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J E S S I C A G A R C Í A R E C I L L A S I N G . A G R .

J O S E L U I S M A R T Í N E Z Q U I N T E R O I N G . A G R .

Implementación de un protocolo de fertilización in vitro en bovinos en el

laboratorio de reproducción animal de Zamorano

Biotecnología de la reproducción • Herramientas

Fertilización In Vitro (FIV) • Ventajas

Producción de embriones • Obtención de oocitos • Maduración in vitro • Fertilización in vitro • Cultivo in vitro

INTRODUCCIÓN

MATERIALES Y MÉTODOS

1. Preparación de medios:

• Solución salina al 0.9% (NaCl) • Medio de Colección de Oocitos (OCM) • Medio de Maduración de Oocitos (CCOs-MMO) • Soluciones TL • Medios TALP (Tyrode´s Albumina Lactato Pyruvato) • Fluido Sintético de Oviducto (SOF) • Percoll 90%

2. Lavado de ovarios:

• Solución de transporte

3. Recolección de oocitos:

• Microgotas flotantes de 50µL • Incubadora • Selección de ovarios y aspiración • Medio OCM a baño María (5mL) • Placa de búsqueda y placa nunclon • 20 oocitos por microgota

4. Maduración in vitro:

• Búsqueda en placa grid • Lavado y transferencia de oocitos

5. Fertilización in vitro:

• Elaboración de Percoll • Percoll 90% y Percoll 45% • Evaluación de semen • Placa nunclon y Hepes-TALP • Capacitación del semen • Penicilamina-Hipotaurina-

Epinefrina. • IVF-TL

6. Cultivo de embriones:

• Microgotas de SOF • Hepes- TL y hialuronidasa • Vortex • Lavado de embriones • Desarrollo embrionario al tercer día • Adición de suero fetal inactivado: quinto día • Blastocistos al día 7

Fernández et al. (1999): 45.98% y 54.01% Huanca et al. (2007): 60.7%. Cansino Arroyo et al. (2008): 63.14% y 36.89%

Número de oocitos recuperados utilizando la técnica de aspiración ovárica.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Repetición Ovarios

aspirados Oocitos

extraídos Oocitos viables

extraídos

Oocitos degenerados

Promedio de oocitos viables

por ovario

1 32 221 145 (65.61%) 76 (34.38%) 4.5

2 37 223 147 (65.92%) 76 (34.08%) 4.0

Total 69 444 292 (65.76%) 152 (34.23%) 4.2

Zona pelúcida

Zona pelúcida

Células del cumulus

oophorus

Detritus

A B

Oocitos obtenidos de la punción ovárica con sus estructuras. A) Oocito viable B) Oocito degenerado.

Fernández Reyes et al. (2010): en cerdas 32.1% y 67.8% Cansino Arroyo et al. (2008): SIT (74.93%), SIA (74.68%) y SIC (69.87%).

Porcentaje de Maduración In Vitro (MIV)

Repetición Oocitos iniciales Oocitos madurados Oocitos no madurados

1 145 85.52% (124) 14.48% (21)

2 147 73.47% (108) 26.53% (39)

Total 292 79.45% (232) 20.55% (60)

Oocitos obtenidos de maduración in vitro. A) Partes de un oocito madurado B) Oocito madurado y no madurado.

A B

Cansino Arroyo et al. (2008): SIT (42.48%), SIA (34.94%) y SIC (31.12%). Fernández et al. (1999): 70%

Porcentaje de fertilización in vitro de oocitos bovinos.

Repetición Oocitos maduros

iniciales Oocitos fecundados Oocitos no fecundados

1 124 45.16% (56) 54.83% (68)

2 108 41.66% (45) 58.33% (63)

Total 232 43.53% (101) 56.46% (131)

Oocitos fertilizados en el día uno del proceso de fertilización in vitro.

C. polar

Lopez et al. (2007): 31%, 32% ,37% y 43% . Mejía Isaza et al. (2009): KSOMaa (44%)

Porcentaje de clivaje y apoptosis

Repetición Número de oocitos

fecundados Oocitos en proceso

de clivaje Oocitos en proceso de

apoptosis

1 56 58.9% (33) 41.1% (23)

2 45 51.1% (23) 48.8% (22)

Total 101 55.4% (56) 44.5% (45)

Embriones en clivaje obtenidos en el Laboratorio de Reproducción Animal de la EAP Zamorano. A) Estados embrionarios de clivaje. B) Selección de blastocistos con la pipeta Drummond.

Pipeta Drummond

B A

Embriones en clivaje

(Blastocisto)

Embriones en apoptosis. Día 5 de cultivo.

Fernández et al. (2007): 0%, 2.1 % y 2.6% Mejía Isaza et al. (2009): KSOMaa (0%) y CR1aa (15%) Ratto et al. (1999): 15.7% en células oviductuales y 0% en medio condicionado. Ahuja Aguirre et al. (2009): KSOM (31.6%)

Porcentaje de blastocitos obtenidos al día siete.

Repetición Oocitos en proceso de clivaje Número de blastocistos

1 33 45.5% (15)

2 23 65.2% (15)

Total 56 53.6% (30)

CONCLUSIONES Bajo las condiciones del Laboratorio de Reproducción Animal de la EAP Zamorano se obtuvieron:

• Mayor número de oocitos viables extraídos y un promedio de oocitos viables

por ovario similar al de la literatura citada.

• Mayor porcentaje en maduración in vitro y blastocistos al día 7.

• Menor porcentaje de fertilización in vitro y apoptosis.

• Porcentaje de clivaje similar a los reportados en la literatura científica

Video FIV

Ingrediente Sp-TL HEPES-TL IVF-TL

Agua (mL) 79.232 177.0 40.157

Solución 17: NaCl (mL) 4.34 10.0 2.5

Solución 18: KCl (mL) 1.96 4.0 1.0

Solución 19: bicarb (mL) 10.00 1.6 5.0

Solución 20: phosphate (mL) 1.0 2.0 0.50

Solución 1: Na-lactate (mL) 0.368 0.372 0.093

Solución 21: HEPES (mL) 1.0 2.0 0

Solución 22: Ca chloride (mL) 1.0 2.0 0.50

Solución 23: Mg chlor (mL) 1.10 1.0 0.25

pH 7.4 7.3 7.4

Osmolaridad (mOsm) 295-305 275-285 290-300

Ingrediente Sp-TALP HEPES-TALP IVF-TALP

TL (mL) 38.0 100.0 50.0

BSA, Fracción V (mg) 240 300 0

BSA, EFAF (mg)* 0 0 300

Solución 2: pyruvato (mL) 2.0 1.0 0.5

Solución 8: gentamicina (μL) 80 150 50

Solución 7: heparina (μL) 0 0 250

Nº de ovocitos por ovario puncionado= 10

Porcentaje de ovocitos clivados / ovocitos totales = 80

Porcentaje de embriones / ovocitos totales al día 7 de

cultivo = 30

Porcentaje de preñez al día 30 = 50

Eficiencia del sistema de producción in vitro

100 ovocitos = 30 embriones transferibles

15 preñeces a los 30 días

13 nacimientos

Eficiencia global

Q|

Producción in vitro de embriones

• Transgénesis • Clonado

Aplicaciones/Ventajas

• Aumenta y estandariza su producción

• Facilita el progreso genético (puede duplicar la producción in vivo por

superovulación)

• Optimiza el uso de semen de alto valor

• Aprovechar donantes

Producción in vitro de embriones

Aplicaciones/Ventajas

Aumenta y estandariza su producción, facilita el progreso genético

•IA o Servicio Natural: 6 terneros •SOTE: 40 terneros •OPU: 80 terneros

Producción in vitro de embriones

Aplicaciones/Ventajas

Optimiza la utilización de semen de alto valor

•IA 1,5 dosis: 1 ternero •SOTE 2 dosis: 2 terneros •PIV 1 dosis: 1 hasta 120 terneros

Producción in vitro de embriones

Aplicaciones/Ventajas

Aprovechar donantes

•Hembras prepúberes

•Hembras con defectos adquiridos que impidan

la gestación

•Hembras sin respuesta superovulatoria

•Hembras preñadas

•Hembras faenadas/castradas

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