de éste trabajo, el cual fue evaluar la genotoxicidad y determinar la DL50 de

los compuestos monotiomorfolínicos LQM318, LQM339 y los compuestos monopiperidínicos

LQM336, LQM344; se llevó a cabo satisfactoriamente, ya que se logró contribuir a la

caracterización toxicológica de tales compuestos.

44

11. GLOSARIO DE ABREVIATURAS

mmHg milímetros de mercurio.

CCT Canadian Cardiovascular Society.

ST Periodo entre la despolarización y repolarizaión del ventrículo izquierdo.

LQM Laboratorio de Química Medicinal.

DL50 Dosis Letal 50.

IAM Infarto agudo al Miocardio.

Ipm Impulsos por minuto.

CMT Concentración Mínima Tóxica.

CME Concentración Mínima Efectiva.

OECD Organization for Economic Co-operation and Development

mg/Kg miligramos por kilogramo de peso.

ADN ácido desoxirribonucléico.

ARN ácido ribonucléico.

ATP adenosin trifosfato.

EPC eritrocitos policromáticos.

EPCMN eritrocitos policromáticos micronucleados.

ENC eritrocitos normocrómicos.

FESC Facultad de Estudios Superiores Cuautitlán

T0 toma de muestra antes de la administración

T24 toma de muestra 24 horas después de la administración.



45

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