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UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE

LA MIXTECA

Producción de lacasa a partir de hongos

ligninolíticos utilizando vinazas y bagazo de

origen mezcalero

Avances

Alumna: I.A. Stefi Castillejos Márquez

Director de tesis: Dr. Vania S. Robles González

Co- Director: Dra. Ireri V. Robles González

Huajuapan de León, Oaxaca. junio de 2014.

2

ÍNDICE

Contenido Página Resumen 3 Índice de tablas 5 Índice de figuras 6 Abreviaturas y simbología 7 1. Antecedentes 8

1.1 Enzimas 8 1.1.1 Obtención y producción de enzimas 9 1.2 Hongos ligninolíticos 10

1.2.1 Definición 10 1.2.2 Características 11 1.2.3 Inmovilización de hongos ligninolíticos 12 1.2.4 Enzimas Extracelulares (Mecanismo enzimático) 13 1.2.5 Enzimas ligninolíticas 13 1.2.6 Lacasa 14

1.3 Sustratos utilizados 20 1.3.1 Vinazas Mezcaleras 21

1.3.1.1 Obtención 21 1.3.1.2 Características fisicoquímicas 22 1.3.1.3 Problemas ambientales 23

1.4 Sistemas fermentativos para la producción de enzimas 24 1.5 Purificación de enzimas 27

1.5.1 Membranas de filtración 29 2. Justificación 35 3. Hipótesis 36 4. Objetivos 36

- Generales 36 - Específicos 36

5. Metodología 38 FASE I: Caracterización Fisicoquímicas de las vinazas mezcaleras (VM) y

bagazo de origen mezcalero. 38

FASE II: Evaluación de medios de cultivo para el crecimiento de los hongos ligninolíticos.

49

FASE III: Selección de la cepa (s) de Pleurotus spp que presenten la mayor actividad enzimática de lacasa y evaluación de actividad enzimática de Trametes versicolor.

51

FASE IV: Obtención de lacasa 51 FASE V: Purificación parcial de la enzima lacasa 56

6. Resultados y discusión 60 7. Concusiones 75

Referencias 77

3

RESUMEN

En el presente estudio se obtuvo el análisis de la vinaza mezcalera, la cual presentó:

una fuerte coloración café obscuro, un bajo pH, altos contenidos de materia orgánica

expresado como DQO, fructosa residual, conductividad eléctrica, cenizas yminerales,

principalmente de calcio y magnesio. Se observó que la cantidad de minerales

presentes en las muestras de bagazo estudiadas fue mayor a las encontradas en la

muestra de vinazas. El contenido de fenoles que se determinaron en las muestras de

vinazas y bagazo, fue 497 ± 109 mgEAG/L y 0.014± 0.0005 mgEAG/g de bagazo)

respectivamente.Una vez caracterizada la vinaza y el bagazo se usaron para la

producción de lacasa,empleando las cepas de Trametes versicolor (Tv) y Pleurotus

spp-UTMB (Ps) mediante fermentación en estado sólido (FES), usando bagazo de

penca de agave Potatorum zucc (Pz) y penca de agave Angustifolia haw (Ah) como

sustratos.Las condiciones óptimas para la producción de lacasa en la FES fueron con la

cepa de Tv y bagazo Pz, obteniéndose una actividad enzimática de lacasa (AELac) de

386.9±27.4 U/L al sexto día de fermentación. Para la fermentación en cultivo sumergido

(FCS), se utilizó vinaza mezcalera diluida (VMD) como sustrato, a concentraciones de

ázucares reductores de674 (VMD-674) y 917 (VMD-917) mg equivalentes de fructosa

(EF)/L, se emplearon pellets dobles (diámetros promedio de 0.5 ± 0.1 cm), formados

con bagazo en polvo de Ah y Tv o Ps (Tv-Aho Ps-Ah). Las condiciones óptimas para la

producción de lacasa en FCSfueron utilizando pellets formados conTv-Ah y VMD-917

mg EF /L, obteniéndose al noveno día una AELac de 2402 ± 76 U/L. De los resultados

concluimos que el mejor cultivo para la producción de lacasa fue el sistema en cultivo

sumergido.

4

Finalmente se logró la separación de la enzima lacasa producida por los pellets

formados por Tv-Ahen FCS a nivel matraz, mediante el uso de membranas de 0.45 m

y de 10 kDa. Se identificaron cuatro bandas intensas mediante SDS-PAGE, dos de las

cuales tuvieron pesos moleculares de 100 kDa y cercano a los 50 kDa (pesos

moleculares reportados para la enzima lacasa). Mediante los zimogramas se constató

la presencia de al menos dos bandas con actividad de lacasa, lo cual apoyó lo

observado en los resultados obtenidos de AELac determinadas en las FCS y FES.

El presente estudio es el primero en reportar el uso de vinazas de origen mezcalero y

bagazos de pencas de agave Potatorum zucc y agave Angustifolia haw asi como el uso

de pellets formados con HL y Agave para la producción de la enzima lacasa, lo que le

daría un valor agregado a estos desechos, asi mismo se promovería una reducción de

la contaminación de estos desechos ya que actualmente son vertidos al medio

ambiente sin previo tratamiento.

5

ÍNDICE DE TABLAS

N° de Tabla Página 1. Características de enzimas ligninolíticas. 14 2. Aplicaciones de lacasa en la industria textil, papelera y

ambiental. 17

3. Aplicaciones de la Lacasa en la industria alimentaria. 19 4. Ventajas y desventajas de los FES 25 5. Residuos sólidos empleados en sistema de fermentación en

estado sólido 26

6. Clasificación de las membranas de acuerdo a su fuerza impulsora

31

7. Carácterísticas de las operaciones de membranas 32 8. Especificaciones para la determinación de sulfatos y fosfatos 44 9. Parámetros para la lectura de metales en el equipo de

absorción atómica. 47

10. Nombre y clave de las cepas a utilizar en los ensayos 49 11. Diseño factorial general para los experimentos de la FCS. 53 12. Diseño factorial general para los experimentos de la FES 55 13. Composición del gel de acrilamida 7.5%. 57 14. Composición del gel nativo (concentrador y separador). 58 15. Parámetros determinados en las vinazas mezcaleras. 61 16. Actividad enzimática obtenida de las cepas de Trametes

versicolor y Pleurotus spp. evaluadas en el medio C y D. 62

17. Actividades enzimáticas de lacasa obtenidas por hongos ligninolíticos empleando diversos sustratos sólidos.

69

6

ÍNDICE DE FIGURAS

N° de Figura Página 1. Esquema de acción del sistema ligninolítico 13

2. Estructura de la lacasa. (Átomos de cobre mostrado con esferas amarillas)(Lyashenko et al., 2006)

16

3. Oxidación de subunidades fenólicas de lignina por la acción de lacasa.

18

4. Proceso general de producción de mezcal 22

5. Representación esquemática de las formas de operación de las membranas

30

6. Plan general de trabajo 38

7. Pellets dobles formados con BPeAh – Pleurotus spp o Trametes versicolor.

63

8. Cinéticas de actividad de lacasa empleando pellets dobles formados con BPeAh-Tv con vinazas mezcaleras diluidas

64

9. Cinéticas elaboradas empleando a Ps-UTM-B con vinazas mezcaleras diluidas

65

10. Cinética de actividad enzimática de lacasa empleando Tv– Polvo BPePz y BPeAh

68

11. Cinética de actividad enzimática de lacasa empleando Ps- UTM-B – Polvo de BPeAh y Polvo de BPePz

68

12. Gel de electroforesis SDS-PAGE. Carril a y b: Muestra purificada parcialmente de lacasa de Tv-Ah en medio C. Carril c: estándares de pesos moleculares

73

13. Zimograma de actividad de lacasa. Carril a y b: Muestra purificada parcialmente de lacasa de Tv-Ah en medio C

74

7

ABREVIATURAS Y SIMBOLOGÍA

Significado Abreviatura Ácido 3, 5- dinitrosalicílico DNS Acetileno Ac Agar bacteriológico AB Aire A 2,2-azinobis-(3-etillbenztiazolina-6-sulfonato) ABTS Bagazo de agave Angustifolia haw Ah Bagazo de agace Potatorum zucc Pz Caldo dextrosa sabouraud 2% CDS-2% Conductividad eléctrica K Demanda bioquímica de oxígeno DBO Demanda química de oxígeno DQO Ditiotreitol DTE Equivalentes de ácido gálico EAG Equivalentes de fructosa EF Extracto de malta EM Fermentación en estado sólido FES Fermentación en cultivo sumergido FEC Glutationa GSH 1-hidroxibenzotriazol HBT Hongo ligninolítico HL Lacasa Lac Lignino peroxidasa LiP Manganeso peroxidasa MnP Sólidos suspendidos SS Sólidos suspendidos fijos SSF Sólidos suspendidos volátiles SSV Sólidos totales ST Trametes versicolor Tv Vinazas mezcaleras VM

8

1. ANTECEDENTES

1.1. Enzimas

Las enzimas son proteínas que juegan un rol como catalizadores regulando las

reacciones químicas que se llevan a cabo en organismos vivos. Un catalizador es una

sustancia que aumenta la velocidad de una reacción química disminuyendo la energía

de activación, pero sin afectar el equilibrio final.Las enzimas son proteínas globulares,

están conformadas por una sola cadena polipeptídica que contiene 100 o más residuos

de aminoácidos. Dependiendo del orden en el que se encuentren los residuos de

aminoácidos en la cadena, será la actividad biológica de la enzima.

Dentro de las principales características de las enzimas es la especificidad de las

reacciones que catalizan y de los sustratos que intervienen en la reacción; cabe resaltar

que algunas enzimas no son específicas a un solo sustrato, sino a un grupo de ellos

(enzimas poco específicas) (Crestini y Argyropoulos, 1998; Pickard et al., 1999). El

sustrato se une sólo a una porción pequeña de la superficie de la proteína formando el

complejo enzima sustrato.A esa porción proteica se le denomina sitio activo.

La cinética enzimática mide la velocidad de reacción que se realiza en presencia de

enzimas. La actividad enzimática es la función de la enzima, es decir, la capacidad de

la enzima para acelerar la reacción y se puede determinar midiendo la cantidad de

sustrato que desaparece o la cantidad de producto formado por unidad de

tiempo.Dentro de los factores que afectan la actividad enzimática tenemos la

concentración del sustrato, concentración de producto, temperatura, pH, fuerza iónica,

presencia de inhibidores. Una de las formas de medir la actividad enzimática, es

9

mediante el uso de modelos, siendo el más sencillo el modelo de Michaelis–Menten

(Koolman y Klaus-Heinrich, 2004).

Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacciones que catalizan, y existen 6

principales grupos:

Oxidoreductasas: Transferencia de eléctrones (iones hidruro o átomos H)

Tranferasas: Transferencia de grupos de una molécula a otra.

Hidrolasas: Reacciones que implican la ruptura hidrolítica de enlaces químicos.

Liasas: catalizan la ruptura de enlaces (C-C, C-S y algunos C-N, excluyendo

enlaces peptídicos).

Isomerasas: Transforman sus substratos de una forma isomérica en otra.

Ligasas: Catalizan la formación de enlace entre C y O, S, N y otros átomos.

Las enzimas pueden encontrarse en todos los seres vivos. Cada enzima tiene

propiedades y especificidades diferentes, así mismo dependiendo de su origen, serán

sus acciones y funciones biológicas que desempeñen (Jegannathan y Nielsen, 2013).

1.1.1. Obtención y producción de enzimas

Las enzimas pueden obtenerse y producirse de diversas fuentes. A nivel industrial

generalmente se utilizan hongos y bacteriascomo fuente de enzimas debido a que se

pueden alcanzar grandes producciones y son fuente de una gran diversidad de

enzimas, las cuales suelen utilizarse en procesos industriales (Santos et al., 2012;

Wang et al., 2013; Ramesh y Venugopalan, 1987). A nivel industrial, algunas enzimas

utilizadas son costosas por ejemplo la celulasa con un precio de venta de US$12/Kg

grado industrial y US$206-2000/g de enzima purificada (Robles-González et al., 2012);

10

la lacasa entre US$140-292/g de enzima pura (www.sigmaaldrich.com; Osma et al.,

2011).

Dentro de los factores que afectan el costo total de la enzima son: el medio de cultivo,

gastos de operación (cultivo e incubación), equipo utilizado, gastosde producción

(extracción, separación y purificación de la enzima) (Osma et al., 2011).Debido a que al

sustrato utilizado se le atribuye una alta influcia en el costo final de la enzima, es un

factor importante que se debe de tomar en cuenta para la reducción de costo de

producción de las enzimas (Castillo, 2005; Hareshk y Dattam, 2002; Osma et al., 2010).

Por tal motivo, se han buscado sustratos más económicos para disminuir su costo de

producción y como consecuencia su costo de venta (Osma et al., 2011;Kahraman y

Yesilada, 2001; Pant y Adholeya, 2007). Debido a lo anterior, en los últimos años ha

sido de gran interés utilizar desechos industriales como sustratos (sueros, colorantes,

vinazas, aguas negras, etc.). Sin embargo, las bacterias y algunos hongos no tienen la

capacidad de utilizar desechos de origen industrial ó agroindustrial como sustrato,

debido a que este tipo de desechos contiene compuestos recalcitrantes, lo que puede

inhibir el crecimiento de los organismos antes mencionados. Los hongos de

putrefacción blanca u hongos ligninolíticos, cuentan con un complejo enzimático que si

les permite utilizar como sustrato este tipo de desechos (Dellamatrice et al., 2005;

Archibald et al., 1997; Takemori et al., 1992).

1.2. Hongos Ligninolíticos

1.2.1 Definición

Los hongos ligninolíticos u hongos de putrefacción blancase encuentran ampliamente

distribuidos en la naturaleza; pueden vivir en ambientes húmedos y secos. Su

11

temperatura óptima varía entre 20 y 30°C.Los hongos ligninolíticos ayudan a la

descomposición de la materia orgánica mediante la hidrólisis de sustratos por su

sistema enzimático, para posteriormente ser absorbidos a través de la fina pared de la

célula (Archibald et al., 1997). El sustrato requerido para el crecimiento de los hongos

va a depender del tipo de enzimas que el hongo tenga la capacidad de producir.

1.2.2. Características

La mayoría de los hongos ligninolíticos pertenecen al grupo Basidiomicetes y son los

organismos eficientes para la degradación de lignina. Los hongos ligninolíticos

contienen un sistema enzimático extracelular único y poco especifico para un solo

sustrato. Pueden causar degradación simultánea de la lignina y de polisacáridos de la

pared celular (Kahraman y Yesilada, 2003; Tišma et al., 2012).Al degradar la lignina

tienen acceso a la celulosa y hemicelulosa y pueden aprovecharlos como fuente de

carbono y energía (Homolka et al., 1997, Mickiashvili et al., 2006).

El mecanismo para la degradación de lignina tiene como base la producción de

radicales libres lo que permite que estas enzimas sean catalíticamente activas sobre

una gran diversidad de sustratos orgánicos, lo cual les confiere un uso potencial en

diferentes áreas como: industria alimentaría, biorremediación, farmaceútica entre otras

(Mendonça et al., 2010; Gedikli et al., 2010).

Los hongos ligninolíticos se han empleado para la producción de enzimas empleando

residuos industriales y agroindustriales.Algunas de las cepas empleadas son:Trametes

versicolor, Pleurotus spp., Trametes multicolor, Pleurotus sajor caju(Leitner et al., 2002;

Sannia et al., 1986; Giardina et al., 2010; Tišma et al., 2012; Kahraman y Yesilada,

2003).

12

1.2.3 Inmovilización de hongos ligninolíticos.

La inmovilización celular se define como la ubicación física de células en un espacio o

región específica, de forma natural o inducida, en la cual son capaces de mantener una

actividad catalítica deseada (Karel et al., 1985).La inmovilización se da debido a

procesosde adherencia a superficies o entre los microorganismos.La

inmovilizaciónpuede ser por atrapamiento en los espacios o poros de fibras y geles

(Garzón y Barragán, 2008). Los hongos filamentosos se pueden fijar al soporte de dos

maneras: i) por la producción de polisacáridos que actúan como sustancias adherentes;

ii) por adsorción a soportes con alta porosidad, lo cual permite que los filamentos

penetren y colonicen el soporte (Fernandez y Henao, 2007). De igual manera se han

inmobilizado entre microorganismos, colocando micelio inmovilizado (en caso de

hongos filamentosos) en un agitador rotatorio (Elisashviliet al., 2010).

La inmovilización celular nos ofrece las siguientes ventajas: i) mayor actividad

matábolica; ii) fácil recuperación del caldo de fermentación; iii) mayor superficie de

contacto; iv) se trabaja con mayor cantidad de biomasa; v) disponibilidad homogénea

de nutrientes y oxígeno para las células; vi) mayor persistencia dentro del sistema; vii)

mayor resistencia a la toxicidad.

La inmovilización se realiza en diversos soportes como residuos orgánicos, residuos

agroindustriales,plásticos y fibras de vidrio (Shinet al., 2002; Silverio et al., 2013; Feng

et al., 2013; Boran y Yesilada, 2011). En el presente trabajo se inmovilizó a los hongos

ligninolíticos mediante la formación de pellets con polvo de agave, para la producción

de enzimas, debido a las vetajas que este proceso nos otorga.

13

1.2.4 Mecanismo enzimático

Los mecanismos enzimáticos utilizados para la degradación de la lignina son oxidativos

y producen radicales libres, los cuales al ser muy reactivos, reaccionan entre sí

volviendose a polimerizar, iniciandose reacciones que pueden seguir cualquier camino

sin control, a lo cual se le denomina “combustión enzimática” (Kirk y Farrel,

1987).Dentro de las enzimas de los hongos ligninolíticos,se encuentran las peroxidasas

que contienen un grupo hemo,Lignino peroxidasa (LiP) y Manganeso peroxidasa (MnP),

estas enzimas reducen al oxígeno para la producción de peróxido de hidrogeno. Otra

enzima que forma parte del mecanismo de degradación es la lacasa, la cual reduce el

oxígeno disuelto en agua, y oxida sustratos fenólicos formando radicales catiónicos,

quinonas o radicales fenoxi (Archibald et al., 1997; Osma et al., 2010).

Nota:Glox:Glioxal oxidasa; LiP: lignino peróxidasa; MnP: manganeso peróxidasa.

Figura1.Esquema de acción del sistema ligninolítico (Archibald et al., 1997)

1.2.5 Enzimas ligninolíticas

Las enzimas ligninolíticas son producidas por el hongo ligninolítico, cuando se

encuentra en un medio con limitaciones de fuente e carbono y nitrógeno (Sathiya et al.,

14

2006). Se han descrito tres enzimas ligninolíticas que son producidas por los hongos de

la pudrición blanca: lignino-peroxidasa (LiP), manganeso-peroxidasa (MnP) y lacasa

(Lac). En la Tabla 1 se muestra un resumen de las características generales de las

enzimas ligninolíticas.

Tabla 1. Características de enzimas ligninolíticas.

Características de las enzimas

MnP1(1.11.1.13) Mn(II):

H2O2oxidoreductasa

LiP1 (1.11.1.14) diarilpropano O2

H2O2oxidoreductasa

Lac2,3(1.10.3.2) p-benzodiol

O2oxidoreductasa

Grupo proteico

Hemo (Fe II) Hemo (Fe II) Cobre I,II=I Cobre III=2

PM (KDa) 32.- 62.5 38 – 47 60 – 100

Punto isoeléctrico

2.8 – 7.2 3.2 – 4.7 3- 7

Punto de pH 2.6 – 4.5 2.0 – 5.0 2.0 – 8.5 Productoras

de H2O2 Si Si No

Especificidad Mn2+ Amplia, aromáticos

incluidos, no fenólicos

Amplia, fenólicos

Ref: 1Yadav et al., 2009;

2Osma et al., 2010;

3Madhavi y Lele, 2006.

Dentro de este grupo de enzimas ligninolíticas, desde finales del siglo XIX han

aumentado los estudios y el interés por la lacasa, debido a sus aplicaciones potenciales

en muchos campos industriales como: la industria alimentaria, ambiental, textil,

papelera, entre otras. Por tal motivo el presente trabajo esta enfocado en la producción

de lacasa mediante el uso de hongos ligninolíticos.

1.2.6 Lacasa

La lacasa son proteínas multicobre con actividad fenoloxidasa (EC 1.10.3.2,

bencenodiol: oxígeno oxidorreductasas). Se diferencia de la mayoría de las

fenoloxidasas debido a que produce agua en lugar de peróxido de hidrógeno por la

15

reducción del oxígeno, lo cual se representa en las ecuaciones 1 y 2 (Yaropolov et al.,

1994; Latour, 1998).

[1]

[2]

La lacasa es una enzima glicosilada monomerica. Puede provenir principalmente de

hongos,plantas y algunas bacterias. Las funciones que cumple la lacasa en los hongos

ligninolíticos se relacionan con la morfogénesis, la pigmentación de los conidios, la

formación de rizoformos, el desarrollo de cuerpos fructificantes y la protección frente a

compuestos fenólicos tóxicos liberados durante la degradación de la lignina (Archibald

et al., 1997). La mayoría de las lacasas tiene un peso molecular de entre 60-100 kDa

(Osma et al., 2010, Madhavi y Lele, 2006; Lu et al., 2007; Marugesan et al., 2006). El

10-50% del peso molecular es atribuido a la glucosidación, siendo la manosa el

carbohidrato que comúnmente se encuentra unido a dicha enzima.El contenido

dencarbohidratos está relacionado con la estabilidad estructural de la proteína y consu

protección frente a procesos de proteolisis e inactivación por radicales (Yoshitake et al.,

1993; Ko et al., 2001). Las lacasas son enzimas estables,el rango ótimo de

temperaturas varia entre 50 y 70°C (Morozova et al., 2007b). Poseen un punto

isoelétrico entre 2.6 y 4.5 y presentan actividad en un amplio rango de pH, entre 2.0 y

8.5 (Thurston, 1994; Leonowicz et al., 2001; Morozova et al., 2007b). Catalizan la

oxidación de un amplio rango de sustratos, como compuestos fenólicos (orto y para

difenoles, metoxifenoles, etc), aminas aromáticas (Yaropolov et al., 1994; Collins y

Dobson, 1997), iones inorgánicos (Morozova et al., 2007a) e incluso pueden llevar a

cabo desmetilaciones (Kirk et al., 1987) y deshalogenaciones en el caso de

16

compuestos sustituidos.Algunos autores reportan que la presenciade mediadorescomo:

el ABTS (2,2-azinobis-(3-etillbenztiazolina-6-sulfonato)) (Crestini y Argyropoulos, 1998;

Pickard et al., 1999), HBT (1-hidroxibenzotriazol) (Crestini y Argyropoulos, 1998), entre

otros, pueden llegar a oxidar compuestos no fenólicos.

La lacasa es una p-difenol oxidoreductasa que contiene cobre en su estructura (Figura

2).

Figura 2. Estructura de lacasa. (Átomos de cobre mostrado con esferas amarillas)(Lyashenko et al., 2006)

Los átomos de cobre presentes en la estructura de la lacasase clasifican en tres tipos

(1,2,3) con diferentes propiedades (Leontievsky et al., 1997).

Cobre tipo 1 (T1): responsable del color azul de la proteína. Muestra absorbancia en la

región del visible (605nm) causada por el enlace covalente cobre-cisteína. Este cobre

es el sitio donde ocurre la oxidación del sustrato.

Cobre tipo 2 (T2): No presenta absorbancia en la región visible. Tiene afinidad por

aniones (F-1,CN-1, etc.) que actúan como inhibidores de la actividad de la enzima.

17

Cobre tipo 3 (T3): es un complejo formado por un par de iones Cu2+ - Cu2+enlasados

por hidróxido como puente. Muestran absorbancia a 330 nm. La reacción que cataliza

la lacasa es la siguiente:

Los cobresT2 yT3 forman un grupo de atómos de cobre. En este lugar se reduce el

oxígeno. El cobre del centro es T1 y es el primer aceptor de electrones del sustrato.

Después los electrones se trasfieren al centroT2-T3, al recibir cuatro electrones

reducen una molécula de oxígeno a agua.

En la Tabla 2 se muestran algunas aplicaciones industriales de la lacasa.

Tabla 2. Aplicaciones de lacasa en la industria textil, papelera y ambiental

Enzima Aplicaciones Ref.

Lacasa

Despolimerización de la lignina

1,2 Deslignificación de pastas de madera

Blanqueo de pastas kraft

Degradación de blanqueo de colorantes textiles 3,4,5

Biodegradación de hidrocarburos xenobióticos aromáticos

policiclicos. 6,7

Referencias: 1 Archibald et al., 1997;

2 Lund y Ragauskas, 2001;

3 Mc Kay, 1979;

4Cripps et al,.1990;

5Cooper, 1993;

6Pointing, 2001;

7Bamforth y Singleton, 2005.

En la industria papelera, la lacasa, se utiliza principalmente para la despolimerización

de la lignina. Esta acción la lleva a cabo mediante el ataque a subunidades fenólicas de

la lignina (Figura 3).

18

Figura 3. Oxidación de subunidades fenólicas de lignina por la acción de lacasa.

(Archibald et al., 1997)

En cuanto a la industria textil, esta enzima, es ampliamente utilizada para la remoción

de colorantes; esto porque algunos de los colorantes utilizados en la industria textil son

compuestos polifenólicos, y por lo tanto sustrato para la lacasa (Archibald et al., 1997;

Reyes et al., 1999).

Otra industria en dónde la lacasa tiene diversas aplicaciones, es la industria

alimentaria.Esto debido a que compuestos como fenoles, ácidos grasos insaturados,

carbohidratos y proteínas (que contienen en su estructura tioles), son sustratos para

esta enzima y están comúnmente presentes en varios alimentos y bebidas. Estos

pueden ser modificados por la acción de la lacasa logrando así nuevas funcionalidades,

mejoramiento de la calidad o reducción de costos. (Minussi et al., 2002; Kirk et al.,

2002).

Algunas de las aplicaciones que tiene la lacasa en alimentos se muestran en la Tabla 3

2 H2O

O2

Lacasa

Ruptura enlace

arilo- alquilo

Radical fenoxilo P- quinona

Lignina Lignina

19

Tabla 3. Aplicaciones de la lacasa en la industria alimentaria.

Enzima Aplicaciones Ref.

Lacasa

Estabilidad de vinos (reducción de compuestos polifenólicos)

1,2

Estabilización de cerveza (reducción de compuestos polifenólicos)

2,3

Clarificante en el procesamiento de jugos de fruta (reducción de compuestos polifenólicos)

4,5

En panadería, aumentando la fuerza, estabilidad, maleabilidad de la masa. (ruptura de los enlaces entrecruzados de ácido ferúlico y arabinoxilano)

6,7

Mejoramiento de los parámetros sensoriales de los alimentos (eliminando compuestos indeseables, controla olor y mejora sabor).

8, 9

Referencias: 1Conrad et al.,2002 ;

2Minussi et al., 2002.

3Giovanelli, 1989.

4Minussi et al., 2007;

5Siebert, 1999;

6Labat

et al., 2000; 7Si , 1994.

8Bouwens et al., 1997;

9Takemori et al., 1992.

En el vino, la principal función de la lacasa, es la oxidación de los polifenoles,

reduciendo el sabor a corcho (por su interacción con los polifenoles) y/o astringencia en

los vinos embotellados y añejados (Conrad et al., 2000). En la industria cervecera y de

jugos se utiliza como clarificante, ya que las principales sustancias que causan turbidez

son compuestos polifenólicos, los cuales forman complejos con la lacasa,

precipitándolos y facilitando su eliminación (Giovanelli, 1989, McMurrough et al., 1999;

Mathiasen, 1995; Siebert, 1999; Cantarelli, 1986). En panadería, la lacasa mejora la

calidad de la masa, al actuar sobre el arabinoxilano y el ácido ferúlico, creando un

enlace cruzado entre ellos (Si, 1994; Selinheimo et al., 2006., Renzetti et al., 2010). El

mejoramiento de los parámetros sensoriales por el uso de la lacasa son principalmente

para el control de olores, mejoramiento del sabor y la reducción de compuestos

20

indeseables. Se han utilizado en productos ricos en ácidos grasos como: cacao

(Takemori et al., 1992), aceites de soya (Petersen y Mathiasen, 1996), entre otros. Este

mejoramiento se lleva a cabo por una desoxigenación, debido a que la lacasa utiliza al

oxígeno como su último aceptor de electrones en las reacciones oxido reducción que

cataliza. De igual manera la lacasa se ha adicionado en la formación de geles de la

pectina de remolacha, lográndose un mejoramiento y formación de nuevas estructuras

de los geles (Kuuva et al., 2003).

1.3 Sustratos utilizados

Uno de los principales parámetros a considerar para la obtención de enzimas, es el

sustrato, el cual debe proporcionar una fuente óptima de carbono y nitrógeno para el

crecimiento de cada microorganismo.

Cuando se habla de producción industrial de enzimas, es común el empleo de bacterias

y hongos, ya que estos proporcionan las cantidades requeridas a este nivel de

producción. Sin embargo el uso de algunas enzimas sigue siendo limitado debido al alto

costo de producción (Osma et al., 2010; Madhavi y Lele, 2006). Por tal motivo en los

últimos años se ha optado por reducir los costos mediante el uso de sustratos

alternativos como desechos provenientes de la industria textil, aguas residuales,

alimentaria, residuos agroindustriales, entre otros. Así mismo, se logra la reducción de

compuestos contaminantes para el medio ambiente al darse un uso a los desechos

mencionados anteriormente. Dentro de los desechos industriales, los residuos

agroindustriales han sido de interés a nivel mundial debido a que muchos de sus

constituyentes pueden ser utilizados como sustrato para el crecimiento de

21

microrganismos productores de enzimas (Saval, 2012; Strong, 2010; Moldes et al.,

2003).

Las vinazas son residuos agroindustriales provenientes de la producción de mezcal. El

estado de Oaxaca produce el 60% de mezcal de todo el país. En el año 2012 se

produjeron 971,955 litros de mezcal certificado (COMERCAM), los cuales durante su

procesamiento generaron más de 14 millones de litros de vinazas y 19 millones de

kilogramos de bagazo. Este tipo de residuos recalcitrantes pueden ser utilizados como

sustrato para el crecimiento de hongos ligninolíticos, y para la producción de enzimas

ligninolíticas como la lacasa, debido laconcentración de azúcares y la concentración de

compuestos fenólicos, los cuales se han reportado que tiene un efecto inductor sobre la

producción de lacasa (Gedikli et al., 2010).

1.3.1. Vinazas mezcaleras

1.3.1.1. Obtención

Las vinazas se definen como los residuos líquidos remanentes en la etapa de la

destilación de los azucares fermentados de distintas fuentes por ejemplo melazas, caña

de azúcar, jugos de uva, agave previamente hidrolizado, etc. (Robles-González et

al.,2012).El proceso de elaboración de mezcal se realiza en cuatro etapas: la cocción

del agave, molienda del agave, hidrólisis, fermentación y destilación (Figura 4). Una de

las operaciones es el proceso de destilación en la cual se obtiene como subproducto las

vinazas.

22

Figura 4. Proceso general de producción de mezcal (Robles- González et al., 2012)

1.3.1.2 Características fisicoquímica de las vinazas

Las vinazas presentan una composición variada la cual depende de la materia prima

empleada para la fermentación, así como otros aspectos del proceso de producción.

Las aguas de lavado para la limpieza de los fermentadores, destiladores, así como las

aguas de enfriamiento o de condensación contribuyen a esta variabilidad (Duarte et al.,

1997). En términos generales, las vinazas consisten de: alta concentración de sólidos

disueltos; el 50% de estos sólidos corresponde a azucares reductores (Sangave et al.,

2007b), compuestos no volátiles del caldo de fermentación, compuestos fenólicos

(Sales et al., 1987; Capasso et al., 1992), concentraciones altas de sales minerales, alta

conductividad electrolítica (250-300dS m-1) y fuertemente coloreados por la presencia

de melanoidinas, las cuales le otorgan a las vinazas una fuerte coloración marron

oscuro (Peña et al., 2003; García et al., 1997; Jiménez et al., 2003; Coca et al., 2005).

Materia prima

(Piña de

Agave)

Trozamiento Cocimiento

(Hidrólisis

térmica)

Jugo del

agave

Molienda Bagazo

Destilación Vinazas

Fermentación

23

Las vinazas son ácidas con un pH aproximado entre 3.5-4.5. Estudios resalizados en

vinazas mezcaleras encontraron que su composición era similar a las reportadas para

vinazas de otros orígenes. Sin embargo, existe diferencia entre la composición de las

vinazas mezcaleras lo cual podría deberse al sistema de producción (artesanal o

industrial) (Robles-González et al.,2012). La cantidad de materia orgánica de

contaminantes expresada como demanda bioquímica de oxígeno (DBO) y demandas

químicas de oxígeno (DQO) es elevada (valores entre 35,000–50,000 mgO2/Ly 70,000–

150,000 mgO2/L, respectivamente (Nandy et al., 2002; Sangave et al., 2007; Madejón et

al., 2001b), pH ácidos de 3.5 a 4 y fuertemente coloridas, alto contenido de compuestos

fenólicos (478- 541 mg EAG/L), alta cantidad de cenizas (2000 – 1550 mg/L), y altas

concentraciones de minerales (Robles-González et al., 2012).Por lo anterior las vinazas

mezcaleras califican como efluentes agresivos al medio ambiente. Sin embargo existen

alternativas para el uso de estos efluentes agresivos como: producción de enzimas de

interés comercial, para la producción de proteína unicelular, y para la obtención de

compuestos polifenólicos.

1.3.1.3 Problemas ambientales.

La descarga de vinazas sin ningún tratamiento previo en suelos, alteraría la

composición química y física, debido a los altos niveles de salinidad de las vinazas

(250 a300 dsm-1) así como los altos contenidos de fósforo (0.06 g/kg). Los sólidos

suspendidos pueden azolvar los suelos provocando una menor permeabilidad y por lo

tanto favorecer fermentaciones anaerobias, trayendo como consecuencia la generación

de olores desagradables y la removilización de metales pesados previamente

presentes en el suelo. La presencia de compuestos fenólicos y polifenólicos de

24

naturaleza ácida, puede provocar inhibición en la germinación de semillas y daños a los

cultivos así como efectos negativos en la actividad microbiológica del suelo (Kannabiran

y Pragasam, 1993; Díaz et al., 2002). El bajo pH que tienen las vinazas puede ser

asociado con la remoción de metales pesados en el suelo (García et al., 1997).

Las vinazaspueden incrementar la temperaturade los cuerpos receptores (suelo o

aguas) debido a que la temperatura a la cual son vertidas oscilan entre los 50 y 90°C,

trayendo como consecuencia la disminución de la solubilidad de oxígeno, lo cual es

crítico para los sistemas acuáticos (Jiménez et al., 2005; Mane et al.,2006). Por otro

lado la turbidez provocada por los sólidos suspendidos y su coloración café oscuro

pueden restringirla penetración de la luz provocando una reducción de la oxigenación

del agua por la inhibición de la fotosíntesis trayendo como consecuencia el daño a la

vida acuática (Fitzgibbon et al., 1995). Las altas cargas orgánicas e inorgánicas pueden

causar en los diferentes cursos de agua, la presencia en canales o ríos de compuestos

orgánicos putrescibles como compuestos sulfurados pueden provocar olores molestos

(Pant y Adholeya, 2007b).La concentración relativamente alta de nutrientes de P y N

puede causar eutrofización en los cuerpos de agua, depósitos y canales (Vlyssides et

al., 1997).

1.4 Sistemas fermentativos para la producción de enzimas.

Las estimaciones del valor de inversión para la producción de enzimas a nivel industrial

ha incrementadode US$1 billones en 1995 aUS$1.5 billonesen el año 2000. Hoy en día

se invierten aproximadamente US$2.7 billones (Godfrey y West, 1996; McCoy, 2000;

www.megazyme.com). La mayoría de la producción de enzimas se lleva acabo

utilizando fermentación en cultivo sumergido (FCS) y fermentación en estado sólido

25

(FES) (Aguilar et al., 2002; Viniegra-González et al., 2003). El término FES es aplicado

cuando se trata de procesos en los cuales materiales insolubles en agua son utilizados

para el crecimiento microbiano (Moo-Young et al., 1983). Los microorganismos

necesitan cierta cantidad de agua para crecer, por lo tanto la cantidad de agua

suministrada en este tipo de sistema fermentativo no debe exceder la capacidad de

saturación del material que forme la cama sólida (Laukevics et al., 1984; Mudgett,

1986). En la Tabla 4 se muestran algunas de las ventajas y desventajas que ofrecen el

sistema fermentativo en estado sólido.

Tabla 4. Ventajas y desventajas de la fermetación en estado sólido (Toca-Herreraet

al.,2007).

Ventajas Desventajas

El medio de cultivo es simple: los

sustratos sólidos pueden utilizarse

solos o enriquecidos.

El uso de microorganismos esta

reducido a los que crecen a baja

humedad.

El producto de interés está

concentrado.

La determinación de parámetros de pH,

acidez, O2 disuelto, se dificulta.

La baja humedad que se tiene en

estos sistemas reduce la probabilidad

de contaminación microbiana.

La tranferencia de masa por difución es

limitada.

La cantidad de desechos generados

es menor que en SmF.

Los tiempos de cultivo son más largos

que en fermentación en cultivo

sumergido.

En la Tabla 5 se muestran algunos de los residuos sólidos que se han empleado como

sustrato para FES. Como se puede observar una de las estrategias utilizadas ha sido el

uso de desechos de cereales como: salvado de trigo, rastrojo de maíz, lignocelulosa y

26

bagazo de caña de azúcar; los cuales se han empleado principalmente para la

producción de celulasa y enzimas ligninolíticas como LiP, MnP y Lac, mediante el uso

de hongos ligninolíticos.

Tabla 5. Residuos sólidos empleados en sistema de fermentación en estado sólido.

Hongo Sustrato Aplicación Ref.

Penicillium decumbens L-06

Residuos de

salvado de trigo

Producción de celulasa 1

Pleurotus Ostreatus, Pleurotus sajor- caju

Ligninocelulosa 2

Trichoderma reesei TG3

Rastrojo de maíz 3

Trichoderma reesei

, Pleurotus

ostreatus, Pleurotus

sajor- caju

Caña de azúcar Producción de enzimas

ligninolíticas

5

Trametes versicolor

200801, Funalia

troji ATCC 200800.

Salvado de trigo Producción de lacasa

6

Trametes versicolor

ATCC 44308,

Pleurotus ostreatus

FCL 247

Harina de colza 7

Pleurotus ostreatus

ATCC MYA-2306,

Trametes versicolor

NBR C4937.

Reisuos del tomate Producción de lacasa, xylanasas y

proteasas.

8

Referencias: 1Long et al., 2009;

2Khalil et al., 2011;

3Chen et al., 2011;

4Pal et al., 1995;

5Aguiar et al., 2010;

6Boran y

Yesilada, 2011;Żuchowskiet al., 2013; 8Iandoloet al., 2011.

27

La FCS es un sistema en el cual se realiza el proceso de fermentación en un sistema

completamente líquido, y en este mismo se encuentran los nutrientes necesarios para

el crecimiento de los microorganismos. Su principal ventaja ante el FES es la facilidad

de controlar los parámetros de pH, acidez, temperatura, concentración de nutrientes en

el sistema así como homogeneidad mediante la aplicación de sistemas de agitación,

mejor transferencia de masa, y facilidad para extraer los metabolitos producidos

(García, 1993). Para este tipo de sistemas se pueden utilizar caldos de cultivo y

cualquier residuo líquido para la producción de enzimas.

1.5 Purificación de enzimas

Las enzimas que son producidas por los microorganismos, pueden ser intracelulares o

extracelulares, siendo las segundas las más fáciles de separar del medio de

fermentación, ya que no requiere etapa de lisis o ruptura celular. La purificación de

enzimas consiste en una serie de pasos que permiten el aislamiento de un solo tipo de

enzimas a partir de una matriz compleja, así mismo, requiere de técnicas y

tratamientos bioquímicos. Generalmente se aplica la combinación de varias etapas:

i)centrifugación y ultra centrifugación, ii) precipitación de las proteínas empleando

soluciones saturadas de NH4SO4 ó mediante tratamiento térmico, iii) separación

mediante columnas de cromatografía (exclusión molecular, intercambio iónico,

afinidad), iv) mediante geles de electroforesis y v) el uso de membranas de

filtración(Philippoussis et al., 2011; Okamoto et al., 2000).

Debido al gran interés de la lacasa por sus diversas aplicaciones a nivel industriales

necesario tener a la enzima lo más pura posible (Minussi et al., 2002; Kirk et al., 2002).

De manera general, cada método de preparación consiste en 3 etapas principales i)

28

eliminación de desechos celulares, la cual comúnmente se realiza mediante el paso del

caldo de cultivo a través del papel filtro, filtros de fibra de vidrio, microfiltración o

centrifugación. ii) concentración del caldo de cultivo, iii)eliminación de compuestos

indeseados de bajo y alto peso molecular. Para estas últimas se utiliza comúnmente

precipitación salina y ultrafiltración (Bryjak y Rekuć, 2010).

Se ha reportado la siguiente metodología para la extracción y purificación de la lacasa

del medio de cultivo producida a partir de hongos ligninolíticos. La extracción consiste

en: i) homegenización del medio de cultivo, la cual se lleva a cabo mediante un

mezclado de los cuerpos fructíferos del hongo, ii) posteriormente se centrifuga a

13000g /30 minutos, filtrando el sobrenadante. Las estrategias para la purificación de la

enzima se puede realizar con el uso de agentes precipitantes y mediante el uso de

procesos de filtración (procesos de ultra y microfiltración), la primera de ellas consiste

en tomar el sobrenadante obtenido en la etapa de extracción y precipitar la proteína

presente con sulfato de amonio (45-80%) a 4°C, posteriormente se centrifuga la

muestra entre 1600g- 51200g por 15-40 minutos, el sobrenadante se precipita

nuevamente con sulfato de amonio a saturación (80-100%) a 4°C, la muestra se

centrifuga entre 10 000- 13 000g/ 15-40 minutos, la muestra se dializa y se somete a

una cromatografía de intercambio iónico, mediante el uso de una columna aniónica (Q-

Sepharose XL (16 x130 mm) cargada con buffer citrato 20 mM buffer, pH 5) ó

cromatografía en gel, las fracciones de lacasa obtenidas se someten nuevamente a

precipitación con sulfato de amonio (80%) y centrifugación a13 000g/ 15 minutos), por

último se usa una columna de intercambio aniónico (Sephadex G-100 (8x400 mm),

equipada con buffer citrato 20 mM pH 5) (Lettera et al., 2010; Forootanfar et al., 2011;

29

Autore et al., 2009; Okamoto et al., 2000). La segunda estrategía consite en: la

concentración del sobrenadante por ultrafiltración a 4°C (viva flow 200 system,

200cm2), la solución resultante se somete a cromatografía de intercambio iónico

(columna anionica DEAE, sepharosa flujo rápido, 10mmX40cm, equipada con buffer

Na2HPO4-ácido citrico 0.02 mM, pH 9.0), posteriormente se somete a ultrafiltración (10

kDa) para la concentración de la enzima y finalmente se hace pasar por una columna

sephadex G100 (16 mmX50 cm; Amersham Biosciences, Pharmacia, equipada con

buffer Na2HPO4-ácido citrico 0.02 mM, pH 8.0) (Lo- Qion et al., 2011; Salony et al.,

2006).

En el presente trabajo se pretende utilizar las operaciones de membrana microfiltración

y ultrafiltración para la purificación parcial de lacasa.

1.5.2 Membranas de filtración

En 1861, Graham reportó el primer experimento de diálisis empleando membranas

sintéticas. Las membranas pueden discriminar entre dos o más tipos de moléculas por

sus diferencias en tamaño, forma o estructura química. Los procesos de membrana son

caracterizados por el hecho de que las corrientes de alimentación se dividen en dos: un

retenido y un permeado. Si el objetivo es la concentración, el retenido usualmente es el

producto, sin embargo, en el caso de purificación, tanto el retenido como el permeado

podrían ser el producto. Las membranas tienen 2 formas de operación, i) filtración

frontal(Figura 5a) en donde el flujo es perpendicular a la superficie filtrante, en este tipo

de filtración se forma un gel que debe retirarse cada determinado tiempo, por lo que el

proceso no es continuo; ii) filtración tangencial (Figura 5b) en donde el flujo es paralelo

a la superficie filtrante, este tipo de filtración se lleva acabo ejerciendo una presión y se

30

establece un flujo de circulación de líquido es rápido, así al tiempo que se efectúa la

filtración, se auto limpia la membrana, lo que permite tener un flujo continuo. Estas

últimas se han utilizado ampliamente en años recientes, debido a que permite un

trabajo continuo, puede filtrar partículas de tamaño muy pequeño, reutilizar el residuo

de la filtración, y efectuar una selección por tipo de moléculas (Mulder, 2012).

Figura 5. Representación esquemática de las formas de operación de las membranas.

Dentro de los beneficios que se le atribuyen a la tecnología de membranas tangenciales

se pueden resumir en los siguientes: la separación puede llevarse de manera continua,

el consumo de energía es bajo, puede combinarse con otros sistemas de separación,

pueden trabajar sobre condiciones leves, el escalamiento es fácil, las propiedades de

las membranas son variables y pueden ajustarse, no requieren aditivos. Algunas de las

desventajas que tiene este tipo de tecnología son: el tiempo de vida de la membrana es

corto, baja selectividad, fenómeno de polarización de la concentración y el “fouling”. El

fenómeno de polarización se refiere a la relación existente entre la concentración del

soluto en el permeado y en el retenido. El “fouling” de membrana ocurre generalmente

en procesos de micro y ultrafiltración, se refiere al ensuciamiento o a un taponamiento

de los poros de la membrana lo cual retrasa el proceso de filtrado (Mulder, 2012).

Gel de filtración

31

Hoy en día, la tecnología de membranas puede aplicarse en todas las áreas industriales

como: en la producción de bebidas y alimentos, metalurgia, industria del papel, textil,

farmacéutica, automotriz, biotecnología y la industria química. Los procesos de

membrana cubren diversos problemas de separación con una membrana específica

para cada problema. Las membranas pueden diferir en su estructura y funcionalidad.

Los procesos con membranas pueden clasificarse en función de su fuerza impulsora

que puede ser presión, concentración, presión parcial o potencial eléctrico (Tabla 6).

Tabla 6.Clasificación de las membranas de acuerdo a su fuerza impulsora

Fuerza impulsora Procesos

Presión

Microfiltración

Ultrafiltración

Nanofiltración

Ósmosis inversa

Presión parcial Separación de gases

Permeación

Concentración Diálisis

Potencial eléctrico Electrodiálisis

Electrolisis con membranas

Las operaciones de separación por membrana basadas en la presión trabajan con

diferentes tamaños de partículas que se clasifican como: macroporos (>50nm), meso

poros (de 2nm a 50nm) y microporos (<2nm) y y dependiendo del tamaño de partícula a

separar será la operación que se utilizará. Las operaciones de membranas también

32

difieren en las presiones con las que se trabaja, siendo menores las presiones con las

que trabaja la microfiltración (<2 bar) y aumentando hasta la osmosis inversa (hasta 80

bar). Otra diferencia es la morfología o estructura de las membranas, existen 2 tipos las

membranas simétricas y las asimétricas. En las membranas simétricas (porosas o no

porosas) la resistencia de transferencia de masa está determinada por el espesor de la

membrana, mientras más espesa existe menos transferencia de masa, este tipo de

membranas tiene el mismo tamaño de poro a lo largo del espesor de la membrana. Las

membranas asimétricas varían el tamaño de poro a lo largo de su espesor y combinan

la selectividad de una membrana porosa con una buena transferencia de masa.

También cabe resaltar que existen varios materiales para la elaboración de membranas

y se clasifican como membranas biológicaso sintéticas. Las membranas biológicas son

aquellas con las que cuenta las células para sobrevivir. Las membranas sintéticas a su

vez se clasifican en orgánicas (polímeros o macromoléculas) e inorgánicas (cerámicas

o vidrios), siendo las primeras las más importantes. En la Tabla 7 se muestran alguna

de las características de operaciones de membranas, la presión de operación, los tipos

de membranas, así como, los tamaños del diámetro de poro y algunas aplicaciones

industriales (Mulder, 2012).

Tabla 7. Características de las operaciones de membranas

Variable Microfiltración Ultrafiltración Nanofiltración Osmosis inversa

Presión de

operación

(Bar)

<2 1 – 10 10 – 25 Agua salobre: 15

– 25; agua de

mar: 40 – 80

Tipo de

membrana

Microporosa

simétrica o

Microporosa

simétrica o

Semipermeable

simétrica

Semipermeable

simétrica

33

asimétrica asimétrica

Diámetro de

poro

10 – 0.05 µm. 1 – 100 nm. < 2 nm < 2nm

Uso para

separación de

Biotecnológico

Levaduras y

hongos (103-

104 nm)

Bacterias (300-

104 nm)

Coloides (100-

103nm)

Biotecnológico

Coloides (102-

103 nm), virus

30-300 nm),

proteínas (104-

106 Da),

enzimas (104-

106 Da)

Eliminación de

dureza en

agua, etapa

previa a

osmosis

inversa. Iones

multivalentes.

Eliminación de

iones Antibióticos

(300-103Da),

azucares (200-400

Da), ác. orgánicos

(100-500 Da),

iones orgánicos

(10-100Da)

Los procesos de membrana son ampliamente utilizados en biotecnología debido a que

las condiciones de operación no son drásticas, lo que permite que las biomoléculas

sensibles no cambien sus propiedades (Charcosset, 2006). La ultrafiltración y

microfiltración son las técnicas más utilizadas, especialmente en separación o

fraccionamiento de proteínas y/o enzimas (Koltuniewicz y Drioli, 2008). Algunos

trabajos en los que se han empleado procesos de micro y ultrafiltración para la

concentración y/o purificación de enzimas son los siguientes; Bryjak y Rekuć (2010)

realizaron la purificación de lacasa a partir de Cerrena unicolor, cultivada en medio

sintético,empleando membranas de microfiltración de 0.22 m y de ultrafiltración

biomax 100 y 10 KDa asi como ultracel de 10 KDa. La microfiltración se empleó con el

fin de eliminar residuos celulares y la ultrafiltración para la purificaciónde enzimas, el

proceso convencional de precipitación no fue necesario para obtener una mejor

purificación de la enzima. Pant y Adholeya (2010) empleando fermentación en estado

34

sólido (paja de trigo humedecidas con vinazas obtenidas de la fermentación de

melazas) y cepas del genero Ascomycota y Basidiomycota obtuvieron enzimas

ligninolíticas (lignino peroxidasa, manganeso peroxidasa y lacasa), las cuales fueron

recuperadas del medio de fermentación mediante filtración con papel Whatman No. 42,

seguida de una centrifugación a 12000 rpm por 30 min. Por último se utilizó una

membrana de ultrafiltración de 10 KDa, la cual fue adecuada para realizar la

concentración y purificaciónde las enzimas. Por su parte Gottschalk et al., (2008)

realizaron la concentración de lignino peroxidasa obtenida a partir de Streptomycetes

viridosporus T7A, mediante el uso de una celda con agitación a nivel laboratorio con

membranas de ultrafiltración de 10, 20 y 50 KDa elaboradas de polisulfona. Las cuales

se compararon entre sí y con una membrana de celulosa de 20 KDa, observaron que la

mayor concentración de la enzima (90%) se logró con la membrana de polisulfona de

10 KDa. Tishchenko et al., (2010), realizararon la separación de un complejo de

enzimas quitinolíticas de Clostridium paraputrificum J4, mediante el uso de diafiltración

empleando membranas de 100, 30 y 10 KDa. La membrana de 100 KDa fue capaz de

retener las impurezas mientras que en el retenido de la membrana de 30 KDa se

encontró el complejo enzimático.

35

2. JUSTIFICACIÓN

Los subproductos agroindustriales constituyen un problema serio de residuos en gran

parte del mundo debido a dos factores principales: un aumento en la producción de

estos y al surgimiento de leyes ambientales más estrictas. Dichos subproductos

agroindustriales generan de forma ineludible residuos causantes de contaminación

ambiental en aguas, suelos y atmósfera, que además ponen en peligro la salud humana

y el nicho ecológico de muchas especies animales y vegetales. De la gran diversidad de

residuos agroindustriales generados en México, la industria del mezcal resulta ser un

problema ambiental grave. El Estado de Oaxaca produce el 65% del mezcal del país,

por la tanto genera unacantidad considerable de bagazo (19 millones de kilogramos) y

de vinazas (14 millones de litros). A este tipo de residuos no se le da un tratamiento

adecuado paraevitar problemas ambientales, y es una oportunidad para que los

productores de mezcal puedan darle un valor agregado a sus desechos.

Entre las alternativas que presentan mejores posibilidades de utilización de las vinazas

y el bagazo proveniente de la industria mezcalera, se encuentran los procesos de

biotransformación a partir del uso de hongos ligninolíticos, los cuales producen enzimas

extracelulares (Lacasa, Manganeso peroxidasa y Ligninoperoxidasa), las cuales en los

desde finales del siglo XIX han tenido un impacto importante dentro de la industria

alimentaria (estabilizador de vinos, cerveza y jugo de frutas), biorremediación

(eliminación de herbicidas, PCB´s, TNT) en la producción de etanol a partir de materia

ligninolitica, por mencionar solo algunas.

36

El presente trabajo tiene como objetivo principal el aprovechamiento de los desechos

líquidos y sólidos generados por la industria mezcalera del estado de Oaxaca, para

producir la enzima lacasa, la cual en los últimos años ha tenido un alto interés

comercial.Así mismo se pretende dar un propuesta biotecnológica al problema

ambiental generado por este tipo de efluentes y en una etapa final ser una alternativa

para los productores de mezcal al tratar los desechos líquidos y obtener un beneficio

económico.

3. HIPÓTESIS

o La presencia de azúcares residuales de la fermentación de agave en las vinazas

de origen mezcalero servirán como medio de cultivo para la producción

enzimática de lacasa empleando Trametes versicolor y Pleurotus spp.

o La presencia de compuestos fenólicos en los medios de fermentación

promoverán la producción delacasa.

4. OBJETIVOS

Objetivo general

o Producir lacasa a partir de Pleurotus spp.y Trametes versicolorempleando

vinazas y bagazo de origen mezcalero como sustrato.

Objetivos específicos

o Efectuar la caracterización fisicoquímica del bagazo y las vinazas

mezcaleras.

37

o Realizar el cultivo, propagación y mantenimiento de Pleurotus spp.y

Trametes versicolor en medio sólido.

o Evaluar y seleccionar el mejor medio de cultivo líquido para la

propagación y mantenimiento de Pleurotus spp.

o Seleccionar a la cepa de Pleurotus spp. que presente la mayor actividad

enzimática.

o Realizar la formación de pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo) para

utilizarlos como biocatalizadores para la producción de lacasa en

fermentación en cultivo sumergido.

o Evaluar la influencia de la concentración de azucares reductores

(expresados como mg de equivalente de fructosa/L) en vinazas

mezcaleras para la producción de lacasa en fermentación en cultivo

sumergido utilizando pellets dobles (hongo ligninolítico+ bagazo).

o Evaluar la actividad de lacasa en fermentación en estado sólido

empleando bagazo mezcalero como sustrato.

o Seleccionar al sistema de fermentación que muestre la mayor actividad de

lacasa y realizar la extracción, separación y purificación parcial.

38

5. METODOLOGÍA

- Plan general de trabajo

En la figura 6 se muestra el plan general de trabajo, el cual se dividió en las siguientes

fases.

Figura 6. Plan general de trabajo.

FASE I. Caracterización fisicoquímica de las vinazas y bagazo de origen

mezcalero.

Las vinazas fueron sometidas a un pre-tratamiento que consistió en una sedimentación

y una centrifugación posterior, antes de la determinación de los parámetros

fisicoquímicos evaluados.

FASE I. Caracterización fisicoquímica de las vinazas y bagazo de origen mezcalero

FASE II: Evaluación de los medios de cultivo para el crecimiento de los hongos ligninolíticos

FASE III: Selección de la cepa (s) de Pleurotus spp. que presenten la mayor actividad enzimática de lacasa y evaluación de la actividad enzimática de Trametes versicolor.

FASE IV: obtención de Lacasa

FASE V: Purificación parcial de la enzima lacasa

39

Actividad 1-FI. Obtención y caracterización fisicoquímicade las vinazas

mezcaleras

40

Parámetros fisicoquímicos a evaluados:

F1.1. 1. pH (Método estándar 423)

El pH es uno de los parámetros más importantes y frecuentes utilizados en análisis

químicos para determinar el carácter ácido o básico de una sustancia. La medición del

pH se basó en determinar la actividad de los iones hidrógeno por medio de una

medición potenciométrica utilizando un electrodo de vidrio y un electrodo de referencia.

Se midió la muestra de vinazas con un potenciómetro a 25°C calibrado con soluciones

buffer de pH 4.0 y 7.0.

F1.1.2. Demanda Química de Oxígeno (DQO) (Método estándar 5220 D)

Se uso el método de digestión con dicromato (método 8000 de Hach).Se utilizó un

incubador de tipo baño seco el cual proporciona constantemente una temperatura de

150 2º C, que es la requerida para la estimación de la DQO de una muestra. Bajo

estas condiciones de temperatura, los compuestos orgánicos sonsusceptibles de ser

oxidados reaccionan con un fuerte oxidante, el dicromato de potasio, con lo que el ión

dicromato (CrO7-2) se reduce a ión crómico (Cr3+), de color verde, el cual se cuantifica a

600 nm. La mezcla de reacción también contiene iones plata y mercurio. La plata actúa

como catalizador de la reacción y el mercurio se utiliza para eliminar las interferencias

ocasionadas por los cloruros.

Reactivo 1 (solución digestora): Se adicionó 10.2 g de K2Cr2O7 y 33.3 g de HgSO4a

167 mL de H2SO4 concentrado, posteriormente se mezclaron con 500 mL de agua

deionizada. La solución se enfrió y diluyó a 1 L con agua deionizada.

Reactivo 2 (solución catalítica): 9.51 g de AgSO4se disolvieron en 1 L de H2SO4.

41

Reactivo 3. Se disolvieron 8.5 g de biftalato ácido de potasio (KHC8H4O4) en agua

deionizada, y se aforó a 1 L. Esta solución demanda 10,000 mg de O2/L para su

oxidación, ya que la DQO teórica de este compuesto es de 1.12 mg de O2/ mg de

biftalato. A partir de esta solución, se prepararón los testigos de concentración

necesarios para elaborar la curva de calibración correspondiente.

Se le adicionaron 3.5 mL de Reactivo 1 y 1.5 mL del Reactivo 2 a tubos que contengan

2.5 mL de muestra convenientemente diluida, se agitaron durante 10 segundos, y

posteriormente los tubos se colocaron en el reactor de baño seco a 150º C por dos

horas. Los tubos se dejaron enfriar a temperatura ambiente y el color desarrollado se

leyó a 600 nm en un espectrofotómetro marca Hach modelo DR500. El

espectrofotómetro se ajustó con un blanco de reactivo. El ensayo de los testigos de

concentración y del blanco del reactivo se realizó de la misma forma y simultáneamente

al de las muestras problema.

F1.1.3. Sólidostotales (ST), suspendidos (SS), volátiles (SSV), suspendidos fijos (SSF)

y volátiles totales (SVT) (Método estándar 2540)

Analíticamente el contenido total de sólidos en las aguas residuales se define como

toda la materia orgánica remanente que queda como residuo después de una

evaporación a 103-105 °C. Los sólidos totales o residuos de evaporación, pueden ser

clasificados en no filtrables (suspendidos) y filtrables de un volumen conocido que pasa

a través de un filtro. Un filtro de fibra de vidrio (Whatman GF/C) con tamaño de poro

nominal de 1.2 μm es comúnmente empleado para llevar a cabo esta separación. Los

sólidos disueltos consisten en moléculas orgánicas e inorgánicas así como iones

42

presentes en el agua residual. Cada una de las categorías puede ser clasificada en

base a su volatilidad a 550 ± 50 °C. La fracción orgánica se puede oxidar y volatilizar a

esta temperatura y quedar una fracción remanente en forma de cenizas (fracción

inorgánica). A estas fracciones se les conoce como sólidos suspendidos volátiles y

sólidos suspendidos fijos respectivamente.

Procedimiento: se llevóun crisol Gooch a peso constante en una estufa a 100 °C y se

colocó un filtro de fibra de vidrio de 0.45 µm, con la superficie rugosa hacia arriba. Se

colocaron en un matraz kitasato provisto de un sostén de sargent y se aplicó vacío

agregando suficiente agua destilada para que el disco se fijara en la base del crisol y

cubriera completamente las perforaciones; se llevó a la mufla durante 15 minutos a 550

°C ± 50 °C. Se atemperóel crisol en un desecador y se pesó en la balanza analítica.

Posteriormente, el crisol se colocó en el matraz kitasato y se filtró1 mL de muestra. Se

seco en una estufa previamente ajustada a 100 °C durante una hora. El crisol se

atemperóen el desecador y se pesó en la balanza analítica, el resultado de esta pesada

representa los sólidos suspendidos totales (SST). El crisol se pasó a la mufla a 550 °C

± 50 °C durante 20 minutos, se dejó atemperar en el desecador y se pesó, con esto se

determinaron los sólidos suspendidos fijos (SSF); los sólidos suspendidos volátiles

(SSV) se calcularon al restar SSF de SST.

F1.1.5. Conductividad (Método estándar 2510 B)

La conductividad eléctrica (k) se define como la capacidad que tienen las sales

inorgánicas en solución (electrolitos) para conducir la corriente eléctrica. Esta capacidad

depende de la presencia de iones cargados positiva y negativamente y la cantidad

43

conducida dependerá del número de iones presentes y de su movilidad, así como de la

temperatura de medición.

La conductividad se determinó empleando un conductimetro modelo sension 156 marca

HACHMR. Se realizó la corrección por temperatura, sólidos disueltos totales y

temperatura del instrumento conforme a lo señalado en el manual del instrumento. Se

calibró con una solución estándar de cloruro de sodio de 1000 μS/cm a 25°C y se

realizó la lectura de las muestras.

F1.1.6. Determinación de sulfatos (Método 8051 HACH MR) y fosfatos (Método 8048

HACH MR)

En general, los fosfatos se encuentran en las aguas como ortofosfatos, es decir, PO-34,

HPO-24, etc. Los ortofosfatos reaccionan con el molibdato en un medio ácido para

formar un complejo de fosfomolibdato. El ácido ascórbico reduce al complejo dando un

intenso color azul de molibdeno.Los iones sulfato en la muestra reaccionan con el bario

contenido en el reactivo Sulfaver 4 Sulfate y forman sulfato de bario, insoluble y turbio.

La turbidez es proporcional a la concentración de sulfatos.

Se ajustó el espectrofotómetro a la longitud especificada para cadauno de los métodos

(ver tabla 10). Se llenó una celda con 10 mL de muestra convenientemente diluida,se le

agregóel contenido de un sobre de reactivo HACHMR y se agitóhasta mezcla

homogénea. Se dejó reposar durante el tiempo especificado en la tabla 10 para una

reacción completa.Se preparó un blanco con agua destilada.

44

La celda del blanco se colocó en un espectrofotómetro y se ajustó a cero,

posteriormente, se introdujo la celda de la muestra y se leyó la absorbancia. La

preparación de la muestra se repitió para obtener un duplicado de la lectura.

Tabla 8.Especificaciones para la determinación de sulfatos y fosfatos.

Parámetro Intervalo Longitud

(nm) Método

(#) Reactivo

Reposo (minutos)

Fosfatos 0 a 2.50 mg/L PO3- 4 890 490

PhosVer 3 Phosphate

2

Sulfatos 0 a 70 mg/L SO2- 4 450 680

SulfaVer 4 Sulfate

5

F1.1.7.Nitrógeno total (Método 10071 HACH MR). Método de Persulfato.

El método de persulfato se usa para determinar el nitrógeno total por la oxidación de los

compuestos nitrogenados a nitrato y su posterior cuantificación.

Se adicionó a dos tubos un sobre de Nitrógeno Total Persulfato (HACH MR).

Posteriormente, se adicionó a un tubo 2 mL de muestra problema y al segundo tubo 2

mL de agua deionizada (blanco). Se agitó vigorosamente durante 30 segundos para su

mezcla completa. Se colocaron los tubos en una parrilla a 105°C durante 30 minutos,

posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente. Se adicionó a cada uno de los

tubos un sobre del reactivo A de nitrógeno total y se agitódurante 15 segundos y se

dejo 3 minutos (tiempo de reacción). Pasado el tiempo, se agregó a cada uno de los

tubos un sobre del reactivo B de nitrógeno total, se agitó durante 15 segundos y se

esperó 2 minutos de tiempo de reacción. Se añadió 2 mL de las muestras

anteriormente digeridas a tubos de Nitrógeno Total reactivo C, se agitó los tubos

45

lentamente y se esperó 5 minutos de tiempo de reacción. Por último la muestra se leyó

en un espectrofotómetro a 410 nm, calibrando a cero con el blanco.El blanco se realizo

adicionando agua destilada en lugar de muestra.

F1.1.8.Determinación del contenido de fenoles totales expresados como ácido gálico

(Box, 1983).

Acondicionamiento de la muestra

Se tomaron 20 mL de muestra, y se sometieron a extracción líquido-líquido por

triplicado con 20 mL de acetato de etilo (v/v) a temperatura ambiente. Se combinaron

las tres fracciones orgánicas y se eliminó el agua presente en los extractos con Na2SO4

anhidro. El acetato de etilo se evaporó empleando un rotavapora 60°C y

posteriormente, la muestra se resuspendió en 20 mL de una mezcla 60:40 de metanol-

agua. La curva estándar se realizó empleando ácido gálico. Para la determinación, en

tubos de ensaye de10 mLse adicionó 50 µL de muestra (o estándar), 3mL de agua

destilada y 250 µL de reactivo de Folin Ciocalteau 1M, y se dejaron reposar por 5

minutos a temperatura ambiente y se agitaron por 15 segundos. Pasado el tiempo, se

adicionaron 750 µL de Na2CO3 al 20%,se homogeneizaron y se dejaron reposar por 40

minutos. Las muestras se leyeron a una absorbancia de 765 nm en un

espectrofotómetro marca Hach modelo DR5000. El blanco se realizó por la sustitución

de la muestra por agua desionizada.

F1.1.9. Color a 475 nm (Peña et al., 2003).

Se midió la absorción de la luz visible a 475 nm que caracteriza el color marrón. Se

tomo 5 mL de muestra y se centrifugó a 4000 x g durante 5 minutos, para eliminar los

46

sólidos que se encuentran en la suspensión. Se filtró a traves de un filtro Whatman No.

41. El filtrado se colocó en una celda de cuarzo para la determinación de la

absorbancia a 475 nm.

F1.1.10. Aromáticos totales (Abs 254 nm; Benitez et al., 2003)

Los compuestos aromáticos orgánicos presentan una absorción a una longitud de onda

de 254nm, debido a las propiedades de los dobles enlaces C=C. A mayor cantidad de

compuestos aromáticos totales existentes, mayor será la absorbancia observada y por

lo tanto mayor será la contaminación por compuestos recalcitrantes orgánicos (Mrkva,

1983).

La muestra se centrifugóa 4000 x g por 10 minutosse filtró a traves de un filtro Whatman

41, el filtrado se colocó en una celda de cuarzo con un paso de luz de 10 mm. Se

realizó la medición a 254nm. Se utilizóagua como blanco de reactivo.

F1.1.11. Minerales: Cu+2, Na+1, K+1, Ca+2, Zn+2, Fe+3, Mg+2, Ni+2, Cd+2. (Método estándar

3111B).

Acondicionamiento de la muestra

En una capsula de porcelana a peso constante, se colocó1mL de vinazas mezcaleras.

La muestra se incineró y calcinó en una mufla a 600 °C. Posteriormente se

disolvieroncon ácido nítrico 0.5 M en un matraz de 100 mL previamente tratado. La

determinación de los metales se realizó empleando un espectrofotómetro de absorción

atómica marca GBC modelo 932AA.En la tabla 09 se muestran los parámetros para

cada metal analizado.

47

Tabla 9. Parámetros para la lectura de metales en el equipo de absorción atómica.

Elemento Longitud de

onda (nm)

Gases de la

flama

Sensibilidad

(mg/L)

Rango de

concentración

óptimo (mg/L)

Ca 422.7 A-Ac 0.02 1- 4

Cu 324.7 A-Ac 0.025 1- 5

Fe 248.3 A-Ac 0.05 2- 9

K 766.5 A-Ac 0.008 0.4- 1.5

Mg 285.2 A-Ac 0.003 0.1- 0.4

Na 589.0 A-Ac 0.004 0.18- 0.7

Zinc 213.9 A-Ac 0.008 0.4- 1.5

Cd 228.8 A-Ac 0.009 0.2- 1.8

Ni 232.0 A- Ac 0.04 1.8- 8

Notas. A: aire; Ac: acetileno; ON: oxido nitroso.GBC Scientific equipment PTY LDT.

F1.1.12. Azúcares reductores. Método DNS (Königet al., 2002)

Preparación del reactivo DNS: Se disolvió 0.8 g de NaOH en 40 mL en agua destilada,

se añadió lentamente 0. 5 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico, posteriormente se agregó, en

agitación, 15 g de tartrato de sodio y potasio.Se aforó a 50 mL de agua destilada.

Determinación. Se adicionó 0.5 mL de la muestra y 0.5 mL del reactivo DNS en tubos

de ensaye con rosca de 10 mL, se colocaron los tubos en baño de agua en ebullición

por 5 min.Se enfriaron en un baño de agua fría hasta temperatura ambiente, una vez

atemperados se adicionaron 5 mL de agua destilada, se agitaron y se leyó la

absorbancia a 540 nm. Se realizó la curva patrón con respecto a fructosa (1,2,3,5,8

mM).La muestra se sustituyó por agua deionizada para el blanco de reactivos.

48

Actividad 2-FI. Determinación de las propiedades físico-químicas del bagazo.

Las pencas de agaveAngustifolia haw (Ah) y Potatorum zucc (Pz) se colocaron en una

autoclave a 15 psi durante 4 horas. Posteriormente se les extrajeron los jugos y el

bagazo obtenido se secó en una estufa a 60°C durante 8 horas. Posteriormente se

realizó una reducción de tamaño manual del bagazo procedente de las pencas deagave

y se redujeron de tamaño empleando en un molino ciclónico marca Foss modelo

CyclotecTM 1093, con malla de 0.5 mm. Los polvos colectados se guardaron en

recipientes de plástico

F1. 2.1. Determinación del contenido de fenoles totales expresados como ácido gálico.

Se llevó a cabo mediante una hidrólisis alcalina empleando 0.2g de la muestra de polvo

de los pencas de agave. La muestra se colocó en un vaso de precipitados conteniendo

4 mL de una solución de NaOH 2N. Se agitó durante 4 horas a 190 rpm en una agitador

orbital marca IKA modelo KS 260. Posteriormente se ajustó el pH de la muestra a 2

con HCl 10%. La determinación de fenoles totales se realizó mediante el método de

Folin y Ciocalteau (Box, 1983).

F1.2.2.Determinación de minerales (Cu,Na, K, Ca, Zn, Fe, Mg). (Método estándar

3111B).

Se calcinó 1 g de bagazo en crisoles a peso constante. Posteriormente, se disolvió en

100 mL de ácido nítrico 0.5 M. Las muestras se guardaron en recipientes de vidrio,

previamente tratadas con ácido nitríco 0.5 M, hasta su análisis. La determinación de los

metales se realizó empleando un espectrofotómetro de absorción atómica marca GBC

modelo 932AA.

49

FASE II: Evaluación de los medios de cultivo para el crecimiento de los hongos

ligninolíticos.

Microorganismos

En la tabla 10 se muestran las claves asignadas a las cepas de hongos ligninolíticos

empleados durante el desarrollo del trabajo.

Tabla 10. Nombre y clave de las cepas a utilizar en los ensayos

Nombre de la cepa Clave

Trametes versicolor(CDBB-h-1051) Tv

Pleurotus spp. (Parentales) PsUTMR y PsUTMB

Pleurotus spp. (Híbridos) H2R2B4 ;H1R4B6; H2R3B4 y H3R2B1

Las cepas parentales de Pleurotus spp. fueron aisladas en el Instituto de Agroindustrias

de la Universidad Tecnológica de la Mixteca, así como las cuatro cepas hibridas

obtenidas de la cruza de las dos cepas antes mencionadas, las cuales fueron

gentilmente donadas por la Dra. Paula Guadarrama (2012). La cepa de Trametes

versicolor (CDBB-h-1051), provino de la colección del CINVESTAV. Esta cepa fue

donada al CINVESTAV por el Dr. Ian Reid, Paprican, Canadá.

Actividad 1-FII. Mantenimiento y propagación

Se realizó la resiembra y verificación de la pureza de la cepa empleando las técnicas

microbiológicas para el mantenimiento y propagación de hongos. Las cepas se

propagaron en medio sólido, en cajas petri conteniendo agar de papa y dextrosa (PDA)

al 2% para Trametes versicolor, y en agar bacteriológico (AB) + extracto de malta (EM)

para las cepas parentales e híbridas de Pleurotus spp.ambas se incubaron a 30 ºC por

8 días.

50

La propagación en medio líquido se realizó mediante la toma de un pedazo de 0.5 cm

de diámetro del micelio (Trametes versicolor o Pleurotus spp.) formado en la superficie

de la caja petri (Medio de propagación AB + EM) y se inoculó en caldo dextrosa

sabouraud 2% para Trametes versicolor. Las cepas de Pleurotus spp.se incubaron en el

medio seleccionado en la actividad 2. Ambas cepas se incubaron entre 8 y 10 días a

30°C.

Actividad 2-FII. Evaluación del medio líquido

Se probaron 4 medios complejos para el crecimiento de las cepas de Pleurotus spp.:

i) Medio de cultivo A, modificado por lo reportado por Robledo et al., 2006.

Las cantidades en (g/L): Dextrosa anhidra (10.0), Peptona de caseína (2.5),

K2HPO4(1.0), KH2PO4(1.0), MgSO4.7H2O (0.5), NaCl (0.3),NH4Cl (1.0), CaCl2.2H2O

(0.1),Tiamina (0.02), Solución de elementos traza 2mL:FeSO4.7H2O (5.0),

MnSO4.H2O (4.0), CoCl2.6H2O (1.0), ZnCl2 (1.0), (NH4)6Mo7O24.4H2O (0.5),

CuSO4.5H2O (0.3), NiCl2.6H2O (1.0).

ii) Medio de cultivo B, las mismos elementos del medio A, se sustituyó la dextrosa

anhidra por extracto de malta

iii) Medio de cultivo C se empleó Caldo dextrosa sabouraud 2% (CDS-2%)

iv) Medio de cultivo D, es el medio C pero con adición de extracto de malta.

Trametes versicolor, se evaluóen el medio C.

Se seleccionó el medio más adecuado de acuerdo a los parámetros siguientes: a)

crecimiento del micelio de manera visual y b) mediante la determinación de actividad

enzimática de lacasa.

51

Actividad 3-FII. Evaluación del medio sólido.

Se evaluaron los siguientes polvos de bagazo de agave: polvo de bagazo de penca de

agave Angustifolia haw (Ah), y el polvo de bagazo de la penca y de la piña del

agavePotatorum zucc (Pz y Pzi respectivamente).

Se seleccionó el medio más adecuado para el crecimiento de las cepas de acuerdo a

los siguientes parámetros: a) crecimiento del micelio de manera visual (empleando las

cepas mostradas en la tabla 12) y b) mediante la determinación de actividad enzimática

de lacasa.

FASE III: Selección de la(s) cepa(s) dePleurotus spp.que presenten la mayor

actividad enzimática de lacasa y evaluación de la actividad enzimática de

Trametes versicolor.

Actividad 1.F-III. Evaluación de la actividad enzimática de lacasa en cepas de

Pleurotus spp. y Trametes versicolor.

La evaluación de la actividad enzimática de la lacasa se llevó a cabo bajo la siguiente

metodología. Se tomaron 2 mL de medio de cultivo y se filtraron a través de un papel

Whatman 41, posteriormente se filtraron a través de una membrana regenerada de

celulosa econofiltro marca Agillent de 0.45 m. El análisis se realizó inmediatamente

después de la toma de muestra.La determinación de la actividad de lacasa se realizó

conforme a lo señalado por Wolfenden y Wilson, 1982.

FASE IV. Obtención de lacasa.

Actividad 1-FIV. Cinética en fermentación en cultivo sumergido (FCS)

F4.1.1. Propagación del Hongo ligninolítico.

52

Se tomó un pedazo de 0.5 cm de diámetro del micelio (Trametes versicolor ó Pleurotus

spp.) formado en la superficie de una caja petri con medio de propagación AB +

EM.Las muestras se inocularon en matraces Erlenmyer conteniendo 100 mL del medio

de cultivo líquidoseleccionado en la Fase II para las cepas de Pleurotus spp.y en CDS

2% para Trametes versicolor. Se dejaronincubar en una incubadora marca Shel lab

modelo SMI2 a 30°C durante 10 días. Posteriormente el micelio formado de Trametes

versicolor y el de las cepas de Pleurotus spp. (seleccionadas en la Fase III) en la

superficie del matraz, se transfirieron a un vaso de vidrio estéril y se licuó.

Posteriormente se tomó una muestra de 1 mL y se determinó la concentración de

sólidos suspendidos totales (SST) conforme a lo establecido en los métodos estándar

2540 (APHA-AWWA-WPC. 1998).

F4.1.2. Formación de los pellets doble HL+ bagazo de agave.

Se empleó polvo de bagazo previamente acondicionado en la Actividad 2-FI empleando

una relación de bagazo/hongo ligninolítico de 50 mg de polvo de bagazo/30 mg

biomasa del HL (SST). Para la formación del pellet, se tomaron 100mL del medio A y se

vertieron en un matraz Erlenmeyer de 250 mL, se adicionaron 50 mg de polvo de

bagazo y se esterilizó a 15 psi por 15 min, posteriormente, se inocularon con 30 mg de

los HL en base seca. Los matraces se colocaron en una agitadora orbital marca IKA

modelo KS 260 a 140 rpm durante los primeros dos días y posteriormente a 150 rpm

hasta la formación de los pellets (aproximadamente de 4 a 5 días). La formación de

pellets se realizó atemperatura ambiente.

F4.1.3. Desarrollo de la fermentación en cultivo sumergido.

Se realizaron cinéticas en cultivo sumergido por lote empleando matraces de 250 mL

conteniendo 180 mL de vinazas mezcaleras previamente diluidas a 600, 800, 1200 y

53

1800 mg de equivalentes fructosa (EF)/L y esterilizadas, e inoculadas con los pellets

formados en la Fase IV, los cualesantes de ser inoculados se filtraron del medio de

formación de pellets y se lavaron con agua isotónica esterilizada. Las concentraciones

de las vinazas mezcaleras fueron expresadas como equivalentes de fructosa para

facilidad de comparación de resultados. Los matraces se colocaron en una agitadora

orbital marca IKA modelo KS 260 a 150 rpm a temperatura ambiente durante 14 días.

El tratamiento control consistió en sustituir las vinazas mezcaleras por el medio de

cultivo seleccionado en la Fase II para Pleurotus spp., y el medio C para Trametes

versicolor. El propósito del control fue la comparación de la actividad enzimática de

lacasa en un medio con los elementos reportados para el crecimiento de hongos

ligninolíticos y las obtenidas empleando vinazas.

El seguimiento de la cinética a nivel matraz para la evaluación de la actividad de lacasa

empleando vinazas mezcaleras+ pellets formados por HL+ bagazo de agave, se realizó

mediante la extracción de 2 mL del medio de cultivo (vinazas o medio control) y se

midió la actividad enzimática de lacasa conforme a lo reportado por Wolfenden y

Wilson, 1982.El diseño de experimentos consistió en un factorial general donde el

efecto del factor concentración de equivalentes de fructosa a niveles de:600, 800, 1200

y 1800 mg EF/L, sobre la actividad enzimática fue examinada (Tabla 11).

Tabla 11: Diseño factorial general para los experimentos de la FCS.

Factor A Origen de la

cepa

Factor B Concentración de azucares reductore expreados como mg EF/L

600 800 1200 1800

Trametes versicolor

X X X X

Pleurotus spp. X X X X

54

F4.1.4.Determinación de actividad enzimática de lacasa.

Una de las reacciones catalizadas por la enzima es la que tiene lugar con el ABTS

(ácido 2,2-azino-bis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonico)) el cual es un reactivo que se

puede emplear para la cuantificación de la lacasa por que participa en una reacción

específica. Mezcla de reacción (2mL): En una celda de cuarzo con un paso de luz de

10mm, se añadió 0.30mL de buffer citrato- fosfato (pH 3.0) se adicionó 0.10 mL del

sustrato ABTS 1mM, 1mL de la muestra o agua (blanco) y se llevó a 2mL con agua

destilada (0.6mL). La mezcla de reacción se realizó a 30°C en un espectrofotómetro

marca Hach modelo DR500 acoplada a una cámara termoestática (“celda Peltier”). Se

leyó el aumento de Abs λ= 420 nm, durante 5 minutos. Una unidad de actividad

enzimática de lacasa (1 U de Lac) se define como la cantidad de enzima requerida para

oxidar 1 μmol ABTS/min*mL de solución de la enzima. La actividad enzimática

volumétrica es definida como la actividad enzimática presente en un volumen definido

del filtrado del sistema de fermentación.

Actividad 2-FIV. Cinética en fermentación en estado sólido (FES) empleando

polvo de bagazo de agave + HL.

La cinética en estado sólido se realizó mediante muestras destructivas, la cual consistió

en inocular n muestras de bagazo mezcalero con el hongo ligninolítico e ir tomando una

muestra cada tercer día y evaluar el parámetro de actividad enzimática de lacasa

durante un periodo de 15 días.

Para realizar la cinética se colocaron 0.5g de bagazo de agave previamente

acondicionado (tamaño de partícula 0.5mm) en cajas petri y se esterilizaron a15 psi por

15 minutos. Posteriormente se inocularon con 15mg de biomasa de cada hongo

ligninolítico (los cuales se propagaron como se indicó en la Fase IV Actividad 1), las

55

cajas petri se sellaron con papel parafilm y se dejaron a temperatura ambiente. Cada

tercer día se verificó el contenido de humedad y se adicionó con 2 mL de medio de

cultivo.

En el tratamiento control, se sustituyó al bagazo por el medio de cultivo líquido

seleccionado en la Fase II para Pleurotus spp.y el medio C para Trametes versicolor. El

propósito fue comparar la actividad enzimática de lacasa con respecto a las obtenidas

empleando bagazo mezcalero.

Los ensayos se realizaron en cajas petri por duplicado y se determinó actividad

enzimática de lacasa cada tercer día por 15 días. Para la determinación de la actividad

enzimática se realizó el lavado del HL+bagazo de las cajas petri, mediante la adición de

5mL de buffer 0.1 M de citrato-fosfato pH 3 y se filtró a través de un filtro Whatman No

41. La medición de la actividad enzimática de lacasa se llevó a acabo conforme a lo

señalado por Wolfenden y Wilson, 1982.

El diseño de experimentos consistió en un factorial general donde el efecto del origen

delbagazo utilizado a dos niveles (penca de agave Potatorum zucc y penca de agave

Angustifolia haw) y la cepa de hongo ligninolítico a dos niveles (Trametes versicolor y

Pleurotus spp.) fueron evaluados sobre la actividad enzimática de lacasa (Tabla 12).

Tabla 12: Diseño factorial general para los experimentos de la FES.

Factor A Origen de la cepa

Factor B Polvo de bagazo de agave

Penca de agave Potatorum zucc

Penca de agave Angustifolia haw

Trametes versicolor X X

Pleurotus spp. X X

56

FASE V. Purificación parcial de la enzima lacasa.

Actividad 1-FV. Elección de la cepa con mayor actividad de lacasa.

Se eligió la cepa con mayor actividad enzimática obtenida en los ensayos de cultivo

sumergido y del cultivo en estado sólido. Se obtuvo el tiempo de fermentación para la

máxima actividad enzimática de lacasa a partir de las cinéticas de fermentación.

Actividad 2-FV. Separación de laenzima lacasa del medio de fermentación.

La separación de la enzima lacasa del medio de cultivo se realizó mediante las

siguientes etapas: Etapa 1.Separación de la biomasa, se tomaron 100 mL de medio de

cultivo, enel tiempo de cinética donde se observó la mayor actividad de lacasa y se filtró

a vacío empleando un filtro Whatman No 41. Etapa 2. Eliminación de residuos del HL, 5

mL del filtrado obtenido en la etapa 1, contenidos en una jeringa, se pasaron a través

de una membrana de celulosa regenerada de 0.45 m (econofiltro marca Agillent).

Etapa 3. Concentración y purificación parcial de la lacasa, se tomaron 500 L del

filtrado obtenido en la etapa 2 y se colocaron en un centricon con membrana de

polisulfona de tamaño de poro de 10kDa (Millipore®), se filtraronempleando una

centrifuga marca Hangzhou Allsheng Instruments, modelo mini-10K, sin refrigerar, a

10,000 rpm por 5 minutos, 4 veces, obteniendo un volumen final de 100 L. Se

recupero el retenido el cual fue utilizado para las pruebas de electroforesis.

Actividad 3-FVI. Identificación de la lacasa mediante electroforesis en

condiciones desnaturalizantes.

La identificaciónde la enzima lacasa se realizó mediante electroforesis en gel de

poliacrilamida dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE, de sus siglas en ingles), lo que

permitió identificar a la lacasa por pesos moleculares, empleando estándares de pesos

57

moleculares de 250, 150, 100, 75, 50, 30, 25, 20, 15 y 10 kDa (Precision Plus Protein™

Standards, marca Biorad). Se utilizó un equipo marca BioRad modelo Mini-PROTEAN®,

y gelesde acrilamidaal 7.5% los cuales fueron preparados como se indica en la Tabla

13.

Tabla 13: Composición del gel de acrilamida 7.5%.

Reactivo Gel separador Gel concentrador

Acrilamida 30%- Bis acrilamida 0.8% 1.25 mL 0.4 mL Buffer Tris- HCl 1.5 M, pH 8.8 1.25 mL ------ Buffer Tris- HCl 0.5M, pH 6.8 ------- 0.75 mL H2O destilada 2.1 mL 1.52 mL SDS10% (dodecil sulfato de sodio) 0.1 mL 0.03 mL persulfato 10% 0.035 mL 0.015 mL TEMED(N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina)

0.005 mL 0.010 mL

Para la preparación del buffer de carga se pesaron100 g de SDS, 1g azul de

bromofenol,100 mL de gliceroly se disolvió en 1 l del buffer Tris- HCl 0.2M pH 6.8.Se

agregaron 10 µL de mercaptoetanol por cada 1000 µL de buffer de carga antes de

usarse.

Para la elaboración del buffer de corrida se pesaron 2.04g de Tris- Base, 9.8g de

glicina, 6.8mL de SDS 10% y se disolvieron en 850 mL de agua deionizada.

La solución de teñidora se preparo con metanol al 40% (v/v); 10% ácido acético (v/v); y

0.25% azul Coomassie G-250 (p/v). Se mezclaron y se disovió a homogeneidad,

posteriormente se filtró empleando filtro Whatman No. 41.

Para la preparación de la muestra se pusieron en un eppendorf 50 L de la muestra

concentraday purificada parcialmente y buffer de carga en una relación 1:1 (v/v). se

mezclo usando un vortex (Ika modelo Vortex 3) y se colocó en un baño de agua en

ebullición por 5 minutos. Posteriormente, 20 L de la mezcla se colocaron en un pozo

58

del gel. El tiempo de corrida fue de 90 minutos a 120V.Una vez terminada la corrida, el

proceso de tinción se llevo a cabo utilizando un microondas (marca Panasonic modelo

NN-SF550M), para lo cual el gel se sumergió en la solución teñidora y se calentó con

una potencia de 1000 watts por dos minutos con intervalos de tiempo de 15 segundos.

Posteriormente el gel se lavócon agua deionizada para eliminar el colorante no fijado en

las bandas de proteína, el desteñido se llevó a cabo en el microondas en las mismas

condiciones de calentamiento antes mencionadas.

Actividad 4-FVI. Identificación de la actividad de la lacasa mediante Zimogramas.

El zimograma se realizó para observar la presencia de bandas con actividad de lacasa

en la muestra obtenida en la etapa 3, para lo cual se llevo una electroforesis en

condiciones nativas, empleando como sustrato una soluciónde ABTS 1 mM en buffer de

citrato-fosfato pH 3.

El gel nativo se elaboró con concentraciones de gel de acrilamida de 7% para el gel

separador y 4% para el gel concentrador.

Tabla 14: Composición del gel nativo (concentrador y separador).

Reactivo Gel separador (7%)

Gel concentrador (4%)

Acrilamida 30%- Bis acrilamida 0.8% 1.25 mL 0.446 mL Buffer Tris- HCl 1.5 M, pH 8.8 1.25 mL ------ Buffer Tris- HCl 0.5M, pH 6.8 ------- 0.833 mL H2O destilada 2.1 mL 2.033mL persulfato 10% 0.033 mL 0.0166 mL TEMED(N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina)

0.005 mL 0.033 mL

Para la preparación del buffer de carga se pesó1g azul de bromofenol y se midió 100

mL de gliceroly se disolvió en 1 l del buffer Tris- HCl 0.2 M pH 6.8.

59

Paa la elaboración del buffer de corrida, se pesaron 2.04g de Tris- Base, 9.8 g de

glicina y se disolvió en 850 mL de agua deionizada.

Como sustrato se utilizó una solución de ABTS 1mM, disuelta en buffer citrato-fosfato

0.1M pH 3.0.

Para la preparación de la muestra, se añadieron 50 L de la muestra concentrada y

purificada parcialmente y 50 L de buffer de carga en una relación 1:1 (v/v) en un

eppendorf.Se mezcló mediante un vortex y posteriormente, 20 L de la mezcla se

colocaron en un pozo del gel. El tiempo de corrida fue de 90 minutos a 120V.Una vez

terminada la corrida, el gel se enjuagó con 25 mL de buffer citrato-fosfato 0.1 M pH 3.0,

y se sumergió en 25 mLde una solución de ABTS 1 mM, a temperatura ambiente y en

ausencia de luz, durante 10 min, pasado el tiempo se retiro la solución de ABTS y por

último se enjuagó el gel con buffer citrato-fosfato 0.1M pH 3.0.

60

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.

Fase I. Caracterización fisicoquímica de vinazas y bagazo de origen mezcalero.

La muestra analizada presentó en general (Tabla 15): ser fuertemente colorida (color

café obscuro 2.82 Abs a 475 nm) alto contenido de materia orgánica medida como

DQO (62500 mg O2/L).Malandra et al., (2003) mencionan que los azúcares contribuyen

en gran medida a la demanda química de oxígeno. Las vinazas contienen alto

contenido de compuestos aromáticos totales (84.0 Abs a 254 nm), altas

concentraciones de fenoles totales expresados como ácido gálico (497 mg equivalente

de ácido gálico (EAG) /L) lo cual esta relacionado con el pH ácido de las vinzas (pH 2.5)

que puede removilizar los metales pesados en el suelo, no obstante el medio ácido

favorece la producción de lacasa por hongos ligninolíticos (Liu et al., 2009). Los

compuestos fenólicos y polifenólicos pueden inhibir la germinación de semillas

provocando daños severos a los campos de cultivo así como un impacto negativo a la

actividad microbiana de los suelos, sin embargo los compuestos fenólicos han sido

reportados como inductores para la producción enzimática de lacasa (Gedikli et al.,

2010; Tiṡma et al., 2012; Elisashvili et al., 2010).Las vinazas cuentan con una

conductividad eléctrica de 4.52 ± 0.012 µS/cm, la cual esta relacionado con el contenido

de meteles presentes en la muestra. La presencia de cobre es importante, ya que se ha

reportado como un metal inductor en la producción de enzimas en bajas

concentraciones (1 mM de cobre) (Hess et al., 2002).Por otro lado la alta concentración

de solidos suspendidos totales puede obstruir los poros del suelo provocando

condiciones anaerobias lo cual contribuye a la fitotoxicidad de los cultivos por la

acumulación de sustancias orgánicas como ácido acético, láctico, glicerol y amonio.

61

Tabla 15. Parámetros determinados en las vinazas mezcaleras.

Parámetro Resultados

DQO (mg O2/L) 62500 ± 7053

SST (mg/L) 9400 ± 2690

SSF (mg/L) 1200 ± 290

SSV (mg/L) 8200 ± 2970

Fenoles totales (mg EAG/L) 497 ± 109

Color (abs 475nm) 2.8 ± 0.09

Compuestos aromáticos totales (abs

254nm)

84.0 ± 3.6

Nitrógeno total (mg N/mL) 45.5 ± 3.5

N-NO3- (mg/L) 228.8 ± 5.3

NO2- (mg/L) 455 ± 21

SO42- (mg/L) 425 ± 7

PO4-3 (mg/L) 105 ± 5

pH 2.4 ± 0.02

Conductividad (µS/cm) 4.5 ± 0.01

Fructosaazúcares reductores (mg EF/L) 5900 ± 100

Con respecto a la caracterización del bagazo se obtuvieron los siguientes resultados: la

concentración de fenoles totales expresados como ácido gálico en la muestra de

bagazo de penca de agave Potatorum zucc (BPAPz) fue 0.038± 0.0019mgEAG/g de

bagazo y de 0.014± 0.0005 mgEAG/g de bagazopara la penca de Angustifolia haw

(espadín). La concentración de cenizas para el bagazo agave Potatorum zucc fue 0.12

± 0.007 g de ceniza/g de bagazo y 0.11 ± 0.008 para bagazo de agave Angustifolia haw.

Las cuales pueden promover alteraciones negativas a la fertilidad de los suelos y

ocasionar contaminación ambiental por lixiviados (Rodríguez et al., 2010).

62

Fase 2 y 3. Evaluación de los medios de cultivo para el crecimiento de los

hongos ligninolíticos y selección de la cepa con mayor actividad enzimática.

En los medios C y D (Actividad 2-FII) el crecimiento de las cepas de Pleurotus spp.(Ps)

fue positivo después de 10 días de incubación. En los medio A y B no se observó

crecimiento del micelio de Ps. Una vez probado el medio, se procedió a la evaluación

de la actividad enzimática de lacasa, con la finalidad de seleccionar la cepa y definir el

medio de cultivo con el cual se obtuviera la mayor actividad. En la tabla 16 se muestran

los resultados de la actividad enzimática obtenida con las diferentes cepas de Pleurotus

spp. (Ps) en los medios C y D, observándose una mayor actividad enzimática en el

medio D; de igual manera se muestra la actividad enzimática de lacasa obtenida por

Trametes versicolor (Tv).

La mayor actividad enzimática de lacasa se obtuvo con la cepa de Tv, obteniéndose un

valor de 538±58 U/L. Para las cepas de Ps, la mayor actividad obtenida fue con la cepa

UTM-B en el medio D, con un valor de 248±0.1 U/L. Por tal motivo se seleccionó a la

cepa UTM-B, para trabajar con ella en la producción enzimática.

Tabla 16. Actividad enzimática obtenida de las cepas de Trametes versicolory Pleurotus

spp.evaluadas en el medio C y D.

Cepa Actividad enzimática (U/L)

UTM-B (Medio C) 94±7

UTM-B (Medio D) 248±0.2

H1R4B6 (Medio C) 6.9±0.1

H1R4B6 (Medio D) 81±1

UTM-R (Medio C) 1.6±0.03

63

UTM-R (Medio D) 7.4±0.7

H2R2B4(Medio C) 6.4±0.01

H2R2B4(Medio D) 18.3±0.7

H2R3B4 (Medio C) 3.1±1

H2R3B4 (Medio D) 2.4±0.3

H3R2B1 (Medio C) 2.9±0.03

H3R2B1 (Medio D) 81±1

TVC (Medio C) 538±58

Nota: CDS 2%: Caldo dextrosa sabouraud (Medio C). CDS+EM: caldo dextrosa sabouraud con extracto de

malta (Medio D). Tv: Trametes versicolor.

Fase 4. Formación de pellets dobles.

En la figura 7 se muestran los pellets dobles formados con Ps -UTMB +Ah y Tv + Ah,

los cuales presentaron diámetros promedio de 0.5 ± 0.1 cm.

Figura 7. Pellets dobles formados con Pleurotus spp.– Ah(a) o Trametes versicolor (b).

Fase 5. Actividad 1. Cinética de fermentación a nivel matraz en cultivo sumergido

(FCS).

En las figuras 8 y 9, se muestranlos resultados obtenidos de las cinéticas enzimáticas

empleando vinazas mezcaleras con concentraciones de 674 y 917mg EF/L,

(a) (b)

64

yempleando pellets dobles de Tv + Ah ó Ps-UTMB + Ah respectivamente. Las

actividades enzimáticas de lacasa fueron medidas cada tercer día por 18 días. En la

figura 8 observamos que la mayor la mayor actividad enzimática alcanzada con pellets

dobles formados con Tv + Ah se obtuvo al noveno día, con 2402 ± 76 U/L, posterior a

este tiempo se observó un decaimiento en su actividad enzimática. Esta actividad de

lacasa fue 2 veces mayor que la máxima actividad de lacasa obtenida empleando

vinazas con una concentración de 674 mg EF/L y 60 veces mayor que la actividad

máxima de lacasa obtenida con el control.

Figura 8. Cinéticas de actividad de lacasa empleando pellets dobles formados con Tv-Ah con

vinazas mezcaleras diluidas, □: a 674 mg EF/L; ◊:a 917 mg EF/L; y Δ:control (medio C)

En la figura 9, se muestran los resultados de la cinética de actividad enzimática

obtenidocon los pellets dobles formados con Ps-UTMB-Ah, donde la mayor actividad

enzimática obtenida fue de 13.9±0.5 U/L, empleando VMD-917, la cual fue 10 veces

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 3 6 9 12 15 18

Ac

tivid

ad

en

zim

áti

ca

(U

/L)

Tiempo (días)

65

mayor que la obtenida emplando vinazas a 676 mg EF/L, y 20 veces mayor que la

obtenida con el control.

Figura 9. Cinéticas elaboradas empleando a Ps-UTM-B con vinazas mezcaleras diluidas. □: 674

mg EF/L; ◊:a 917 mg EF/L; yΔ: control (medio D).

Los pellets dobles formados con BPeAh-Tv mostraron una actividad enzimática 172

veces mayor que la obtenida con las actividades enzimáticas alcanzadas con Ps-

UTMB-Ah.

Con respecto a las cinéticas de actividad enzimática obtenidas a concentraciones de

1303 y 1918 mg EF/L, no se observó actividad enzimática. Eggert et al.(1996) reportan

que a concentraciones altas de azúcares simples en el medio de cultivo, pueden causar

inhibición en la producción de lacasa. Sin ambargo la concentración de fenoles y de

minerales a altas concentraciones, de igual manera, inhiben la producción de

lacasa(Zille et al., 2003; Johannes y Majcherczyk, 2000).

0

2

4

6

8

10

12

14

16

0 3 6 9 12 15 18

Ac

tivid

ad

en

zim

áti

ca

(U

/L)

Tiempo (días)

66

Las condiciones de cultivo óptimo para la producción de lacasa, fue utilizando el medio

de cultivo que contenía una concentración de 917 mgEF/mL, 0.043 mM de EAG,

empleando Trametes versicolor inmovilizado en pellets formados con de BPeAh, al

noveno día de cinética.

Se observa que la actividad enzimática obtenida con la cepa de Trametes versicolor,

fue mayor cuando se inmovilizó Trametes versicolor en los pellets dobles. Resultados

similares fueron obtenidos por Wang et al. (2013), quienes emplearon a Trametes

versicolor CICC 14001 libre e inmovilizado, ellos obtuvieron actividades de lacasa

mayores empleando al hongo inmovilizado (470.5 U/L) que emplando al hongo libre

(328.9 U/L). La actividad enzimática de lacasa para la cepa de Pleurotus spp. UTMB fue

mayor cuando se encontraba libre, que inmovilizado formando pellets con el bagazo de

la penca del agave Angustifolia haw.En el mismo sentido, Zille et al.(2003) obtuvieron

una actividad menor de lacasa cuando utilizaron ala enzima inmovilizado que es su

forma libre; ellos mencionan que puede deberse a que la estructura de la lacasa

inmovilizada puede quedar menos disponible después de la inmovilización, debido al

acomodo estructural de la enzima, y dándole así menos estabilidad. Emine et al. (1995),

mencionan que el proceso de inmovilización causa cambios en la conformación de la

proteína, asi como en su estado de ionización y disociasión de la enzima.

Los resultados obtenidos en cultivo sumergido empleando vinazas mezcaleras y pellets

dobles, se comparan favorablemente con los estudios realizados por Silverio et

al.,2013, quienes reportaron una actividad enzimática de lacasa de 10.7 U/L empleando

pellets formados con Trametes versicolor MUM 04.100 y fibra sintética comercialen un

medio de cultivo sintético. Por su parte Feng et al., 2013, obtuvieron una actividad de

lacasa de 503.3 U/L empleando pellets de alginato de calcio y Trametes versicolor

67

CICC 14001, en un medio de cultivo sintético. Sun et al.,2013, obtuvieron una actividad

de lacasa de 2198.2 x103 U/L empleando melasas al 2%, utilizando Coriolus hisutus.

Freixo et al., 2011, obtuvieron una actividad enzimática de lacasa de 147 U/L

empleando a Pleurotus ostratus en un medio mineral. Por su parte Patrick et al., 2011

reportaron una actividad máxima de 62 U/L utilizando a Pleurotus sajor-caju, en un

medio mineral. Se puede observar que las actividades enzimáicas obtenidas entran

dentro de los rangos reportados.

Fase 5. Actividad 2.Fermentación en estado sólido (FES).

Los resultados de la actividad enzimática de lacasa, llevada a cabo empleando las

cepas de Ps-UTM-B y Tv, en medio sólido usando como sustrato el polvo de bagazo

de penca de agave Potatorum zucc (Pz) y penca de Angustifolia haw (Ah), se muestran

en las figuras 10 y 11. Las cinéticas se llevaron a cabo por 15 días haciendo la

medición de actividad enzimática de lacasa cada tercer día. Al día 7 se humedecieron

nuevamente con 5 mL de medio de cultivo estéril (CDS-2% + EM para Ps-UTMB y

CDS-2% para Tv).

Para Trametes versicolor la mayor actividad enzimática de lacasa obtenida fue al sexto

día con 386.9±27.4 U/L, empleando Pz (ver figura 10). Esta actividad fue 1.7 veces

mayor a la máxima actividad de lacasa obtenida empleando Ah.

68

Figura 10. Cinética de actividad enzimática de lacasa empleando Tv–Pz (◊) y Ah (□).

Como se observa en la figura 11, la mayor actividad enzimática de lacasa obtenida con

Ps-UTMB fue al noveno día, empleando como sustrato Ah obteniéndose valores de

actividad enzimática de 33.1 ± 1.9 U/L. Esta actividad fue 1.4 veces mayor a la máxima

actividad de lacasa obtenida empleando Pz.

Figura 11. Cinética de actividad enzimática de lacasa empleando Ps-UTMB–Ah (□).Polvo Pz (◊).

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 3 6 9 12 15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

(U/L

)

Tiempo (días)

0

5

10

15

20

25

30

35

0 3 6 9 12 15

Act

ivid

ad e

nzi

mát

ica

(U/L

)

Tiempo (días)

69

En la tabla 17 se muestran algunos de los sustratos empleados para la producción de

lacasa en estado sólido, se puede observar que la mayoría son residuos industriales

como: salvado de trigo, salvado de cebada, semilla de uva, humectados con vinazas,

melasas, suero de leche, residuos de la producción de aceite de olivo (diluidos). Las

actividades enzimáticas se encuentran entre 2430 y 23000 U/L. Los resultados

obtenidos son menores a los reportados en la tabla 16, sin embargo esto podría

deberse al alto contenido de minerales los cuales están presentes en el bagazo de las

especies de agave utilizadas, ya que una alta concentración de zinc, calcio, fierro,

pudieran ser inhibidores de la actividad enzimática de lacasa (Zille et al., 2003).

Para la la optimización y obtención de mayor actividad de lacasa pordrían proponerse

las siguientes estrategías: i) la humectación con residuos de vinazas, las cuales

pudieran servir como inductores de la producción de lacasa, debido a la presencia de

ácidos fenólicos, ii) hidrolisis alcalina, ácidas o enzimáticas de los bagazos de penca de

agave, con la finalidad de tener a los inductores como el cobre y los ácidos fenólicos

presentes en este residuo con mayor biodisponibilidad para los HL.

Tabla 17. Actividades enzimáticas de lacasa obtenidas por hongos ligninolíticos

empleando diversos sustratos sólidos.

Microorganismo Sistema de

cultivo

Observaciones Actividad enzimática máx Ref

Trametes

versicolor y

Funalia Trogii

Fermentación en

estado sólido

empleando como

sustrato salvado

de trigo.

La humidificación

del sustrato sólido

se realizó con

vinazas, residuos

de la elaboración

de aceite de oliva

y suero lácteo, a

La mayor actividad

enzimática de obtuvo al

decimo día empleando a

Trametes versicolor y

vinazas al 50%, con una

actividad de lacasa de

1

70

concentraciones

de 25, 50 y 100%,

y melasas al 1 y

5%.

8510 ± 5170 U/L

Trametes

hirsuta (BT

2566)

Fermentación en

estado sólido

empleando como

sustrato salvado

de cebada o

semilla de uva

La humidificación

del medio e llevo

a cabo empleando

medio de cultivo

mineral. Ambos

experimentos se

corrieron en

paralelo.

La mayor actividad

enzimática obtenida fue

empleando como sustrato

semillas de uva 23000 U/L

2

Pleurotus

ostreatus(ATCC

32783)

Fermentación en

estado sólido

emplearon

esponja de

poliuretano de

baja densidad

como medio

sólido.

La humidificación

del medio sólido

fue con un medio

mineral, el cual

sirvió como

sustrato al hongo

ligninolítico.

La mayor actividad

enzimática obtenida para

la fermentación en estado

sólido fue de 2430 U/L

3

Pleurotus

ostreatus

Fermentación en

estado sólido

empleando como

sustrato salvado.

La humidificación

se llevo a cabo

con vinazas

estériles en una

relación 1:1.

Se obtuvo una máxima

actividad enzimática

promedio de 20 000 U/L a

los 22 días de

fermentación.

4

Referencias:1Boran y Yesilada, 2011.,

2Moldes et al., 2003.,

3Téllez-Téllez et al., 2008.,

4Ramirez et al., 2003.

Elisashvili et al. (2008), evaluaron la actividad enzimática de lacasa en fermentación en

estado sólido empleando como sustrato hoja de árbol (Fagus sylvatica) y fermentación

en cultivo sumergido remplazando la concentración de azúcar por hojas de árbol a una

concentración de 40g/L, utilizando cepas de Pleurotus ostreatus y Lentinus edodes;

obtuvieron actividades máximas de lacasa en FES de 57 ± 4.7 U/frasco empleando L.

edodes y 17 ± 1.8 U/frasco con P. ostreatus; en comparación con FCS donde

obtuvieron actividades máximas de 89 ± 6.5 y 11 ± 0.9 U/frasco con L. edodes y P.

71

ostreatus respectivamente. Por otro lado Coelho et al.(2010) compararon la

degradación de bentazon por lacasa y manganeso peroxidasa producidas por

Ganoderma lucidum, empleando fermentación en cultivo sumergido utilizando medio

mineral adicionado con 1% de mazorca de maíz y fermentación en estado sólido

empleando únicamente como sustrato a la mazorca de maíz; se obtuvieron actividades

de lacasa, tanto en FES como en FCS, de 0.6 U/L, sin embargo en el caso de las

actividades de manganeso peroxidasa fueron 10 veces mayor en FES (0.18 U/L) que

en FCS (0.018 U/L). Por su parte Stajic et al.(2004) realizaron la comparación de FCS y

FES, en la producción de lacasa, se probaron diferentes cepas de Pleurotus,

obteniendo mayores actividades en FES que en FCS (2144,62 ± 57,78 vs 27,05 ± 0,25

U / L, respectivamente). Lo anterior podría deberse a la naturaleza del sustrato, ya que

se ha observado que la presencia de algunos residuos ligninolíticos pueden estimular la

producción de enzimas por los basidiomycetes (Elisashvili et al., 2008) asi como al tipo

de enzima ensayada. Sandhya et al. (2005) menciona que la obtención de mayores

actividades enzimáticas en FES, es debido a que se asemejan las condiciones

naturales del habitad de hongo. Sin embargp en el presente trabajo se obtuvieron

mayores actividades de lacasa empleando fermentación en cultivo sumergido con 2402

± 76 U/L, comparada con la fermentación en estado sólido de 386.9±27.4 U/L. Estos

resultados podrían deberse a la disponibilidad de los nutrientes presentes en las

vinazas como lo son: azúcares reductores y compuestos fenolicos disueltos, estos

últimos inductores de la síntesis de lacasa, en comparación con el bagazo en el cual

existe una concentración elevada de minerales, los cuales pudieran causar inhibición de

la enzima.

72

Fase 6. Separación, purificación parcial e identificación de lacasa obtenida en

fermentación por lote en cultivo sumergido empleando Trametes versicolor y

BPeAh.

La enzima lacasa producida a partir de Tv-Ah en el medio C, se logró separar y purificar

parcialmenteempleando membranas de 0.45 m y de 10 kDa, a temperatura ambiente.

Con la primera filtración se separó la biomasa presente en el medio de cultivo. Con la

membrana de 10 kDa, se logró eliminar proteínas de menor peso molecular al del

tamaño de poro la membrana y además se logró la concentración de la lacasa. Lo

anterior se constató con los resultados obtenidos con SDS-PAGE y zimograma porque

se lograron ver bandas bien definidas e intensas (Figura 12 y 13).

Respecto a la identificación de la enzima lacasa, en el gel SDS-PAGE (Figura 12) se

observaron cuatro bandas intensas, que correspondieron a los pesos moleculares de

100,cercano a los 50 kDa, y dos bandas entre 30 y 15 kDa. Las dos primeras bandas

corresponden a pesos moleculares reportados para la enzima lacasa (Osma et al.,

2010; Madhavi y Lele, 2006; Lu et al., 2007; Marugesan et al., 2006).

73

Figura 12. Gel de electroforesis SDS-PAGE. Carril a y b: Muestra purificada parcialmente de

lacasa de Tv-Ah en medio C. Carril c: estándares de pesos moleculares.

En el zimograma (Figura 13) se observaron dos bandas de color verde esmeralda,lo

que indica la presencia de actividad de lacasa en la muestra parcialmente purificada de

Tv-Ah en medio C. Esto corrobora los resultados de actividad de lacasa obtenida en los

cultivos de FCS. Además, las dos bandas observadas en el zimograma con actividad de

lacasa, indican la presencia de isoenzimas termoestables producidas por Trametes

versicolor-CDBB-h-1051, porque conservaron su actividad enzimática a pesar de que el

proceso de concentración y purificación parcial que se llevo a cabo en una centrifuga

sin refrigeración.

250 kD

75 kD

15 kD

10 kD

25 kD

150 kD

100 kD

50 kD

30kD

a b c

74

Figura 13 Zimograma de actividad de lacasa. Carril a y b: Muestra purificada parcialmente de

lacasa de Tv-Ah en medio C.

Los resultados obtenidos en esta fase permiten inferir la producción de lacasa

empleando los medios de cultivo con vinazas mezcaleras y bagazo de agave donde

también se detectó esta actividad enzimática.

a b

75

7. CONCLUSIONES

Se logró la caracterización fisicoquímica de las vinazas mezcaleras y mostró las

siguientes características:fuerte coloración café obscuro, un bajo pH, alto

contenido de materia orgánica expresado como DQO, alto contenido de fructosa,

un alto contenido de cenizas, así como en su alta conductividad eléctrica.

El bagazo presentó un alto contenido de 120 mg de cenizas/g de bagazo para

ambas pencas.

El medio líquido adecuado para el crecimiento de las cepas de Pleurotus spp. fue

el medio CDS 2% con adición de extracto de malta.

Se selecciono a la cepa parentalUTMB, la cual mostró la mayor actividad

enzimática (248 ± 0.2 U/L) en la etapa de selección de las cepas de Pleurotus

spp.

Se obtuvieron pellets dobles a partir de polvo de agave Angustifolia haw con

diámetros promedio de 0.5 ± 0.1 cm.

Las condiciones óptimas para la producción de lacasa en la FES fueron con la

cepa de Tv y bagazo Pz, obteniéndose una AELac de 386.9±27.4 U/L al sexto

día de fermentación.

Las condiciones óptimas para la producción de lacasa en FCSfueron utilizando

pellets formados conTv-Ah, VMD y vinazas mezcaleras diluidas a una

concentración de 917 mg de fructosa /L, obteniéndose al noveno día una AELac

de 2402 ± 76 U/L.

De los resultados concluimos que el mejor cultivo para la producción de lacasa

fue el sistema en cultivo sumergido.

Se logró la separación y purificación parcial de la enzima lacasa producida por

los pellets formados por Tv-Ah en FCS a nivel matraz, mediante el uso de

membranas de 0.45 m y de 10 kDa.

Se identificaron cuatro bandas intensas mediante SDS-PAGE, dos de las cuales

tuvieron pesos moleculares reportados para la enzima lacasa (100 kDa y

cercano a los 50 kDa).

76

Se constató la presencia de actividad de lacasa en la muestra parcialmente

purificada de Tv-Ah en medio C,a partir delos resultados obtenidos con el

zimograma donde se observaron dos bandas con actividad enzimática.

77

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