CUMARINAS 12
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0 CUMARINAS CONTENIDO Pgs. I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….2 II. PRINCIPIOS TEORICOS…………………………………………………...3 III. DETALLES EXPERIMENTALES 3.1 Materiales………………………………………………………………...6 3.2 Reactivos………………………………………………………………...6 3.3 Muestra…………………………………………………………………...6 3.4 Procedimiento 3.4.1 Obtención del Extracto………………………………………….7 3.4.2 Reacción de identificación……………………………………...9 3.4.2.1 resultados…………………………………………………….9 3.4.3 Análisis cromatográfico………………………………………...10 IV. REACCIONES QUÍMICAS………………………………………………....11 V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS y CONCLUSIONES……………...…...12 VI. RECOMENDACIONES……………………………………………………..12 VII. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………….......13 VIII. CUESTIONARIO…………………………………………………………….14
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CUMARINAS
CONTENIDO
Pgs.
I. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………….2
II. PRINCIPIOS TEORICOS…………………………………………………...3
III. DETALLES EXPERIMENTALES3.1 Materiales………………………………………………………………...63.2 Reactivos………………………………………………………………...63.3 Muestra…………………………………………………………………...63.4 Procedimiento 3.4.1 Obtención del Extracto………………………………………….7 3.4.2 Reacción de identificación……………………………………...9 3.4.2.1 resultados…………………………………………………….9 3.4.3 Análisis cromatográfico………………………………………...10
IV. REACCIONES QUÍMICAS………………………………………………....11
V. DISCUSIÓN DE RESULTADOS y CONCLUSIONES……………...…...12
VI. RECOMENDACIONES……………………………………………………..12
VII. BIBLIOGRAFÍA………………………………………………………….......13
VIII. CUESTIONARIO…………………………………………………………….14
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CUMARINAS
I. INTRODUCCIÓN
Las cumarinas están biogenéticamente relacionadas a los fenilpropanos
como flavonoides y ligninas así como a las sustancias derivadas del acetato,
como esteroides y terpenoides, ya que la biosíntesis trascurre por ambas vías
shikimato y policetido del acetato.
Las cumarinas debido a su anillo lactónico, son solubles en soluciones acuosas
o alcohólicas de NaOH dando una coloración amarilla.
Las cumarinas son productos naturales ampliamente distribuidos en la
naturaleza. En el humano el principal metabolito de la cumarina es la 7-
hidroxicumarina, el cual es la forma activa del compuesto. Estos y otros
compuestos relacionados presentan actividades biológicas de importancia
terapéutica, entre las cuales destaca su efecto antitumoral.
En esta práctica se realizo la extracción de la cumarina a partir de la ruda la cual
se seco por dos días en la estufa, luego se trituró y colocó en un cartucho para
llevarla al soxhelt, posteriormente se realizaron las pruebas de identificación en
el papel watman y finalmente se realizó el análisis cromatográfico (CCD)
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CUMARINAS
II. PRINCIPIOS TEÓRICOS
CUMARINAS
Las cumarinas son compuestos ampliamente distribuidos en las plantas, principalmente en las familias Umbeliferae y Rutaceae; se encuetran en todas las partes de la planta desde la razí a flores y frutos siendo más abundante en estos últimos; se presentan a menudo como mezclas, en forma libre o como glicósidos. Los desarrollos en los procesos de aislamiento y análisis estructural en estos últimos años han conducido a un marcado incremento en el número de cumarinas aisladas de plantas; ello unido al interés despertado por el amplio rango de actividad biológica que muchas cumarinas han mostrado, como por ejemplo la acción anticoagulante y antibacterial del dicumarol, la acción antibiótica de la novobiocina, el agua hepatotoxidad y carninogenicidad de ciertas aflatoxinas astrogénica del cumestrol, la acción fotosensibilizadora de furanocumarinas como el bergapteno y la xantotoxina, la acción insexticida de los surangin A y B, entre otros; cabe destacar también las aplicaciones de las cumarinas como saborizantes y en perfumería. (Figura 6) Las cumarinas de las cuales solo el 5% aproximadamente carece de oxígeno en la posición 7, pueden clasificarse como:
Simples, o sus derviados hidroxilados, alcoxilados y alquilados, y sus glicósidos.
Furanocumarinas, lineales o angulars Piranocumarinas, análogas a las anteriores con un anillo de pirano,
pueden ser también lineales o angulares. Cumarinas preniladas, y Cumarinas sustituidas en el anillo de pirona.
Proceden de la lactonización del ácido 2-hidroxi-cinámico
•Sustituciones en el C-7: OH.
•Tri-hidroxiladas en 6,7,8
•OH: metilarse, heterósidos : Ej.: Fraxósido, Esculósido
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CUMARINAS
•Cumarinas policíclicas:
-Furanocumarinas: Ej . Bergapteno, Psoraleno
-Piranocumarinas: Ej.: Visnadina
Con el nombre de cumarinas se conoce a un grupo muy amplio de principios
activos fenólicos que se encuentran en plantas medicinales y tienen en común
una estructura química de 2H-1-benzopiran-2-ona, denominada cumarina. Sobre
esta estructura, que se origina biosintéticamente por lactonización del ácido
cumarínico (2-hidroxi-Z-cinámico), se disponen sustituyentes de distinta
naturaleza química lo que da lugar a distintos tipos de cumarinas: sencillas y
complejas.
Prácticamente todas las cumarinas, a excepción de la cumarina propiamente
dicha, poseen un sustituyente hidroxílico en posición 7 ya sea libre, como
sucede en la umbeliferona, o combinado (metilo, azúcares, etc.). Las cumarinas
sencillas pueden poseer además hidroxilos adicionales también libres o
combinados. Ejemplo de ellas son el esculetol del castaño de Indias con dos
hidroxilos libres sobre los carbonos C-5 y C-7 o el escopoletol presente en
algunas Solanáceas (belladona) que posee un hidroximetilo en C-5 y un
hidroxilo libre en C-7.
•Distribución:
Ampliamente distribuidas:
-ASTERÁCEAS
-FABÁCEAS
-APIÁCEAS
-RUTÁCEAS
•Propiedades físico-químicas: extracción y caracterización
-Sólidos cristalizables
-Color blanco o amarillento
-Frecuentemente en forma de heterósidos por los grupos OH
-Solubilidad:
-glucósidos: mezclas hidroalcohólicas
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-geninas: disolventes orgánicos apolares (ac. de etilo; cloroformo, eter
-Fluorescencia a la luz UV: azul, amarillo o púrpura)
•Identificación:
-Extracción con mezclas hidroalcohólicas
-Separación por CCF
-Identificación : luz UV
•Valoración
-Técnicas espectrofluorimétricas
•Importancia farmacológica: (Limitada)
•Entre las principales:
•Vitamínica P
•Tónicos venosos (esculósido)
•Fotosensibilizantes (psoraleno)
•Vasodilatadores coronarios (visnadina)
•Anticoagulantes (dicumarol)
Drogas con cumarinas:
•Meliloto
•Castaño de Indias
•Kela
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III. DETALLES EXPERIMENTALES
3.1 Materiales:
2 vasos de 250 mLEquipo soxhletEquipo CCDLámpara uv 365nmBaguetaProbetaCromatofolio 2.1 x 4.8cm
3.2 Reactivos:
Etanol NaOH 10%
Sistema: hexano : EtOAc (3:1)
CHCl3 : MeOH (1:1)
3.3 Muestra:
Ruda
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3.4Procedimiento
3.4.1Obtención del extracto
Se pesó unos 30g aproximadamente de hojas de ruda, y se llevo a un extractor
soxhlet con EtOH durante 3 horas. Se concentro en un rotavapor.
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Referencias:
1. buzo / agitador / granallas o esferas.2. Balón.3. brazo para ascenso del vapor.4. cartucho de extracción o cartucho Soxhlet.5. muestra (residuo).6. entrada del sifón.7. descarga del sifón.8. Adaptador.9. refrigerante (condensador).10.entrada de agua de refrigeración.11.salida de agua de refrigeración.
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3.4.2 Reacción de identificación:
Métodos cualitativos
3.4.2.1Resultados
Para la reacción de identificación se obtuvo una coloración amarilla fluorescente.
3.4.3 Análisis Cromatográfico
Del extracto obtenido se le practico una CCD. Para ello se realizo usando los sistemas:
Sistema: hexano : EtOAc (3:1)
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CHCl3 : MeOH (1:1)
FLUORESCENCIA VERDE
Se calculo el Coeficiente de Reparto (RF) :
RF = Distancia recorrida por la muestra (cm) Distancia recorrida por el solvente(cm)
Sistema 1: hexano : EtOAc (3:1)
MuestraRuda
BANDA 1 BANDA 2 BANDA 3
Distancia recorrida por La muestra
(cm)
5.0 5.0 5.0
Distancia recorrida por el solvente
(cm)
1.8 3.8 4.4
RF 0.36 0.76 0.88
Sistema 2:CHCl3 : MeOH (1:1)
MuestraRuda
BANDA 1
Distancia recorrida por La muestra
(cm)
4.9
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Distancia recorrida por el solvente
(cm)
4.05
RF 0.827
IV. REACCIONES QUÍMICAS
V. DISCUSION DE RESULTADOS y CONCLUSIONES
La ruda dio un resultado positivo para ambas pruebas debido a la alta
presencia de cumarinas y furanocumarinas como el bergapteno.
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Las cumarinas debido a su anillo lactónico son solubles en soluciones
acuosas o alcohólicas de NaOH dando una coloración amarilla.
La muestra tratada con hidróxido de sodio 1 mol/L provoca una marcada
disminución de la cumarina, lo cual evidencia una degradación del
compuesto en este medio, aspecto que era de esperar pues se conoce
que las cumarinas presentan en su estructura un agrupamiento lactónico,
los cuales en medio básico sufren rompimiento del anillo y forman sales
de cadenas abiertas.
El método para extraer cumarinas de manera confiable es utilizando el
método soxhlet.
Las furanocumarinas presentan actividad fotosensible debido a la
reactividad del estado triplete que presentan las cumarinas que se genera
cuando estas interactúan con la radiación UV.
La extracción de las cumarinas puede realizarse tanto sobre material seco como
fresco, con solventes de polaridades diferentes, dependiendo de los tipos de
estructura, algunas son ligeramente solubles en solventes apolares.
VI. RECOMENDACIONES
Dado que los ensayos son cualitativos se debe usar una cantidad
adecuada de muestra para poder notar el cambio de coloración y dar una
respuesta de veracidad.
Cuando se prepara el sistema de cromatografía de capa delgada, los cromatofolios no deben ser movidos del solvente, es decir no se debe trasladar de un lugar a otro hasta que el solvente haya alcanzado la distancia máxima.
VII. BIBLIOGRAFÍA
Domínguez, Xorge A. Métodos de Investigación fotoquímica. Editorial
Limusa, México, 1973
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Lock de Ugaz. Investigación Fotoquímica, Segunda Edición. 1994.
Editorial fondo PUCP. Pág 146-160
G. G Alicia, Burton Seldes y Gerardo, Introducción al Estudio de los
Productos Naturales, Tercera Edición, Tomo 14 1985
García Barriga, Hdo. Flora Medicinal de Colombia: Tomo II Instituto
Nacional de Ciencias Naturales Bogotá Colombia, 1975, p 340
http://es.wikipedia.org/wiki/cumarina#mw-head
http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htm
http://farmacia.udea.edu.com
http://www.elergonomista.com/fitoterapia/cumarinas.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Extractor_Soxhlet
VIII. CUESTIONARIO
1.- cuales son las funciones de actividad biologica de estos compuestos.
De 5 ejemplos con su actividad biologica
Sus principales actividades son:
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a) Tienen propiedades vitamínicas, disminuyen la permeabilidad capilar y
aumentan la resistencia de las paredes de capilares (protegen la fragilidad
capilar y actúan como tónico venoso).
b) Las piranocumarinas tienen acción antiespasmódica y vasodilatadora de
coronarias.
c) Algunos tienen propiedades sedantes, como la angelicina.
d) Acción antibacteriana.
e) Reconocimiento de algunas drogas (mana, solanacaeas midriaticas,
castaño de indias).
2.- Nombre 5 cumarinas con sus estructuras.
La Psoralen (furanocumarina): Escopoletina (hidroxicumarina):
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CUMARINAS
Umbeliferona (hidroxicumarina):
3.- ¿a qué cree ud que se debe la fotosensibilidad de estos compuestos?
Esta actividad fotosensibilizante es explicable debido a la reactividad del estado
triplete de las furanocumarinas que se genera cuando estas interactúan con la
radiación UV y cuyas posibles reacciones se pueden agrupar en dos categorías.
- Los fotoenlaces directos con macromoléculas como el DNA, el RNA y las
proteínas.
- Las fotomodificaciones indirectas a los sustratos biológicos a través de
formas reactivas del oxigeno.
Las furanocumarinas se han usado, junto con la radiación UV en el tratamiento
de varias enfermedades d la piel como psoriasis, el vitiligio y la micosis
fungoides; el bergapteno, además se usan como protectores solares en
preparaciones cosméticas.
La actividad fotosensibilizante de las furanocumarinas sobre las células, se
manifiesta como fototoxicidad que altera y desorganiza numerosos procesos
biológicos en diferentes tipos de células como células bacteriales o fúngicas, en
virus a nivel de DNA, en células de mamíferos in vitro, en tejidos vegetales, y en
células epidérmicas en aves y mamíferos.
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4.- ¿Porque se usa la cromatografia para su detección? cual es la
diferencia de usar una cromatografia de celulosa y otra de silicagel?
Se usa la cromatografía por ser un método sencillo que nos permite ver a través
de la lámpara UV y porque permite una buena expansión, permitiendo así
separarse de alguna impureza que se encuentre.
Cromatografía en papel:
Es un proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar análisis cualitativos
ya que pese a no ser una única técnica muy potente no requiere de ningún tipo
de equipamiento.
La fase estacionaria está constituida simplemente por una tira de papel de filtro.
La muestra se deposita en un extremo colocando pequeñas gotas de la solución
y evaporando el solvente. Luego el disolvente empleado como la fase móvil se
hace ascender por capilaridad. Esto es, se coloca la tira de papel verticalmente y
con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase móvil
en el fondo.
Después de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al
extremo se retira el papel y seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las
sustancias tienen color propio se verán las manchas de distinto color separadas.
Cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos
de revelado.
Hay varios factores de los cuales depende una cromatografía eficaz: la elección
dl solvente y la del papel de filtro.
Cromatografía de silicagel:
La muestra aplicada en la capa es adsorbida en la superficie del material por la
acción de fuerzas electrostáticas (fuerzas de Van der Waals, puentes de
Hidrógeno, efectos inductivos, etc). Luego, cuando la capa es expuesta a un flujo
por acción capilar, se inicia una competencia de enlaces entre los sitios activos
del adsorbente y la sustancia con el solvente.
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La diferencia es que se pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre
l papel destruirán el cromatograma.
5.- ¿que son aflatoxinas? ¿Cómo se forman? ¿Quién las produce? ¿Cómo
se les puede identificar?
Las aflatoxinas son micotoxinas producidas por muchas especies del género de
hongos Aspergillus , como metabolitos secundarios.
Las aflatoxinas son un grupo de compuestos que cobraron importancia a partir
de la muerte repentina en Escocia (1960), de cien mil pavos alimentados con
maní infectado con una especie fúngica: Aspergilus flavus proveniente del Brasil.
Las aflatoxinas son generadas por diferentes especies de hongos que aparecen
en distintos cultivos que se encuentren expuestos a altas temperaturas durante
bastante tiempo o por el contrario están sufriendo sequias severas, condiciones
que se dan en países con climas húmedos y cálidos.
Los cultivos afectados por los hongos comprenden cereales, especias,
oleaginosas, etc. Cuanto más propicias son las condiciones, mayores son los
niveles de aflatoxinas.
El crecimiento de este hongo se ve afectado por la termohigrotropía, es decir
que responde al estímulo de la temperatura y la humedad relativa de la
atmósfera y del sustrato. Así, la formación de aflatoxinas en el maní tiene lugar si
este se almacena entre 20° y 40°C con un 10-20% de humedad y con un 70-
90% de humedad relativa en el aire: el crecimiento del hongo se ve favorecido si
los granos están dañados por insectos o roedores. Pero, aún en ausencia de
estas condiciones, si ya han germinado algunas esporas en el sustrato, se
pueden formar "nichos ecológicos" que favorecen el desarrollo de sectores con
micelios generadores de aflatoxinas porque al crecer produce agua por
respiración aumentando así la humedad de algunas semillas o granos.
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6.- ¿en qué tipos de alimentos se pueden formar las aflatoxinas y que daño
causaría al hombre?
Los micelios de ésta y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son
capaces de colonizar semillas y tortas de oleaginosas de maní, girasol, algodón,
soja, sésamo, avellanas, almendras y cereales y sus derivados dispuestos en
sacos o silos.
Los posibles efectos que se pueden mostrar en el hombre pueden ser:
La aflatoxicosis aguda cuando se consumen niveles medios a altos de
aflatoxinas. Los efectos de esta intoxicación pueden incluir hemorragia, daño
agudo del hígado, el edema, la alteración en la digestión, la absorción y/o el
metabolismo de alimentos, y posiblemente la muerte.
La aflatoxicosis crónica resulta del consumo de niveles bajos a moderados de
aflatoxinas. Los efectos son generalmente subclínicos y difíciles de reconocer.
Algunos de los síntomas comunes son una difícil y deteriorada absorción de los
alimentos e índices de crecimiento más lento.
Para que un animal (o ser humano) haya muerto por causa de aflatoxinas debió
ser suministrado con grandes dosis de las mismas -y 'posiblemente' durante
largo tiempo-, esto pone en duda la cadena entera de control de calidad sobre la
que el gobierno nacional (además de la empresa) tiene una gran cuota de
responsabilidad.
7.- ¿que son ligninas? de ej. con sus respectivas estructuras.
La lignina es un grupo de compuestos químicos usados en las paredes
celulares de las plantas para crear madera.
La palabra lignina proviene del término latino lignum, que significa madera; así, a
las plantas que contienen gran cantidad de lignina se las denomina leñosas.
La lignina está formada por la extracción irreversible del agua de los azúcares,
creando compuestos aromáticos. Los polímeros de lignina son estructuras
transconectadas con un peso molecular de 10.000 uma.
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CUMARINAS
Se caracteriza por ser un complejo aromático (no carbohidrato) del que existen
muchos polímeros estructurales (ligninas). Resulta conveniente utilizar el término
lignina en un sentido colectivo para señalar la fracción lignina de la fibra.
Después de los polisacáridos, la lignina es el polímero orgánico más abundante
en el mundo vegetal. Es importante destacar que es la única fibra no
polisacárido que se conoce.
Las ligninas son polímeros insolubles en ácidos y solubles en álcalis fuertes
como el hidróxido de sodio, que no se digieren ni se absorben y tampoco son
atacados por la microflora del colon. Pueden ligarse a los ácidos biliares y otros
compuestos orgánicos (por ejemplo, colesterol), retrasando o disminuyendo la
absorción en el intestino delgado de dichos componentes.
Estructura generalizada de la Lignina (reproducida con permiso de "Real-
World Cases in Green Chemistry," copyright 2000 de la Sociedad Americana de
Química)
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8.- ¿porque es importante el uso de bloqueadores solares?
Son importantes porque evita que los rayos UV e IR penetren la piel de manera
intensa, se dice intensa por el debilitamiento de la capa de ozono.
son productos que tienen ingredientes químicos que nos ayudan a protegernos
de la radiación UV. El mecanismo de acción es por absorción, reflexión y
dispersión de los rayos ultravioleta que llegan a la piel. Incrementa su acción la
capacidad que tenga el bloqueador para adherirse. Es importante usar
bloqueadores solares porque estos podrían causar:
Cáncer de piel, tiene una rápida ramificación que podría producir
metástesis en otros órganos del cuerpo. Pudiendo llegar a producir la
muerte.
Debilitamiento de las defensas del organismo
Manchas en la piel
Daños en los ojos
Foto envejecimiento
9.-¿ qué tipo de cumarinas está presente en la ruda y el apio?
Las cumarinas que estan presentes en la ruda y el apio son:
APIO: Piranocumarina de la familia Apiaceae.
RUDA: Furanocumarina (bergapteno y psoraleno) de la familia Rutaceae.
10.- ¿Dónde se encuentran a las cumarinas generalmente?
Se encuentran en los tegumentos d las semillas. Frutos. Flores. Raíces. Hojas. Y
tallos; aunque la mayor concentración se encuentra en general en frutos y flores.
11.-Fundamente el mecanismo de acción.
Acción farmacológica y empleos-Escina-Extracto de Castaño de Indias-Esculósido: tónico venosoProbadas propiedades anti-inflamatorias y antiedematosas•EXPERIMENTALExtracto: protector de pequeños vasos: red capilar•USOS:
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Extracto y escina: componentes de preparados indicados en la insuficienciavenosa: vía tópica y vía oral.
•Flebología:-úlceras varicosas, flebitis•Proctología:-hemorroides, fisuras anales•Traumatología:-edemas, inflamaciones, contusiones
La corteza del tronco: extracción de esculósido
12.- ¿en qué consiste la fluorescencia? Indique 3 ejemplos que reportan
esta propiedad.
La fluorescencia es la propiedad de una sustancia para emitir luz cuando es expuesta a radiaciones del tipo ultravioleta, rayos catódicos o rayos X. Las radiaciones absorbidas (invisibles al ojo humano), son transformadas en luz visible, o sea, de una longitud de onda mayor al incidente.
En el proceso, una molécula absorbe un fotón de alta energía, el cual es emitido como un fotón de baja energía (mayor longitud de onda). La diferencia de energía entre la absorción y la emisión, es disipada como calor (vibraciones moleculares). Todo el proceso es muy corto (millonésimas de segundo) y este tiempo es la principal diferencia con otro conocido fenómeno luminoso, la fosforescencia.
Las sustancias que producen este tipo de radiación se denominan fluoritas, mientras que el fenómeno en sí mismo, se debe a la presencia de materia orgánica o de iones de tierras raras.
Sin embargo, en una muestra de minerales que poseen propiedades fluorescentes, no todos ellos, incluso los que se han extraído de un mismo lugar, presentan la característica luminiscencia. Por otro lado existe una amplia variedad de colores, dependiendo de la longitud de onda emitida.
Existen muchos compuestos naturales y sintéticos que exhiben fluorescencia, y tienen un número de aplicaciones. Algunos animales del fondo del océano, como los ojiverde, usan la fluorescencia.
Las moléculas biológicas pueden ser marcadas con un grupo químico fluorescente (fluorocromo) mediante una reacción química simple, lo cual permite una detección sensible y cuantitativa de la molécula. Algunos ejemplos:
La microscopía de fluorescencia de tejidos, células o estructuras subcelulares es lograda marcando el anticuerpo con un fluorocromo y permitiendo que éste encuentre su antígeno correspondiente presente en la muestra. Al marcar varios anticuerpos con diferentes fluorocromos se puede lograr la visualización de múltiples objetivos dentro de una misma imagen.
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Secuenciación automática de ADN por el método de terminación de la cadena: cada uno de los cuatro ddNTP’s se encuentra marcado con un fluorocromo específico de tal forma que se generan cadenas de diferente longitud que al ser sometidas a una fuente de UV se puede determinar la base nitrogenada terminal de cada cadena debido a la longitud de onda emitida característica de cada fluorocromo.
Gel de agarosa teñido con bromuro de etidio. El bromuro de etidio se intercala en el ADN y fluoresce naranja cuando se expone a luz UV.
Detección de ADN: el compuesto bromuro de etidio, libre de cambiar su conformación en solución, tiene poca fluorescencia. La fluorescencia del bromuro de etidio se aumenta enormemente cuando se une al ADN, de tal forma que este compuesto es muy útil para visualizar la localización de fragmentos de ADN en el método de electroforesis en geles de agarosa. El bromuro de etidio puede ser tóxico por tanto, una alternativa más segura es teñir con SYBR Green.
Microarreglos Inmunología: los sitios de unión de un anticuerpo a un espécimen
microscópico por ejemplo, pueden ser vistos, e incluso cuantificados, empleando la fluorescencia si se le ha unido previamente un grupo químico fluorescente al anticuerpo específico.
La fluorescencia ha sido empleada para el estudio de la estructura y conformación del ADN, así mismo como de proteínas, con técnicas como la transferencia de energía de resonancia, la cual mide distancias a nivel de angstroms. Lo anterior es especialmente importante en complejos de biomoléculas múltiples.
FACS (Citometría) La Proteína Verde Fluorescente (GFP), de la medusa Aequorea victoria,
se ha convertido en una herramienta de investigación muy importante. GFP y otras proteínas relacionadas son usadas como reporteros de un sin número de eventos biológicos incluyendo aquellos de localización subcelular. Los niveles de expresión génica son medidos en algunas ocasiones uniendo el gen de producción de GFP con el gen de interés.
También, diversas moléculas biológicas tienen fluorescencia intrínseca y por tanto, pueden ser empleadas sin necesidad de unirlas a una etiqueta química. Algunas veces, esta fluorescencia intrínseca cambia cuando la molécula se encuentra en un ambiente específico, de tal forma que la distribución o el ligamiento de la molécula pueden ser medidos. La bilirrubina, por ejemplo, es altamente fluorescente cuando se une a la albúmina sérica en un sitio específico.
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La protoporfirina zinc, la cual se encuentra en las células sanguíneas cuando la producción del grupo hemo es inhibido por la existencia de plomo o la ausencia de hierro en la sangre, tiene una fuerte fluorescencia y puede ser, por tanto, empleada para detectar estos problemas.
13.- Esquematice el método de extracción de las cumarinas e indique otro
método de extracción.
METODO DE SOXHLET
MÉTODO DE ANÁLISIS POR CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC)
Para la determinación de cumarina en la muestra, se desarrolló un método de análisis por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC).
Ruda seca por dos días en la estufa
Ruda seca por dos días en la estufa
Molido de muestraMolido de muestra
Llevar al soxhlet con
EtOH durante 3horasLlevar al soxhlet con
EtOH durante 3horas
Análisis Cromatográfico
(CCD)
Análisis Cromatográfico
(CCD)
Reacción de identificación en
papel watman colocando NaOH
10%
Reacción de identificación en
papel watman colocando NaOH
10%
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Este método fue aplicado en la planta Justicia pectoralis Jacq. es una especie vegetal de la familia Acantaceae. Nativa de los trópicos de América, se encuentra tanto en las Antillas, como en la zona continental. Comúnmente recibe diversas denominaciones como son curia (Puerto Rico), sana herida (Jamaica), anador (Brasil), entre otras. En Cuba es conocida como tilo o tila, carpintero o té criollo y se emplea en general como neurosedante en forma de decocción de las hojas frescas o secas,acción esta que ha sido demostrada por diversos autores a lo largo de los últimos 20 años.
Se ha comprobado que entre los elementos mayoritarios que aparecen en los extractos obtenidos a partir de esta planta, se encuentra la cumarina simple, componente al que se le atribuyen propiedades antiinflamatorias, analgésicas y sedantes, entre otras. Estudios recientes, no publicados, han demostrado que después de realizarse diversos fraccionamientos, la acción sedante se mantiene de manera significativa, en las fracciones donde se encuentra presente la cumarina. Por tal razón se ha decidido usar este componente como marcador analítico para el control de la calidad y estudio de estabilidad de la materia prima y las formas terminadas.
Se emplearon para ello las condiciones experimentales siguientes: precolumna Aluspher 100 (RP-select B 5 mm) con columna Lichrospher100, RP 18 (25 cm de longitud y 4 mm de diámetro y 5 micras), utilizándose como fase móvil una mezcla de metanolagua (40:60) y detector UV a una longitud de onda de 274 nm. El flujo de la fase móvil fue de 1 mL/min y el volumen de inyección fue de 20 mL.
La preparación de las muestras se realizó de la manera siguiente: se pesaron con exactitud alrededor de 25 mg de extracto seco y se trasvasaron a un matraz aforado de 25 mL de capacidad. Se adicionaron 15 mL de fase móvil y se agitaron en forma circular hasta disolución de la muestra. Posteriormente se llevó a volumen con fase móvil y se mezcló.
La cuantificación se realizó mediante una curva de calibración de un estándar de referencia de cumarina simple (Aldrich Chemical Co.) que abarcó un rango entre 4,0 y 20,0 mg/mL a partir de una solución madre de 0,22 mg/mL.
Para la validación del método, primeramente se evaluó la especificidad, donde se estudió la influencia de un medio básico sobre el polvo seco, para lo que se colocaron 25 mg del polvo seco en otro tubo para ensayo con tapa de rosca y se adicionó 1 mL de solución de hidróxido de sodio 1 mol/L, se mezcló y se mantuvo por 5 min en estufa a 45 ºC.
Por otro lado, se sometieron muestras del polvo a condiciones extremas de oxidación con peróxido de hidrógeno 30 %. El experimento consistió en colocar 25 mg del polvo en un tubo para ensayo con tapa de rosca, adicionarle 2 mL de peróxido de hidrógeno 30 % y colocarlo en una estufa a 45 ºC durante 60 min.
Se puede afirmar que el método desarrollado es específico, preciso, exacto y lineal, por lo que puede ser empleado para la cuantificación de cumarina en muestras de polvo seco obtenidas mediante secado por aspersión.
