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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA PROYECTO DE TESIS ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA In Vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE LAS HOJAS DE Ruta graveolens (Ruda), MEDIANTE EL MÉTODO DE MACRODILUCIÓN FRENTE A Staphylococcus aureus y Escherichia coli. PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE QUÍMICO FARMACÉUTICO PRESENTADO POR LOS BACHILLERES: Maita Vásquez, Jessica Jeaneth Guerra Davila, Percy Jonathan ASESOR: Q.F. Luis D. Nonato Ramirez Dr. IQUITOS – PERÚ 2015
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE LA AMAZONÍA PERUANA
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
PROYECTO DE TESIS
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA In Vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
LAS HOJAS DE Ruta graveolens (Ruda), MEDIANTE EL MÉTODO DE
MACRODILUCIÓN FRENTE A Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
PARA OPTAR EL TÍTULO PROFESIONAL DE
QUÍMICO FARMACÉUTICO
PRESENTADO POR LOS BACHILLERES:
Maita Vásquez, Jessica Jeaneth
Guerra Davila, Percy Jonathan
ASESOR:
Q.F. Luis D. Nonato Ramirez Dr.
IQUITOS – PERÚ
2015
CONTENIDO
DEDICATORIA…………………………………………………………………… 1
AGRADECIMIENTO……………………………………………………………. 2
RESUMEN………………………………………………...…………………....... 3
ABSTRACT………………………………………………………………………. 4
INTRODUCCION……………………………………………………………....... 5
OBJETIVO………………………………………………...…………………....... 7
General……............................................................................................................ 7
Específicos……………………..………….………................................................ 7
CAPITULO I…………………………................................................................... 8
1.1. MARCO REFERENCIAL……………………………….............................. 09
1.1.1. Antecedentes…………………………………………………………….…. 09
1.2. MARCO TEORICO……………………………….…………….…..……… 11
1.2.1. Antecedentes históricos…………………….…………………..………..... 11
1.2.1.1. Origen………………………………………………………………….. 11
1.2.1.2. Descripción Botánica………………………………………………….… 11
1.2.1.3. Partes Usadas Medicinalmente………………………………………... 11
1.2.1.4. Descripción Taxonómica….………......................................………….… 12
1.2.1.5. Clasificación Taxonómica…………….....................…………….……… 12
1.2.1.6. Nombres Comunes………………………………………………--……... 12
1.2.1.7. Cultivo de Ruta graveolens (Ruda)…………………..………………. 12
1.2.1.7.1. Cosecha………………………………………………………………… 13
1.2.1.7.2. Post-Cosecha………………………………………………………… 13
1.2.1.8. Composición Fitoquímica y Propiedades Medicinales……………… 13
1.2.1.9. Propiedades que presenta la Ruda………………………………………. 15
1.2.1.10. Reacciones Adversas y Advertencias………………………………… 18
1.2.2. Características de las Cepas en Estudio…………………………………. 19
1.2.2.1. Staphylococcusaureus………………………………………………. 19
1.2.2.1.1. Taxonomía…………………………………………………………… 19
1.2.2.1.2. Características……………………………………………………... 19
1.2.2.1.3. Patogenia………………………………………………………….. 20
1.2.2.2. Escherichia coli………………………………………………….. 21
1.2.2.2.1. Taxonomía………………………………………………………… 21
1.2.2.2.2. Características…………………………………………………... 21
1.2.2.2.3. Patogenia………………………………………………………….. 22
1.2.3. Ensayos Antimicrobianos………………………………………………... 23
1.3. VARIABLES……………………………………………………………… 27
1.3.1. Variables…………………………………………………………………. 27
1.3.1.1. Independiente………………………………………………………….. 27
1.3.1.2. Dependiente……………………………………………………………. 27
1.3.2. Indicadores……………………………………………………..………….. 27
1.3.2.1. Independiente………………………………………………………….. 27
1.3.2.2. Dependiente……………………………………………………………. 27
1.3.3. Operaciones de las Variables…………………………………………….. 28
CAPITULO II………………………………………………………………….. 30
2.1. METODOLOGIA……………………………………………………………. 31
2.1.1. Tipo de Investigación………………………………………………….…... 31
2.1.2. Población y Muestra………………………...…………………………..…. 32
2.1.2.1. Población Vegetal………………………………………….……..……. 32
2.1.2.2. Muestra Vegetal…………………………………………….………..… 32
2.1.2.3. Criterios de Inclusión………………...……………………...….… 32
2.1.2.4. Criterios de Exclusión……………..…………………………………… 32
2.1.2.5. Población Microbiológica………………………………………..…….. 32
2.1.2.6. Muestra Microbiológica…………………………………………..……. 32
2.1.2.7. Criterios de Inclusión…………………………………………………... 32
2.1.2.8. Criterios de Exclusión……………...………………………..………… 33
2.2. MATERIAL Y EQUIPOS…...…………………………………………. 33
2.2.1. Material de Vidrio……………………………………………………... 33
2.2.2. Material de Metal………………………………………………………… 33
2.2.3. Otros Materiales………………………………………………………….. 33
2.2.4. Equipos…………………………………………………………………… 34
2.2.5. Reactivos………………………………………………………………. 34
2.2.6. Medio de Cultivo……………………………….………………………….. 35
2.3. CRITERIOS DE BIOSEGURIDAD…………………..………………..… 35
2.4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL……………...………………..... 36
2.4.1. Material Vegetal……..……………………………...................................... 36
2.4.2. Recolección dela Muestra Vegetal…………………………………..……. 36
2.4.3. Identificación de la Muestra Vegetal……………………..………..….. 36
2.4.4. Secado y Molienda de la Muestra Vegetal…………...……………….. 36
2.4.5. Obtención del Extracto Etanolico………………………………………... 37
2.4.6. Tamisaje Fitoquimico……………………………………………………. 37
2.4.7. Prueba de Susceptibilidad y Acción Antibacteriana de los extractos por el
método de Macrodilución………………………………………….…………… 39
2.4.7.1. Concentración Mínima Inhibitoria (Método de Macrodilución)………. 40
2.4.7.2. Colocación del Inoculo en los Tubos………………………………..…. 40
2.4.7.3. Incubación…………………………………………………………...…... 40
2.4.7.4. Procedimiento y Lectura e Interpretación de la CIM……………………. 40
2.4.8. Procedimiento de los Ensayos de la Actividad Antibacteriana………... 42
2.4.8.1. Cepas Empleadas………………………………………………….…… 42
2.4.8.2. Preparación de la Solución Madre……………………………………. 42
2.4.8.3. Preparación del Inoculo……………………………………………….……..
42 2.4.8.4. Preparación de la suspensión bacteriana y su aplicación en la prueba de
macrodilución………………………………………………………………..….... 42
2.4.8.5. Macrodilucion en Caldos (tubos)………………………...…………….. 43
2.4.8.6. Ensayo de la Actividad Antibacteriana………………………………….. 43
2.4.8.7. Preparación y Control de Extractos…………………………………..... 43
2.4.8.8. Preparación del estándar (0.5 Mc Farland) para el inóculo….................... 47
2.5. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE DATOS……….……................... 48
CAPITULO III……………………………………………………….……...…… 49
3.1.RESULTADOS……………………………………………………………. 50
3.1.1.Tamizaje Fitoquímico del Extracto Etanólico..………...…….…………... 50
3.1.2. Ensayo de concentración inhibitoria mínima (CIM)……………….….... 51
3.2. DISCUSIÓN………………………………..…...………….…………..……. 55
3.3.CONCLUSIÓN…………………………………...……………………….…. 57
3.4.RECOMENDACIÓN……….……………………………….……...………. 58
3.5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS……………………….……………… 59
3.6. ANEXO……….……………………………………………..………………. 63
INDICE DE FIGURAS
Figura 04: Procedimiento del Control del Método de Macrodilución en Caldo… 44
Figura 05: Procedimiento del Control del Método de Macrodilución en Caldo… 47
INDICE DE TABLA
Tabla 01: Resultados obtenidos del Tamizaje Fitoquímico del extracto
Etanolico de las hojas de Ruta graveolens
“Ruda”……………………….…….………………………………………...….. 50 Tabla 02: Clasificación de la actividad antibacteriana según la concentración
inhibitoria mínima (CIM)……………………………………...…………….....… 51
Tabla 03: Resultados obtenidos en el ensayo de concentración inhibitoria
mínima del extracto Etanólico de Ruta graveolens “Ruda”……...……...……. 51
INDICE DE IMAGENES
Imagen N° 01: Concentración inhibitoria mínima para Escherichia coli.............. 52
Imagen N° 02: Concentración inhibitoria mínima para Staphylococcus aureus... 52
INDICE DE GRAFICOS
Gráfico 01: Gráfico de barras del CIM encontrado del extracto Etanólico de
Ruta graveolens “Ruda” frente a las cepas en estudio....……………..……...... 53
Gráfico 02: Gráfico de barras del Control Positivo con Gentamicina frente a
las bacterias en estudio de la concentración inhibitoria mínima del extracto
Etanólico de Ruta graveolens “Ruda”………………...……...……………….... 54
INDICE DE ANEXO
ANEXO N° 01
Preparación del Agar Müeller Hinton……..……………..……………..……..…. 63
ANEXO N° 02
Recuperación de Cultivos Conservados…………………………….……...….…. 64
ANEXO N° 03
Preparación del Estándar (0,5 mc. Farland) para el Inóculo……..….………. 65
ANEXO N° 04
Esquema: Obtención del extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens…... 66
ANEXO N° 05
Figura: Procedimiento para la preparación y el control de calidad de la turbidez
estándar de Mc. Farland………………………………………....…………….…. 67
ANEXO N° 06
Cuadro: Distribución de los grupos de trabajo por el método de
macrodilución………………………………………………………………….…. 68
ANEXO N° 07
Cuadro: Distribución del grupo control positivo por el método de
macrodilución…………………………………………………………………….. 69
ANEXO N° 08
Datos de Pasaporte de Colección de Especies de las Plantas Medicinales en
Estudio………………………………………………………………..……………70
ANEXO N° 09
Constancia de la Muestra Botánica………………………..……..……….…….... 71
ANEXO N° 10
Imagen Satelital de la Ubicación de la Comunidad de Nina Rumi……............…. 72
ANEXO N° 11
Fotos…………………………………………...……..………..…….……….…... 73
1
DEDICATORIA
“A Dios del cielo, por guiarme y
protegerme en mi camino”.
Tu señor Dios que desde tu reino
nos cuidas y proteges, ilumíname
por un buen camino; Porque en
los días de oscuridad me diste luz
y fuerza para continuar,
brindándome salud para lograr y
seguir adelante mis objetivos.
A mi madre, luz marina Vásquez,
por apoyarme en todo lo está en
su alcance, por saber escucharme
y aconsejarme en todo el trayecto
de mi formación.
A mi familia por estar presente
en todo instante en mi vida, por
compartir alegrías y percances.
Jessica Jeaneth Maita Vásquez.
A Dios y mis queridos padres
Berta y Oswaldo por guiarme por el buen
camino y apoyarme incondicionalmente durante todos estos años de mi vida.
A mis hermanos
Julieta, Miguel, Oswaldo, Carlos y Ramón
por ayudarme con sus consejos
para Superarme en la vida.
Percy Jonathan Guerra Davila.
2
AGRADECIMIENTOS
En el presente trabajo queremos agradecer a Dios por
bendecirnos para llegar a cumplir una de nuestras metas, ser
profesionales. Gracias Señor Dios por brindarnos salud y
conocimiento
Agradecer y hacer mención a las personas que nos apoyaron en
el proceso de nuestra tesis y a los estuvieron con nosotros
apoyándonos, brindándonos consejos, enseñanzas, conocimientos,
etc.
A nuestro asesor de tesis el Dr. Luis Nonato Ramírez por su
esfuerzo y dedicación quien con sus conocimientos, su
experiencia, su paciencia y motivación nos apoyado en el
desarrollo del presente proyecto de investigación.
También agradecemos a nuestros padres por darme la vida y
apoyarme en todo momento y de toda la forma posible,
comprendiéndonos y teniéndonos paciencia; porque con sus
esfuerzos hemos podido culminar este Proyecto de Investigación.
De igual manera agradezco a nuestros hermanos por sus consejos
y palabras de aliento que me dieron para superar los muchos
obstáculos que hay en la vida.
Por último agradecemos a todos nuestros amigos que nos
apoyaron de manera incondicional en cada etapa de nuestra
vida.
“la educación es el mayor motor del desarrollo personal”
....Muchas gracias!!
3
----------------------------------------------------------------------------------------------------- “ACTIVIDAD ANTIBACTERIANAIn Vitro DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE
LAS HOJAS DE Ruta graveolens (Ruda), MEDIANTE EL MÉTODO DE
MACRODILUCIÓN FRENTE A Staphylococcus aureus y Escherichia coli.”
Bachiller: Jessica Jeaneth, Maita Vasquez. Percy Jonathan, Guerra Davila.
RESUMEN
El objetivo de este estudio fue determinar la actividad antibacteriana in vitro del
extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda”, mediante el método de
macrodilución frente a Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Las hojas de
Ruta graveolens “Ruda” fueron recolectadas en el centro poblado de la Comunidad
de Nina Rumi (Carretera Zungarococha) estáubicado en la margen derecha del Rio
Nanay a 25 kilómetros de la ciudad de Iquitos. Las bacterias utilizadas,
Staphylococcusaureus ATCC 25923; Escherichia coli ATCC 25922, fueron
proporcionados por el departamento de Microbiología de la Facultad de Industrias
Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana. Las dosis del
extracto fueron 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 mg/ml, se utilizó como control positivo
Gentamicina 160 mg/2ml. El estudio se realizó en el Laboratorio de Microbiología
de la Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional de la
Amazonía Peruana (UNAP). Del tamizaje fitoquímico realizado al extracto
etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda”, se determinó la presencia de
alcaloides, taninos, fenoles, flavonoides, saponinas, cumarinas, esteroides,
triterpenos.
Con los resultados obtenidos se demostró que tiene buena actividad antibacteriana
del extracto etanólico frente a las dos cepas estudiadas, obteniendo la concentración
de 0.5 mg/ml para Staphylococcus aureus y 0.25 mg/ml para Escherichia coli.
Palabras claves: Hojas de Ruta graveolens, método de macrodilución, actividad
antibacteriana, concentración mínima inhibitoria.
5 4
----------------------------------------------------------------------------------------------------- "In Vitro ANTIBACTERIAL ACTIVITY OF ETHANOL EXTRACT FROM
LEAVES OF Ruta graveolens(Ruda), THROUGH THE FRONT
MACRODILUTION METHOD Staphylococcus aureus AND Escherichia coli."
Bachelor: Jessica Jeaneth, Maita Vasquez, Percy Jonathan, Guerra Davila.
ABSTRACT
The aim of this study was to determine the in vitro antibacterial activity of ethanol
extract of the leaves of Ruta graveolens (Ruda), by macrodilution method against
Staphylococcus aureus and Escherichia coli. The leaves of Ruta graveolens
"Ruda" were collected from the population center of the Commonwealth of Nina
Rumi (Highway Zungarococha) is located on the right bank of the Rio Nanay 25
kilometers from the city of Iquitos. The bacteria used, Staphylococcus aureus
ATCC 25923; Escherichia coli ATCC 25922, were provided by the Department of
Microbiology, Faculty of Food Industry National University of the Peruvian
Amazon. Extract doses were 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5, 0.25 mg/ml, was used as
positive control gentamicin 160 mg/2ml. The study was conducted at the
Laboratory of Microbiology, Faculty of Food Industry of the National University of
the Peruvian Amazon (UNAP). Phytochemical screening of the ethanol extract
made from the leaves of Ruta graveolens (Ruda), the presence of alkaloids,
tannins, phenols, flavonoids, saponins, coumarins, steroids, triterpenes, are
determined.
With the results obtained it was demonstrated that has good antibacterial activity of
ethanol extract against the two strains tested, obtaining the concentration of 0.5
mg/ml for Staphylococcus aureus and 0.25 mg/ml for Escherichia coli.
Keywords: Ruta graveolens leaves, macrodilutión method, antibacterial activity,
minimum inhibitory concentration
5
INTRODUCCION.
La especie Ruta graveolens “Ruda”, posee innumerables estudios fármaco-
toxicológicos a nivel internacional, pero aún las bases de datos y sistemas
informativos están poco documentados al respecto. Con las nuevas investigaciones
que existen sobre esta planta, se crean grandes posibilidades de obtener
fitofármacos con acción antioxidante, antiinflamatoria, anticancerígena y
antimicrobiana, entre otras, con menor potencial de efectos adversos1.
El aumento de la disponibilidad de agentes antibacterianos para el tratamiento de
las enfermedades infecciosas en hospitales y en la comunidad, ha producido la
aparición de resistencia de los microorganismos a los antibacterianos, siendo un
problema mundial de salud pública generado en los últimos 50 años, debido
principalmente al uso inapropiado de los antibióticos; porque con esto se favorece
la multiplicación de microorganismos resistentes y, al mismo tiempo, la supresión
de los susceptibles, haciendo más difícil el tratamiento de las infecciones que
causan. Las consecuencias negativas se ven tanto en términos de salud como en el
costo económico.1, 2
La incidencia anual de agentes antibacterianos es de 28,4 casos por cada 100.000
ingresos hospitalarios, la tasa de mortalidad de la infección invasiva
Staphylococcus aureus es alta, variando entre el 19 y el 34%.3Escherichia coli es
el agente causal más frecuente de las infecciones del tracto urinario extra
hospitalarias con 63.5%, y el más frecuente en el medio hospitalario con 16.6%.3
Los microorganismos entéricos como Escherichia coli son causantes de una gran
parte de morbilidad y mortalidad en los países en vías de desarrollo, como es el
caso de nuestro país y más de nuestra región siendo afectada por estas clases de
bacterias entéricas. Otro microorganismo como Staphylococcus aureus es el
responsable del 50% de las infecciones intrahospitalarias registradas por el Instituto
Nacional de Salud (INS). 4
En la actualidad las enfermedades infecciosas son una de las principales causas de
muerte en cualquier parte del mundo. Por un lado en los países en vías de desarrollo
6
difícilmente están disponibles los antibióticos de segunda línea, utilizados contra
bacterias resistentes y por otro lado en los países desarrollados la emergencia de
infecciones por bacterias multirresistentes tanto adquiridas intrahospitalariamente
como en la comunidad ha sobrepasado a la aparición de nuevos antibióticos.5
A nivel mundial el 70% de las bacterias responsables de las infecciones
nosocomiales son resistentes al menos a uno de los antibióticos más comúnmente
utilizados para tratarlas. En el 2005 se reportó en los Estados Unidos a nivel de los
centros hospitalarios, una incidencia de resistencia bacteriana del 3% por parte de
enterobacterias productoras de beta-lactamasa de espectro extendido (BLEEs),
como Escherichia coli y en comparación con Latinoamérica de un 9% - 62%. En
Europa las bacterias Meticilino-resistentes como Staphylococcus aureus mostraron
un 42% de resistencia en pacientes de la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI), y
27% en pacientes de otras áreas de hospitalización, en comparación con los reportes
de resistencia bacteriana en Latinoamérica del 35% y Estados unidos 25%-51%.5
En el Perú por medio de un estudio realizado a pacientes ambulatorios del Hospital
Daniel Alcides Carrión con infección del tracto urinario adquiridas en la
comunidad, se reportó que Staphylococcus aureus representa un 100% de
resistencia a penicilinas. En el mismo estudio se reportaron, resistencias de 48%,
58% y 31% para Oxacilina, Eritromicina, Ciprofloxacino respectivamente. En la
ciudad de Iquitos se reportó 11.8% y 33.3% para fármacos Cotrimoxazol y
Tetraciclina respectivamente, fármacos como Cloranfenicol y Gentamicina aún
pueden ser considerados para su empleo por la menor resistencia encontrada con
33%. 6
En el Perú, como en otros países en vías de desarrollo, las plantas medicinales
representan aún la principal herramienta terapéutica en medicina tradicional. La
flora peruana ofrece grandes posibilidades para el descubrimiento de nuevos
compuestos con actividad antifúngica. Se calcula que el Perú posee unas 25 000
especies de plantas conocidas, de las cuales 5354 (31,3%) son especies nativas. 7
7
OBJETIVOS
GENERAL:
Determinar la actividad antibacteriana in vitro del extracto etanólico de las hojas
de Ruta graveolens “Ruda”, mediante el método de macrodilución frente a
Staphylococcus aureusyEscherichia coli.
ESPECIFICOS:
Obtener el extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda”.
Realizar el tamizaje fitoquímico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda”.
Evaluarla Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) del extracto etanólico de las
hojas de Ruta graveolens “Ruda”frente Staphylococcus aureus mediante el
método de macrodilución.
Evaluar la Concentración MínimaInhibitoria (CMI) del extracto etanólico de las
hojas de Ruta graveolens “Ruda” frente Escherichia coli, mediante el método
de macrodilución.
Comparar el efecto antibacteriano de las hojas deRuta graveolens “Ruda” frente
Staphylococcus aureus y Escherichia coli.
8
CAPITULO I
9
1.1. MARCO REFERENCIAL
1.1.1. ANTECEDENTES:
Bayoud (2007), encontró que el extracto etanólico de la hoja de Ruta graveolens a
una concentración de 10mg/ml, presentó actividad antimicrobiana contra
Pseudomona aeruginosa con un resultado de un halo de 9mm.8
Lujan col.2007, demostró la actividad antimicrobiana de los extractos etanólicos de
Ruda (Ruta graveolens),Tomillo (Thymus vulgaris), Perejil (Petroselinum
sativums),contra cepas hospitalarias con resistencia múltiple a Staphylococcus
aureus, los extracto se maceraron en alcohol de 70 grados, las pruebas de
susceptibilidad lo realizaron de acuerdo con las recomendaciones de la NCCLS,
también detectaron la presencia de omega 3 y 6, donde concluyen que los
responsables de la actividad bactericida son timol, carvacrol y eugenol (ejemplo).9
Alonso J., Helsinki (2004), demostró que extractos alcohólicos de Ruta graveolens
presentaron efecto inhibidor del crecimiento in vitro de los hongos
Epidermophyton floccosum, Trichophyton rubrum y T. mentagrophytes; y efecto
bacteriostático frente a Micrococcus pyogenes var. aureusy Escherichia coli.
Sobre Pseudomonas aeruginosa demostraron efectos inhibitorios a dosis de 25
mg/mL. El mismo resultado observaron sobre Bacillus subtilis y Staphylococcus
aureus en dosis de 12,5 mg/mL. También demostraron que el extracto acuoso de
Ruta graveolens tiene actividad inhibitoria in vitro frente a Erwinia amylovora, E.
carotovora, Pseudomonas syringae y Xanthomonas campestris. Asimismo,
revelaron propiedades sobre Culex quinquefasciatus y repelentes frente a Popillia
japónica.10
Naveda G. (2010), Demostró que el extracto etanolico de Ruta graveolens (Ruda),
presentó concentración mínima inhibitoria (CMI) de 22,85 mg/ml. Staphylococcus
aureusfue la cepa más sensible, seguida por Pseudomona aeruginosa.11
Los extractos de Thymus vulgaris, Ruta graveolens y Larrea tridentataen hexano,
acetato de etilo y alcohol etílico mostraron entre un 60 a 65% de actividad contra
Streptococcus agalactiae y Staphylococcus aureus, en comparación a la
10
Amoxicilina y Gentamicina. La CMI de los extractos crudos mostraron entre uno a
dos logaritmos por debajo de las CMI de los antibióticos. 11
K. Meepagala K. et.al (2005), K. SCHRADER, D. WEDGE, A. IVANOVA,I.
KOSTOVA,J. VILLEGAS, J. MORTON Evaluaron que los aceites ensayados de
Ruta graveolens presentaron un amplio rango de actividad tanto para bacterias
Gram positivas (S. aureus y E. faecalis) como Gram negativas (E. coli y K.
pneumonie). Analizaron los datos obtenidos en este ensayo y pudieron observar
que la muestra IMinhibió un total de cuatro bacterias, exhibiendo una CIM de 100
μg/ml para S. aureus(7mm) y 200 μg/mL para E. faecalis(8mm), E. coli(9mm) y K
pneumonie (7 mm); mientras que la ME mostró actividad contra S. aureus (8mm),
E. coli (9 mm) y K. pneumonie (8 mm) a una CIM de 200 μg/ml para cada
bacteria.3
Pokorny et al. (2005). Afirmó que los compuestos fenólicos identificados en varias
especies vegetales, poseen actividad antibacteriana frente a un cierto número de
bacterias Gram positivas y Gram negativas, además inhiben el crecimiento de
microorganismos psicrotofros, coliformes fecales. En un intento para estimular el
uso de antimicrobianos de origen natural, muchos autores han investigado la
actividad antibacteriana de los compuestos fenólicos en varias especies vegetales,
de las cuales Pokorny et al., confirmo y demostró que poseen actividad
antibacteriana.12
Pokorny et al. (2005), demostró que algunos flavonoides presentan actividad
antimicrobiana. Así, las isoflavanonas, isoflavonas, dehidroflavonoles, chalconas,
dehidrochalconas y flavanos son compuestos flavonoides que presentan actividad
antimicrobiana contra patógenos en plantas. 12
11
1.2. MARCO TEÓRICO:
1.2.1. ANTECEDENTES HISTÓRICOS.
1.2.1.1. Origen:
Ruta graveolens “Ruda”, es originaria del sur de Europa y del Mediterráneo
Oriental(África del norte y sur de Europa)y del Asia menor. Actualmente está
naturalizada y cultivada en diversas partes del mundo. En América se la encuentra
en Canadá, Estados Unidos, México, Bolivia, Brasil, Colombia, Ecuador, Perú y
Chile. 13
1.2.1.2. Descripción botánica
La Ruda es una planta resistente, perenne y arbustiva que mide desde 50 hasta 100
cm. de altura. Esta provista de una raíz leñosa, fasciculada y de tallos cilíndricos,
erguidos, que engrosan año tras año, de estructura leñosa en la base y con ramas
superiores herbáceas.14
Las hojas son alternas, de color verde azulado, bi o tri pinnadas, los segmentos
laterales son alargados y el terminal ovalado. Están provistas de glándulas que
despiden un olor fuerte, en ocasiones desagradable, pero característico de la
especie.15, 16
Las flores son de color amarillo o amarillo verdoso, miden de 8 a10 mm de
diámetro y están agrupados en ramilletes terminales. La flor central tiene 5 pétalos
y 5 sépalos, mientras que las restantes tienen 4 pétalos y 4 sépalos. Los pétalos son
cóncavos y dentados. 15, 16
El fruto es una capsula redondeada que contiene semillas de color negro con forma
arriñonada.15
1.2.1.3.Partes Usadas Medicinalmente:
Hojas, recogidas antes de la floración, y partes aéreas, ocasionalmente se emplean
las flores (cuando comienzan a abrirse).17
12
1.2.1.4.Descripción Taxonómica:
La Ruda pertenece a la Familia de las Rutáceas que comprende 161 géneros y más
de 1600 especies cosmopolitas que van desde pequeñas “matas” hasta arbustos y
árboles. El género Ruta incluya siete especies de arbustos aromáticos. 17, 4
Esta familia agrupa gran cantidad de plantas útiles en medicina, puesto que son
ricas en aceites esenciales, alcaloides, glucósidos.17, 4
1.2.1.5.Clasificación Taxonómica:
Reino : Plantae
Filo : Magnoliophyta
Clase : Magnoliopsida
Subclase : Rosidae
Orden : Sapindales
Familia : Rutaceae
Subfamilia: Rutoideae
Género : Ruta
Especie : Ruta graveolens13
1.2.1.6.Nombres comunes
Ruda, ruda hortense (Español), arruda (Portugués), rue herb of grace o Common
rue (Inglés), rue o péganion o herbe de grâce (Francés), ruta o rua o aruga amara
(Italiano), raute (Alemán).13
1.2.1.7. Cultivo de Ruta graveolens “Ruda”
Se cultiva en suelos drenados, secos, gravosos o pedregosos, ligeros y calizos o
silíceos con preferencia por los últimos. La Ruda es una planta un poco exigente, en
cuanto a suelos, puesto que crece espontáneamente cuando estos son pobres y
secos.13
13
1.2.1.7.1. Cosecha
La Ruda florece entre los meses de mayo y agosto. La etapa correcta de recolección
depende de la parte de la planta que se requiera usar. Si se necesitan hojas, tallos o
flores se debe recolectar al principio de la floración, en estado de botón, puesto que
es en este periodo cuando más principios activos poseen. Si se necesitan solo hojas
y tallos, es mejor hacer la recolección antes de la floración, dado que en esta etapa
los principios activos están concentrados en la savia. La cosecha se realiza con un
corte de 12 a 15 cm. del suelo. 11
1.2.1.7.2. Post-Cosecha de las Hojas.:
a. Limpieza y esterilización:
Primero se someten a una clasificación por tamaño, seleccionando los de mejor
desarrollo y uniformidad, eliminando las hojas en mal estado. Posteriormente se
lava para eliminar la tierra, se esteriliza con agua hervida durante unos 15
minutos.14
b. Desecado:
Las hojas son extendidas para facilitar el secado, que puede ser natural (varios días
al sol) o mecánico. 14
c. Molienda:
Es un proceso industrial. Se utilizan baterías de molinos en serie hasta obtener un
polvo impalpable.16
1.2.1.8. Composición Fitoquímica y Propiedades Medicinales.
a. Composición fitoquímica
Aceite esencial (0,1-0,6%): Compuesto por ésteres (acetatos de 2-nonilo y 2-
undeiclo, etc); metilnonil, metilheptilcetona; monoterpenos (a y b-pineno,
limoneno), cetonas alifáticas (metilnonilcetona en una proporción del 90%),
alcoholes (2-undecanol), cumarinas y furanocumarinas (0,15-0,70%) destacando:
14
bergapteno, psoraleno, dafnoretina, isoimperatorina, escopoletina, umbeliferona,
pangelina, etc. 18,19
Alcaloides furoquinólicos: Arborinina, arborotina, rutamina, graveolina,
graveolinina, 6-metoxidictamina, furoquinolina, t-fagarina, gammafagarina,
kokusaginina, skimianina, cocusaginina, rutacridona, metilacridona, dictamnina,
isogravacridonclorina (furanocridona).18, 19
Flavonoides: Rutina (1-2%), quercetina. 18, 19
Otros: Resina, goma, ácido ascórbico, ácido málico, taninos, lignanos (raíz),
sustancias amargas, glucósidos solubles en agua (sinapoil-6-feruloilsucrosa,
metilcnidiósido, metilpicraquasiósido A, 3¢, 6¢-disinapoilsucrosa, cnidiósido A,
picraquasiósido A, etc.), naftoherniarina, suberona e isorutarina, xantoxina,
rutamarina e isopimpenelina.18, 19
b. Propiedades Medicinales:
A la Ruda se le atribuyen propiedades antiespasmódicas, sudoríficas, rubefacientes,
antiparasitarias, hipotensoras, sedantes, alelopáticas, citotóxicas, antisépticas,
emenagogas, venotónicas y vasoprotectoras.16, 18
En la Amazonía brasileña se le reconocen propiedades sedantes, antiasmáticas y
analgésicas. 18, 19
c. Usos
Esta planta es utilizada en casos de dismenorreas (sólo en dosis altas es abortiva),
como estimulante uterino, la Ruda es usada por los homeópatas para reducir los
síntomas menopaúsicos causados por una disminución de la secreción estrogénica
del ovario envejecido. En casos de anginas y tonsilitis, pleuresía, complicaciones
respiratorias, calambres.18La esencia es utilizada como antiespasmódico, digestiva,
anticonvulsivante, antiparasitario, trastornos circulatorios, arteriosclerosis:
neuralgias, nerviosismo, histeria; debilidad visual, inflamaciones, trastornos de la
diuresis, gota.18
15
En patologías externas, la Ruda se utiliza para el vitiligio, la sarna, el reumatismo,
los golpes, la ciática, el dolor de oído. También, aplicada en la cabeza para evitar la
caída del cabello, antipirético y aplicada en el pecho es eficaz contra la bronquitis
crónica.14, 17
Sin embargo, varios autores concuerdan que es una planta, cuya dosis debe ser
aplicada con sumo cuidado, puesto que si supera los valores permitidos, puede
resultar toxica y provocar dolor de estómago, de cabeza, vómito, diarrea,
hemorragias, aborto y lesiones en la piel al contacto con la planta. Por ello, su uso
está contraindicado en casos de dermatosis, embarazo, prostatitis y gastroenteritis.17
d. Administración Tópica
El aceite se usa externamente en fricciones sobre zonas dolorosas: luxaciones;
como también en procesos dermatológicos: eczema, psoriasis (recordar que las
furocumarinas son fotosensibilizantes), lesiones óseas y antiinflamatorio.
Infusiones o champús son utilizados contra la pediculosis y sarna.18, 19
1.2.1.9.Propiedades que Presenta la Ruda.
A. Bloqueador de canales de potasio
A nivel neurológico, algunos componentes de la Ruta graveolens han demostrado
ejercer una acción bloqueadora de los canales de potasio, lo que abre las puertas de
una eventual investigación en el tratamiento de la esclerosis múltiple. Sobre el atrio
aislado de ratas, la Ruta graveolens ha demostrado efectos inotrópico y
cronotrópico positivos.18
B. Actividad venotónica:
Es inherente a su contenido en rutina, cuyas propiedades benéficas en la pared
venosa son compartidas con la troxerrutina o tri-hidroxi-etilrutósido (un derivado
de la g-benzopirona). La planta de Ruta graveolens no suele emplearse
frecuentemente como flebotónico, pero su alto contenido en rutina hace que
merezca hablarse de ella. Este flavonoide ejerce acciones vasoprotectoras al actuar
sobre la resistencia y permeabilidad capilar y que es conocido como efecto
16
vitamínico P. La rutina en conjunto con troxerrutina han mostrado ser buenos
agentes flebotónicos, aunque menos potentes que la escina.10
Dicho reforzamiento venotónico evita la liberación de enzimas tóxicas liberadas por
los lisosomas de la célula muscular de la pared venosa durante situaciones de
anoxia e inflamación tisular. Por otra parte disminuyen la permeabilidad de los
capilares, aumentando su resistencia a través de una acción a-adrenérgica. Esta
acción es potenciada por la escina. También protegen el sustrato extracelular,
evitando la degradación de los proteoglicanos. Además permite distribuir correcta y
adecuadamente el colágeno, de ahí sus nuevas aplicaciones dentro del campo de la
Mesoterapia. Las altas dosis de troxerrutina (3 gr), equivalentes a 400 mg de
benzopirona, han resultado útiles en la reabsorción de edemas linfáticos. Se destaca
la troxerrutina pues mejora la microcirculación en todas las afecciones vasculares
con compromiso distal, como por ejemplo la diabetes, favoreciendo el paso de los
eritrocitos a nivel capilar, mejorando así la oxigenación tisular.10,18
C. Antiinflamatorio, antihistamínica y antiespasmódica
La arborina presenta actividad antihistamínica, antiespasmódica y antiinflamatoria.
En ratas, el extracto de Ruta graveolens demostró efecto antinociceptivo, de
manera dosis-dependiente.10,18
Contiene ácido octadecatrienoico 9,12,15 metil éster (ácido linoleico) conocido
como omega 6 y del ácido octadecadienoico 9,12 metil éster (ácido α linolenico)
conocido como omega 3, ambos compuestos son ampliamente conocidos por sus
propiedades como antioxidantes, es decir tienen una amplia capacidad para atrapar
radicales libres causantes del estrés oxidativo lo cual les atribuye un efecto
beneficioso en la prevención de padecimiento tales como enfermedades
cardiovasculares, circulatorias, cancerígenas y neurológicas, también poseen
actividades antiinflamatorias, antialérgicas, antitrombóticas, antimicrobianas y
antineoplásicas.19
D. Psoriasis
Además propiedades fototóxicas de furocumarinas, bergapteno y xantotoxina son
útiles en el tratamiento de la psoriasis. Es por ello que la esencia de Ruta
graveolens puede causar dermatitis por contacto si se usa frecuentemente.15
17
E. Efecto sobre la movilidad de los espermatozoides
Un extracto acuoso liofilizado de Ruda (Ruta graveolens) ha mostrado un efecto
inhibidor, in vitro, sobre la movilidad de espermatozoides humanos.Tras el
tratamiento de muestras de semen humano, obtenidas de una Clínica de Fertilidad,
se observó un efecto concentración-dependiente e inmediato de inmovilización en
los espermatozoides. A la concentración de 10 mg/ml este efecto se producía en el
100% de los espermatozoides (106 por muestra de semen). Además, éstos
permanecían vivos y tras ser lavados recuperaban la motilidad. Los autores discuten
el posible mecanismo de acción por un efecto bloqueante de los canales de potasio,
relacionados con la movilidad de esperma, y que podría estar relacionado con la
presencia de cumarina en el extracto.20
F. Anticonceptiva.
Estudios previos realizados al extracto acuoso de Ruta graveolensreportaron
actividad anticonceptiva observándose que interfiere en el sistema reproductivo,
alterando el nivel hormonal y la morfología de los ovarios en ratas hembras
jóvenes.21
En relación a la composición química se han reportado alcaloides del tipo acridinas
y quinolinas; flavonoides, cumarinas, fitotoxinas y terpenos; algunos de estos
compuestos se les han atribuido propiedades citotóxicas y anticoagulantes.22, 23
G. Antifungico
Diferentes extractos de Ruta graveolens demostraron actividad inhibitoria in vitro
sobre Candida albicans la cual fue obtenida de pacientes durante el curso de
vaginitis aguda. Las fracciones cumarínicas de la Ruta graveolens exhibieron
actividad inhibitoria frente a Rhizoctonia solani y Heterobasidium annosum. En
diluciones homeopáticas de las hojas de Ruta graveolens junto a fosfato cálcico en
casos de cisticercosis intracraneana, demostraron beneficios en la administración,
observándose mejorías en el 69,4% de los casos, con una excelente tolerancia.10, 18
H. Actividad Inmunomoduladora - Antitumoral:
Determinadas cumarinas no sólo ejercen acciones anticoagulantes (tal es el caso del
dicumarol) sino también inmunomoduladoras, comprobado a través de la absorción
de luz ultravioleta. Esta fotoactivación hace que dichas sustancias (inertes antes de
18
la irradiación), se fijen firmemente al ADN, alterando así la división celular que
realizan las células tumorales. De esta manera, el 8-metoxipsoraleno expuesto a
radiaciones de determinadas longitudes de onda, ha demostrado ser una sustancia
fotoactiva útil en el abordaje del linfoma cutáneo de células T, conocido como
Síndrome de Sezary y cierto tipo de leucemias. Trabajos previos también señalaban
a la rutina con la capacidad de generar un efecto inhibitorio en la formación de
tumores en piel de ratones tras inducción con benzopireno. Finalmente, el extracto
de 6 éter-petrólico de Ruda.10
1.2.1.10. Reacciones adversas y advertencias.
a. Reacciones adversas:
En humanos, las furanocumarins originan eritemas, vesicación e hiperpigmentación
sobre piel sometida a los rayos UVA (fotodermatitis) o radiación actínica, e incluso
dermatitis de contacto en cultivos de jardín.15, 16,10
La esencia de Ruta graveolens puede causar dermatitis por contacto si se usa
frecuentemente.16,10
La dosis terapéutica puede causar conducta melancólica, trastornos del sueño,
cansancio, desvanecimiento, vértigo y espasmos, mientras que el jugo de las hojas
puede provocar irritación gástrica e intestinal, desmayos, somnolencia, hipotensión,
aborto, hinchazón de la lengua y piel húmeda, por lo que su administración debiera
descartarse.16, 10
La hierba contiene furanocumarinas las cuales tienen acciones fototóxicas y
mutagénicas.10
En un ensayo clínico realizado en el A. K. Tibbia College para el tratamiento de
vitíligo, en donde a los pacientes se les administró 2-3 mg de Ruta graveolens en
forma oral y tópica; se observaron en 21 pacientes los siguientes efectos adversos:
epistaxis (12 pacientes), náuseas/vómitos (8 pacientes), y hematuria (1 paciente).19
b. Advertencias
Debido al escaso margen entre dosis terapéutica y dosis tóxica, no sería
recomendable su administración oral.18,20
19
Nunca usar internamente en embarazo o lactancia porque sus principios activos
son embriotóxicos. No usar internamente en niños pequeños o jóvenes. No usar
en pacientes cardíacos o con daño renal.20
1.2.2. CARACTERÍSTICAS DE LAS CEPAS EN ESTUDIO:
1.2.2.1. Staphylococcus aureus
1.2.2.1.1. Taxonomía.
Dominio : Bacteria
Filo : Firmicutes.
Clase : Cocci
Orden : Bacillales
Familia : Staphylococaceae
Género : Staphylococcus
Rosenbach 1884
Especie : Staphylococcus aureus
1.2.2.1.2. Características
Staphylococcus aureus, conocido comúnmente como estafilococo áureo o dorado,
es una bacteria anaerobia Gram positivo productora de coagulasa y catalasa que se
encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo, estimándose que una de cada
tres personas se hallan colonizadas, pero no infectadas, por ella. Este
microorganismo fue descrito por vez primera en el año 1880, concretamente en la
ciudad escocesa de Aberdeen, por el cirujano Alexander Ogston, en el que drenaba
un absceso infectado.24
Staphylococcus aureus es la principal especie patógena de su género, causa común
de infecciones diversas, tanto de origen comunitario como hospitalario. El interés
actual del estudio de este patógeno deriva, bien de su elevada frecuencia, o por
representar, en el caso de cepas resistentes a meticilina, una de las principales
causas de brotes de infección nosocomial en nuestro país.25
20
La variabilidad de Staphylococcus aureus, la rápida respuesta adaptativa frente a
cambios del medio, y su continua adquisición de determinantes de resistencia
antibiótica, han hecho de éste un residente habitual del hábitat hospitalario, donde
origina problemas de multirresistencia, ocasionalmente importantes. Aunque el
término resistencia a meticilina incluye resistencia a derivados ß-lactámicos, las
cepas SARM presentan, en general, resistencia múltiple a varios grupos de
antibióticos. A través de diversos mecanismos, estos aislados presentan resistencia
al cloranfenicol, tetraciclinas, macrólidos, lincosaminas, aminoglucósidos e incluso,
quinolonas, describiéndose cada vez con mayor frecuencia brotes SARM sensibles
sólo a los glucopéptidos.26
1.2.2.1.3. Patogenia.
Staphylococcus aureus es un agente patogénico que actúa como un
microorganismo saprófito, se encuentra en la piel del individuo sano pero en
ocasiones en que las defensas disminuyen pueden causar enfermedad. El principal
grupo de riesgo son pacientes hospitalizados o inmunocomprometidos.
Infección de piel y partes blandas. Neumonía, sialadenitis, sepsis con o sin
metástasis (osteítis, artritis, endocarditis, abscesos localizados). Enfermedades por
toxinas (síndrome de piel escaldada por estafilococo, síndrome del shock tóxico y
gastroenteritis).25
Staphylococcus aureus posee resistencia a través de una beta-lactamasa inducible
que le confiere resistencia ante la penicilina, esta beta-lactamasa está codificada en
un plásmido presente en más del 90% de las cepas.25
La resistencia al óxido nítrico es una cualidad peculiar del Staphylococcus aureus,
capacidad que lo distingue de otros patógenos, incluyendo los comensales
Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus. Esa observación se
ha hecho tanto en especies resistentes a la meticilina como en las que son
susceptibles al antibiótico, así como en cepas hospitalarias como adquiridas en la
comunidad.26
21
1.2.2.2.Escherichia coli
1.2.2.2.1. Taxonomía.
Dominio : Bacteria.
Filo : Proteobacteria.
Clase : Gammaproteobacteria.
Orden : Enterobacteriales.
Família : Enterobacteriaceae.
Género : Escherichia.
Espécie : Escherichia coli.
Migula, 1895.
1.2.2.2.2. Características
Escherichia colies un bastón Gram negativo (bacilo) de la familia
Enterobacteriaceae. La mayoría de las E. coli son comensales normales que se
encuentran en el tracto digestivo. Las cepas patógenas de este organismo se
distinguen de la flora normal por poseer factores de virulencia, como exotoxinas.
Los factores de virulencia específicos pueden utilizarse, junto al tipo de
enfermedad, para separar dichos organismos en patotipos.27
Escherichia coli es quizás el microorganismo procariota más estudiado por el ser
humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente en los intestinos
animales, por ende en las aguas negras. Fue descrita por primera vez en 1885 por
Theodore von Escherich, bacteriólogo alemán, quien la denominó Bacterium coli.
Posteriormente la taxonomía le adjudicó el nombre Escherichia coli, en honor a su
descubridor. Ésta y otras bacterias son necesarias para el funcionamiento correcto
del proceso digestivo, además de producir las vitaminas B y K. Es un bacilo que
reacciona negativamente a la tinción de Gram (gram negativo), es anaerobio
facultativo, móvil por flagelos peritricos (que rodean su cuerpo), no forma esporas,
es capaz de fermentar la glucosa y la lactosa y su prueba de IMVIC es ++--.28
22
1.2.2.2.3. Patogenia.
Escherichia coli puede causar infecciones intestinales y extraintestinales
generalmente graves, tales como infecciones del aparato excretor, cistitis,
meningitis, peritonitis, mastitis, septicemia y neumonía Gram-negativa.
El grupo Escherichia enteroinvasiva y Shigella spp. Se encuentra relacionada
genética y bioquímicamente. Se asocia fundamentalmente con brotes de origen
alimentario por alimentos importados, 5 siendo responsables de la “diarrea del
viajero”. El mecanismo de patogenicidad de ECEI es la invasión del epitelio del
colon, sin producción de toxinas LT y ST, dando lugar a una diarrea disenteriforme
acuosa que se manifiesta con sangre y mucosidad en heces acompañado de fiebre y
dolor abdominal6. En algunos casos sólo se produce diarrea. 27
Escherichia coli rica está dividida por sus propiedades virulentas, pudiendo causar
diarrea en humanos y otros animales. Otras cepas causan diarreas hemorrágicas por
virtud de su agresividad, patogenicidad y toxicidad. En muchos países ya hubo
casos de muerte con esta bacteria. Generalmente les pasa a niños entre 1 y 8 años.
Causado por la contaminación de los alimentos, y posterior mala cocción de los
mismos.29
Debido a su alta presencia en el intestino, la Escherichia coli se utiliza como el
indicador principal para detectar y medir la contaminación fecal en la evaluación de
la inocuidad del agua y de los alimentos. Consideradas comensales inofensivas, las
cepas de Escherichia coli constituyen alrededor del 1% de la población microbiana
normal del intestino. Si bien la mayoría de las cepas dentro del intestino son
agentes patógenos gastrointestinales beneficiosos para el ser humano, otros son
perjudiciales.30
Son más comunes en mujeres por la corta longitud de la uretra (25 a50 mm, o bien
1 a2 pulgadas) en comparación con los hombres (unos 20 cm, o unas 8 pulgadas).
Entre los ancianos, las infecciones urinarias tienden a ser de la misma proporción
entre hombres y mujeres. 30
23
1.2.3. ENSAYOS ANTIMICROBIANOS.
La actividad antibacteriana de los productos naturales de origen vegetal, tanto
extractos de plantas como sustancias puras, pueden ser detectadas cuando se
colocan esas muestras en contacto con varias bacterias y se observa la respuestas
del crecimiento bacteriano.31
Existe una gran variedad de métodos para detectar actividad antibacteriana.
Dependiendo del método los resultados pueden ser grandemente influenciados una
vez que ellos no son igualmente sensitivos o no se basan en los mismos
principios.31Normalmente, esos métodos son clasificados en tres grandes grupos:
métodos de difusión, dilución y antibiograma. Estos son los más comúnmente
utilizados por los grupos de búsqueda de antibacteriano de origen vegetal y serán
descritos abajo.
a. Método de Difusión en Agar.
Conocido como test de Kirby-Bauer, ese método fue estandarizado por Bauer et al.
En 1996. Este es el ensayo más usado en la separación de plantas con actividad
antimicrobiana bien en la práctica clínica y está recomendado por la Clinical and
Laboratory Institute (CLSI). Básicamente consiste en colocar un reservorio
impregnado con la muestra en contacto con un medio de cultivo inoculado y, al
final del periodo de incubación, medir el diámetro de la zona clara (zona de
inhibición de crecimiento) alrededor del reservorio. La medida del diámetro es un
buen indicador de la actividad antimicrobiana.31
El microorganismo puede ser inoculado de diferentes formas. Normalmente ellos
son inoculados en la superficie de agar sólido, pero también pueden ser mezclados
en el agar de 45 a 50°C.31.Algunos autores utilizan placas Petri conteniendo dos
capas de medio. La primera capa es colocada en la placa y luego, después de su
solidificación, otro tipo de agar mezclado con microorganismos es colocado por
encima del primero.31
Existen diferentes reservorios, como discos de papel, cilindros de acero inoxidable
y cavidades perforadas del agar. Algunos autores consideran las cavidades el único
reservorio apropiado para extractos acuosos, pues la interferencia de las partículas
es mucho menor.28 Muchas veces, antes de impregnar la muestra en los reservorios,
24
estos son esterilizadas por medio de filtración con filtros millipore de 0.45 um. Tal
procedimiento es hecho principalmente cuando se trata de extractos acuosos.32
Antes de incubar el sistema inoculado, puede ser mantenido a temperaturas más
bajas por algunas horas con el objetivo de facilitar la difusión de la muestra y,
consecuentemente, aumentar el diámetro de inhibición mejorando el límite de
detección. Algunos estudios consideran suficiente mantener las placas a 4° C por 1
a 2 horas.32
Otros consideran suficiente dejar las placas a temperatura ambiente por 30
minutos.31Aun utilizan film plástico para sellar las placas Petri con la intención de
evitar una eventual evaporación de las muestras.32 Los diámetros de las zonas de
inhibición son normalmente medidas con un paquimetro. El diámetro también
puede ser medido automáticamente con la ayuda de software.33 Con el objetivo de
facilitar la medida del halo, las placas Petri pueden ser rociadas después del periodo
de incubación con indicadores redox del tipo sal de tetrazolium.33
No existe ningún valor patrón que determina que la muestra es activa o no. Es
frecuente expresar los resultados como un criterio para determinar la
susceptibilidad, susceptibilidad intermedia y la resistencia. En estos casos, son
creadas escalas basadas en el tamaño de las zonas de inhibición. Cuanto mayor sea
el halo, más sensible es el microorganismo.38, 39 También es posible comparar los
halos de las muestras con los halos formados por los controles (antibiótico o anti
fúngico).40 Algunos autores solo consideran una muestra activa si la razón del halo
de la muestra por el halo del control fuera mayor que cero, o sea, el halo de la
muestra es igual o mayor que al del control.31
Existe una variación del método de difusión en agar utilizado tanto para aceites
esenciales como para extractos brutos. En esta técnica, los microorganismo son
inoculados en el superficie del agar y después de 10 minutos, una gota de 10 uL de
la muestra es colocada en el centro de la placa. Después del periodo de incubación,
el diámetro de la zona de inhibición es medido.31
Algunos estudios validan la actividad antimicrobiana activada por la luz utilizando
la técnica de difusión en agar. En estos casos, una placa es expuesta a la luz UV por
dos horas, en cuantas otras placas son mantenidas en el oscuro. Después del periodo
de incubación, los diámetros son medidos y se verifica la exposición a la luz UV
25
fue capaz de aumentar ese halo, sugiriendo la presencia de sustancias activadas por
fluorescencia.33 Para algunos autores, la actividad de la luz UV es considerada
positiva si ambas placas, aquella dejada al oscuro y aquella dejada en el UV,
muestran zonas de inhibición. Si apenas la placa expuesta al UV presentase halos,
la luz es considerada fototóxica.34
El método de difusión en agar no es apropiado para investigar la actividad de
muestras no polares o aquellas que no se difunden fácilmente en el agar.45 Entre
tanto, esta técnica es extremadamente utilizada hasta para muestras apolares. En
general, las diferencias en la propiedad química, como solubilidad, volatidad y
difusión pueden afectar la potencia de diferentes muestras.31
Este método, simple y no oneroso, es generalmente usado para la separación de
varios extractos. El extracto que presenta la actividad presentará su Concentración
Inhibitoria Mínima (CIM) calculada posteriormente por los métodos de dilución. Es
importante enfatizar que el método de difusión en agar es utilizado para la
determinación cualitativa de la actividad antimicrobiana. Normalmente, esa técnica
verifica cuales extractos presentan potencial actividad y cuales organismos son
susceptibles.31
b. Método de Macrodilución.
Las pruebas de dilución han sido utilizadas durante años. Los procedimientos
iniciales serán realizados en tubos de ensayo grandes (13 por 100 mm) con
volúmenes de caldo de por lo menos 1 ml. Este método fue estandarizado en la
década de los años 70 por el Estudio Cooperativo Internacional y luego la NCCLS
publicó un estándar del método. Este método es llamado macrodilución en caldo. A
partir de los años 60 se comenzaron a utilizar dispositivos serológicos para
dispensar y diluir. Esta miniaturización simple de la técnica se conoció como
macrodilución en caldo.32
Fundamentos: Consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes
concentraciones de antimicrobianos, en diluciones a la mitad y observar el
crecimiento de los microorganismos para luego definir la CIM (Concentración
mínima inhibitoria).32
26
En el método de macrodilución se emplea por cada combinación de bacteria con
antibacteriano, un juego de tubos. Habitualmente se prepara el juego de tubos con
1ml de caldo MH (Müeller Hinton) suplementado con Ca++ y Mg++ estéril sin
antibacteriano.32
Para un pequeño número de pruebas se preparan diluciones al doble directamente
en los tubos, del modo siguiente. Se colocan 2 ml de solución de antibiótico en el
primer tubo de la serie de diluciones. En cada uno de los tubos restantes se añade 1
ml de caldo MH. Con una pipeta estéril se transfiere 1 ml del primer tubo al
segundo. Después de mezclar el contenido del segundo tubo, se transfiere 1 ml con
una pipeta diferente (en esta transferencia y en todas las sucesivas) al tercer tubo.32
El proceso continúa hasta el penúltimo tubo, al que se le quita1 ml, que se descarta.
El último tubo no recibe solución de antibiótico y sirve de control de crecimiento.
Las concentraciones finales de antibióticos en esta prueba son iguales a la mitad de
la serie inicial de dilución, debido al agregado de una concentración igual de
inóculo en el caldo. Se prepara un inóculo bacteriano que contenga 105 a 106
UFC/ml ajustando la turbidez de un caldo de cultivo al estándar y diluyendo luego a
1:200 en caldo. Añadir a cada tubo 1ml del inóculo ajustado. Incubar los tubos a
35°C entre 16 y 20 horas.32
27
1.3. VARIABLES Y INDICADORES
1.3.1. VARIABLES
1.3.1.1. Independiente
Extracto etanólico de las Hojas de Ruta graveolens “Ruda”.
1.3.1.2. Dependiente
Actividad antibacteriana In Vitro
1.3.2. INDICADORES
1.3.2.1. Independiente (X): concentración del extracto
Concentración baja: 0.25 mg/ml
Concentración media: 4 mg/ml
Concentración alta: 32 mg/ml
1.3.2.2.Dependientes (Y): grado de turbidez
4 (no inhibición),
3 (ligera inhibición)
2 (inhibición aparente)
1 (ligera turbidez del medio)
0 (inhibición)
28
1.3.3. OPERACIONALIZACIÓN DE LAS VARIABLES
Variable
Independiente
Definición
Conceptual
Definición Operacional
Indicador
Índices
Escala de
Medición
Tipo de
Variable
Extracto
etanólico
de las hojas
de Ruta
graveolens
”Ruda”.
Producto que
se obtendrá
mediante el
método de
extracción,
etanol por
rotavapor.
El solvente en contacto
con la especie vegetal
arrastrará los metabolitos
secundarios solubles en él
con extracción en
rotavapor a una
temperatura de 70° C
durante 3 horas
Concentración
del extracto
etanólico de
las hojas de
Ruta
graveolens
“Ruda”.
Método de Macrodilución:
Concentración baja: 0.25 mg/ml
Concentración media:4.0 mg/ml
Concentración alta: 32 mg/ml
Nominal
Cuantitativa
29
Variable
Dependiente
Definición Conceptual
Definición
Operacional
Indicador
Índices
Escala de
Medición
Tipo de
Variable
Actividad
antibacteriana
Constituida por el cambio
en la pared y membrana
celular de la bacteria
Staphylococcus aureus y
Escherichia coli causado
por agentes químicos
externos produciendo una
inhibición en el
crecimiento del mismo.
El grado de turbidez
que presentarán los
medios de cultivos
inoculados con
Staphylococcus
aureus y
Escherichia coli
expuesta al extracto
en estudio
Concentración
inhibitoria
mínima
(C.I.M.)
Grado de Turbidez
Nominal
Cualitativa
0 Ausencia de turbidez en
los cultivos de las cepas
ensayadas. Inhibición.
1 Ligera turbidez.
2 Inhibición aparente.
3 Ligera inhibición.
4 No inhibición.
30
CAPITULO II
31
2.1. METODOLOGIA
2.1.1. TIPO DE INVESTIGACIÓN.
En el trabajo de investigación se empleó los diseños descriptivo, prospectivo y
Longitudinal:
Descriptivo; porque en el estudio describirá e interpretará en forma clara y
detallada los hechos obtenidos en la investigación.
Prospectivo; porque se desarrolló a través del tiempo, registrando la
información a partir del inicio del estudio
Longitudinal; porque permitió realizar la recolección sistemática de las
variables involucradas en función del tiempo.
32
2.1.2. POBLACION Y MUESTRA
2.1.2.1.Población vegetal
La población vegetal en estudio estuvo constituida por la especie vegetal Ruta
graveolens “Ruda”, fueron ubicados en el centro poblado Nina Rumí en el margen
derecho del Rio Nanay a 25 kilómetros de la ciudad de Iquitos, vía Carretera
Iquitos Nauta. Limita por el este, norte y sur con terrenos de la Universidad
Nacional de la Amazonia Peruana y por el lado oeste con el Rio Nanay.
2.1.2.2.Muestra vegetal
La muestra estuvo constituida por las hojas de Ruta graveolens “Ruda”.
2.1.2.3.Criterios de Inclusión
Hojas sin presencia de bacterias y hongos.
La especie vegetal fue identificada en el Herbarium Amazonense de la Facultad
Ingeniería Forestal, el cual otorgó una constancia de la planta en estudio.
2.1.2.4. Criterios de Exclusión
Las Hojas presentaron bacterias u hongos.
2.1.2.5.Población Microbiológica.
La población microbiológica fue constituida por dos bacterias, Staphylococcus
aureus ATCC 25923 y Escherichia coliATCC 25922, son bacterias anaeróbias
Facultativas Gram positivas y Gram negativas.
2.1.2.6.Muestra Microbiológica.
Las muestras microbiológicas estuvieron constituidas por las bacterias.
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Escherichia coli ATCC 25922
2.1.2.7.Criterios de Inclusión
Se emplearon bacterias jóvenes.
Se extrajo una azada de bacteria y se sembró en un agar nutritivo, donde crecen
nuevas bacterias.
33
2.1.2.8. Criterios de Exclusión
Cepas que presentaron formas irregulares.
2.2. MATERIALES Y EQUIPOS
2.2.1. Material de Vidrio:
Embudos LBT GERMANY
Erlenmeyer de 250 y 500 ml LBT GERMANY
Frasco ámbar con tapa rosca.
Matraz 1000 ml LBT GERMANY
Micropipeta Pasteur LABMATE SOFT
Pipetas de 1, 2, 5 y 10 ml LBT GERMANY
Probetas de 10, 100, 250 y 1000 ml LBT GERMANY
Tubos ensayo con tapa rosca (75 x 120 mm.) LBT GERMANY
Tubos de ensayo de 5 y 7 ml LBT GERMANY
Vasos de precipitado de 5, 10, 20, 50 y 100 ml LBT GERMANY
Bagueta LBT GERMANY
Placas petri LBT GERMANY
2.2.2. Material de Metal:
Asa de Kolle para siembra bacteriológica.
Cuchillo mediano.
Escobillas lava tubos.
Espátulas medianas.
Gradilla metálica.
Pinza estéril.
Regla Vernier.
2.2.3. Otros Materiales:
Algodón
Detergente
34
Hisopos para medios de cultivos.
Papel aluminio.
Papel de despacho.
Papel secante.
Papel tissue.
Parafilm 2´x 250´
Plumón marcador FABER CASTELL
Soportes para tubos LBT GERMANY
Mandil o guardapolvo
Guantes quirúrgicos
Mascarillas.
2.2.4. Equipos:
Autoclave AUTESTER MOD. 437 – P
Balanza analítica SARTORIUS
Termostatos de Inmersión SELECTA PRECISTERM
Cámara fotográfica profesional SONY DSC – S3000
Centrifuga CHRIST
Cocina eléctrica PREMIER.
Equipo de filtración NALGENE
Cabina de bioseguridad NUAIRE CLASS II
Desionizador de agua OPTIC IVYMEN SYSTEMN AC – L8
Estufa SELECTA
Incubadora SELECTA
Refrigeradora LG
Rotavapor BÜCHI
Mechero de bunsen SELECTA
Vórtex MIXER MODEL VM-1000
2.2.5. Reactivos:
Ácido Clorhídrico 0.5 M. AVANTOR
Ácido Sulfúrico 0.2M. ALDRICH
35
Agua Destilada. BRAUN
Carbonato de Sodio. NSK
Etanol 70° MERCK
Cloruro de Bario. JT BACKER
2.2.6. Medios de Cultivo
Agar Müeller Hinton BD BIPLATE
Agar Nutritivo BD BIPLATE
Caldo Müeller Hinton BD BIPLATE
2.3. CRITERIOS DE BIOSEGURIDAD:
Se aplicaron las medidas de bioseguridad establecidas en las normas de
Bioseguridad (Serie Normas Técnicas Nº 18-INS), aplicable al personal, uso y
desecho de sustancias y materiales, acceso a los locales, y el medio ambiente. Las
bacterias mencionadas en el presente trabajo corresponden trabajarlas a un nivel de
bioseguridad.36
Las principales medidas de bioseguridad incluyeron:
El acceso al laboratorio estuvo limitado al personal autorizado.
El personal del laboratorio realizó el cumplimiento de las normas de
seguridad.
Todas las áreas estuvieron debidamente marcadas con la señal de riesgo
biológico y su nivel de contención.
La ropa fue protectora, fácilmente ajustable y confortable, utilizando siempre
guardapolvo o mandilón de laboratorio, así como guantes, gafas, Etc. Debe
estar disponible en todo momento.
Se usaron gafas protectoras y mascarillas faciales si existe riesgo de
salpicaduras y/o aerosoles.
Se utilizó guantes estériles.
Tras quitarse los guantes, se realizó un lavado de manos.
Se utilizó zapatos protectores que cubrieron completamente los pies.
36
El procesamiento de las muestras se realizó sobre una superficie de trabajo
cubierta con papel absorbente plastificado o papel de filtro.
Las superficies de trabajo fueron descontaminados por el operador antes y
después de cada actividad.
Los reactivos fueron etiquetados y almacenados en viales adecuados con tapa
rosca.
Todos los desechos del laboratorio fueron descontaminados adecuadamente,
antes de eliminarlos en solución desinfectante o ser autoclavados a 121ºC
durante 20 minutos, o incinerarse.37
2.4. PROCEDIMIENTO
2.4.1. Material Vegetal: Se utilizó las hojas de la Ruta graveolens “Ruda”.
2.4.2. Recolección de la Muestra Vegetal:
Las muestras de las hojas de Ruta graveolens “Ruda” fueron recolectadas en la
comunidad de Nina Rumi (Carretera Zungarococha). Departamento de Loreto-Perú.
2.4.3. Identificación de la Muestra Vegetal:
Parte de la muestra vegetal de las hojas de Ruta graveolens “Ruda” fue identificada
en el “Herbarium Amazonense”, posteriormente fue depositado en el laboratorio de
Fitoquímica de la Facultad Facultad de Industrias Alimentarias de la Universidad,
Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP).Ubicado en la Av. Freyre N° 610 -
Iquitos. (Anexo- Imagen N° 09).
2.4.4. Secado y Molienda de la Muestra Vegetal:
La materia prima fue expuesta al sol para el secado durante 20 días. Se
seleccionó rigurosamente las hojasde Ruta graveolens “Ruda”, procediendo a
la molienda de las hojas, utilizando un moledor para que la muestra sea
37
suficientemente pequeñas, luego se procedió a envasarlos en recipientes
adecuados que serán conservadas en lugares secos y frescos.
2.4.5. Obtención del Extracto Etanólico.
El extracto etanólico se obtuvo por maceración de la muestra por 10 veces
consecutivas con etanol (96 grados) durante 7 días cada vez.
Para cada extracción se maceraron 1000 g de materia prima (Ruda), en 2 000 ml de
etanol, durante 7 días. La concentración del extracto se realizó por eliminación del
disolvente a presión reducida en un rotavapor, a una temperatura de 60ºC y a una
presión de 690 mmHg. Por espacio de 3 horas aproximadamente, posteriormente se
dejará secar a temperatura ambiente por 3 días (Anexo N° 12).
2.4.6. Tamizaje Fitoquímico:
Se realizó el tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de las hojas Ruta
graveolens “Ruda” .y a continuación se detalla cada uno de los ensayos
fitoquímicos.
Identificación de Alcaloides: Ensayo de Dragendorff.
La fracción se disolvió en 1ml de Ácido Clorhídricoal 1% (Densidad 1.189kg/l
al 38%) en ausencia de solvente orgánico, se mezcló con 1 gota de reactivo, si
hay opalescencia se considera (+), turbidez (++), precipitado (+++) de color rojo
ladrillo.
Identificación de Aminoácidos y Aminas: Ensayo de Ninhidrina.
Sé tomó una alícuota del extracto en etanol, si el extracto se encuentra en otro
solvente orgánico, este se evapora a sequedad en ambos casos se mezcla con 2ml
en solución de Ninhidrina en alcohol. La mezcla se calentó de 5 a10 minutos en
baño de agua. Este ensayo se considera positivo cuando se desarrolla un azul
violáceo.
38
Identificación de aldehídos: Ensayo de Fehling.
El residuo se disolvió en 1-2 ml de agua, en caso que la fracción no sea acuosa,
se adiciona 2 ml del reactivo, se calentó la mezcla en baño de agua durante 10-
30 min. El ensayo se considera positivo si la solución se colorea de rojo o
aparece precipitado rojo.
Identificación de cumarinas: Ensayo de Baljet.
Permitió reconocer en un extracto la presencia de compuestos de agrupamientos
lactónicos, en particular cumarinas, aunque estos compuestos lactónicos pueden
dar positivo al ensayo: como lactonas sesquiterpénicas, etc. Por ello si la alícuota
del extracto no se encuentra en alcohol debió evaporarse el solvente en baño de
agua, y redisolverse en la menor cantidad de alcohol.
En estas condiciones se adiciona 1 ml de reactivo, considerándose un ensayo
positivo la aparición de coloración o precipitado rojo respectivamente.
Identificación de Glicósidos: Ensayos de Molish.
2 ml del extracto se mezcló en un tubo de ensayo y se le añadió 3 gotas de
solución o-naftol al 5% en etanol. Se mezcló y por la pared del tubo se adicionó
1ml de ácido sulfúrico concentrado. La aparición de anillo violáceo en la
interface indica reacción positiva.
Identificación de Glicósidos Cardiotónicos: Ensayo de Kedde.
La fracción se disolvió en 1 ml de alcohol etílico y se mezcló con 1 ml de
reactivo, se deja reposar durante 5-10 minutos. Un ensayo positivo es aquel en el
que se desarrolla una coloración violácea persistente durante 1-2 horas.
Identificación de Flavonoides: Ensayo de Shinoda.
Permite reconocer la presencia de flavonoides en un extracto vegetal. Si la
alícuota del extracto se encuentra en etano, se diluye con 1ml de ácido
clorhídrico concentrado y un pedacito de cinta de magnesio metálica. Después
de la reacción se esperan 5 min., se añade 1ml de alcohol amílico, se mezclan las
fases y se deja reposar hasta que las mismas se separen. El ensayo se consideró
positivo cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo, anaranjado, carmelita
o rojo intenso en todos los casos.
39
Identificación de Fenoles y taninos: Ensayo de Cloruro Férrico.
A la fracción disuelta en 1 ml de etanol, se le añadió 0.5 ml de una solución de
Cloruro Férrico al 5% en solución salina (85%). La aparición de un color o
precipitado verde oscuro indica la presencia de fenoles y/o taninos. El extracto
acuoso se adiciona acetato de sodio previo al ensayo.
Identificación de Mucílagos: Ensayo de mucílagos.
Permitió reconocer en los extractos vegetales la presencia de esta estructura tipo
polisacárido, que forma un alcaloide hidrófilo de alto índice de masa que
aumenta la densidad del agua cuando se extrae.
Para ello una alícuota del extracto en agua se enfría a 0-5 ºC y si la solución
toma una consistencia gomosa al tacto el ensayo es positivo.
Identificación de Quinonas: Ensayo de Bornträger
La fracción se disolvió en 1ml de cloroformo, se agita con 1ml de solución de
NaOH al 5% en agua. Si la fase acuosa alcalina (superior), se colorea de rosado
o rojo, el ensayo se considera positivo (naftoquinona y antraquinona).
Identificación de Saponinas: Ensayo de Espuma.
Permitió reconocer la presencia de saponinas tanto del tipo esteroidal como
triterpénica. De modo que si la alícuota se encuentra en alcohol, se diluyó con 5
veces su volumen en agua y se agita la mezcla frecuentemente durante 2
minutos. El ensayo se considera positivo si aparece espuma de más de 2 mm de
altura en la superficie y persiste por más de 2 minutos. 35
2.4.7. Prueba de Susceptibilidad y Acción Antibacteriana de los Extractos por
el Método de Macrodilución.
Evaluación de la Actividad Antibacteriana: Las bacterias de ensayo fueron
proporcionados por el departamento de Microbiología de la Facultad de Industrias
Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (Staphylococcus
aureus ATCC 25923; Escherichia coli ATCC 25922).
40
2.4.7.1.Concentración Mínima Inhibitoria (Método de Macrodilución):
Preparación del inóculo: El inóculo estándar, para macrodilución en caldo, se
obtuvo por crecimiento de la bacteria hasta una turbidez equivalente al tubo 0.5 de
la escala de Mc Farland o por suspensión directa de colonias, en caldo o solución
fisiológica, hasta alcanzar dicha turbidez.
2.4.7.2.Colocación del inóculo en los tubos.
Macrodilución en caldo (tubos).
Una vez obtenido el inóculo de turbidez comparable al 0,5 de Mc Farland. Se
agregó 1 ml. del inóculo estandarizado a cada tubo de dilución de muestra y al tubo
control de crecimiento y se homogeniza la mezcla. No debe transcurrir más de 15
minutos entre la preparación del inóculo y su colocación en el tubo, para evitar que
el número de bacterias aumente por duplicación. Se tuvo que tener en cuenta que
tanto la muestra, como el inóculo sufrirán una dilución al medio. Es aconsejable
realizar un control de pureza del inoculo, subcultivando una alícuota en un medio
sólido no selectivo.31
2.4.7.3.Incubación.
El tiempo de incubación para la mayoría de las bacterias fue de 16 a 20 horas en
una incubadora seca, para la técnica de macrodilución.
2.4.7.4. Procedimiento y Lectura e interpretación de la CIM.
La CIM corresponde a la mínima concentración de antibiótico en donde no se
observa desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en μg/ml.32
Cálculo en gramos del extracto.
Peso en gr. = mg de extracto x 1gr.
del extracto 1000 mg.
41
Peso en gr. = 640 mg. x 1gr.
del extracto 1000mg.
Peso en gr. = 0.64 gr.
del extracto
Procedimiento: Se pesó en la balanza analítica 640 mg del extracto en viales tipo
spendorf estériles, diluidos en 1 ml de disolución metanol/agua (1:1) para alcanzar
una concentración de prueba de 640 mg/ ml (Solución madre o Stock), se colocó en
el vórtex para la homogenización. De la solución madre se extrajo 0.2 ml y fue
añadido al tubo N° 01 que contuvo 1.8 ml de caldo Müeller Hinton. Del tubo N° 01
se extrajo 1 ml para ser añadido al Tubo N° 02 y así sucesivamente hasta llegar al
tubo N° 08. Del tubo N° 08 se sacó 1 ml que fue desechado. Después de este
proceso se añadió a todos los tubos 1 ml de la suspensión bacteriana. El volumen
final mínimo, en cada tubo, fue de 2 ml. Las concentraciones fueron comprendidas
entre los rangos de 32 mg/ml a 0.25 mg/ml. Los extractos que no se disolvieron por
agitación fueron mantenidos por algunos minutos en baño maría (temperatura de
40°C) y colocados nuevamente en el vórtex. En el control positivo empleado en la
prueba se utilizó el antibiótico Gentamicina (160 mg/2ml), del cual se utilizó 0.64
ml y se enrasó hasta 5 ml de agua destilada en un tubo estéril para obtener una
solución madre o stock de 10240 μg/ml. De la solución madre se extrajo 0.2 ml y
fue añadido al tubo N° 01 que contuvo 1.8 ml de caldo Müeller Hinton. Del tubo
N° 01 se extrajo 1 ml para ser añadido al Tubo N° 02 y así sucesivamente hasta
llegar al tubo N° 09. Del tubo N° 09 se sacó 1 ml que fue desechado. Después de
este proceso se añadió a todos los tubos 1 ml de la suspensión bacteriana. Las
concentraciones fueron comprendidas entre los rangos de 512 μg/ml a 2 μg/ml. La
CIM fue la menor concentración de antibiótico capaz de inhibir completamente el
desarrollo bacteriano en el tubo. El punto final quedó definido a simple vista por la
falta de turbidez del caldo. Para determinar el punto final de desarrollo, debió
compararse cada tubo con el tubo control de crecimiento.
42
2.4.8. Procedimiento de los Ensayos la Actividad Antibacteriana.
2.4.8.1.Cepas empleadas:
Se emplearon dos (02) cepas, Staphylococcus aureus y Escherichia coli, las cuales
fueron proporcionadas por el departamento de Microbiología de la Facultad de
Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana, la
Universidad lo obtuvo del Instituto Nacional de Salud (INS-Perú), cuyas
características fenotípicas están detalladas en el (Anexo - Foto Nº 04 y 05).
2.4.8.2.Preparación de la solución madre:
Se restableció la movilización de las cepas petrificadas por refrigeración,
respectivamente identificadas, que son colocadas en medio caldo nutritivo
glucosado de sabouraud a una temperatura de incubación de 37 ºC por 24 horas.
Posteriormente se realizó el sembrío en forma de estrías con el asa bacteriológica
en placas de agar Müeller-Hinton(MH) a temperatura de incubación de 37 ºC por
24 horas para lograr la producción de colonias.(Anexo - Foto N° 08 y09)
2.4.8.3.Preparación del inóculo:
Usando el asa bacteriológica, se extrajo del sembrío de agar un aproximado de 2 a 5
colonias aisladas de Escherichia coli y Staphylococcus aureus, y se depositó en un
tubo conteniendo 10 ml de solución salina (NaCl) estéril al 0.9%; que se ajustó la
suspensión a la turbidez de la escala 0,5 de Mc. Farland. (5 x 105 UFC/ml), para la
comparación bacteriológica en estudio. (Anexo - Foto 16, 17, 18, 19, 20 y 21).
2.4.8.4. Preparación de la suspensión bacteriana y su aplicación en la prueba
de macrodilución:
Una vez obtenido el inóculo de turbidez comparable al 0,5 de Mc. Farland, diluir
0.1 ml de la suspensión bacteriana con cloruro de sodio 0.9 % en 9.9 ml de caldo
Meller-Hinton, para así obtener un total de 10 ml. La inoculación con la suspensión
estandarizada debe hacerse dentro de los 15 minutos de preparada la misma, para
evitar que el número de microorganismos aumente por duplicación.
43
2.4.8.5.Macrodilución en caldo (tubos).
Se agrega 1 ml. del inóculo estandarizado a cada tubo de dilución de muestra y
al tubo control de crecimiento y se homogeniza la mezcla. No deben transcurrir
más de 15 minutos entre la preparación del inóculo y su colocación en el tubo.
Se debe tener en cuenta que tanto la muestra, como el inóculo sufrirán una
dilución al medio.
2.4.8.6. Ensayo de la actividad antibacteriana.
Esta técnica fue utilizada para determinar la actividad antibacteriana del extracto
etanólico obtenido de las hojas de Ruta graveolens “Ruda” frente a Staphylococcus
aureus y Eschericia coli.
El método ensayado se realizó según los procedimientos establecidos en el
Protocolo del 2007 por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI
por su sigla en inglés, anteriormente conocido como NCCLS)
2.4.8.7.Preparación y control de extractos.
A. Método de Macrodilución en caldo
Se pesó 640 mg del extracto en viales tipo spendorf estériles, diluidos en 1 ml
de disolución metanol/agua (1:1) para alcanzar la concentración de prueba de
640 mg/ ml (Solución Madre o Stock).
De la solución madre se extrajo 0.2 ml y fue añadido al tubo N° 01 que
contenía 1.8 ml de caldo Müeller Hinton.
Del tubo N° 01 se extrajo 1 ml, lo cual fue añadido al Tubo N° 02 y así
sucesivamente hasta llegar al tubo N°08.
Del tubo N° 08 se extrajo 1 ml que fue desechado.
44
Después del proceso se añadió a todos los tubos 1 ml de la suspensión
bacteriana.
El volumen final mínimo, en cada tubo, fue de 2 ml.
Las concentraciones estuvieron comprendidas entre los rangos de 32 mg/ml a
0.25 mg/ml.
Los extractos que no se disolvieron por agitación fueron mantenidos por
algunos minutos en baño maría (temperatura de 40°C) y fueron colocados
nuevamente en el vórtex.
El control positivo empleado en la prueba fue el antibiótico Gentamicina (160
mg/2ml), del cual se utilizó 0.64 ml y se enrasó hasta 5 ml en un tubo estéril
para obtener una solución madre o stock de 1024 ug/ml.
De la solución madre se extrajo 0.2 ml y se añadió al tubo N° 01 que contuvo
1.8 ml de caldo Müeller Hinton.
Del tubo N° 01 se extrajo 1 ml, lo cual fue añadió al Tubo N° 02 y así
sucesivamente hasta llegar al tubo N° 09.
Del tubo N° 09 se extrajo 1 ml que fue desechado.
Después de este proceso se añadió a todos los tubos 1 ml de la suspensión
bacteriana.
Las concentraciones estuvieron comprendidas entre los rangos de 512 ug/ml a
2 ug/ml. Representación en la figura N°04.
45
FIGURA N° 04.
Procedimiento del Control del Método de Macrodilución en Caldo
B. Método de macrodilución en caldo.
Se pesó 640 mg del extracto en viales tipo spendorf estériles, diluidos en 1 ml
de disolución metanol/agua (1:1) alcanzando una concentración de prueba de
640 mg/ml (Solución madre o Stock).
De la solución madre se extrajo 0.2 ml y se añadió al tubo N° 01 que contuvo
1.8 ml de caldo Müeller Hilton.
Del tubo N° 01 se extrajo 1 ml, lo cual se añadió al Tubo N° 02 y así
sucesivamente hasta llegar al tubo N°08.
Del tubo N° 08 se extrajo 1 ml que fue desechado.
La batería se completó con un tubo que sirva como control negativo (solo
caldo).
46
Después de este proceso se añadió a todos los tubos 1 ml de la suspensión
bacteriana a concentración de 5 x 105 UFC/ml (que se obtenía al hacer
dilución de 1:100 de inóculo 0.5 de Mc Farland).
El volumen final mínimo, en cada tubo, fue de 2 ml.
Se debe tener en cuenta que con el agregado de la suspensión bacteriana, las
concentraciones del extracto vegetal en cada tubo se diluyeron en el medio;
por lo tanto dichas concentraciones deben ser preparadas al doble de la
concentración final deseada.
Las concentraciones están comprendidas entre los rangos de 32 mg/ml a 0.25
mg/ml.
Los tubos, se incubaron a 35±2ºC en aerobiosis, por espacio de 18-24 horas.
La prueba se realizó por triplicado. Se consideró que el resultado del ensayo
era válido si entre cada réplica no había variación en ± una dilución (caso
contrario se descartaba y se repetía la prueba).
Luego se procedió a la interpretación de los resultados, la cual se determinó
a simple vista, por la falta de turbidez del caldo, para ello se comparó cada
tubo con el tubo control de crecimiento.
El control positivo que se empleó en la prueba fue el antibiótico gentamicina
(160 mg/2ml), del cual se utilizó 0.64 ml y se enrasó hasta 5 ml en un tubo
estéril para obtener una solución madre o stock de 10240 ug/ml.
De la solución madre se extrajo 0.2 ml y fue añadido al tubo N° 01 que
contendrá 1.8 ml de caldo Müeller Hinton.
Del tubo N° 01 se extrajo 1 ml, lo cual fue añadido al Tubo N° 02 y así
sucesivamente hasta llegar al tubo N° 09.
47
Del tubo N° 09 se extrajo 1 ml que se desechó.
Después de este proceso se añadió a todos los tubos 1 ml de la suspensión
bacteriana.
Las concentraciones estuvieron comprendidas entre los rangos de 5120 ug/ml
a 20 ug/ml. Representación en la figura N° 05.
FIGURA N° 05
Procedimiento del Control del Método de Macrodilución en Caldo
2.4.8.8. Preparación del estándar (0.5 Mc Farland) para el inóculo
Para estandarizar la densidad del inóculo se usó una suspensión de Sulfato de Bario
(0,5 de la escala de Mc Farland) como estándar.
48
1. Preparación del estándar de turbidez:
a. Se agregó 0,5 ml de una solución de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al 1,175% P/V)
a 99,5 ml de una solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V) en constante
movimiento para mantener la suspensión.
b. Se verificó la densidad correcta del estándar usando un espectrofotómetro, cuya
absorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el estándar 0,5 de Mc Farland.
c. Se distribuyó de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa de rosca o tapón de jebe,
similares a los que se usaron para preparar el inóculo.
d. Se Ajustó bien las tapas o tapones y se conservó en la oscuridad a temperatura
ambiente y anotando la fecha de preparación.
e. Antes de ser usado se agitó vigorosamente dicho estándar de preferencia, en un
agitador mecánico.
f. Se verificó mensualmente la densidad de los estándares de sulfato de bario, y
reemplazó cuando fue necesario.
2.5. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE DATOS.
Los datos se procesaron mediante el Análisis de Varianza de una sola vía, que se
encuentra contenido en el programa estadístico SPSS versión 22 para Windows 8,
también se empleó Excel versión en español para ordenar los datos; estas
herramientas nos permitieron elaborar tablas y gráficos de las concentraciones
mínimas inhibitorias (CMI) obtenidas del extracto etanólico de Ruta graveolens
“Ruda” y calcular los datos estadísticos necesarios para el estudio, de esta manera
se realizó las debidas comparaciones entre los grupos experimentales.
49
CAPITULO III
50
3.1. RESULTADOS
En el presente estudio de investigación con el extracto Etanólico de las hojas de
Ruta graveolens “Ruda” hemos encontrado los siguientes resultados:
3.1.1. Tamizaje Fitoquímico del Extracto Etanolico.
Tabla N° 01: Resultados obtenidos del Tamizaje Fitoquímico del extracto
Etanolico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda”.
ENSAYOS PARA RESULTADOS
Alcaloides +++
Taninos +
Fenoles +++
Aldehídos -
Flavonoides +++
Saponinas +
Mucílagos -
Lactonas -
Cumarinas ++
Azúcares Reductores -
Esteroides +
Triterpenos (carotenoides) +
Leyenda: (-) Ensayo Negativo; (+) Ensayo positivo. Contenido: (+++) Abundante;
(++) Mediano; (+) Poco.
En la tabla N° 01 se observa, que las hojas de Ruta graveolens “Ruda”, presentan
en mayor cantidad alcaloides, fenoles y flavonoides, en cantidades regulares se
encontró cumarina y en pequeñas cantidades taninos, saponinas, esteroides,
triterpenos. Pero lo que no se encontró fueron aldehídos, mucilagos, latonas,
azucares reductores.
51
3.1.2. Ensayo de concentración inhibitoria mínima (CIM)
Tabla N° 02: Clasificación de la actividad antibacteriana según la
concentración inhibitoria mínima (CIM)
ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
CONCENTRACIÓN INHIBITORIA
MÍNIMA
Inactivo
Poco activo
Moderado activo
Buena actividad
> 16 mg/ml
6 – 15 mg/ml
1 – 5 mg/ml
< 1 mg/ml
Fuente: Protocolo de Estudio de la Actividad Antibacteriana
Tabla N° 03: Resultados obtenidos en el ensayo de concentración inhibitoria
mínima del extracto Etanólico de Ruta graveolens “Ruda”
Escherichia coli CIM Clasificación
Staphylococcus aureus CIM Clasificación
C1 32 mg/ml Inactivo 32 mg/ml Inactivo
C2 16 mg/ml Inactivo 16 mg/ml Inactivo
C3 8 mg/ml Poco activo 8 mg/ml Poco activo
C4 4 mg/ml Moderado activo 4 mg/ml Moderado activo
C5 2 mg/ml Moderado activo 2 mg/ml Moderado activo
C6 1 mg/ml Moderado activo 1 mg/ml Moderado activo
C7 0.5 mg/ml Buena actividad 0.5 mg/ml Buena actividad *
C8 0.25 mg/ml Buena actividad * 0.25 mg/ml Buena actividad
* Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Según los resultados de la tabla N°03 podemos observar que la actividad
antibacteriana de la concentración inhibitoria mínima frente a Echerichia coli y
Staphylococcus aureus, donde presentaron buena actividad a 0.25 mg/ml para
Echerichia coli y a 0.5 mg/ml para Staphylococcus aureus
52
Imagen N° 01: Concentración inhibitoria mínima para Escherichia coli.
En la imagen N° 01 se evidencio que la CMI para Escherichia coli se encontró en
el tubo C8 (0.25 mg/ml), ya que en él se vio el ligero cambio de turbidez
característica de la prueba.
Imagen N° 02: Concentración inhibitoria mínima para Staphylococcus aureus.
En la imagen N° 02 se evidencio que la CMI para Staphylococcus aureus, se
encontró en el tubo C7 (0.5 mg/ml), ya que en él se vio el ligero cambio de turbidez
característica de la prueba.
53
Gráfico N° 01: Gráfico de barras del CIM encontrado del extracto Etanólico
de Ruta graveolens “Ruda” frente a las cepas en estudio.
En el gráfico se observa que la mínima concentración que inhibe (CMI) el
crecimiento de las bacterias en estudio es de 0,5 mg/ml y 0,25 mg/ml para
Staphylococcus aureus y Escherichia coli respectivamente se considera dentro del
rango de buena actividad (< 1 mg/ml).
Gráfico N° 02: Gráfico de barras del Control Positivo con Gentamicina frente
a las bacterias en estudio de la concentración inhibitoria mínima del extracto
Etanólico de Ruta graveolens “Ruda”.
54
GENTAMICINA
En el gráfico se observa que las cepas utilizadas para el estudio fueron sensibles al
tratamiento con GENTAMICINA 160mg/2ml (fármaco) en el control positivo,
mostrando una concentración inhibitoria mínima (CIM)de8 µg/ml para Staphylococcus
aureus y 2 µg/ml para Escherichia coli respectivamente.
Cuadro de Resumen de resultados obtenidos realizado en el presente estudio:
Microorganismo Etanólico
Staphylococcus
aureus
Buena
Actividad
Escherichia coli Buena
Actividad
55
3.2.DISCUSIÓN.
En el tamizaje del extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda” se
encontraron a los metabolitos causante de la actividad antibacteriana, “fenoles,
alcaloides, flavonoides”, los cuales presentaron actividad antibacteriana contra
bacterias Gram positivas (Staphylococcus aureus) y Gram negativas (Escherichia
coli). En el caso de Pokorny et al., 2005. Los resultados aportados por muchos
autores, han investigado la actividad antibacteriana de los compuestos fenólicos
identificados en varias especies vegetales, algunos flavonoides presentaron
actividad antimicrobiana. Así, las isoflavanonas, isoflavonas, dehidroflavonoles,
chalconas, dehidrochalconas y flavanos son compuestos flavonoides que
demostraron tener actividad antimicrobiana contra patógenos en plantas, de las
cuales se afirmó que poseen actividad antibacteriana frente a un cierto número de
bacterias Gram positivas y Gram negativas, además inhiben el crecimiento de
microorganismos psicrótrofos, coliformes fecales.
Para el control positivo se usó Gentamicina 160 mg/2ml, que es un antibiótico de
primera línea, además es el antibiótico más usados para diferentes pruebas de
sensibilidad microbiana, presentando para Staphylococcus aureus y Escherichia
colilas concentraciones mínimas inhibitorias, de 97% (8 µg/ml) y 48,8 %(2 µg/ml)
respectivamente algo que evidencio (Naveda G. 2010) en los extractos de Thymus
vulgaris, Ruta graveolens y Larrea tridentata en hexano, acetato de etilo y alcohol
etílico, encontraron entre un 60 a 65% de actividad contra Streptococcus agalactiae
y Staphylococcus aureus, en comparación a la amoxicilina y Gentamicina.
En el trabajo de investigación encontramos que el extracto etanólico de las hojas de
Ruta graveolens “Ruda”, presenta actividad antibacteriana contra bacterias Gram
negativos (Escherichia coli) a una concentración de 0.25 mg/ml, al igual que el
estudio realizado por Bayoud, (2007) con la misma especie de planta en estudio, a
una concentración de 10mg/ml, demostró que presenta buena actividad
antibacteriana contra Gram negativas (Pseudomonas aeruginosa).
El extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda” demostró tener buena
actividad antibacteriana, frente a la bacteria intrahospitalaria Staphylococcus
56
aureus, en el caso de Lujan col, (2007) también demostró tener actividad
antibacteriana del extracto etanólico de Ruda (Ruta graveolens), Tomillo (Thymus
vulgaris), Perejil (Petroselinum sativums), contra la cepa intrahospitalaria con
resistencia múltiple a Staphylococcus aureus.
En el presente estudio se demostró, mediante el método de macrodilución, que el
extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda” presentó efecto
antibacteriano, al inhibir el crecimiento In Vitro de la bacteria Staphylococcus
aureus y este resultados coinciden con lo registrado por, Alonso J., Helsinki 2004
quien en su investigación obtuvo como resultado, donde el extracto de Ruta
graveolens presenta efecto inhibitorio sobre Staphylococcus aureus. Encontramos
como concentración inhibitoria para Staphylococcus aureus a 0.5 mg/ml mientras
que en el estudio de Alonso J., Helsinki 2004 la concentración inhibitoria para la
misma bacteria fue de 12,5 mg/ml. Lo mismo demostró Naveda G. 2010 con el
extracto etanólico de Ruta graveolens “Ruda” frente a Staphylococcus aureus,
pero con una concentración mínima inhibitoria de 22.85 mg/ml, lo que nos indica
que esta bacteria es sensible a este tipo de extracto.
57
3.3. CONCLUSIONES
Se determinó que el extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda”
presentan buena actividad
En el Tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de las hojas de Ruta
graveolens “Ruda”; se demostró la presencia de alcaloides, fenoles, flavonoides,
cumarinas, saponinas, esteroides, triterpenos.
La Concentración Inhibitoria Mínima (CMI) del extracto etanólico de las hojas
de Ruta graveolens “Ruda” obteniendo una concentración de 0.5 mg/ml para
Staphylococcus aureus
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de las hojas
de Ruta graveolens “Ruda” obteniendo una concentración de 0.25 mg/ml para
Escherichia coli
El extracto etanólico de las hojas de Ruta graveolens “Ruda”, evaluado
mediante el método de macrodilución en caldo, se obtuvo una concentración
inhibitoria mínima de 0.5 mg/ml frente a Staphylococcus aureus y 0.25 mg/ml
frente a Escherichia coli, clasificándolo como buena actividad, esto en
comparación con el control positivo (Gentamicina).
58
3.4. RECOMENDACIONES
Fomentar a seguir adelante con el estudio de las otras partes de la planta Ruta
graveolens “Ruda”, ya que hay poca información. Realizar diseños de ensayos
antibacteriano con diferentes controles positivos y cepas de bacterias a esta
especie vegetal con el objetivo de profundizar su estudio.
Evaluar el extracto en estudio y con otros solventes con otras pruebas como
disco difusión, E – test, microdilución u otras pruebas en caldo o agar.
Continuar el presente trabajo para determinar cuál de los metabolitos
secundarios es el que otorga la actividad antibacteriana.
59
3.5. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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60
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aureus,con resistencia mutiple, Torreon, Universidad Agraria Antonio Narro,
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10) Alonso J.: Tratado de fitofármacos y nutracéuticos. 1ºEd. Editorial Corpus
Libros. Rosario. Argentina. pág: 939-944. 2004
11) Naveda G.;”Establecimiento de un Proceso de Obstencion de Extracto de
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Ingenieria Quimica y Agroindustria.Ecuador. pag. 72.2010
12) Pokorny J., Yanishieva N., Gordon. ; antioxidants de los alimentos: aplicaiones
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61
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19) Kuskoski, E. M., et al: "Aplicación de diversos métodos químicos para
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62
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30) Drasar BS, Hill MJ. Human intestinal flora. Academic Press, London, UK.,
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31) Lynch, R., Mellor, E.: Métodos de laboratorio, Segunda edición, Nueva
editorial Interamericana, México - México,(9) pag 924 - 925.1972
32) Brook G. Carroll K. Butel J. Morse S. Microbiología médica. 19ª Edición.
Editorial Manual moderno. Bogotá – Colombia. pag 235 - 275. 2008
33) Taroco, V. Seija, R. Vignoli: Métodos de estudio de la sensibilidad
antibiótica. Procedimientos de Microbiología Clínica.; pag. 663 - 670. 2001
34) Sacsaquispe R. Velásquez J.: Manual de procedimientos para la prueba de
sensibilidad antimicrobiana por el método de Disco Difusión. Ministerio de
Salud, Instituto Nacional de Salud, pag 10 – 21. 2002.
35) Lock O.: Investigacion fotoquimica. Segunda edicion. Peru Pontificia
UniversidadCatolica del Peru Fondo editorial, 1994.
36) Guerra G.: Bioseguridad en el Laboratorio. Bioseguridad. Ministerio de
Salud del PERÚ, Instituto Nacional de Salud-INS. Organismo Público
Descentralizado del Sector Salud, pag 15 – 19. 2000.
37) Rodríguez J. : Manual de bioseguridad de Microbiología, 2008
63
3.6. ANEXOS
ANEXO N° 01
Preparación del Agar Mueller Hinton
1. Preparar el medio a partir de la base deshidratada de acuerdo a las indicaciones
del fabricante.
2. Autoclavar y dejar enfriar en baño de agua hasta que alcance los 45°C - 50°C.
3. Una vez esterilizado y solidificado, medir el pH del agar. El valor del mismo
debe encontrarse entre 7,2 y 7,4 a temperatura ambiente. Esta medición puede
realizarse:
a. Utilizando un electrodo de superficie
b. Macerando el medio en agua destilada y utilizando un electrodo de inmersión
c. Solidificando el agar con el electrodo del potenciómetro
4. Repartir el medio en placas petri (60 ml – 70 ml o 25 ml – 30 ml, para placas de
150 mm o 100 mm de diámetro interno respectivamente), de manera que el
grosor del agar en la placa sea de 4 mm.
5. Realizar las pruebas de esterilidad para cada lote de Mueller Hinton, incubando
una o dos placas de cada lote a 30°C – 35°C durante 24 horas o más. Estas
placas utilizadas deben ser, luego, descartadas.
Fuente: Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antibacteriana
por el método de Disco Difusión. Ministerio de Salud, Instituto Nacional de
Salud 29.
64
ANEXO N° 02
Recuperación de Cultivos Conservados
1. Congelados:
Descongelar a temperatura ambiente o en baño de agua a 36°C – 37°C. Transferir
una alícuota del criotubo a un medio apropiado como agar tripticasa soya.
2. Cultivos en agar:
Con asa de siembra estéril romper el agar y tomar una asada para sembrar en medio
sólido o caldo tripticasa soya.
Incubar a 35 – 37°C durante 18 – 24 horas, y antes de utilizarlos realizar
previamente otro subcultivo obteniendo colonias aisladas.
Fuente: Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antibacteriana
por el método de Disco Difusión. Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud
29
65
ANEXO N° 03
Preparación del Estándar (0,5 Mc. Farland) para el Inóculo
1. Para estandarizar la densidad del inóculo se usa una suspensión de sulfato de
bario (0,5 de la escala de Mc Farland) como estándar.
2. Preparación del estándar de turbidez.
a. Agregar 0,5 ml de una solución de BaCl2 0,048 M (BaCl22H2O al 1,175%
P/V) a 99,5 ml de una solución de H2SO4 0,18 M (0,36 N) (1% V/V) en
constante movimiento para mantener la suspensión.
b. Verificar la densidad correcta del estándar usando un fotocolorímetro o
espectrofotómetro, cuya absorbancia a 625 nm es 0,08 a 0,10 para el estándar
0,5 de Mc. Farland.
c. Distribuir de 4 ml a 6 ml en tubos con tapa de rosca o tapón de jebe, similares
a los que se usarán para preparar el inóculo.
d. Ajustar bien las tapas o tapones y conservarlos en la oscuridad a temperatura
ambiente y anotar la fecha de preparación.
e. Antes de ser usado agitar vigorosamente dicho estándar de preferencia, en un
agitador mecánico.
f. Verificar mensualmente la densidad de los estándares de sulfato de bario, y
reemplazarlo cuando sea necesario.
Fuente: Manual de procedimientos para la prueba de sensibilidad antimicrobiana
por el método de Disco Difusión. Ministerio de Salud, Instituto Nacional de Salud
66
ANEXO N° 04
ESQUEMA: Obtención del extracto Etanólico de las hojas de Ruta graveolens
“Ruda”
Etanólico una semana por
2 meses y medio, cada 7
días.
Rotavapor
Materia Prima
Hojas
Extracto
Etanólico
Concentración
Extracción
Secado
Molienda
Actividad
Antibacteriana
67
ANEXO N° 05
FIGURA:Procedimiento para la preparación y el control de calidad de la
turbidez estándar de Mc Farland.
68
ANEXO N° 06
(*) FUENTE: ELABORADO POR LOS AUTORES
Dónde: (1) concentración de 32 mg/ml; (2) concentración de 16 mg/ml; (3)
concentración de 8 mg/ml; (4) concentración de 4 mg/ml; (5) concentración de 2
mg/ml; (6) concentración de 1 mg/ml; (7) concentración de 0.5 mg/ml; (8)
concentración de 0.25 mg/ml; (C) concentración de 0 mg/ml
69
ANEXO N° 07
(*) FUENTE: ELABORADO POR LOS AUTORES
Dónde: (1) concentración de 512 ug/ml; (2) concentración de 216 ug/ml; (3)
concentración de 128 ug/ml; (4) concentración de 64 ug/ml; (5) concentración de
32 ug/ml; (6) concentración de 16ug/ml; (7) concentración de 8ug/ml; (8)
concentración de 4ug/ml; concentración de 2 ug/ml; (C) concentración de 0 ug/ml
70
ANEXO N° 08
Datos de Pasaporte de Colección de Especies de las Plantas Medicinales en
Estudio
Descripción de Datos de la Especie Ruta graveolens“Ruda”
Nº de Ficha: ……………….
FICHA DE CAMPO
DATOS GENERALES:
Lugar de colección:……………..…..Distrito:……………..…….Provincia:…………...….…
Fecha:………………………………..Tipo de Bosque:………………………………………..
Coordenadas UTM: (X)…………………..………… (Y)…………………………………..…..
Tipo de Suelo:……………………………..Otras características:…………………………....
Nombre del Colector:……………………………………………..Nº Colección:……………..
TAXONOMÍA:
Familia Vegetal:………………..……………Nombre Científico:………………….………….
Nombre Vulgar:…………………………………………………………………………………..
CARACTERÍSTICAS VEGETALES:
Habitat:…………………………..Estadío Productivo:………………………………….……..
Posición de Hojas:……………….Presencia de Órganos Accesorios en Hojas:………….
Forma del Tallo:………………….Órganos Accesorios en Tallo:……………………………
Características de la Corteza:………….…Látex:………….Color de Látex:………….…....
Tipo de Inflorescencia:………….Posición de Inflorescencia:…………..............................
Tipo de Flor por Sexo:.................Nº de Pétalos:................Unión de Sépalos:…….……..
N de Estambres:..........................Posición de Estambres:…….........................................
Posición de Ovarios:…………....................Nº de Carpelos:…………………….…..………
Tipo de Fruto:…………………….Consistencia:…………..…..Dehiscencia:…….……..….
DATOS ETNOFARMACOLÓGICOS:
Uso Medicinal 1:………………………….…Parte Usada:…………………….................
Cantidad Usada .:…………………………… Forma de Preparación:………….................
Uso Medicinal 2:………………………….…Parte Usada:…………………….................
Cantidad Usada .:…………………………… Forma de Preparación:………….................
Uso Medicinal 3:…………………………… Parte Usada:……………………..................
Cantidad Usada .:…………………………… Forma de Preparación:………….................
COLECTA DE MATERIAL BIOLÓGICO:
Peso:………………………………………………………………………........…………......…...
Parte Colectada:………………………………………………………………………..................
Observaciones:……………………………………………………….............................................
...................................................................................................………………....................
71
ANEXO N° 09
CONSTANCIA DE LA MUESTRA BOTÁNICA
72
ANEXO N° 10
Imagen Satelital de la Ubicación Geográfica de la Comunidad de Nina Rumi.
IMAGEN: Ubicación Geográfica de Zona Campesina Nina Rumi.
73
ANEXO N° 11
Ruta graveolens “Ruda”
FOTO N° 01: Pesado de las hojas deRuta graveolens “Ruda”
ANEXO N° 12
OBTENCIÓN DEL EXTRACTO ETANOLICO DE LAS HOJAS DE Ruta
graveolens
FOTO N° 02 y 03:Proceso de extracción etanólica de las hojas de Ruta
graveolens. “Ruda” mediante extracción en rotavapor realizado en el Laboratorio
de Fitoquímica de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad
Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP).
74
BACTERIA PARA EL ESTUDIO DE INVESTIGACION
FOTO N° 04:Cepas certificadas de Escherichia coli proporcionados por El
Instituto Nacional de Salud INS – Perú, almacenadas en refrigeración óptima.
FOTO N° 05:Cepas certificadas de Staphylococcus aureus proporcionados por El
Instituto Nacional de Salud INS – Perú, almacenadas en refrigeración óptima.
75
TUBOS CON ESCALA DE MC FARLAND
FOTO N° 06 y 07: Para comparar y obtener el inoculo de turbidez de MC Farland.
PREPARACIÓN DEL CALDO PARA LAS COLONIAS DE BACTERIAS
FOTO N° 08 y 09: Placas petri con caldo para el crecimiento de bacterias
76
MUESTRAS BACTERIOLÓGICAS DEL ESTUDIO.
FOTO N° 10 y 11: Escherichia coli es quizás el microorganismo procariota más
estudiado por el ser humano, se trata de una bacteria que se encuentra generalmente
en los intestinos animales, por ende en las aguas negras.
FOTO N° 12 y 13:Staphylococcus aureus, conocido comúnmente como
estafilococo áureo o dorado, es una bacteria anaerobia Gram positiva productora de
coagulasa y catalasa que se encuentra ampliamente distribuida por todo el mundo,
estimándose que una de cada tres personas se hallan colonizadas, pero no
infectadas, por ella.
77
EXTRACTO SECO EN POLVO DE Ruta graveolens“ruda”
FOTO N° 14 y 15:Muestra seca en polvo de Ruta graveolens rotulada
PREPARACIÓN PARA SOLUCIÓN MADRE
FOTO N° 16 y17:Sepesó 640mg del extracto de Ruta graveolens. “Ruda” y se
diluyó en etanol.
78
HOMOGENIZACIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE
FOTO N° 18 y 19: El Equipo vortex permitió la homogenización de la solución
madre de Ruta graveolens. “Ruda”
SOLUCIÓN MADRE
FOTO N° 20 y 21:Solución madre de Ruta graveolens. “Ruda” debidamente
homogenizada.
79
CALDO MULLER HINTON
FOTO N° 22: Caldo Müeller Hinton parael Método de Macrodilución.
PROCEDIMIENTO - MOTODO DE MACRODILUCIÓN
FOTO N° 23: Tubos de ensayo con caldo Müeller Hinton
80
EXTRACCIÓN DE COLONIAS
FOTO N° 24 y 25: Del Sembrío de agar se extrajo colonias de Escherichia coli
(B)
FOTO N° 26 y 27: Del Sembrío de agar se extrajo colonias de Staphylococcus
aureus (A)
81
PREPARACIÓN DEL INOCULO DEL ENSAYO
FOTO N° 28: Preparación del inoculo de la bacteria Escherichia coli para el
ensayo de la actividad antibacteriana
FOTO N° 29: Preparación del inoculo de la bacteria Staphylococcus aureus (A)
para el ensayo de la actividad antibacteriana
82
TUBOS CON LAS MUESTRAS BACTERIOLÓGICAS EN ESTUDIO
FOTO N° 30 y 31: Comparación bacteriológica de Escherichia coli (B) con la
escala 0.5 de la turbidez Mac Farland.
FOTO N° 32 y 33: Comparación bacteriológica de Staphylococcus aureus (A) con
la escala 0.5 de la turbidez Mac Farland.
83
EXTRACCIÓN DE LA SOLUCIÓN MADRE HACIA LOS TUBOS DE
ENSAYO
FOTO N° 34 y 35: Se extrajo de la solución madre y agrega a los tubos con caldo
Müeller Hinton y bacteria de Escherichia coli (B)
FOTO N° 36 y 37: Se extrajo de la solución madre y se agrega a los tubos con
caldo Müeller Hinton y bacteria de Staphylococcus aureus (A).
84
RESULDOS
FOTO 38: Concentración inhibitoria mínima para Escherichia coli
FOTO 39: Concentración inhibitoria mínima para Staphylococcus aureus.
85
CONTROL POSITIVO EN LA PRUEBA
FOTO N° 40: Se extrajo el antibiótico para el control positivo en la prueba
FOTO N° 41: Tubos de ensayo con el antibiótico Gentamicina para observar la
concentración inhibitoria mínima
86
EQUIPOS DE ESTERILIZACIÓN
FOTO N° 42 y 43: Equipos que se utilizaron para esterilizar los materiales de
laboratorio
ALGUNOS EQUIPOS UTILIZADOS
FOTO N° 44 y 45: Balanza Analítica para pesar la muestra en polvo de Ruta
graveolens y Sembrío e incubación de las cepas bacteriológicas.
