VIAS DE SUPERVIVENCIA CELULAR ACTIVADAS POR LA INFECCIÓN CON VIRUS RABIA EN NEURONAS SENSORIALES

JUAN CARLOS GARCÍA BETANCUR Trabajo de Grado presentado como requisito

para optar al título de Microbiólogo

Director

JAIME EDUARDO CASTELLANOS MSc, PhD Codirectores

HELENA GROOT DE RESTREPO MSc MYRIAM LUCÍA VELANDIA MSc

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

PROGRAMA DE PREGRADO EN MICROBIOLOGÍA

Bogotá D.C Febrero 27 de 2006

VIAS DE SUPERVIVENCIA CELULAR ACTIVADAS POR LA INFECCIÓN CON VIRUS RABIA EN NEURONAS SENSORIALES

JUAN CARLOS GARCÍA BETANCUR

APROBADO

______________________________

Jaime Eduardo Castellanos MSc, PhD Director

_________________________ ______________________________

Helena Groot De Restrepo MSc Myriam Lucía Velandia MSc

Codirectora Codirectora

_________________________

Alejandro Malagón PhD

Universidad de los Andes

A Mi Padre, Heliodoro García Ángel y a Mi Madre, María Lucydalba Betancur Cardona; Por Ser Mis Amigos, Mis Héroes, Mis Fuerzas, Mis Consejeros y Mi Infinito Apoyo. Su incalculable amor ha hecho posible todo en mi vida… y que todo sea posible valioso y sagrado.

AGRADECIMIENTOS Ante todo a Myriam Lucía Velandia del Instituto de Virología, mi mejor jefa, maestra y

compañera. Por brindarme abiertamente su amistad, su consejo y su conocimiento.

Al Doctor Jaime Eduardo Castellanos, por abrirme las puertas del Instituto de Virología

bajo su dirección, por su valiosa crítica y consejo para la realización de este trabajo.

A la Doctora Helena Groot de Restrepo, la Doctora Nhora Rodríguez de Sánchez y la

Doctora Marina Ordóñez del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de

los Andes quienes depositaron su confianza en mí y en este trabajo y cuya enorme

colaboración, compromiso y consejo lo hizo posible.

A todos mis compañeros del Instituto de Virología de la Universidad El Bosque pues de

cada uno de ellos aprendí no solo lecciones académicas, sino lecciones para mi vida.

Finalmente, a cada una de las personas que estuvo al tanto de la realización de este

trabajo y cuyo ánimo y compromiso me permitió no desfallecer en los momentos difíciles,

especialmente a María Angélica Vargas, a quien más que un agradecimiento le dedico

con todo mi corazón este trabajo.

A todos ustedes, mil gracias.

TABLA DE CONTENIDO Página

RESUMEN INTRODUCCIÓN LISTA DE ABREVIATURAS 1. VIRUS RABIA 1

1.1. ENTIDADES VIRALES 1 1.2. RABDOVIRUS 1

1.2.1. ESTRUCTURA Y GENOMA 1 1.2.2. GENÉTICA MOLECULAR 7 1.2.2.1. TRANSCRIPCIÓN 8 1.2.2.2. REPLICACIÓN 12 1.2.3. PROTEÍNAS VIRALES 16 1.2.3.1. PROTEÍNA N 16 1.2.3.2. PROTEÍNA P 17 1.2.3.3. PROTEÍNA M 19 1.2.3.4. PROTEÍNA G 20 1.2.3.5. PROTEÍNA L 21

1.3. VIRUS RABIA (RABV) 22 1.3.1. EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN 22 1.3.2. DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO 26 1.3.3. PATOGÉNESIS 30

1.3.3.1. ADSORCIÓN DEL VIRUS 34 1.3.3.2. ENTRADA 36 1.3.3.3. ENSAMBLAJE Y GEMACIÓN 37 1.3.3.4. RESPUESTA INMUNE 40

2. LA APOPTOSIS O MUERTE CELULAR PROGRAMADA 42 2.1. INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES 42 2.2. LA APOPTOSIS Y LA HOMEOSTASIS CELULAR 44

2.3. RUTAS CELULARES DE ACTIVACIÓN APOPTÓTICA 47 2.3.1. RUTA EXTRÍNSECA 58 2.3.2. RUTA INTRÍNSECA 53 2.4. PROTEÍNAS PRINCIPALES EN LA APOPTOSIS 55

2.4.1. ASPECTOS GENERALES DE LAS CASPASAS 55 2.4.1.1. CASPASA 8 58 2.4.1.2. CASPASA 3 60 2.4.1.3. CASPASA 9 61

2.4.2. Bcl-2 PRO Y ANTI APOPTOSIS 64 2.4.3. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Nk-β 68

2.5. REMOCIÓN DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS 70 2.5.1. TRANSPORTADORES ABC 70 2.5.2. RECONOCIMIENTO Y REMOCIÓN 72

2.6. LA APOPTOSIS Y LAS INFECCIONES 75 2.6.1. ARN COMO INDUCTOR DE APOPTOSIS 77

2.6.1. REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR VIRUS 78 3. NEURONAS SENSORIALES 84 3.1. NEURONAS DEL GANGLIO DE LA RAIZ DORSAL 85 3.2. CLASIFICACIÓN DE LAS SUBPOBLACIONES 86 3.2.1. CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA 88 3.2.2. CLASIFICACIÓN FISIOLÓGICA 89 3.2.3. CLASIFICACIÓN BIOQUÍMICA 91 3.2.3.1. NEUROFILAMENTOS 91 3.2.3.2. NEUROPÉPTIDOS 92 3.2.3.2. ENZIMAS 96 3.2.3.3. RECEPTORES Y OTRAS MOLÉCULAS 99 3.3. DESARROLLO DE LAS NEURONAS SENSORIALES 103 3.3.1. BASES CELULARES Y MOLECULARES 103 3.3.2. REGENERACIÓN Y PLASTICIDAD IN VITRO 104 4. VIAS APOPTÓTICAS Y DE SUPERVIVENCIA NEURONAL ACTIVADAS POR INFECCIÓN CON VIRUS RABIA 106 4.1. FENÓMENOS DE APOPTOSIS EN LA INFECCIÓN POR RABV 108 4.2. FENÓMENOS INMUNES EN LA INFECCIÓN POR RABV 115 5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS 121 6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 122

RESÚMEN

El Virus Rabia (RABV) es un virus ARN con sentido negativo perteneciente a la familia de

los Rabdovirus. Es altamente neurotrópico y produce una parálisis focal y/o ceguera así

como una encefalitis de carácter letal. Los mecanismos de transcripción y replicación de

este virus junto con la interacción de proteínas virales con factores celulares específ icos

encierran características especiales de regulación que le permiten llevar a cabo un

proceso de evasión de la apoptosis. De igual manera, la interacción de estas proteínas

virales con componentes específ icos de las neuronas hospederas genera mecanismos

altamente eficientes de evasión de la respuesta inmune. Como resultado, el RABV infecta

neuronas sensoriales de los Ganglios de la Raíz Dorsal y motoras de la Médula Espinal

(ME) sin influir aparentemente en la f isiología neuronal y se transporta de forma

retrógrada hasta el SNC donde causa daño f isiológico en prácticamente todas las

subpoblaciones neuronales. La apoptosis o muerte celular programada es un proceso

autoregulatorio de las células eucariotas que responde a diferentes tipos de estímulos

tanto de carácter interno como externo. La activación de la apoptosis es un proceso

multifactorial que encierra la proteólisis de la mayoría de los compuestos extracelulares y

que se diferencia de la necrosis por la ausencia de respuesta inflamatoria. Fenómenos

durante el desarrollo, selección inmune e infecciones son los estímulos más comunes

para este tipo de control celular. Los GRD son agregados celulares ubicados en los

espacios intervertebrales a lo largo y a cada lado de la médula. Estas neuronas constituyen junto con las neuronas de la raíz ventral la base de la comunicación a través

de la columna vertebral. Teniendo en cuenta el papel crítico que las neuronas del GRD

juegan en el proceso de captura y transporte del RABV desde la periferia hasta el SNC,

se plantea la participación de las diferentes rutas involucradas en los procesos de

apoptosis y supervivencia neuronal, así como la participación de las células satélite no

neuronales en este proceso. Las características morfológicas, f isiológicas y bioquímicas

de las diferentes subpoblaciones neuronales presentes en el GRD pueden ser las

determinantes en conjunto con las proteínas virales en el comportamiento antiapoptótico y

la subversión inmune que desencadena este virus.

INTRODUCCIÓN

La enfermedad rábica continúa siendo un problema de salud pública considerable. Según

estimaciones de la OMS, en el mundo anualmente cerca de un millón de personas

reciben tratamiento antirrábico post-contacto con el virus y alrededor de 50000 personas

mueren anualmente como resultado de la infección. La fase aguda de la enfermedad es

generalmente intratable y f inalmente los mecanismos exactos de patogénesis y la biología

molecular de la interacción virus-hospedero no están descritos por completo.

Como parte del proyecto investigativo que se inició en el Instituto de Virología de la

Universidad El Bosque, esta revisión abordará los temas más relevantes asociados a la

inmunopatogénesis del virus. Contar con una descripción exacta sobre los conceptos

básicos del problema (biología molecular del virus y sus interacciones con la célula

hospedera, el programa de muerte celular y el modelo de neuronas sensoriales) brinda

una perspectiva preeliminar mucho más amplia y una base teórica fuerte que permite

focalizar el problema de transporte viral y evasión de la respuesta apoptótica e inmune y

proponer soluciones innovadoras.

Dividida en 4 Capítulos fundamentales, esta revisión abordará a profundidad y basada en

artículos originales, revisiones especializadas y bibliografía actualizada, todos los

aspectos relacionados con los Rabdovirus haciendo especial énfasis en el Virus Rabia,

con los procesos y mecanismos a nivel celular que determinan la apoptosis, las

características principales de la neuronas sensoriales del GRD y f inalmente una revisión de los avances en el entendimiento del procesos apoptóticos e inmunes que rigen la

patogénesis del Virus Rabia.

LISTA DE ABREVIATURAS

AIF Factor Inductor de Apoptosis.

CD Células Dendríticas.

CMH Complejo Mayor de Histocompatibil idad.

CPA Células Presentadoras de Antígenos.

CTL Linfocitos T Citotóxicos.

CVS Cepa viral Challenge Virus Standard del RABV.

ERA Cepa viral Evelyn Rotkitniki Abelset del RABV.

GRD Ganglios de la Raíz Dorsal.

IFN Interferón.

L Neuronas Grandes.

MCP Muerte Celular Programada.

nAChR Receptor Nicotínico Acetilcolina.

NCAM Molécula de Adhesión Neuronal.

NF Neurofilamento.

NGF Factor de Crecimiento Nerviosos.

ORF Marcos de Lectura Abiertos.

p75NTR Receptor de baja afinidad de Neutrofinas p75.

PV Cepa viral Pasteur del RABV.

RABV Virus Rabia (Según la nueva nomenclatura de la ICTV).

RE Retículo Endoplasmático.

RIG Regiones Intergénicas.

RNP Complejo Ribonucleoprotéico.

SAD Cepa Viral Street Alabama Dufferin del RABV.

SD Neuronas Oscuras y Pequeñas.

SHBRV Cepa viral Silver Haired Bat Rabies Virus del RABV.

SNC Sistema Nervioso Central.

SNP Sistema Nervioso Periférico.

SP Sustancia P.

STAT Transductor de Señales y Activador de la Transcripción 1.

TNF Factor de Necrosis Tumoral.

TNFR Receptores del Factor de Necrosis Tumoral.

TRAIL Ligando Inductor de Apoptosis Relacionado con TNF.

UFP Unidades Formadoras de Placa.

1

1. VIRUS RABIA 1.1. ENTIDADES VIRALES Los virus son entidades submicroscópicas cuyo tamaño varía entre los 0,1 y los 0,00001

um3. Son cuerpos parasitarios compuestas por proteínas, algunos por bicapa de

fosfolípidos (obtenidas de la membrana celular de su hospedero), un solo tipo de ácido

nucleico que forma genomas entre los 3 y 300 kb -sea de cadena sencilla o doble- (Heller

et al., 2000) y que se caracterizan por ser parásitos intracelulares altamente infecciosos,

acelulares, no cultivables en medios sintéticos y f iltrables (Beijirinick, 1988); cuyo proceso

de replicación solo se puede llevar a cabo dentro de una célula hospedera, debido a que

utilizan su maquinaria de replicación, transcripción y traducción.

Aunque la gran mayoría de su ciclo replicativo requiere la maquinaria molecular de su

hospedero, el genoma viral posee la información genética necesaria para redireccionar

dicha maquinaria a la generación de nuevos viriones, así como macromoléculas

específ icas y ausentes en una célula: sea ARN polimerasa dependiente de ARN, proteínas de iniciación para la replicación de su genoma y/o proteínas que interf ieren con

el mecanismo de defensa celular, sea respuesta inmune o apoptosis (Strauss, 2002).

Con orígenes evolutivos presuntamente independientes, los virus se han clasif icado en

tres grandes clases: virus de DNA con replicación a DNA, virus de ARN con replicación de

su genoma a ARN y f inalmente virus de ARN con replicación a DNA (o retrovirus). Dentro

de estas tres clases encontramos gran cantidad de familias, las cuales están definidas por

el tamaño, sentido (dirección 5´ - 3´ o viceversa) y número de fragmentos de su genoma

(Strauss, 2002). El Comité Internacional para la Taxonomía de Virus (ICTV por sus siglas

en inglés) estableció la taxonomía y nomenclatura viral según el tipo y sentido de su

material genético, como se observa en la Tabla 1.

1.2. RABDOVIRUS

1.2.1. ESTRUCTURA Y GENOMA La familia Rabdoviridae (de la raíz griega Rabdo, que signif ica en forma de bala),

perteneciente al grupo de los virus con genoma ARN de cadena sencilla y sentido

negativo (orden Mononegavirales) evocan evolutivamente al genoma de la familia

Paramyxoviridae y esta formada por aproximadamente 200 diferentes especies virales

caracterizadas por su morfología tubular, como se observa en la Figura 1. Sin embargo,

su estructura no suele ser muy regular, debido en parte a que la envoltura lipídica no está

en contacto directo con la nucleocápside y tanto esta membrana lipídica como la proteína

2

antigénica de superficie G se unen al complejo de la ribonucleoproteína (RNP) por medio

del “puente” que forma entre ellas la proteína de matriz, o proteína viral M. Los viriones

están compuestos por una membrana externa que se deriva de la célula hospedera donde

el virus gema, por un núcleo interno conocido como la ribonucleoproteína -compuesto por

tres diferentes proteínas-, una única glicoproteína que atraviesa la membrana y que en

arreglos triméricos forma aproximadamente 400 prolongaciones extramembranales

alrededor del virus y f inalmente alrededor de 1800 moléculas de la proteína de matriz, o

proteína M, cuyo papel fundamental es la unión entre el complejo ribonucleoprotéico

(RNP) y la membrana viral.

Tabla 1. Principales Familias Virales

Tipo de Ácido Nucleico Tamaño del Genoma

Segmentos del Genoma

Familias

DNA de Cadena Doble ds DNA

5 a 400 kpb 1

Poxviridae Asfariviridae Iridoviridae Herpesviridae Adenoviridae Polyomaviridae Papillomaviridae

DNA de Cadena Sencilla ss DNA

4 a 6 kb 1 Parvoviridae

ARN de Cadena Doble ds ARN

4,6 a 30 kpb 1 a 12 Reoviridae Birnaviridae

ARN de Cadena Sencilla Sentido 5´- 3´ ss (+) ARN

8 a 33 kb 1

Coronaviridae Arteriviridae Togaviridae Flaviviridae Piconarviridae Astroviridae Calciviridae

ARN de Cadena Sencilla Sentido 3´- 5´ ss (-) ARN

6 a 23 kpb 1 a 8

Paramyxoviridae Filoviridae Rabdoviridae Bornaviridae Orthomyxoviridae Bunyaviridae Arenaviridae

ARN de Cadena Sencilla Transcriptasa Reversa ss ARN RT

7 a 10 kb Dímero Retroviridae

DNA de Cadena Doble Transcriptasa Reversa ds DNA RT

3 a 8 kpb 1 Hepadnaviridae Caulimoviridae

Tabla acorde y modif icada de Granoff and Webster (1999).

3

Dentro del núcleo ribonucleoprotéico se aloja el genoma viral que consta de una sola

molécula de ARN de sentido negativo con un tamaño entre los 11 y 12 kb, dependiendo

del género y especie dentro de la familia. Todos los miembros de esta familia poseen

genomas sumamente similares, que codif ican para las proteínas N, P, M, G y L en el

sentido 3´ a 5´. Las proteínas N, P y L están involucradas con la transcripción y

replicación del genoma viral, siendo L una ARN polimerasa dependiente de ARN con

función 5´-capping y 3´-poliadenilación e involucrada fuertemente en el reconocimiento,

iniciación y regulación de la transición replicación-transcripción. La proteína nominal P es

la fosfoproteína del virus y con la proteína de la nucleocápside N, sirven como

transcriptasa y replicasa viral (Harty et al., 2003. Ruigrok et al., 2004). Por otro lado

están las proteínas de membrana: la G o Glicoproteína y la M o proteína de Matriz. La

proteína G está dirigida hacia la parte más exterior del virus, es de carácter trimérico -

como peplómeros-, se encuentra intercalada entre la bicapa lipídica y es la responsable

de la unión a los receptores de la célula hospedera, de allí su gran carácter antigénico. La proteína M es bien conocida por se la proteína de puente entre la envoltura del virus

(tanto G como la bicapa lipídica) y la proteína de Nucleocápside, así como por ser la

unidad estructural responsable de la invaginación del virus dentro de la bicapa lipídica de

su hospedero en el momento de la gemación (Fields 2001. Whitt et al., 2000. Wills et al.,

1999. Cupp et al., 1999). Aunque las funciones son completamente conservadas entre

todos los miembros de la familia Rabdoviridae, existen variaciones signif icativas en la

estructura de los genomas, especialmente dependiendo de la especie hospedera. Es así

que los Rabdovirus que infectan peces poseen un pequeño gen extra entre los genes G y

L, los que infectan plantas pueden tener un gen extra entre los genes P y M y los virus

sigma que infectan Droshopila tienen tres genes extra entre N y G así como una región

sobrelapada de 33 nts entre el gen G y el gen que le precede (Fields, 2001).

La partícula viral es de aproximadamente 180 nm de largo por unos 75 nm de ancho, a

excepción de los Rabdovirus baciliformes, generalmente virus cuyos hospederos son

plantas y cuyo tamaño es de aproximadamente el doble (Fields, 2001).

El ARN genómico se dispone de una forma muy particular, cuya organización ha sido

vislumbrada a través de técnicas de cuantif icación bioquímica y microscopía electrónica.

Básicamente el genoma viral se encuentra envuelto dentro de un complejo estrecho con

aproximadamente 1200 moléculas de la proteína de nucleocápside (N) que se organiza a

manera de esferas a lo largo del ARN, cada molécula N cubriendo exactamente 9

nucleótidos. Esta organización forma una hélice con aproximadamente 35 giros dentro

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del virion. Adicionalmente, la ARN polimerasa dependiente de ARN, compuesta por la

proteína viral L y su cofactor conocido como la fosfoproteína (P), se asocian con la

proteína N formando el complejo RNP y se encuentran 50 y 500 moléculas por virion,

respectivamente (Jackson A et al., 1987). Como se discutirá posteriormente, en el

subcapítulo pertinente a los fenómenos de replicación y transcripción del genoma de los

Rabdovirus, se generan ARN mensajeros (ARNm) separados para cada uno de los

genes. Sorprendentemente, aún durante los procesos de transcripción y replicación del

ARN genómico, este se encuentra estrechamente relacionado con el complejo RNP

(Fields, 2001).

Según su rango de hospederos, los Rabdovirus se dividen en cinco (5) géneros:

Epherovirus, CytoRabdovirus, Lyssavirus y Vesiculovirus; siendo los dos últimos, los

géneros presentes en ciertas patologías humanas, mientras que los dos primeros infectan

gran rango de animales y plantas, respectivamente (Harty et al.. 2003).

Esta familia viral es considerada como la más simple de todos los virus con genoma ARN no segmentado perteneciente al orden de los Mononegavirales. La organización genética

de los Rabdovirus es similar al de las familias Paramyxoviridae y Filoviridae, familias

pertenecientes al mismo orden. Debido a que los genomas de estas familias son de

sentido negativo, y por ende no codif icante, una característica fundamental es la

presencia de la ARN polimerasa dependiente de ARN como plantilla molecular. Debido a

esta característica, la replicación del genoma viral requiere la síntesis inicial de proteínas

virales –polimerasa incluída- que resulta en la síntesis de copias completas de

antigenomas, base de la transcripción, y posteriormente la síntesis de compias completas

de genomas (ARN de sentido negativo) que son subsecuentemente empaquetados dentro

del complejo proteínico que da origen a la progenie viral (Chaffotte et al., 1996).

Los virus pertenecientes a esta familia están ampliamente distribuidos en la naturaleza y

poseen un extenso rango de hospederos, infectando desde vertebrados e invertebrados

hasta varias especies de plantas. Aunque el mayor problema de salud pública y por ende

económico lo representa las infecciones por virus rabia, existen otros Rabdovirus que

causan grandes pérdidas económicas en las industria pesquera. Estos virus parecen

tener ciclos de infección restringidos a vertebrados. Sin embargo, otros virus miembros

de esta familia son transmitidos hacia vertebrados y plantas por medio de artrópodos,

organismos que se cree por estudios hechos a nivel de f ilogenia molecular de virus fueron

el hospedero original desde el cual todos los Rabdovirus evolucionaron.

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En 1987, Shope y Tesh publicaron una excelente revisión sobre la ecología y la

clasif icación de esta familia de virus, enfatizando aquellos que infectan mamíferos,

aproximadamente unas 70 especies clasif icadas dentro de los géneros Vesiculovirus y

Lyssavirus (Jackson et al., 1987). Sorprendentemente, de la revisión hecha por Shope y

Tesh se puede resaltar la alta capacidad que tienen estos virus para infectar una gran

cantidad de hospederos, característica que no comparten con casi ninguna otra entidad

viral, ya que los virus suelen ser especie-específ icos.

Figura 1. Modelo general de la morfología de la familia Rhabdoviridae. Se observa la forma tubular que oscila entre los 180nm largo x 75nm ancho; caracterizada además por la terminación planar generada por la gemación de la célula infectada. La parte más exterior está compuesta por una bicapa lipídica que forma la envoltura del virus y que obtienen de la membrana plasmática de su hospedero. Esta envoltura está cubierta parcialmente por trímeros de glicoproteína viral (de aproximadamente 67KDa) que le dan su apariencia puntiaguda, además de ser el mayor antígeno de superficie. Al mismo tiempo, dicha cobertura está unida a la nucleocápside viral por una proteína membranal de matriz de aproximadamente 26KDa. Interiormente se encuentran las proteínas N, P y L, encargadas de cubrir el ARN viral, servir como proteína de transcripción y como ARN polimerasa dependiente de ARN, respectivamente. Figura tomada de Smith et al., 1988. Sin embargo, ciertas especies de Rabdovirus poseen un hospedero específ ico y solo son

infectivos a determinadas temperaturas ambientales. Algunos de los Rabdovirus del

género Vesiculovirus son transmitidos por insectos hematófagos (Letchw orth et al., 1999),

lo que en parte puede explicar la naturaleza cíclica y temporal de algunas enfermedades

de importancia como la estomatitis vesicular, causada por el virus que lleva dicho nombre,

VSV (Vesicular Stomatitis Virus por sus iniciales en inglés), Rabdovirus endémico en

Centro América, el norte de Sur América, India y Medio Oriente. Aunque este virus infecta

principalmente animales domésticos, se han presentado casos de infección en personas

que han estado en contacto con el virus en condiciones naturales o de laboratorio,

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causando síntomas muy similares a los causados por el virus Influenza (Tesh et al.,

1969).

El nivel de clasif icación por serotipos, como ocurre con el VSV New Jersey y el VSV

Indiana se realiza con base en la similitud existente entre la secuencia de ARN genómico

para la secuencia codif icante para la glicoproteína, también conocida como proteína viral

G. Por ejemplo para estos dos serotipos se estima una similitud tan solo del 50%, lo que

permite subclasif icarlos con certeza ya que las tasas de mutación en infecciones naturales

en areas geográficas delimitadas es considerablemente menor que en cepas virales

pasajeadas en laboratorio (Bilsel et al., 1990).

Una de las características más sorprendentes de los virus pertecientes a esta familia es

su sistema de genética reversa, particularidad que ha sido crucial para el conocimiento de

sus fenómenos de replicación y ensamblaje, así como una herramienta vital en biología

molecular, pues genes extraños adicionales pueden ser introducidos en virus

recombinantes logrando genes de expresión muy estable como lo reportan Mebatsion y Schnell en trabajos individuales en 1996 (Mebatsion et al., 1996 y Schnell et al., 1996).

Un ejemplo muy interesante de la utilización de estos vectores recombinantes lo presenta

el VSV como vector de la vacuna contra la inf luenza, expresando el gen de la

hemaglutinina. La aplicación intranasal de una cantidad correspondiente a 100 unidades

formadoras de placa (UFP) confirió resistencia inmunológica a los ratones sometidos a

esta prueba experimental (Roberts et al., 1998). Recientemente se ha reportado algunos

estudios hechos contra el VIH utilizando vectores Rabdovirales, específ icamente el VSV,

y los resultados obtenidos en macacos muestran la ausencia total de patogénesis por

VIH y la generación de una respuesta inmune muy fuerte y específ ica contra este

retrovirus (Fields, 2001).

Schnell y su grupo de colaboradores presentaron en el año de 1997 en la revista Cell un

estudio muy interesante, donde a partir de virus VSV recombinantes los cuales no

poseían la secuencia genómica para producir la glicoproteína G y en lugar de esta ARN

codif icante para la molécula receptora y coreceptora del VIH, estos virus efectivamente se

unieron específ icamente a células infectadas In vitro, las infectaron y por ende las

asesinaron (Schnell et al., 1997). Finalmente, otros trabajos con Rabdovirus

recombinantes han permitido establecer los dominios de fusión de los receptores y

coreceptores de las células hospederas con la glicoproteína de virus tan peligrosos como

el Ebola sin la necesidad de trabajar bajo condiciones de bioseguridad tipo 4 (Ito et al.,

1999).

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1.2.2. GENÉTICA MOLECULAR

Con una sola molécula de ARN de aproximadamente -aproximadamente 12000 bases-, y

con sentido negativo, lo que signif ica una dirección 3´ - 5´, el genoma de los virus

pertenecientes a esta familia se caracteriza por poseer una región líder de

aproximadamente 50 nucleótidos (nts) en su extremo 3´ que funciona como sitio único de

entrada de la ARN polimerasa viral; y una región no transcribible de aproximadamente 60

nts en su extremo 5´. En cuanto al fenómeno de transcripción del ARNv a ARNm, dentro

de estas dos regiones reguladoras se encierran los cinco genes monocistrónicos para las

tres proteínas estructurales (G, M y N) y las proteínas funcionales (P y L) del virus. Entre

cada gen existen regiones intergénicas o no codif icantes y señales de poliadenilación

para el extremo 3´ de cada uno de los cinco ARNm como se puede observar claramente

en la Figura 2.

Figura 2. Genoma Rhabdoviridae. ARN sentido negativo o dirección 3´- 5´. El genoma de los miembros pertenecientes a esta familia del orden Mononegavirales (Mono por poseer un genoma con un solo segmento y nega por ser antisentido) se caracteriza por generar ARNm monocistrónicos para cinco proteínas virales, cada uno con secuencias que forman estructuras secundarias de ARN conocidas como cap en su extremo 5´ y poliadeniladas en el 3 ́generadas por la ARN polimerasa viral. Estos genes están separados por regiones intergénicas (RIG) altamente conservadas en el número y secuencias de nucleótidos entre cada gen. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.

La estrategia para descubrir las bases de la genética molecular de los Rabdovirus y los

mecanismos moleculares involucrados en la patogénesis de enfermedades tan

importantes para la salud humana como la rabia ha tomado un rumbo diferente al de otros

virus pues ha requerido el desarrollo de sistemas de ADN copia (ADNc) para la

recuperación de viriones infecciosos, logro alcanzado para el RABV en 1994 por Matthias

Schnell, Teshome Mebatsion y Karl-Klaus Conzelmann del Centro Federal de

Investigación de Enfermedades Virales en Animales en Alemania, quienes con ADNc del

RABV y bajo el promotor T7 lograron entidades infecciosas gracias a la síntesis de la

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polimerasa del bacteriófago T7 insertada como ADN por el sistema vaccinia antes de la

transfección del ADNc del genoma del RABV (Mebatsion T et al., 1994).

La necesidad de obtener ADNc se debe a que ni el ARNv ni el ARNvc pueden generar

ARNm en la ausencia de la ARN polimerasa viral. Además, el ensamblaje In vitro de ARN

diseñado dentro del complejo RNP es prácticamente imposible dado la complejidad de las

interacciones ARN-proteína y proteína-proteína, así como del gran tamaño de los

genomas virales. Sin embargo, la exitosa estrategia de utilizar ADNc no ha sido la única.

Como es ampliamente referenciado por Roberts y Rose en 1998, otra estrategia utilizada

antes de la utilización del ADNc fue el diseño de mini genomas de ARN, donde uno o más

genes eran f lanquados por secuencias naturales en los extremos 5´y 3´ de sistemas de

expresión de plásmidos de ADN como el del virus vaccinia (Roberts A y Rose JK, 1998).

Desafortunadamente, ninguna de estas estrategias permitía generar virus infectantes a

partir de ARN de sentido negativo.

1.2.2.1. TRANSCRIPCIÓN El primer evento para la síntesis de nuevos virus después de la liberación del complejo

RNP es la transcripción del genoma viral para la generación de los ARNm

monocistrónicos para cada uno de las proteínas virales. Es conveniente aclarar que el

complejo RNP no es una entidad aislada de la maquinaria celular y que se encuentra

accesible a proteínas celulares. Debido al carácter negativo del ARNv y como

característica principal del orden de los Mononegavirales, esta transcripción es llevada a

cabo por la proteína L -una ARN polimerasa dependiente de ARN- en conjunto con tres

unidades de la fosfoproteína P (antes conocida como NS) que actúa como cofactor de la

polimerasa viral dependiendo de su estado de fosforilación. Como fuera publicado en

PNAS por Barik y su grupo de colaboradores en 1992, la fosforilación de los residuos

Serina y Treonina en el dominio l del extremo N-terminal de la proteína viral P por la

caseína kinasa ll celular activaba transcripcionalmente a dicha proteína y por ende a la

polimerasa viral en ensayos de transcripción In vitro (Barik S et al., 1992). Sin embargo,

estudios posteriores hechos de igual manera en el VSV por Spadafora y su grupo cuatro

años más tarde pusieron en tela de juicio esta teoría estableciendo que aunque la

fosforilación de P era importante para la modulación del complejo transcripcional no era

una proteína esencial para la transcripción (Spadafora D et al., 1996). Una vez más, el

disponer de ADNc del genoma del VSV permitió establecer que definitivamente la

fosforilación de P en el dominio establecido para 1994 es esencial para el fenómeno de

9

transcripción y no está involucrada en la replicación (Pattnaik et al., 1997). Esta

activación parece darse debido a que la fosforilación permite la trimerización de unidades

de P y este trímero es funcionalmente activo para activar a la polimerasa viral. Con la

proteína L activa, la transcripción se lleva a cabo en un complejo formado por el genoma

viral y la proteína estructural de nucleocápside o proteína N. Hipotéticamente, este

complejo se forma para evitar que las ribonucleasas celulares degraden este ARN de

cadena sencilla (Fields, 2001). Sin embargo, la disposición del ARN dentro del complejo

permitiría postular que existen también características estructurales para el

reconocimiento del genoma viral y su posterior transcripción una vez dentro del

citoplasma de la célula hospedera. Aunque los ensayos In vitro con ARNv y las proteínas

virales purif icadas mostraban transcripción positiva, trabajos hechos por Gupta y su

equipo de colaboradores permitió establecer que existen proteínas celulares, como los

factores de elongación de la transcripción como EF-1a, EF-1b y EF-1g, esenciales para

un proceso de transcripción similar al que ocurre In vivo (Gupta AK et al., 1998). Seguido a la entrada del virus a su célula blanco y la posterior liberación del ARN viral en

el complejo RNP, se inicia la transcripción de la región líder, secuencia de nucleótidos

que dispara la transcripción de los genes estructurales. Aunque esta región líder no

posee la estructura cap en su extremo 5´ ni poliadenilación en el 3´, cuando existen

concentraciones suficientes de las proteínas N y P en complejo es encapsidada,

contribuyendo posiblemente en el mecanismo de autorregulación de los fenómenos de

replicación-transcripción mediante su interacción con la proteína de nucleocápside N

(Fields, 2001). Se propone que el ARNv nunca se separa de la proteína N y que es

esencial como unidad de transcripción junto con las proteínas L y P, pues se probó que el

ARNv desnudo transfectado en células In vitro no es infeccioso (Pattnaik et al., 1990).

Se ha determinado, por lo menos para el VSV (Vesicular Stomatitis Virus), que el

complejo RNP posee alrededor de 1200 copias de la proteína N, 500 de la fosfoproteína P

y tan solo 50 de la ARN polimerasa o proteína L. Sin embargo, estos niveles basales de

la ARN polimerasa dependiente de ARN y los otros dos factores involucrados en

transcripción y replicación son suficientes para generar ARNv de novo y todas las demás

proteínas contenidas en su genoma, incluyendo la glicoproteína G y la proteína de matriz

M (Strauss, 2002).

Tan pronto como la ARN polimerasa viral se une al único sitio de entrada en el extremo 3´

del ARNv se inicia la transcripción y se libera un ARN no codif icante de la región líder.

Este proceso continúa con la síntesis secuencial de los cinco ARNm con estructuras cap

10

en su extremo 5´, generadas por la ARN polimerasa viral, y poliadenilados en su extremo

3´ que facilitan la traducción y generan protección contra ARNasas celulares,

respectivamente. Como se observa en la Figura 2, el primer ARN mensajero que se

genera es el que dará origen a la proteína de nucleocápside N. Inmediatamente inicia el

proceso de transcripción adquiere la secuencia cap en el extremo 5´ como resultado de la

acción de la ARN polimerasa viral o proteína L. Al f inal de este gen se encuentra la

secuencia de reconocimiento AUACU7 donde la ARN polimerasa comienza a perder

afinidad por el ARNv y produce una secuencia de adeninas, conocida como Poli(A) que

queda ubicada en el extremo 3´ del ARN mensajero. De manera similar ocurre la síntesis

secuencial de ARNm de los otros cuatro genes virales donde la ARN polimerasa viral no

perderá afinidad al menos que encuentre la secuencia AUAC justo antes de una

secuencia U7 con y no se unirá al menos que se tope con la secuencia UUGUC, que se

encuentra después de los nucleótidos de la RIG, pues estas secuencias intergénicas son

obviadas por la proteína L. Estudios de transcripción In vitro han demostrado que la polimerasa viral tiene un periodo

de pausa que va desde 1 hasta 2 minutos en las RIG y luego, con una frecuencia del 70%

al 80% reinicia la transcripción del siguiente gen. Estos mismos estudios postulan que

este tiempo de pausa se debe al periodo que toma la proteína L en copiar la secuencia U7

que dará origen a la secuencia poli(A) en cada uno de los ARNm del VSV (Iverson LE et

al., 1981).

Las proteínas N, M, G y L son traducidas como un solo polipéptido, mientras que P se

traduce como tres proteínas de masas moleculares diferentes debido a la presencia de

codones de inicio alternativos. El codon AUG genera la proteína nominal P funcional, sin

embargo existen otro dos codones de inicio AUG dentro del gen que generan polipéptidos

de 55 y 65 aminoácidos, donde la proteína más corta es la versión truncada de la proteína

de 65 aminoácidos (Strauss, 2002). Se probó que estas versiones truncadas de la

proteína P poseen señales especiales de localización en membrana nuclear y de exporte

núcleo-citoplasma lo que permite hipotéticamente asociarlas con mecanismos de

fosforilación y oligomerización de la proteína P completa y relacionarlas también procesos

de regulación del transporte de otras proteínas virales como L y N en posibles fenómenos

de evasión de la respuesta antiviral mediante la interacción con proteínas nucleares

(Blondel et al., 2002 y 2005).

Aunque la síntesis de la proteína G se inicia, al igual que para todas la proteínas de los

Rabdovirus, en ribosomas libres, la proteína activa y su glicosilación ocurre en el retículo

11

endoplasmático y el aparato de Golgi (Centers for Disease Control: Compendium of

animal rabies control, 1995).

En cada una de las trascripciones del genoma viral ocurre un fenómeno de atenuación

como resultado de un gradiente en la acumulación de ARNm, así como elementos tipo cis

como la presencia de las estructuras secundarias de ARN en el extremo 5´ conocidas

como cap, la metilación del ARN y la poliadenilación en el extremo 3´, donde las proteínas

virales recién sintetizadas y proteínas celulares interf ieren directamente con el ARNv.

Estudios realizados por Stillman y sus colaboradores en 1997 con mini genomas

recombinantes del VSV permitieron establecer que los primeros tres nucleótidos de la

secuencia conservada 3´UUGUC….5´ de cada gen –secuencia complementaria al cap-

AACAG al inicio de cada gen en el ARNm) eran esenciales para la expresión genética,

pues el Uracilo en la posición 1 y la Guanina en la posición 3 permitían la acumulación de

transcritos de los genes virales en células infectadas debido a que los nucleótidos

correctos en estas posiciones hacían posible la generación de la estructura cap en el extremo 5´ mediante la adición, mediada por la polimerasa viral, de la secuencia 5´-

7mGpppG, responsables de dar forma a la estructura cap y de facilitar el inicio de la

transcripción (Stillman EA et al., 1997 y 1999). A diferencia de los retrovirus o de los virus

ARN de sentido positivo para los cuales el mecanismo de generación de la estructura cap

y las proteínas virales como los factores celulares involucrados han sido descritas, para

los Rabdovirus, el sistema por el cual los ARNm adquieren la secuencia de nucleótidos

que dará origen a la estructura cap y las proteínas involucradas no han sido definidas

completamente a la fecha, sin embargo, debido a que el ciclo de vida de esta familia de

virus se lleva a cabo completamente en el citoplasma de la célula hospedera, se pueden

descartar enzimas nucleares, al menos que exista tráfico desde el núcleo mediado por la

localización de las formas truncadas de la fosfoproteína P, opción no considerada por

Blondel y su grupo en su estudio del año 2005 (Blondel et al., 2005).

Análisis de la estructura cap de los transcritos del VSV han revelado que los dos primeros

fosfatos que constituyen la unión 5´-5´ de la Guanosina son contribuidos por la enzima

guanosina difosfato (GDP) a diferencia de los eucariota donde esta reacción es llevada a

cabo por la enzima guanosina monofosfato (GMP) (Abraham G et al., 1975). A partir de la

evidencia recogida, se ha propuesto que la polimerasa viral o proteína L está involucrada

en el proceso capping, pues aunque la proteína L tiene homología de secuencia con

proteínas de unión a nucleótidos, no parece tener relación con la enzima GDP, una

enzima nucleotidil transferasa (Shuman S, 1997). Sin embargo, virus deficientes para la

12

acción metiltransferasa han resultado tener mutaciones mapeadas dentro del gen para la

proteína L (Hercyk N et al., 1988), se sugiere entonces que existe relación entre la

proteína L y factores celulares con propiedades de unión a GDP como EF-1 (Gupta AK et

al., 1998).

En los virus ARN de sentido negativo esta característica de secuencial y polar es una

propiedad inherente de la polimerasa y garantiza que las proteínas esenciales y de las

cuales se necesita una mayor cantidad para el correcto ensamblaje de viriones infectantes

se produzcan en un mayor número de copias que aquellas que cuyo número es más

reducido dentro de los mismos, como la proteína L. De esta manera se controla que las

proteínas que se necesitan en mayor cantidad, y que se encuentran en las primeras

posiciones dentro del genoma, como N, M y G sean producidas en mayor cantidad, y

proteínas como L sean producidas en menor cantidad, corroborando las concentraciones

de proteína viral encontradas para VSV y haciendo más eficiente el ciclo de vida del virus

(Strauss, 2002).

1.2.2.2. REPLICACIÓN El otro evento crítico y fundamental para la correcta proliferación del virus es la replicación

del genoma viral. Los miembros pertenecientes a la familia Rhabdoviridae se caracterizan

por poseer una replicación dependiente de la producción de una hebra complementaria -

con sentido positivo- al genoma conocida como ARN viral complementario (ARNvc) o

antigemoma que constituirá el templado para el ARNv del nuevo virion. En contraste con

la transcripción, en el proceso de replicación del genoma la polimerasa viral debe ignorar

los codones de inicio y parada, las señales para el capping y poliadenilación y todas

aquellas señales que dan origen al ARN líder y ARNm monocistrónicos. A diferencia de la

transcripción, la replicación de los Rabdovirus sucede simultáneamente con la traducción,

particularmente de las proteínas que forman la nucleocápside viral: la proteína N y la

proteína P. Esta característica fue reportada por Davis y Wertz en 1982 donde en

ensayos In vitro inhibiendo la síntesis de proteínas con cicloheximida encontraron que la

síntesis de nuevas moléculas de ARN de sentido negativo era también inhibida, a

diferencia de ARNm que eran producidos de manera regular (Davis & Wertz, 1982). Al

igual que el ARNv el ARN antigenómico nunca se encuentra libre en el citoplasma; es así

que el proceso de replicación, al igual que el de transcripción, se lleva a cabo dentro del

complejo RNP. A diferencia que en otros sistemas, en los Mononegavirales el proceso de

replicación deber ir paralelo al de transcripción y traducción de proteínas pues el nuevo

13

genoma debe ser encapsidado de inmediato. A diferencia del ARNm que se genera a

partir del templado, el antigenoma posee secuencias señal para ser encapsidado. La

ausencia de estas señales es lo que permite, tempranamente post-infección, al ARNm

viajar hasta los ribosomas y traducirse, generar la suficiente cantidad de proteína

requerida para que luego por la acumulación de estas mismas, exista un cambio o switch

de transcripción a replicación. Este switch molecular se atribuye al cambio en la relación

de concentraciones existentes entre el ARNv y las proteínas del complejo RNP,

especialmente N, pues se ha postulado que a altas concentraciones de N, P y L, el ARNv

es encapsidado y la ARN polimerasa viral copia indiscriminadamente ignorando codones

de inicio y parada, generando ARN con sentido 5´ - 3´ o ARNvc que dará, gracias a la

polimerasa viral, origen a copias exactas del ARN de hebra sencilla sentido negativo

dentro del complejo, es decir, nuevos genomas del virus (Centers for Disease Control:

Compendium of animal rabies control, 1995). Este cambio genera ARNvc que servirá

como templado para la generación de ARNv genómico (Strauss, 2002). Adicionalmente, la presencia de este antigenoma resuelve el dilema de como los ARNm no interf ieran

mediante hibridización con el ARN genómico antes de la formación del complejo RNP,

pues si los genomas de ARN se sintetizaran fuera del complejo RNP, inmediatamente

habría interferencia de los mensajeros de ARN presentes en el medio y la formación del

complejo RNP y su posterior complementación a viriones infectivos no sería exitosa. De

manera breve, la Figura 3 muestra el esquema de replicación de los Rabdovirus como el

RABV.

El mecanismo molecular que gobierna este switch transcripción-replicación hasta ahora

está comenzando a ser descifrado, y el grupo de Raul Ladino de la Universidad de

California en San Francisco descubrió en 1998 para el virus Polio, un virus ARN de

sentido positivo, las bases moleculares y proteínas celulares y virales involucradas en el

fenómeno (Ladino et al., 1998). Dentro de estas bases moleculares están las secuencias

presentes en los extremos 3´ y 5´ del genoma viral que además de promover la unión de

los ribosomas y generar sitios poli(A) cumplen funciones estructurales, ya que para los

Bunyavirus, cuyo genoma lo constituye una sola hebra de ARN con sentido negativo, se

comprobó por microscopía electrónica la existencia de estructuras secundarias de ARN

que podrían estar fomentando, como promotores, la ciclización del ARNv para su

replicación (Strauss, 2002). El modelo propuesto para el switch de transcripción a

replicación propone que la molécula de ARN líder es encapsidada por la proteína N de

novo causando un evento de antiterminación que señala a la polimerasa para ignorar las

14

señales que dan origen a los ARNm. Una vez la polimerasa viral ha generado suficientes

copias complementarias al genoma y existen la cantidad necesaria de proteínas N y P,

este ARNvc es encapsidado y dentro de este complejo RNP (+) se inicia la síntesis de

hebras sencillas de ARN genómico que dará origen a la progenie viral, que se encuentra

de 20 a 50 veces más que el ARNvc (Fields, 2001).

Recientemente se ha propuesto un nuevo modelo donde la proteína P es la polimerasa

involucrada en replicación mientras que la proteína L es la polimerasa que actúa en

transcripción. Esta teoría surgió de estudios realizados con virus recombinantes mutantes

en el domino C-terminal de la proteína P. Estos virus permitieron la correcta replicación

del genoma del VSV mientras que la transcripción se vio fuertemente afectada debido a

que estas mutaciones abolían la correcta interacción de la fosfoproteína con la polimerasa

viral por la ausencia de una correcta fosforilación de la proteína mutada (Das et al.,

1997).

Debido a que la encapsidación de los genomas y antigenomas de los Rabdovirus ocurre simultáneamente con su síntesis, se ha propuesto que la señal de antiterminación y de

encapsidación reside en el extremo 5´ del genoma viral, región donde se encuentra la

secuencia líder, específ icamente cinco Adeninas que se repiten cada tercera posición

(Blumberg et al., 1983).

Recientemente, el grupo de Pattnaik descubrió mediante técnicas moleculares que

involucraban ARN subgenómico derivado de ADNc que las señales necesarias para la

encapsidación y la replicación se encuentran dentro de los 36 primeros nucleótidos en el

extremo 5´ y los últimos 51 nucleótidos en el extremo 3´, respectivamente (Pattnaik et al.,

1995). Para el RABV, la encapsidación y el switch molecular tienen una característica

especial: el estatus de fosforilación de la proteína N. A diferencia de otros Rabdovirus

como el VSV, la proteína N del RABV se fosforila en determinados residuos del

aminoácido Serina y la forma no fosforilada de esta proteína tiene una mayor afinidad por

la hebra de ARN líder, al menos en estudios In vitro (Dietzschold et al., 1999).

Específ icamente, una vez el ARNvc es encapsidado, las estructuras formadas por el

extremo 3´ del ARNvc encapsidado (5´ del ARN genómico) promueven la unión de la

polimerasa viral y se inicia la síntesis de la hebra complementaria, que dará origen al

genoma de la progenie viral.

Durante el proceso de replicación del genoma, la existencia de la proteína N es

fundamental, es así que para el VSV existe una relación de 1200 copias de N por cada

500 copias de P y cada 50 copias de L. La ausencia de la proteína estructural N

15

promueve indirectamente la degradación del ARNvc que da origen al ARNv, mientras que

por otro lado, junto con la proteína M, promueve su encapsidación.

Figura 3. Mecanismo de replicación de los Rabdovirus. Posterior a la entrada de viriones infectantes a una nueva célula hospedera el complejo RNP es liberado y una pequeña cantidad de proteína N de ARN polimerasa y su cofactor (proteína P) inician la transcripción de la cadena del ARNv de sentido negativo para la generación de proteínas virales. Por mecanismos de autorregulación de la transcripción mediados por la concentración de proteínas virales y ARNm viral se dispara un switch molecular que desencadena la síntesis de ARN antigenómico con sentido positivo. Este ARN es empaquetado dentro del complejo RNP inmediatamente y sirve como plantil la para la generación de nuevo ARNv genómico el cual es ensamblado dentro del RNP y transportado a membrana donde se fusiona con la proteína G que se encuentra anclada a la membrana celular. Los viriones son secretados y transportados a una nueva célula. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.

Finalmente, el proceso de replicación involucra la maduración de los viriones dentro de su

hospedero. Un paso fundamental para la infectividad de los nuevos viriones es el correcto

procesamiento de sus proteínas, especialmente de la glicoproteína G, conocida como la

proteína de unión y fusión a la célula hospedera y el mayor antígeno de los virus pertenecientes a esta familia. La proteína G recién trascrita a ARNm viral posee una

secuencia de 16 nucleótidos, a modo de secuencia señal, en el extremo que dará origen

al dominio proteínico N-terminal que lidera su entrada en el retículo endoplasmático. Tan

16

pronto esta señal en el ARNm para G es reconocida, es cortada -por acción de enzimas

endógenas de retículo endoplasmático conocidas como signalasas- para dar origen al

péptido viral: una proteína de 495 residuos aminoacídicos con un dominio

transmembranal de 20 amino ácidos en su extremo C-terminal y uno citoplasmático de 29

amino ácidos en su extremo N-terminal. Esta proteína membranal tipo l es glicosilada en

dos residuos del aminoácido Asparagina y transportada hacia la membrana celular, donde

los viriones son ensamblados, adquiriendo su forma final e infectiva, forma que se

observa en la Figura 4 (Strauss, 2002).

Aunque inicialmente se creía que las 5 proteínas existentes en los Rabdovirus eran

exclusivamente estructurales, exceptuando la ARN polimerasa dependiente de ARN

(proteína L) y su cofactor (proteína P), se ha comprobado que tienen funciones en la

regulación de la replicación del virus, así como papeles sorprendentes en el ingreso a la

célula, transporte intercelular y evasión de la respuesta inmune.

1.2.3. PROTEÍNAS VIRALES 1.2.3.1. PROTEÍNA N Proteína de Nucleocápside. La proteína de nucleocápside posee la función crítica de

envolver estrechamente el ARN genómico viral dentro de un estructura resistente a

ARNasas celulares. A su vez, esta estructura o core proteína-ARN sirve como plantilla

para los procesos de transcripción y replicación. A partir de estudios hechos en el VSV,

se ha estimado que cada unidad de la proteína cubre alrededor de 9 nucleótidos de ARN

y que este complejo proteína-ARN interactúa durante la replicación y la transcripción con

los otros dos componentes de la nucleocápside viral: la fosfoproteína P y la ARN

polimerasa viral L, así como con la proteína de matriz M durante la condensación de la

nucleocápside, la unión a membrana y la gemación.

La proteína viral N reconoce secuencias específ icas para empaquetamiento dentro del

extremo 5´ del ARN viral genómico y antigenómico, regulando así los procesos de

transcripción y replicación viral mediante el switch molecular discutido anteriormente.

Debido a que la función fundamental de esta proteína es meramente estructural y otras

funciones relacionadas con patogénesis viral, evasión de la respuesta celular o regulación

genética propia o de su célula hospedera no han sido descritas, se sabe muy poco sobre

su estructura (Fields, 2001). Sin embargo, la supresión o mutación de cinco residuos

dentro de su extremo C-terminal elimina por completo su actividad de unión al ARN así

17

como la interacción con la proteína P, complejo proteínico esencial que evita la

agregación de monómeros de N (Das et al., 1993 y 1999).

1.2.3.2. PROTEÍNA P Fosfoproteína. Como se discutió anteriormente en el capítulo de transcripción, el gen P

codif ica para la proteína P así como para formas truncadas, una de ellas, recientemente

definida como la proteína C para el VSV (Fields, 2001). La proteína P o fosfoproteína en

combinación con la polimerasa viral forma el complejo transcriptasa-replicasa donde P

cumple la función de cofactor no catalítico de la polimerasa viral. La unidad proteínica se

compone de 265 residuos de aminoácidos y se encuentra en diferentes formas de

fosforilación dentro de las células y dentro de los viriones. Su estructura fundamental se

compone de un dominio ácido N-terminal que se compone de 150 residuos de

aminoácidos donde se encuentran los sitios de fosforilación. Desde el residuo 150 al 210

existe una región altamente variable entre las diferentes especies y diferentes cepas virales que se conoce como hinge o punto de giro. El segundo dominio, comprendido

entre el aminoácido 210 y el 244, también posee sitios de fosforilación. Finalmente se

encuentra el extremo C-terminal compuesto por 21 aminoácidos (Fields, 2001).

Los diferentes fenómenos de fosforilación que sufre la proteína P y que son la base para

la acción de la ARN polimerasa (proteína L), son llevados a cabo por proteínas

citoplasmáticas como las Caseína Kinasa ll sobre los residuos de Serina y Treonina

localizados en el dominio l ácido N-terminal (Barik et al., 1992). Estudios recientes han

determinado que la f ina regulación que se lleva a cabo durante la replicación está

mediada por fenómenos de fosforilación dentro del dominio ll, proponiendo que los

patrones diferenciales de fosforilación de la proteína P son la base de la regulación del

switch molecular entre transcripción y regulación (Hw ang et al., 1999). La formación de

trímeros es el requisito principal para la unión de esta fosfoproteína a la polimerasa viral y

al complejo proteína N-ARNv, formando la unidad de transcripción funcionalmente activa

L-P3-N-ARN (Gao et al., 1996). Como se estableció al principio de este capítulo, el gen

que codif ica para la proteína P en los Rabdovirus tiene un segundo marco de lectura que

da origen a dos pequeñas proteínas de carácter básico de 55 y 65 aminoácidos.

Estudiadas principalmente en el VSV, pero presumiblemente presentes en la gran

mayoría de los Rabdovirus del orden de los Vesiculovirus y algunos Lyssavirus, estas

proteínas tomaron los nombres de proteína C y proteína C´ (Fields, 2001). Estudios

realizados eliminando los codones de inicio para estas formas truncada de la proteína P

18

en el VSV mostraron que no existían diferencias en la cinética de crecimiento del virus, ni

en la cantidad de ARNm producido, ni en la concentración de proteína virales presentes,

ni en la disminución de las funciones celulares en comparación con el virus silvestre, al

menos en modelos In vitro (Schnell et al., 1996).

Figura 4. Proteínas y estructura de los virus pertenecientes a la familia Rhabdoviridae. La proteína de mayor tamaño es la ARN polimerasa dependiente de ARN (proteína L), seguida por la proteína antigénica de membrana y principal receptor viral para la entrada a la célula (proteína G). Continúa en orden descendente: la proteína fundamental para la estructura y función del complejo RNP debido a sus dominios de unión al ARN (proteína N), la fosfoproteína o cofactor de la ARN polimerasa viral (proteína P) y finalmente la proteína de matriz, encargada de la unión entre el complejo RNP y la membrana viral (proteína M). Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995. Estudios de patogénesis y de transmisión In vivo han demostrado que tampoco existen

diferencias entre las cepas silvestres y sus contrapartes mutantes para la producción de

las proteínas C y C´ por lo que el papel de estas unidades parece no se esencial para los

fenómenos replicativos, transcripcionales, de patogénesis y transmisión del virus, o por lo

menos, no se ha descubierto todavía. Sin embargo, estudios realizados en RABV, donde

adicionalmente a P se producen cuatro formas truncadas conocidas como P2, P3, P4 y

19

P5, mostraron que estas versiones poseen señales especiales de localización en

membrana nuclear y de exporte núcleo-citoplasma lo que permite hipotéticamente

asociarlas con mecanismos de fosforilación y oligomerización de la proteína P completa y

relacionarlas también en procesos de regulación del transporte de otras proteínas virales

como L y N en posibles fenómenos de evasión de la respuesta antiviral mediante la

interacción con proteínas nucleares (Blondel et al., 2002 y 2005).

1.2.3.3. PROTEÍNA M Proteína de Matriz. Es la proteína de menor tamaño y con mayor abundancia dentro del

virion de los Rabdovirus. Aunque su función principal es servir de puente de unión entre

la membrana de virion y la nucleocápside (Mebatsion et al., 1999), como se observa en la

Figura 4, se ha descrito que también está fuertemente involucrada en la condensación de

la nucleocápside durante el ensamblaje del virus, en la disrupción del citoesqueleto de la

célula hospedera, y en la inhibición de muchas de las funciones celulares (Fields, 2001). Esta proteína es altamente básica y no posee dominios hidrofóbicos, excepto en su

extremo N-terminal, característica que le permite interactuar con la bicapa lipídica que la

partícula viral adquiere de la membrana de su hospedero justo antes de gemar (Lenard et

al., 1990). Adicionalmente, la proteína M sufre fenómenos de fosforilación en los

aminoácidos Serina y Treonina presentes entre las posiciones 20 y 35. Sin embargo, la

disrupción de estos sitios de fosforilación no afecta la funciones de ensamblaje de

viriones, por lo que el papel de esta fosforilación debe ser determinado (Lyles et al.,

1995). Una de las aproximaciones más interesantes a las funciones no estructurales de la

proteína M fue hecha por el grupo de Justice en 1995, cuando mediante la expresión del

gen M del VSV en un sistema de expresión In vitro lograron probar que regiones

conservadas del un dominio rico en prolina de esta proteína viral tenían la capacidad

intrínseca de inducir exocitosis mediante la vesiculación de la membrana de las células

transfectadas con dicha secuencia genética mediante la unión específ ica a dominios WW

determinados de proteínas celulares (Justice et al., 1995 y Harty et al., 1999). Mediante

estudios de microscopía confocal se ha descrito que una fracción de la proteína M se

encuentra asociada a la membrana celular, una fracción mayoritaria se localiza en el

citoplasma y una tercera fracción se localiza dentro del núcleo (Lyles et al., 1988).

Aunque no existen estudios reportados sobre características de la proteína de matriz para

ser transportada a núcleo, puede existir relación entre las características encontradas por

Blondel en el 2005 para las versiones truncadas de la fosfoproteína P, al menos para el

20

RABV (descritas en el capítulo anterior). Recientemente se ha descrito que la proteína M

está involucrada en la disrupción del tráfico nucleocitoplasmático mediante su interacción

específ ica con la nucleoporina Nupp98 así como en la regulación del switch molecular

(Finke et al, 2004). Regresando a la función estructural de la proteína M, reportes muy

convincentes muestran que esta proteína es fundamental para la estabilización de los

trímeros de la glicoproteína G y que solo las membranas de células que expresan formas

silvestres de la proteína M tienen la capacidad de unirse a la nucleocápside viral (Lyles et

al., 1992 y Rose et al., 1993) reafirmando la idea que la proteína M es el puente de unión

entre la membrana y la nucleocápside del virus.

1.2.3.4. PROTEÍNA G

Glicoproteína. Esta proteína transmembranal típica tipo l con la mayoría de sus

aminoácidos expuestos sobre la superficie del virion se distribuye a través de toda la

superficie del mismo con aproximadamente 400 unidades triméricas, para un total de 1200 unidades, como se observa en la Figura 4. Debido a que es la proteína viral más

antigénica ha merecido la mayor parte de los estudios para los Rabdovirus, especialmente

para el VSV y su homólogo RABV. La proteína G está asociada tanto con la envoltura

viral como con el complejo RNP y es considerada como la proteína fundamental de

ensamblaje de los Rabdovirus (Centers for Disease Control: Compendium of animal

rabies control, 1995). El gen G codif ica para una proteína de aproximadamente 500

aminoácidos en una sola cadena peptídica (Fields, 2001). En muchos Rabdovirus, esta

proteína se sintetiza como un precursor con aproximadamente 16 residuos adicionales a

modo de péptido señal en su extremo N-terminal que le permiten a la pre-proteína

asociarse con la chaperona BiP (GRP 78) en el retículo endoplasmático celular para la

adquisición de su conformación correcta (Bole et al., 1990). Posteriormente, los

oligosacáridos glicosilados de esta proteína entran en contacto con una segunda

chaperona molecular, la calnexina, en una acción secuencial de plegamiento a la

realizada por la chaperona BiP, migrando al aparato de Golgi, para 30 minutos más tarde

a su síntesis, aparezca anclada en forma trimérica a la membrana celular de la célula

hospedera (Blobel et al., 1978 y Helenius et al., 1994). Los sitios de glicosilación

mencionados anteriormente son dos ligados a sitios amino, uno de ellos en la posición

117 están fuertemente ligados tanto al correcto plegamiento así como una secuencia de

19 aminoácidos no cargados entre las posiciones 118 y 136 pare el VSV (y entre los

residuos 103 a 179 en el RABV) parecen estar relacionados con las características de

21

inserción a membrana y fusión de este glicoproteína de una manera pH dependiente

(Ghosh et al., 1993 y Whitt et al., 1995). Adicionalmente posee un dominio altamente

hidrofóbico de 20 aminoácidos que sin duda alguna es aquel que se encuentra

atravesando la membrana y un dominio citoplasmático de 29 aminoácidos que se ubican

en la parte interior del virion en posible contacto con la proteína M (Fields, 2001).

Estudios mutacionales de los dominios extracelulares y transmembranales de la proteína

G, como la disrupción de sus sitios de glicosilación, han mostrado que esta proteína se

mantiene como monómeros altamente agregados, plegados incorrectamente y unidos a la

chaperona BiP dentro del retículo endoplasmático. Si por el contrario las mutaciones se

llevan a cabo en el dominio citoplasmático de esta glicoproteína, aunque no se afecta el

correcto plegamiento molecular, la tasa de transporte de la proteína se ve afectada

signif icativamente, indicando que el dominio citoplasmático de la proteína posee la señal

de salida del retículo endoplasmático, posiblemente una señal diacídica conformada por

los aminoácidos Asp-X-Gly (Balch et al., 1997) mientras que la fracción extra y transmembranal poseen las señales de plegamiento y procesamiento (Machamer et al.,

1988).

La organización de los trímeros a través de la membrana citoplasmática es un proceso pH

dependiente donde solo a valores inferiores a pH 6.1 se induce el cambio conformacional

que dará origen a los trímeros estables debido posiblemente a que este bajo pH expone

un dominio hidrofóbico –no definido hasta el momento por falta de homología con otras

proteína transmembranales virales, pero donde el extremo N-terminal es un fuerte

candidato- que se inserta exitosamente dentro de la membrana celular (Helenius et al.,

1993 y Rose et al., 1984).

1.2.3.5. PROTEÍNA L Proteína Larga. Secuenciado por primera vez en 1984 por Schubert y su grupo de

colaboradores (Schubert et al., 1984), esta proteína esta conformada por un poco más de

2100 aminoácidos organizados en una sola cadena polipeptídica. Siendo la proteína viral

más grande, es razonable pensar en la multifuncionalidad de esta enzima de origen viral.

Como se observó en los capítulos referentes a transcripción y replicación, la ARN

polimerasa dependiente de ARN tiene funciones adicionales como el capping del ARNm,

la metilación de la estructura 5´ cap y la poliadenilación del ARN viral (Fields, 2001).

Aunque se han probado todas estas funciones para la polimerasa viral, no se han

reportado estudios de mapeo de los dominios involucrados en cada una de estas

22

funciones ni de los aminoácidos esenciales para las mismas, a excepción del dominio

metiltransferasa, involucrado en la metilación de las estructuras 5´ cap (Moyer et al.,

1988). Las mutaciones dentro de la proteína L causan poliadenilación aberrante en cada

uno de los ARNm, confirmando la función de esta proteína en este proceso (Hunt et al.,

1983). Adicionalmente, el uso del compuesto S-adenosil homocisteína, reconocido por

ser un fuerte bloqueador de la metilación en las estructuras cap, ha demostrado promover

la poliadenilación aberrante de ARNm del VSV (Rose et al., 1977).

1.3. VIRUS RABIA (RABV) 1.3.1. EPIDEMIOLOGÍA DE LA INFECCIÓN Análisis detallados basados en reactividad cruzada con antígenos específ icos anti-

proteína N o mediante análisis de secuencias de ARN permiten incluir al virus dentro del

genero Lyssavirus el virus de rabia (RABV según la nueva nomenclatura establecida por

el Comité Internacional de Taxonomía Viral ICTV). Este virus es sin duda el virus perteneciente a la familia Rabdoviridae de mayor interés clínico. El género Lyssavirus

también contempla entidades como el Virus Mokola, el Virus del murciélago de Lagos, el

Virus Duvenhage, el Virus del Murciélago australiano y los Virus del Murciélago europeo

número 1 y número 2 (Baer, 1991).

Conocida desde el sigo XXlll A.C, la rabia es una enfermedad fatal y ampliamente

diseminada entre humanos y otro mamíferos, caracterizada por la transmisión horizontal,

donde el virus se encuentra principalmente en la saliva del animal rábico que la transmite

por su mordida (Strauss, 2002). El ciclo de transmisión a humanos se observa en la

Figura 5. Las primeras evidencias de la presencia del RABV como agente etiológico de la

encefalitis que lleva su nombre vinieron de reportes histopatológicos que mostraron la

existencia de agregados citoplasmáticos en neuronas y que se llamaron cuerpos de Negri.

La existencia de estos cuerpos se atribuye a la acción de las proteínas G y M,

principalmente de la glicoproteína, pues son estas las proteínas relacionadas con la

envoltura del virus y por ende las únicas capaces de inducir respuesta antiviral mediada

por anticuerpos neutralizantes. Aunque la transmisión ocurre exclusivamente por la

mordida de animales infectados y la penetración directa del virus a las células

musculares, se han reportado casos de infección por contacto por mucosas, donde ocurre

la contaminación de una herida abierta previamente, por rasguños, lamidas o inhalación

de aerosoles del animal infectado, donde una mordida no está involucrada. A modo de

ejemplo, datos estadísticos en Estados Unidos presentados a mitades de los años 90,

23

revelaron que tan solo el 3% de la infecciones con RABV, equivalente a cinco casos de

los 154 reportados entre 1950 y 1980, fueron debidas a exposiciones sin mordidas.

Específ icamente, cuatro de ellos fueron por contacto con aerosoles donde el RABV

estaba altamente concentrado, dos de ellos en exploradores de cuevas y los otros dos en

investigadores de laboratorio (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies

control, 1995). Sorprendentemente, y como caso clínico que abrió una nueva rama de

investigación en el RABV, el quinto caso reportado ocurrió en un paciente quién recibió un

transplante de córnea proveniente de un paciente moribundo de encefalitis quién nunca

fue diagnosticado RABV positivo, como lo reporta el Centro para el Control de

Enfermedades (CDC por sus siglas en inglés) en su informe de RABV en 1995 (Centers

for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).

Figura 5. Ciclo de la infección por RABV. Caracterizada por ser una enfermedad viral de transmisión horizontal, el virus tiene un ciclo de mantenimiento endozootico donde sus vectores son mamíferos que sufren de síntomas igualmente pronunciados pero con tiempos de incubación y desarrollo de la enfermedad rábica muchos menores. Generalmente por mordida, contacto con mucosas y/o saliva o muy raramente por aerosoles el RABV alcanza su hospedero humano, donde, dependiendo del lugar de contacto, especie y condiciones del animal infectado, condición de salud e inmune del paciente y de la cepa viral inoculada, la enfermedad, caracterizada por parálisis focal y/o encefalitis aguda, puede desarrollarse entre los 5 días hasta más de 2 años. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.

24

En un tema que se tratará con más profundidad en el capítulo concerniente a

patogénesis, la infección por RABV se inicia en la periferia, donde se ha recibido la

mordida, y mediante mecanismos de transporte y evasión de la respuesta defensiva e

inmune innata de la célula todavía no comprendidos en su totalidad alcanza el Sistema

Nervioso Central (SNC) llegando hasta el cerebro donde causa una encefalitis muy aguda

y fatal, liderando la enfermedad conocida como rabia (Strauss, 2002).

Aunque mucha literatura reporta a receptores de Acetilcolina como la molécula blanco

para la entrada del RABV a las neuronas, es muy claro por los resultados entregados por

la evidencia In vitro, que este Rabdovirus utiliza diferentes receptores de membrana

celular para su transporte desde la periferia, generalmente células musculares, hasta el

SNC. Toda esta evidencia permite plantear la hipótesis de receptores diferenciales

dependiendo del contexto celular, de la fase de la infección y transporte y de las

características de virulencia de la cepa que ha ingresado (Strauss, 2002, Fields, 2001 y

Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). Continuando con el proceso de desarrollo de la enfermedad, se ha estimado que la probabilidad de

desarrollar rabia a partir de una mordida por un animal rábido depende tanto de la

localización de la mordida, la especie de mamífero rábico que causa la mordida, así como

la virulencia de la cepa de RABV. Mordidas en la cara sin tratamiento antirábico

inmediato desencadenan rabia entre el 40% y el 80% de los casos; mientras que

mordidas en las extremidades inferiores desencadenan en rabia tan solo entre el 0% al

10% de los casos. Otro factor determinante en la severidad de la enfermedad radica en el

tiempo de incubación del virus. Estudios epidemiológicos han revelado que la

enfermedad puede progresar a rabia en periodos que van desde una semana hasta varios

años; pero que tan pronto el virus alcanza el cerebro, la tasa a la que alcanza los demás

órganos es muy elevada. El órgano por excelencia para la correcta transmisión del virus

son las glándulas salivales, dado que la única forma de transmisión natural del virus es

por los f luidos salivales, pues los cambios en el comportamiento inducidos por la infección

cerebral hacen que el animal infectado se torne muy agresivo y tienda a morder a otros

animales. Mientras este es el comportamiento generalizado de otras especies de

mamíferos infectadas con el RABV, en humanos este enfermedad se caracteriza por

causar parálisis generalizada o parcial, ceguera y cambios neurológicos no específ icos

pero muy marcados, caracterizados por ansiedad excesiva, agitación y delirio.

Afortunadamente, la agresividad y beligerancia como consecuencia de la infección no se

desarrolla en humanos, así que la transmisión entre personas no se ha reportado; sin

25

embargo su severidad es igual o quizás peor, dado que, de dos a siete días después que

los síntomas característicos de la enfermedad rábica aparece, el estado comatoso y

posterior muerte son prácticamente inevitables. Tan solo se han reportado tres o siete

casos de humanos con enfermedad rábica que se han recuperado de los miles que

ocurren año tras año (según la fuente consultada) (Strauss, 2002 y Centers for Disease

Control: Compendium of animal rabies control, 1995).

Epidemiológicamente, se ha reportado la presencia de RABV prácticamente en todas las

regiones y prácticamente en todos los países del mundo. Hasta hace menos de una

década, se consideraba que la única región donde el RABV no era endémico era

Australia, país donde no se habían reportado casos de animales salvajes o domésticos

infectados. Sin embargo, recientemente se demostró que una gran variedad de

murciélagos hematófagos australianos son portadores de un virus perteneciente al género

Lyssavirus, conocido como Virus del Murciélago australiano, que desde su reporte han

causado dos episodios fatales de rabia en humanos (Strauss, 2002). Por otro lado, existen países donde el RABV se ha eliminado por completo, caso del Reino Unido, que

tras procesos de vacunación de vida salvaje y doméstica ha erradicado prácticamente por

completo este virus y las estadísticas no revelan caso alguno de rabia en humanos desde

hace varias décadas. Finalmente, países como Estados Unidos y otros muchos en

Europa, tras procesos similares al de Reino Unido llevados a cabo desde las décadas 40

y 50 del siglo pasado, han reducido la población de animales rábicos a menos del 10% de

la población total en riesgo, incluyendo tanto la fauna salvaje como doméstica (Centers for

Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). Aunque estas medidas

han surgido gran efecto en la incidencia de la enfermedad desde mediados del siglo

pasado, desde hace un par de décadas en países donde la enfermedad se creía

controlada en porcentajes mayores al 90%, ha habido un inesperado incremento de la

enfermedad en animales salvajes con un ligero pero considerable aumento en los casos y

muertes humanas, como se observa en la Figura 6 (Strauss, 2002). Estos índices pueden

estar relacionados con el gran dilema que han afrontado los epidemiólogos con respecto a

la persistencia del RABV en la naturaleza: teniendo en cuenta que el mecanismo de

transmisión involucra un animal infectado y sintomático que muere rápidamente, dicha

persistencia puede estar asociada a un fenómeno poco estudiado: la infección latente. De

hecho, en humanos, se ha reportado media decena de casos donde la enfermedad se ha

desarrollado tras siete años o más tras la exposición, y al menos, en uno de ellos, debido

a cambios hormonales durante la pubertad. Teniendo en cuenta estos reportes, sería

26

razonable pensar que existe dentro de las especies salvajes, un reservorio natural y

asintomático del virus, fenómeno que se encuentra en muchas especies virales

antropogénicas. Un candidato para esta función son los murciélagos pues se ha

comprobado que post-infección, estos animales demoran mucho más tiempo en morir que

otros mamíferos, tiempo durante el cual son un reservorio y vector viable para la

dispersión del RABV, sea por su mordida o por medio de aerosoles debidos a sus heces o

su saliva. Sin embargo, análisis a nivel de ARN genómico han demostrado que los virus

encontrados en los murciélagos, como el virus Mokola, dif ieren signif icativamente de los

Lyssavirus encontrados en otros mamíferos salvajes y domésticos; y la mezcla de

diferentes especies de Lyssavirus, casi todos asociados a enfermedad rábica es muy

poco frecuente (Strauss, 2002).

La enfermedad rábica continua siendo un problema de salud pública considerable,

especialmente en países en desarrollo por varias razones: los animales domésticos

siguen siendo los principales vectores de esta enfermedad para los humanos, los regímenes de vacunación contra este virus no son obligatorios para toda la población, la

fase aguda de la enfermedad es generalmente intratable y f inalmente los mecanismos

exactos de patogénesis y la biología molecular de la interacción virus-hospedero no está

descrita por completo. Así, aunque existen las medidas para el control coyuntural de la

enfermedad, en el mundo anualmente más de un millón de personas reciben tratamiento

antirrábico post-contacto con el virus y lastimosamente, 50000 personas mueren

anualmente como resultado de la infección (Strauss, 2002).

1.3.2. DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO Durante siglos, la experiencia permitía inferir que la saliva de los animales infectados con

el virus era el vehículo transmisor de la enfermedad, pero solo hasta 1804 Zinke pudo

transmitir la enfermedad a partir de este f luido corporal. Posteriormente, a f inales del siglo

XIX, Louis Pasteur logró establecer el concepto de vacuna profiláctica contra el RABV a

partir de una cepa adaptada a animales de laboratorio que tras sucesivos pasajes In vivo

perdió por completo sus características virulentas y neurotrópicas sin perder su carácter

antigénico. Una anécdota muy interesante y que se convirtió en el primer reporte hecho

sobre la efectividad de las vacunas profilácticas en humanos es que el día 6 de julio del

año 1885, el joven francés Joseph Miester, quien había sido mordido 14 veces por un

perro rábico fue inmunizado exitosamente con los preparados disecados hechos por Louis

Pasteur a partir de médula espinal de conejos. Posteriormente, mediante virus cultivado

27

en tejido nervioso e inactivado con fenol en lugar de ser desecado, se constituyó como la

vacunación aceptada contra virus rabia durante décadas. Sin embargo, dado los altos

índices de accidentes rábicos producto de la introducción de animales domésticos a áreas

urbanas, la investigación para la generación de vacunas menos riesgosas continuó, y así

a principios los años 60 apareció la vacuna rábica inactivada derivada de virus cultivados

en líneas celulares humanas (Strauss, 2002).

Figura 6. Casos de enfermedad rábica en Estados Unidos en animales domésticos y salvajes (escala de la derecha) contra casos humanos (escala de la izquierda) durante la segunda mitad del siglo pasado, desde el año de 1940 hasta el año 2000. Datos recopilados por Smith et al., 1995 y publicados por Strauss en 2002. Figura tomada de Strauss, 2002. Sin embargo, actualmente líneas celulares animales como la línea de riñón de mono

verde africano (VERO) estandarizadas en los laboratorios del Instituto Pasteur en Francia

también han generado vacunas altamente efectivas contra el RABV. En Estados Unidos,

la Administración de Drogas y Alimentos (FDA por sus siglas en inglés) ha concedido

licencia a las vacunas logradas en células humanas diploides como la HDCV y a la

vacuna rábica adsorbida (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies

control, 1995). Otra característica que hace única a la vacuna antirrábica es que además

de ser profiláctica es también terapéutica. Tras la exposición al virus, la vacuna es

efectiva, e introducida con el suero antirrábico brinda protección inmune. Esta

característica se debe a que el lapso de tiempo entre la exposición y el desarrollo de la

28

enfermedad y mucho más amplio que para cualquier otro virus (Strauss, 2002), lo que

permite que la vacunación genere y potencie la respuesta inmune mucho más rápido que

lo que el RABV tarda en llegar al sistema nervioso.

Además del RABV, el virus Mokola, el virus del murciélago de Lagos, el virus Duvenhage,

el virus del murciélago europeo número 1 y número 2 y el virus del murciélago australiano

son causantes de enfermedad rábica en mamíferos. Sin embargo, aunque todos estos

virus pueden causar enfermedad rábica en humanos, la vacuna profiláctica y el

tratamiento terapéutico existente es exclusivo para RABV, hecho que debido al aumento

de casos de transmisión y enfermedad de las otras seis especies abre un nuevo y

promisorio campo de investigación básica y aplicada para la generación de vacunas así

como para la comprensión y asociación de la biología molecular de estos virus y sus

mecanismos moleculares de patogénesis (Strauss, 2002).

Mediante análisis de secuencias de ARN, mediante anticuerpos monoclonales que

permiten diferenciar las cepas f ijas, mediante las características de adaptación a ciertas especies así como a líneas celulares se ha podido discernir entre las diferentes especies

y cepas –silvestres o cepas calle- de estos Lyssavirus. Este tipo de diagnóstico permite

establecer en ciertos casos, el lugar y animal transmisor en los episodios rábicos. Por

otro lado, en el contexto clínico, aunque la detección temprana es difícil, el diagnóstico se

lleva a cabo mediante la detección de antígeno viral, principalmente la proteína G de

superficie, de anticuerpos específ icos, de ARN viral o mediante el aislamiento directo de

partículas virales. Debido a la cinética de la infección, una sola técnica de diagnóstico

suele ser insuficiente, así que organizaciones de salud internacional recomiendan que si

existe sospecha de enfermedad rábica se deben llevar a cabo el siguiente protocolo de

diagnóstico estandarizado: muestras de suero seriadas de pacientes que no hallan sido

vacunados para la detección de anticuerpos mediante la técnica rápida de inhibición de

foco por f luorescencia (RFFIT por sus siglas en inglés) anti RABV, muestras de f luido

cerebroespinal -aunque el antígeno viral aparece 2 a 3 días después de aparecer en

suero- que suele ser conveniente en pacientes vacunados, muestras de saliva durante las

primeras 2 o 3 semanas de enfermedad para el cultivo de virus en líneas celulares de

neuroblastoma o en animales de laboratorio por inoculación directa de la muestra y

f inalmente biopsias de piel tomadas específ icamente de la base del cuello, para la

detección de antígeno viral mediante inmunofluorescencia. Aunque, en etapas

tempranas de la enfermedad, las biopsias de piel o de cerebro suelen ser negativas, la

inmunofluorescencia se considera el método de diagnóstico antemortem más sensible.

29

Sintomatología y enfermedad debida al RABV se sospecha generalmente en casos de

encefalitis viral no explicada en conjunto con una historia de contacto con f luidos salivares

de algún mamífero, especialmente en zonas endémicas para el virus, debido a que la

rabia humana suele manifestarse de manera similar a encefalitis por herpesvirus,

arbovirus, tétanos, malaria cerebral, enfermedades rickettsiales o tifoideas, síndrome de

Guillan-Barre, polineuropatía inflamatoria aguda, intoxicación por drogas o venenos o

parálisis por poliomielitis y botulismo (Centers for Disease Control: Compendium of animal

rabies control, 1995).

El control de esta enfermedad se fundamenta en la vacunación regular de las especies

animales susceptibles, especialmente las domésticas como perros y gatos. A mitades del

siglo pasado, se llevaron a cabo en Estados Unidos y Europa jornadas de vacunación

masiva de animales domésticos, programa que en pocos meses mostró una disminución

dramática tanto en los casos de rabia animal como en humanos. Sin embargo, hacia esa

misma época se incrementaron los reportes de casos de rabia en animales salvajes como se observa en la Figura 6 debido en parte a que al mismo tiempo se inició un mejor

control epidemiológico del virus en escenarios silvestres. Actualmente se estima que la

incidencia del RABV en animales silvestres es aproximadamente 10 veces mayor que en

animales domésticos y en humanos (Strauss, 2002 y Centers for Disease Control:

Compendium of animal rabies control, 1995). Debido a que actualmente los animales

silvestres se constituyen como el mayor riesgo de infección en humanos, la vacunación

oral con virus atenuados o vacunas recombinantes mediante el novedoso uso de

murciélagos como vectores ofrece una esperanza para la disminución de la transmisión

del virus y por ende, desarrollo de la enfermedad en animales salvajes. En cuanto a

humanos se refiere, el mejor control de la enfermedad es la prevención, evitando la

exposición a la enfermedad pues la vacunación masiva contra el virus en humanas es

inusualmente baja debido a los altos costos de generación de la vacuna y la protección

temporal que esta ofrece, así como la baja probabilidad de adquirir la enfermedad.

Existen poblaciones de alto riesgo donde la vacunación se hace necesaria: veterinarios,

cazadores, trabajadores en áreas silvestres de alta incidencia y personal de laboratorio

que manipula el virus. Bajo este criterio de prevención adoptado prácticamente en todo el

mundo, la metodología de control suele ser post-exposición. Esta consiste en la limpieza

local de la herida, la aplicación de suero hiperinmune antirábico y la vacunación

profiláctica (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).

30

1.3.3. PATOGÉNESIS A diferencia de la enfermedad causada por el VSV que generalmente es de rápido

progreso y eficientemente eliminada del hospedero gracias al sistema inmune, la

enfermedad causada por el RABV de de lento progreso, de respuesta inmune tardía y con

un diagnóstico por lo general letal. Los modelos moleculares obtenidos a partir del VSV

son por lo general extrapolables al RABV independiente del género al que pertenezcan y

a las grandes diferencias en la patología que causan en las diferentes especies de

mamíferos que infectan. La citopatogénesis de estos virus parte de la experiencia

recogida en los muchos tipos de líneas celulares de vertebrados y algunos invertebrados

que son infectadas tanto por el VSV como por el RABV. Entre estas se encuentran: la

línea de riñón de cría de hámster BHK-21, la línea tumoral humana HeLa, la línea

linfoblastoide humana Raji y las células de cornea de conejo. Sin embargo, solo la línea

BHK-21 ha ofrecido una replicación efectiva de las partículas virales (aproximadamente

100000 por célula) con un porcentaje de infección del 10% de las células en cultivo. Las otras líneas presentan bajos porcentajes de infección (5% o menos), baja producción de

partículas virales (con valores de hasta 1 partícula por células), con producción de ARN

genómico alterada, generación de proteínas virales de composición alterada y sin la

presencia de efectos citopáticos evidentes (Fields, 2001).

Durante mucho tiempo se creía que la única y más potente proteína antigénica del RABV

era la glicoproteína G, sin embargo se ha demostrado que el complejo RNP del virus

purif icado o recombinante en forma de vacuna protege contra dosis letales de la cepa

Challenge Virus Strain (CVS por sus siglas en inglés) una de las más letales y

neurotrópicas (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).

Por lo general la citopatogénesis se caracteriza por cambios estructurales en las células

conocidos como cell rounding y que son debidos a la expresión de la proteína de matriz

M. Esta proteína causa la disrupción de las uniones célula-célula por la rápida

depolimerización de la actina, tubulina y vimentina. Esta depolimerización del

citoesqueleto celular causa el rompimiento de las f ibras membranales, de los microtúbulos

y de los f ilamentos intermedios (Blondel et al., 1990). Adicionalmente, se ha probado que

la glicoproteína G es también altamente tóxica para la célula probablemente debido a la

disrupción de la membrana celular (Rose et al., 1983).

Una de las características evolutivas más conservadas entre los virus es la capacidad que

tienen estos para inhibir las síntesis de proteínas celulares como resultado de la

desviación de los mecanismos moleculares de la célula hospedera a su favor. La

31

infección por el VSV y por RABV In vitro resulta en la inhibición substancial de la síntesis

de proteínas celulares dentro de las 4 primeras horas, periodo de tiempo que coincide con

aquel donde se encuentra la mayor cantidad proteínas virales lo que sugiere que existen

mecanismos de competencia generados por el virus. Precisamente Lodish y Porter

encontraron que esta competencia puede deberse a una sobresaturación de los

ribosomas por la gran cantidad de ARNm viral que corresponde a aproximadamente al

75% del ARNm total encontrado en la célula (Lodish et al., 1980). Aunque esta estrategia

puramente pasiva de disrupción propuesta por Lodish y Porter parecía dar solución al

problema de la relación proteína viral-proteína celular, Reichmann y colaboradores en

1983 encontraron un mecanismo un poco más específ ico basado en la selectividad que

ciertas secuencias de nucleótidos presentes en los extremos 5´ y 3´ de los ARNm ejercían

sobre los ribosomas celulares (Reichmann et al., 1983).

Además de la disrupción del citoesqueleto y una inhibición evidente en la síntesis de

proteínas, la citopatogénesis se caracteriza por una inhibición en la transcripción, en el transporte del ARNm del núcleo al citoplasma y la síntesis de ADN en la célula hospedera

(Fields, 2001). Además de la depolimerización del citoesqueleto, trabajos realizados por

Lyles y su grupo de trabajo en 1992 lograron establecer que la proteína de matriz M

parece estar involucrada también en la inhibición de la síntesis de ARNm y su posterior

expresión fuera del núcleo. Posteriormente, en 1998 el mismo Lyles profundizó en el

tema y junto a otro grupo de investigación pudo concluir que la proteína M interfería con la

ARN polimerasa ll celular mediante la inactivación del factor de transcripción TFllD (Lyles

et al., 1992 y Lyles et al., 1998). Adicionalmente, puede existir relación entre las formas

truncadas de la proteína P que fueron descritas por Blondel y colaboradores en el 2005

como proteínas de transporte y exporte citoplasma-núcleo (Blondel et al., 2005) y la

proteína M, pues Dahlberg y Her reportaron en la revista Science en el año de 1997 que

esta proteína viral inhibía el transporte celular mediado por la familia de proteínas Ran

GTP dependientes, específ icamente la Ran-TC4 y sus factores asociados (Dahlberg et

al., 1997). La relación existente radica en que hipotéticamente la forma adicional de P (P2

a P5) puede transportar a M del citoplasma al núcleo para que inicie su inhibición del

transporte del ARNm al citoplasma. Adicional a la función que la proteína de matriz M

descrita anteriormente, otros estudios sugieren que la secuencia de ARN líder viral está

implicada en la inhibición de la síntesis de ARNm celular. Aunque no existen estudios

concluyentes que asocien a la secuencia de ARNv líder con la inhibición de ARNm

síntesis, estudios realizados con luz UV mostraron que viriones tratados con este tipo de

32

radiación eran capaces de transcribir esta región del ARN y de inhibir la síntesis de ARNm

celular así como la síntesis del ADN celular (MacGow an et al., 1988), de la misma forma

la transfección In vitro de células con oligodeoxinucleótidos homólogos a esta secuencia

líder causó una disminución sustancial en el ARNm generado en la célula tratada (Wagner

et al., 1983 y 1984) y trabajos realizados en 1982 por Keene y su grupo de colaborados

mostró que el ARN líder se localizaba al núcleo de las células infectadas poco tiempo

post-infección, resultados que podrían confirmar la función de esta secuencia no

traducible de ARN viral en la inhibición del ADN y por lo tanto del ARNm celular (Keene et

al., 1982). Sin embargo como se ha reportado para la proteína viral M la inhibición de la

síntesis de proteínas celulares no se puede deber únicamente a la interferencia mediada

por la secuencia líder del ARNv.

En los párrafos anteriores se revisó la patogénesis desde una perspectiva molecular. A

continuación se revisará de manera general los aspectos f isonómicos que caracterizan la

patología del RABV. Como se sabe, la infección por este virus se caracteriza generalmente por una invasión y daño agudo del SNC. Se han descrito cinco etapas

generales para esta viremia en humanos: incubación, prodrómica, periodo neurológico

agudo, estado de coma y muerte con diferentes títulos virales como se observa en la

Figura 7. Usualmente el virus se incuba y comienza a manifestarse dentro de los tres

primeros meses. Tan pronto la infección se ha manifestado, no existen agentes

antirrábicos específ icos, así que solo la aplicación inmediata de la vacuna profiláctica

acompañada de la vacuna terapéutica y suero antirrábico son las únicas herramientas

existentes para prevenir la aparición de la enfermedad.

Tras la inoculación, el virus ingresa al Sistema Nervioso Periférico (SNP) después de un

periodo de tiempo variable dentro del tejido muscular donde ocurre replicación viral a muy

bajas tasas. Este periodo se conoce como incubación. En esta fase de la infección, los

datos clínicos han demostrado que no es posible encontrar antígenos virales, lo cual hace

aún más intrigante el proceso de patogénesis del RABV (Campbell, 1988). Desde las

células musculares migra a través de las uniones neuro-musculares, hacía el SNC y luego

directamente hacia el cerebro mediante lo que se cree es un proceso de activación de la

supervivencia neuronal y evasión de la respuesta inmune, hipotéticamente fundamentado

en tasas de replicación viral por debajo del estándar óptimo. Específ icamente este tema

se analizará con más profundidad en el capítulo 4 (Vías Apoptóticas o de Supervivencia

Neuronal Activadas por Infección con Virus Rabia). Ya en el cerebro, activa mecanismos

de respuesta celular muy agresivos que se manif iesta con una encefalitis aguda que

33

conlleva a estado comatoso y muerte del paciente. Antes de la aparición de los síntomas

neuronales específ icos de la enfermedad, en la fase prodrómica generalmente aparecen

síntomas no específ icos tales como malestar general, f iebre y fatiga; acompañados a su

vez por síntomas que involucran el sistema respiratorio como dolor de garganta,

expectoración y disnea; el sistema gastrointestinal como anorexia, disfagia, nauseas,

vómito, dolor abdominal y diarrea; y el sistema nervioso como dolor de cabeza, vértigo,

ansiedad, aprehensión, irritabilidad y neurosis. Otro rasgo que generalmente acompaña

las etapas medias de la infección es el dolor y la parálisis del sitio de inoculación viral que

acompañado por una historia de contacto reciente con un animal sugiere fuertemente el

desarrollo de la enfermedad. Finalmente, la encefalitis aguda se manif iesta con

anormalidades físicas de carácter neurológico como agitación, fotofobia e hidrofobia,

priapismo, libido aumentada, insomnio, pesadillas y depresión así como perturbaciones

marcadas de carácter psiquiátrico (Centers for Disease Control: Compendium of animal

rabies control, 1995). Los análisis patológicos han revelado congestión en los vasos meníngeos, daño

perivascular, necrosis tisular focalizada, inclusiones intracitoplasmáticas neuronales

acidofílicas y en algunos casos neurofagia. Desde el cerebro el virus inicia un proceso de

transporte hacia los demás órganos y tejidos del cuerpo donde ya no se limita a células

del SNC (Campbell, 1988).

Existen dos tipos de clasif icación para la fase neurológica aguda dependiendo del

comportamiento del paciente. Se clasif ica como rabia “furiosa” si predominan

anormalidades neurológicas como hidrofobia e hiperactividad; mientras que se conoce

como rabia “tonta” si en el cuadro clínico predomina la parálisis focal o generalizada,

convulsiones e hiperventilación. Estos dos comportamientos clásicos generados por la

infección están fuertemente relacionados con la genética del virus debido a que cuadros

clínicos de rabia “furiosa” son característicos de una infección por RABV que se manifestó

a nivel celular exclusivamente en el cerebro y que durante su transporte a través del SNC

activó vías de supervivencia y subversión celular. Por otro lado, cuadros clínicos de rabia

“tonta” permiten inferir sobre el carácter menos virulento de la cepa inoculada ya que la

parálisis de ciertas partes del cuerpo es el reflejo del daño neuronal causado por la

respuesta del sistema inmune adaptativo (linfocitos T citotóxicos, células asesinas

naturales y macrófago) e innato (mediado por la activación de las cascadas de

señalización pro-apoptóticas). La producción de citoquinas, interferón e inmunoglobulinas

(IgM e IgG) está muy bien documentada durante procesos de infección y de vacunación y

34

se ha probado que erradican la infección si se generan en etapas tempranas de la

enfermedad (Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995).

Este tema se revisará en el capítulo de respuesta inmune.

1.3.3.1. ADSORCIÓN DEL VIRUS La patogénesis causada por cualquier entidad viral está en íntima relación con la forma

como esta ingresa y se desarrolla dentro de las células hospederas. La infección por

RABV se inicia por la adhesión de la partícula viral a los receptores específ icos presentes

en la superficie celular.

Para este Rabdovirus, los receptores diferenciales parecen depender del entorno celular y

entre ellos se encuentran el receptor nicotínico acetilcolina (nACh) (Lentz et al., 1983), la

molécula de adhesión neuronal (NCAM) (Thoulouze et al., 1998) y el receptor de

neurotrofina (p75NTR) (Tuffereau et al., 1998). Estos receptores han sido difíciles de

identif icar debido al amplio rango de hospederos, a las diferentes propiedades de unión de la glicoproteína G y principalmente del entorno celular (Lafon, 2005).

Existen otros factores que dif icultan los estudios cuantitativos de adsorción del virus,

como los valores de pH extracelular. Por ejemplo, para el VSV al igual que para RABV

existe un valor máximo de tolerancia a pH para la unión eficiente (entre pH 6.5 y pH 6.0).

A un pH de 6.3 la infectividad In vitro se aumenta aproximadamente 20 veces en

comparación con la eficiencia a pH neutro (Whitt et al., 1998). Sin embargo, aún dentro

de este estrecho rango de pH la unión del virus no es completa y no presenta el equilibrio

calculado teóricamente para los Rabdovirus (Simons K et al., 1982).

A nivel molecular se ha propuesto que esta unión se debe a los cambios

conformacionales de la proteína G inducidos por la acidez del medio sugiriendo que el

sitio de unión de esta proteína viral se expone solo durante un periodo de transición del

medio de básico a ácido (Whitt et al., 1998). Estudios hechos por Rose en 1980 y

posteriormente por Pastan y su equipo en 1982 mostraron que para el VSV existen al

menos dos sitios de unión uno de ellos saturable y otro no saturable. Mediante ensayos

de competencia en células Vero se comprobó que el receptor de membrana se trataba de

un fosfolípido, específ icamente fosfatidilserina.

Estudios posteriores para otros Rabdovirus, como el virus de la hemorragia septicémica

viral, un Rabdovirus animal, demostraron que la unión de la glicoproteína viral con

receptores fosfolipídicos es un parámetro conservado para esta familia viral (Coll et al.,

1996). Desafortunadamente para el Rabdovirus de mayor importancia clínica, el RABV, la

35

determinación de sus receptores celulares ha sido más controversial y solo la evidencia

recientemente recopilada por Monique Lafon permite postular los tres receptores

específ icos anteriormente mencionados. La metodología adoptada para la postulación del

receptor nicotínico (AChR) como receptor para el RABV se basó en la similitud de

secuencias entre la glicoproteína viral y las neurotoxinas presentes en el veneno de las

serpientes, como la a bungarotoxina o a-BGT (Smith et al., 1982).

Figura 7. Etapas de la infección por RABV: incubación, prodrómica, periodo neurológico agudo, estado de coma y muerte. Aunque, el periodo de incubación puede ser de varios años, usualmente el virus se incuba y comienza a manifestarse dentro de los tres primeros meses. En el periodo de incubación y prodrómico el virus se encuentra secuestrado en las células musculares dentro del sitio de inoculación en un proceso de replicación sub-óptimo. Posteriormente, inicia un proceso de transporte a través de las uniones neuro-musculares ingresa al SNC llegando hasta el cerebro donde causa encefalitis aguda de carácter letal. Desde el cerebro inicia su migración hacia otros órganos, incluidos glándulas salivares, órgano crítico para su transmisión vertical. Figura tomada de Centers for Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995.

Posteriormente esta hipótesis fue corroborada por varios grupos de investigadores que

mediante el uso de inhibidores del AChR o trabajando con líneas celulares defiencientes

para AChR. Sin embargo, estos mismos trabajos permitieron establecer que no solo este

receptor constituía el sitio de unión de este virus y solo hasta hace unos pocos años se

pudieron describir con exactitud dos receptores adicionales para la entrada del virus: el

receptor de neurotrofinas p75 (p75NTR) y la molécula de adhesión celular neuronal

(NCAM) (Tuffereau et al., 1998 y Toulouse et al., 1998).

36

1.3.3.2. ENTRADA Los viriones infecciosos se fusionan a la membrana de la célula hospedera por un

proceso conocido como adsorción. Varios estudios han probado que para el ingreso del

RABV a las células musculares y/o neuronales existe una interacción directa de trímeros

de la glicoproteína G (Whitt et al., 1991 y Gaudin et al., 1992) viral con receptores

específ icos dependiendo del ambiente y contexto celular. Se postula que después de la

adsorción el virus penetra al citoplasma por endocitosis y se agrega en endosomas que

posteriormente se fusionan con la envoltura viral causando la liberación del complejo RNP

en el citoplasma de la célula hospedera como se observa en la f igura 8 (Centers for

Disease Control: Compendium of animal rabies control, 1995). De manera similar que

para los demás miembros de la familia Rabdoviridae, posterior a la entrada del ARNv del

RABV dentro del complejo RNP, se inicia una transcripción controlada que parece regular

las concentraciones de proteínas virales en lo que parece hacer parte de un fenómeno de

evasión de la respuesta inmune del hospedero. El complejo RNP es fundamental en el proceso de infección de una nueva célula, pues como Pattnaik y su grupo lo comprobaron

en 1997, el ARNv desnudo inyectado en células susceptibles no es infeccioso (Pattnaik et

al., 1997).

Después de la unión a la membrana de la célula los viriones son endocitados por una vía

dependiente de Clatirina proteína encargada del tráfico de sustancias –principalmente

proteínas- a través de la membrana en forma de vesículas (Schmid et al., 2005). Este tipo

de endocitosis fue probada por Simons y su grupo de colaboradores en 1982 junto con los

hallazgos referenciados sobre el estrecho rango de pH al cual los viriones se unen y son

internalizados dentro de la célula satisfactoriamente. Trabajando con la línea celular

MDCK observaron por microscopía electrónica que la internalización de los viriones del

VSV se da en forma de vesículas dependientes de Clatirina que le confieren al virus

resistencia a proteasas y que lo transportan hasta los lisosomas donde el pH bajo genera

una reacción de fusión que libera el ARNv al citoplasma (Simons et al., 1982).

Adicionalmente en 1991 Lenard y sus colaboradores descubrieron que tan pronto los

viriones han ingresado al citoplasma a única proteína que se solubiliza es la proteína de

matriz M, mientras que la proteína de nucleocapside N y la glicoproteína G permanecen

dentro del complejo RNP y asociadas al citoesqueleto de la célula hospedera dentro de

endosomas y lisosomas. Esta distribución especial del complejo RNP planteó para Lenard

y su grupo la hipótesis que estos endosomas constituían el sitio primario de transcripción

viral, sin embargo no definieron función alguna para la distribución de la proteína M

37

(Lenard et al., 1991). Aunque todavía no se conocen las causas por las cuales solo la

proteína M se disocia, evidencia reciente permite inferir que esta proteína estructural de

matriz está involucrada en otras funciones esenciales para la supervivencia viral y en el

caso del RABV en posibles funciones de evasión de la respuesta celular.

1.3.3.3. ENSAMBLAJE Y GEMACIÓN Después que el virus ha entrado al citoplasma de la célula y ha liberado su genoma

dentro del complejo RNP se llevan a cabo los procesos de transcripción y replicación que

ya se revisaron en capítulos anteriores. Tan pronto se ha generado suficiente ARNv y

proteínas virales inicia el proceso de ensamblaje. Según Fields en Virology el proceso de

ensamblaje se puede dividir en tres fases diferentes: Encapasidación del nuevo genoma

viral de ARN dentro de la proteína de nucleocápside N, condensación del complejo RNP y

asociación con la membrana plasmática mediante la proteína de matriz M y liberación de

la partícula viral envuelta. La encapsidación ocurre dentro del citoplasma y ocurre debido a que la cadena de ARNv

genómico que se genera a partir del ARNvc es cubierta inmediatamente por las proteínas

N, P y L recién sintetizadas para formar el complejo RNP. Además de ser un proceso

fundamental para la generación de nuevos viriones, y como se describió en capítulos

anteriores, la encapsidación del ARNv asegura que los mecanismos de transcripción y

replicación viral sean eficientes (Fields, 2001). Después de la encapsidación del genoma

viral, el complejo RNP se asocia con la membrana citoplasmática (y con la glicoproteína G

viral que se encuentra anclada) mediante la proteína de matriz M, en una estructura

fuertemente condensada conocida como esqueleto viral. Brow n y New comb en 1981

utilizaron una estrategia novedosa para estudiar la integridad y estructura del complejo

RNP. Este equipo de investigadores sometió viriones purif icados a un detergente iónico

simulando el proceso de entrada y liberación del RNP. Bajo estas condiciones el

esqueleto viral pierde su estabilidad y condensación producto de la disociación de la

proteína de matriz M. La adición de proteína M purif icada junto con la eliminación del

detergente devolvió la estabilidad y la estructura condensada al complejo RNP (Brow n et

al., 1981). Adicionalmente la adición de proteína M al complejo ribonucleoprotéico inhibe

la transcripción del ARNv como fue probado por Wagner en 1979. Siguiendo una

estrategia similar a la utilizada en el estudio anterior se observó que los fenómenos de

ensamblaje y desensamblaje relacionados con la proteína de matriz inf luían de manera

signif icativa en la infectividad y eficiencia de transcripción del virus (Wagner et al., 1979 y

38

Lyles et al., 1998). Estas ideas junto con los fenómenos de regulación descritos en los

capítulos de transcripción y replicación permiten la construcción de un entorno genético y

estructural que rige el contexto completo de cómo virus los Rabdovirus como el RABV

generan el switch molecular de transcripción a replicación y adicionalmente cómo generan

cantidades de ARNv y proteínas por debajo del umbral de reconocimiento de los

mecanismos de defensa como la vía IFN, la presentación del antígenos virales mediante

el CMH y hasta de un sistema tan sensible como el ARN de interferencia (ARNi).

Hipotéticamente, la condensación del RNP no ocurre hasta que este complejo no este en

contacto con la membrana citoplasmática (Lyles et al., 1989). En segundo lugar este

contacto está mediado por la presencia inicial de una fracción (10% a 20% según lo

reportado por Rose y Chong) de proteína M anclada a la membrana (Rose et al., 1993)

probablemente mediado por la glicoproteína.

Tan pronto se ha condensado el ARNv dentro del RNP las partículas Rabdovirales se

liberan de la célula hospedera en un fenómeno conocido como gemación. Este proceso depende en gran parte del correcto empaquetamiento del RNP dentro de la membrana

citoplasmática y el acople perfecto de la fracción citoplasmática de los monómeros de

glicoproteína G anclados a la membrana con la proteína de matriz M que sirve de puente

entre la nucleocápside y la envoltura viral. Adicionalmente, estudios hechos Lyles en

1996 mostraron que virus mutantes para la proteína M generaban un porcentaje mucho

menor de viriones infectantes y aún mas interesante, aquellos que lograban gemar

satisfactoriamente poseían una forma esférica. La adición de la proteína silvestre

mediante transfección transitoria con ADN plasmídico regresaba las características de

forma de bala a las partículas virales (Lyles et al., 1996). Estudios realizados un año

antes por Li y colaboradores mostraban que la transfección transitoria con el gen

codif icante para la proteína M, en ausencia de cualquier otra proteína viral, promovía la la

invaginación de la membrana y la formación y gemación de vesículas (Li et al., 1995),

demostrando otro de las funciones intrínsecas de este producto viral relacionadas con la

gemación.

En cuanto a la glicoproteína G que se encuentra transmembranalmente anclada se ha

demostrado que solo la interacción con el RNP permite su trimerización (forma funcional y

estructuralmente activa) y que posee dominios en su fracción intracelular involucrados con

la gemación de los viriones infectantes, posiblemente dominios que fomentan la curvatura

de la membrana para su correcta fusión y posterior gemación. Finalmente, el proceso de

liberación de las partículas virales parece estar relacionado con ciertos factores celulares.

39

Figura 8. Ciclo de infección y replicación del RABV. Los viriones infecciosos penetran la membrana de la célula hospedera por adsorción. Se han postulado receptores específicos para el RABV como el nACh, el NCAM y el p75NTR. Después de la adsorción el virus penetra al citoplasma y se agrega en endosomas que se fusionan con la envoltura viral causando la liberación del complejo RNP en el citoplasma de la célula hospedera. Figura tomada de Velandia M, 2005.

Harty y su grupo de investigación probó en 1999 que existe un dominio rico en Prolina

dentro de la proteína M que interacciona con los dominios WW de ciertas proteínas

celulares y cuyo resultado es la liberación de las partículas virales fuera de la célula

infectada (Harty et al., 1999).

40

1.3.3.4. RESPUESTA INMUNE La respuesta inmune es una de las características fundamentales en la patogénesis

causada por enfermedades virales debido a que es esta reacción la causante de los

fenómenos inflamatorios y apoptóticos que alteran la función de células, tejidos y órganos.

Aunque el modelo más utilizado para el estudio de los Rabdovirus es el VSV, este modelo

no es viable para el estudio del mayor Rabdovirus de importancia clínica en el mundo: el

RABV. Sin embargo, a partir de la respuesta esencial que este Rabdovirus genera es

posible establecer analogías con los procesos que ocurren a nivel molecular en el resto

de los Rabdovirus. En un capítulo posterior se tratarán más a profundidad los fenómenos

de respuesta inmune, apoptóticos y de supervivencia celular característicos de la

infección por RABV.

Entre los fenómenos inmunes generalizados se encuentra la respuesta vía interferón

(IFN). Al igual que para la mayoría de los patógenos virales, en las infecciones por

Rabdovirus los interferones proveen la primera y más crítica línea de defensa. Aunque la respuesta por IFN –y de hecho, todo tipo de respuesta inmune-, varía dependiendo de la

cepa y por supuesto de la especie viral, una característica que comparten todos los

Rabdovirus es la sensibilidad que la replicación tiene en respuesta a estas moléculas,

trayendo como resultado la disminución de la tasa de expansión del virus hasta que la

respuesta por anticuerpos surge efecto (Fields, 2001). Esta idea fue corroborada por

Schertler y sus colaboradores en el año de 1996 utilizando ratones transgénicos

deficientes para IFN-a y para el receptor IFN-b. En estos ratones observaron una

diseminación rápida y masiva del VSV en todos los órganos con muerte en un par de días

(Schertler et al., 1996). En cuanto a la respuesta inmune humoral mediada por

anticuerpos, basada en la presencia de inmunoglobulinas neutralizantes que reconocen

diferentes sitios dentro del dominio extramembranal de la glicoproteína G, esta parece

estar en íntima relación con la respuesta primaria generada vía IFN. En el mismo trabajo

de Schertler se comprobó que la administración pasiva de anticuerpos anti-glicoproteína

G devolvía a estos ratones la capacidad de eliminar la infección por VSV y evitar su

diseminación sistémica. En relación a la segunda rama de la respuesta inmune, la

administración de linfocitos T específ icos contra el VSV no tuvo efecto alguno sobre los

ratones infectados. En un estudio anterior se había demostrado el papel secundario que

la respuesta inmune celular mediada por linfocitos T tiene en las infecciones por

Rabdovirus. Utilizando ratones deficientes en linfocitos T CD8+ se demostró que estos

eran igual de resistentes a los ratones con niveles normales de linfocitos T CD8+ a la

41

infección por VSV (Moss et al., 1987). Aparentemente contradictorios resultan los

diferentes estudios relacionados con este tema. Mientras que los trabajos del Moss no

mostraban función alguna de los linfocitos T citotóxicos en la neutralización de la infección

por Rabdovirus, la experiencia de Rose y su grupo de trabajo un año antes mostraba que

existían epítopes dentro de las proteína N y G específ icamente reconocidos por linfocitos

T citotóxicos vía CMH clase l. De hecho este epítope, conocido como N52-59 y

perteneciente al VSV fue uno de los primeros epítopes virales identif icados y

secuenciados (Rose et al., 1986). Adicionalmente, se han descrito varios epítopes

específ icos para linfocitos CD4+ (vía CMH clase ll) localizados dentro de la glicoproteína

viral G (Castro et al., 1994).

Por su lado, para el RABV, como es reportado por Craig Hooper en la revisión hecha en el

2005, la respuesta inmune mediada por linfocitos T CD4+ está definida según la cantidad

de glicoproteína G expresada por la cepa viral. En este caso, las cepas más

neuropatogénicas y letales se caracterizan por expresar cantidades limitadas de proteína G y por no estimular poblaciones de linfocitos T CD4+ ni anticuerpos neutralizantes,

debido quizás a un menor impacto sobre el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH)

clase ll, elemento encargado del reconocimiento del antígeno viral a través de los

linfocitos T CD4+; mientras que las cepas menos letales y por ende más pro-apoptóticas

se caracterizan por cantidades altas de proteína G y por estimular la respuesta de

poblaciones de linfocitos T CD4+ específ icos así como de anticuerpos neutralizantes

(Hooper, 2005). De esta manera pareciera establecerse que aunque la respuesta

mediada por linfocitos T CD8+ (asociados a el CMH tipo l) no es la principal línea de

defensa contra los Rabdovirus, la respuesta por linfocitos T CD4+ juega un papel

determinante en la patogénesis y en el progreso de la infección. Sin embargo, 10 años

atrás Zinkernagel y su grupo mostraron que la infección por Rabdovirus como el VSV

generaba una respuesta rápida de anticuerpos neutralizantes tipo IgM independientes de

la activación de linfocitos CD4+ seguida por la aparición inmunoglobulinas IgG

dependientes de linfocitos CD8+ en respuesta a la presencia de la glicoproteína G sobre

las partículas virales (Zinkernagel et al., 1995). Una conclusión preeliminar basada en los

estudios anteriormente referenciados permite establecer que el VSV y el RABV divergen

en cuanto a la estimulación de la respuesta inmune y aunque siempre se ha querido

homologar al VSV con el RABV, estos trabajos muestran que la biología molecular de

este último es mucho más compleja y que sus características patogénicas pueden ser

producto de dicha divergencia.

42

2. LA APOPTOSIS O MUERTE CELULAR PROGRAMADA 2.1. INTRODUCCIÓN Y CARACTERÍSTICAS GENERALES Hace un poco más de 100 años Paul Ehrlich acuñó el término “horror autotoxicus” a los

desórdenes autoinmunes. Hace solo hasta un par de décadas se pudo definir que este

“horror autotóxico” se debía en la mayoría de los casos a procesos celulares mediados

por la deregulación del fenómeno de Muerte Celular Programada (MCP) que solo fue

llamado formalmente Apoptosis en el año de 1987 por Wyllie con base en sus

características citopatológicas (Wyllie AH, 1987). La apoptosis es definida como un

proceso de autolimitación de la expansión de los tejidos y de eliminación de las células

que ya han cumplido su ciclo (Anaya, 2005) o que por condiciones genéticas o de

infección se encuentran alteradas estructural y funcionalmente. La apoptosis es un

proceso f isiológico contínuo caracterizado por una muerte celular programada que no

causa fenómenos de inflamación debido a que no se expone material intracelular al

espacio extracelular, característica que preliminarmente permite establecer ciertas características bioquímicas del fenómeno (Harrington y Schultz, 2003 y Anaya et al.,

2005).

Actualmente el estudio del fenómeno apoptótico ocupa la mayoría de la investigación en

inmunología clínica debido a su altísima relevancia en enfermedades tan importante como

el cáncer, una enfermedad claramente causada por el crecimiento y supervivencia

desmesurados de ciertas poblaciones celulares (revisado por Przedborski et al., 2001).

Ha sido tal su importancia en la medicina actual que la investigación en esta área ha sido

reconocida con el premio Nobel en Medicina. El día 7 de octubre de 2002 el

estadounidense Robert Horvitz y su equipo del MIT (Massachussets Institute of

Technology) y los ingleses Sydney Brenner y John Sulton del Salk Institute for Biological

Studies (San Diego, California) y del Sanger Institute (Cambridge, Inglaterra)

respectivamente, recibieron este galardon por las investigaciones hechas en

Caenorhabditis elegans que permitieron descubrir las bases moleculares involucradas con

la apoptosis durante el crecimiento de órganos y tejidos (Harrington y Schultz, 2003). En

los capítulos posteriores se referenciarán algunos de los estudios realizados por Horvitz,

la mayoría de ellos publicados en la revista Science.

Se ha establecido que la apoptosis, en general, es un proceso genético predeterminado

que no esta solamente involucrado en la homeostasis del sistema inmune sino también en

la regulación de la f isiología celular (Herrmann y Kalden, 2003). Durante siglos la muerte

celular por apoptosis había sido observada pero solo hasta hace un siglo se comenzó a

43

comprender los mecanismos celulares y solo hasta hace un par de décadas los

fenómenos bioquímicos, moleculares y genéticos que rigen la supervivencia y muerte

celular. Los mecanismos por los cuales las células generan su propia muerte y como

luego sus restos son eliminados del entorno celular son eventos cruciales para el correcto

desarrollo y funcionamiento del organismo y de su sistema inmune. Entre estos

mecanismos se incluyen la eliminación de las células malignas o infectadas mediante la

activación de linfocitos T citotóxicos y células asesinas naturales (Natural Killers o NK por

sus siglas en inglés) y tan pronto la respuesta del sistema inmune ha pasado o en los

sitios inmuno-privilegiados como los ojos o el cerebro, la inactivación de las células

encargadas de la respuesta inflamatoria y la eliminación de las linfocitos T activados.

Dixit y Ashkenasi, autores pertenecientes al departamento de oncología molecular de la

empresa californiana Genentech publicó en el año de 1998 en la revista Science una

revisión muy interesante sobre uno de los hallazgos más signif icativos en relación al

fenómeno apoptótico: los ligandos del Factor de Necrosis Tumoral (TNF por sus siglas en inglés) que hasta ese año contaba ya con 16 miembros, casi todos sintetizados como

precursores de proteína transmembranales tipo ll o como moléculas solubles que se unen

a la superfamilia de genes de los receptores de TNF, todos ellos conocidos como

receptores de muerte o DEATH como Fas (CD95 o Apo1) o el receptor TNFR-1 (p55 o

CD120a), dos de los receptores de muerte mejor caracterizados. Al unirse a sus ligandos

respectivos, estos receptores de membrana transmiten las señales apoptóticas mediante

la interacción del dominio citoplasmático con alugunas proteínas citosólicas ricas en

Cisteína y con una extraordinaria capacidad proteolítica conocidas como caspasas (Dixit

et al., 1998). De la proteasas ricas en Cisteína que cumplen el requisito de homología

estructural y de secuencia establecido por Horvitz desde 1998, 17 proteínas han sido

asociadas con el programa de muerte celular por apoptosis y adicionalmente con el

control de la proliferación de linfocitos T así como el correcto progreso del ciclo celular

(Los et al., 2003 y Aggarw al et al., 1999). Sin embargo las caspasas no son la únicas

proteasas involucradas en el proceso de apoptosis. A propósito de este tema, el Doctor

David E. Johnson de la Universidad de Pittsburg publicó una revisión en septiembre de

2000 en Leukemia donde se recapitula la experiencia genética y bioquímica que ha

podido demostrar la existencia e importancia de las proteasas no caspasas como las

catepsinas (proteasas lisosomales), calpainas, granzimas y el complejo proteasoma en el

fenómeno de muerte celular programada (Johnson, 2000).

44

En los capítulos posteriores se revisará detalladamente algunas de las características y

algunos de los componentes más importantes del fenómeno de apoptosis para en un

capítulo posterior relacionarlo con la evidencia existente para la infección por RABV.

2.2. LA APOPTOSIS Y LA HOMEOSTASIS CELULAR La MCP consta de cuatro pasos fundamentales según Herrmann y Kalden en su libro

Apoptosis and Autoimmunity publicado en el 2003. Estos pasos son: la iniciación que

puede estar mediada por un receptor específ ico para muerte celular en unión a una

proteína ligando o mediada por mitocondria. La activación de las caspasas y por último la

ejecución, donde se incluyen los fenómenos de activación de las nucleasas y los cambios

membranales para culminar con la fagocitosis y la remoción de los cuerpos apoptóticos

(Herrmann y Kalden, 2003) como se observa de manera esquemática en la Figura 9.

Debido a que un fenómeno celular tan relevante requiere de innumerables pasos y rutas

moleculares, se ha descubierto que tanto los procesos de activación de la apoptosis como los procesos de inhibición están altamente regulados por proteínas específ icas lo que

confirma el carácter genético y la modulación ambiental de la apoptosis los cuales se ven

alterados en desordenes inmunes como el cáncer o la diabetes Mellitus tipo-l. De hecho

esta revisión realizada por Behrens en el 2001 aporta un dato muy interesante donde se

afirma que el aumento desmesurado y aparentemente epidémico de este tipo de diabetes

(donde las células pancreáticas son blanco de destrucción del sistema inmune) puede

estar asociado al aumento de las prácticas higiénicas y a la baja exposición a

microorganismos comunes por lo cual el sistema inmune se torna inusualmente sensible

(Behrens et al., 2001).

Durante mucho tiempo se han tratado de marcar las diferencias bioquímicas y

estructurales entre la necrosis y la apoptosis, y aunque la prueba estándar en el

diagnóstico de enfermedades autoinmunes caracterizadas por la apoptosis es la prueba

de TUNEL o el ensayo de tinción para las roturas de la hebra de ADN, aunque esta última

no se puede considerar específ ica para el diagnóstico de MCP. Un análisis bastante

acertado para la diferenciación entre estos dos tipos de muerte celular ha sido la

observación que tras la muerte por apoptosis no se presentan reacciones inflamatorias

pero este criterio no se puede tomar solo en el diagnóstico de apoptosis en enfermedades

infecciosas o autoinmunes.

Por otro lado, la presencia de moléculas ejecutoras y receptores tipos DEATH tampoco

garantiza la activación exclusiva de vías apoptóticas. Existen moléculas como TNF o vías

45

como la de la perforina/granzima que son sobreexpresadas tanto en procesos de necrosis

como de apoptosis, mientras que moléculas exclusivamente apoptóticas como FasL, una

proteína que se encuentra de forma soluble o anclada a membrana y cuyo receptor

específ ico es Fas/APO-1, sirven como moléculas señal para el reclutamiento de células

neutrofilas que una vez activadas causan muerte celular por necrosisd del tejido (Nabel et

a, 1998).

Figura 9. Esquema de los pasos apoptóticos. La existencia de receptores específicos para la muerte programada, como Fas (CD95+) o daños en la mitocondria vía Bax o Bak-dependiente activan los fenómenos proapoptóticos que desencadenan la activación de las caspasas, proteasas encargadas de degradar más de 100 constituyentes celulares. Esta proteólisis l idera cambios estructurales y funcionales en la célula entre los que figura la exposición sobre la superficie celular de ligandos fagocito-específicos, el colapso de la estructura nuclear y la activación de nucleasas y la inactivación de la maquinaria transcripcional y traduccional. Figura tomada de Randhawa y Afford, 2000.

Aunque la experiencia patológica hace muy difícil la diferenciación entre estos dos tipos

de muerte celular, estudios histopatológicos han permitido establecer que los linfocitos T

CD8+ son importantes ejecutores de la muerte celular, mucho más que las poblaciones

celulares constituyentes de la respuesta inmune innata como los macrófagos, células

dendríticas, células asesinas naturales y hasta los neutrófilos (Herrmann y Kalden, 2003).

46

Así, queda establecido que la consolidación de una teoría única para la apoptosis es una

tarea que requiere la disección de los componentes bioquímicos, moleculares y genéticos

exclusivos que interactuan para causar la muerte celular con la participación activa de la

misma célula que está muriendo.

Dadas las características moleculares (bioquímicas y genéticas) de la apoptosis, queda

establecido que este proceso se inicia debido a un rango amplio de señales tanto de

carácter intrínseco como extrínseco y aunque la primera impresión que el término

“apoptosis” genera se relaciona con infecciones, queda claro que esta MCP es un

fenómeno fundamental para el desarrollo, supervivencia y homeostasis del contexto

celular y no exclusivamente en episodios patológicos como cuando se subregula en el

cáncer o se sobrerregula en fenómenos degenerativos (Herrmann y Kandel, 2003). La

evidencia experimental ha revelado que la MCP es fundamental en los procesos de

maduración y funcionalidad de las poblaciones de linfocitos T y B, eliminando aquellas

células no funcionales que no expresan receptores para antígenos, receptores con muy baja afinidad o aquellas que expresan receptores que reaccionan contra el propio CMH

(para los linfocitos T) o que producen autoanticuerpos (para los linfocitos B) en un proceso

conocido como selección negativa y positiva. (Bevan et al., 1998 y Kruisbeek et al.,

1999).

De una manera similar dentro del sistema inmune maduro, la inhibición de las rutas

apopóticas fomenta la supervivencia y reproducción de una línea linfocitaria especializada

mediante la expresión de la familia de proteínas Bcl-2 antiapoptótica durante una infección

y tan pronto la infección es superada procesos apoptóticos mediados por Fas/APO-1 se

encargan de eliminar la sobrepoblación de dicha línea como lo evidenció Cory y su grupo

de investigación en 1995, donde con una estrategia in vivo de diferentes infecciones

inducidas a modelos animales, evaluaron la expresión de moléculas involucradas en la

apoptosis (Fas/APO-1) y en la supervivencia celular (Bcl-2) de los clones linfocitarios

patógeno-específ icos antes, durante y después de la infección (Cory et al., 1995). En los

linfocitos T CD4+ el fenómeno apoptótico se activa mediante la estimulación repetitiva de

sus receptores (RCT o TRC en inglés) o mediante un proceso que involucra la ausencia

de citoquinas, en el cual los linfocitos mueren por ausencia de estos factores troficos. Por

otro lado la inducción de apoptosis en los linfocitos B se induce por la estimulación el los

RCB (o BCR por sus siglas en inglés) (Pape et al., 2001 y Krammer, 2000).

Los estudios anteriores permiten poner en evidencia la íntima y compleja relación que se

abordará en un capítulo posterior: el papel de la apoptosis durante las infecciones como

47

mecanismo de defensa y de mantenimiento de la homeostasis del contexto tisular y en lo

que concierne a esta revisión, a la infección por RABV (Lafon, 2004).

2.3. RUTAS CELULARES DE ACTIVACIÓN APOPTÓTICA El gran avance en el entendimiento de la apoptosis ha venido a partir del descubrimiento

de las caspasas como las proteínas activadoras de los fenómenos de muerte celular

programada y por ende por ser también estas proteínas de acción proteolítica los blancos

para la inhibición de este proceso celular. Una vez transmitidas las señales apoptoticas

como resultado de la reacción ligando TNF-receptor DEATH ocurre una activación

mediada generalmente por autoprocesamiento de las caspasas. Sin embargo la

activación de estas proteasas ejecutoras puede provenir de mecanismos intrínsecos como

cambios de permeabilidad en la mitocondria, proceso conocido como la ruta apoptótica

dependiente de la mitocondria o ruta intrínseca. En cualquiera de los dos casos el

fenómeno apoptótico se caracteriza en estados f inales por la fragmentación del ADN cromosomal, la posterior fragmentación de la membrana citoplasmática y a diferencia del

fenómeno necrótico, la ausencia de moléculas pro-inflamatorias. Una vez la célula se ha

suicidado los procesos de limpieza de los cuerpos apoptóticos convergen con los de

limpieza de los necróticos; ambos llevados a cabo por las células dendríticas (CD) y por

los macrofagos. Las células dendríticas son células presentadoras de antígenos

profesionales y se constituyen comom la primera línea de defensa celular. Una vez

“cargadas” con el antígeno específ icos, las CD promueven la estimulación de los linfocitos

T CD4+ cooperadores y la activación de los linfocitos T CD8+ a linfocitos T citotóxicos

capaces de destruir las células infectadas (Herrmann y Kandel, 2003).

Como en muchos de los estudios recientes en biología celular de eucariotas, el nematodo

Caenorhabditis elegans ha servido como el modelo más sencillo de experimentación con

mayor homología con los humanos. Estudios realizados preeliminares en 1986 revelaron

que durante el desarrollo de este organismos 131 de las 1090 células que lo componen

morían por apoptosis y mediante el rastreo genético de organismos defectuosos para esta

característica se encontraron mutaciones en proteínas que serían conocidas como CED-3

y CED-4 (Caenorhabditis Elegans Development protein 3 and 4). Posteriormente en 1992

el mismo Horvitz identif icó una proteína (CED-9) que actuaba en pasos anteriores a las

proteínas CED-3 y CED-4 y cuya mutación causaba un exceso en la apoptosis de los

embriones de este nematodo. Lo más interesante de este estudio fue que al mutar

conjuntamente CED-3, CED-4 y CED-9 se evitaba el exceso de apoptosis causado por

48

CED-9, mostrando las características pro y antiapoptóticas de estas proteínas y trazando

a su vez las rutas por la cual la MCP se activa y se inhibe. Finalmente, el mismo Horvitz

encontró en 1998 otra de las moléculas involucradas EGL-1. La mutación y subsecuente

pérdida de función en EGL-1 generaba un aumento desmesurado en la supervivencia

celular por la falta de unión a la proteína CED-9). De este modo se planteó a CED-9

como un regulador negativo de la apoptosis (o inhibidor) el cual que une y suprime la

acción apoptótica de CED-4. Sin embargo, cuando EGL-1 se induce, se une a CED-9

evitando la unión de esta proteína con CED-4 y permitiendo su fusión con CED-3,

formando un complejo proapoptótico. Todas estas moléculas en C. elegans resultaron

tener homologías completas en organismos superiores como el hombre como se observa

en la Figura 10.

Análisis de homología f ilogenética, estructural y funcional realizados en 1996 identif icaron

a CED-3 como una caspasa y con homología con la enzima convertidota de interleukina 1

(ICE por sus siglas en inglés), la proteasa rica en Cisteína CPP32 o en otras palabras, con la caspasa 1 (Horvitz et al., 1986, 1992, 1996, 1998). Bajo este contexto y con

metodologías muy similares se inició una carrera tecnológica para el descubrimiento de

estas proteasas ricas en Cisteína de mamíferos que se conocerían con el nombre de

caspasas y que hasta el año de 2003 contaba con 14 proteínas en su lista, todas ellas

cumpliendo con un rol fundamental en el proceso de apoptosis y haciendo cada vez más

extenso y complicando el panorama de las rutas que rigen este fenómeno celular como se

observa en la Figura 11 (Herrmann y Kalden, 2003).

2.3.1. RUTA EXTRÍNSECA Como se dijo anteriormente, la activación de las rutas de MCP o apoptosis se inician por

la unión de una proteína ligando específ ica a un receptor específ ico transmembranal

conocido como receptor DEATH perteneciente a la superfamilia de genes TNF como el

que se observa en la Figura 11. Estos ligandos pueden ser activados por diferentes

agentes como: luz ultravioleta que altera el ADN, eliminación de los factores de

crecimiento en el medio o fármacos utilizados en quimioterapia (Hannun et al., 1997). Por

su parte, los receptores se caracterizan por: 1) Poseer un dominio extracelular rico en

Cisteína compuesto por tres regiones extracelulares, 2) Por estar conformados por tres

cadenas polipéptidas idénticas y 3) Por compartir características de unión y de

señalización similares. A la fecha se conocen seis diferentes receptores DEATH: Fas,

49

TNFR1, DR3, TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand) también conocido como

TRAIL-R1 o DR4, TRAIL-2 o DR5 y DR6 (Dixit et al., 1998).

Figura 10. EGL-1 es definido como una proteína proapoptótica que se une a CED-9 evitando su unión con CED-4 a la vez que fomenta la unión de esta molécula apoptótica con CED-3 para formar un complejo de activación de la apoptosis. Estudios bioquímicos similares y análisis de secuencias de ADN así como análisis traduccionales encontraron homologías en células de otros mamíferos. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003. Análisis de homología fi logenética, estructural y funcional realizados en 1996 identificaron a CED-3 como una caspasa y con homología con la enzima convertidota de interleukina 1 (ICE por sus siglas en inglés), la proteasa rica en Cisteína CPP32 o en otras palabras, con la caspasa 1 (Horvitz et al., 1986, 1992, 1996, 1998). Bajo este contexto y con metodología muy similares se inició una carrera tecnológica para el descubrimiento de estas proteasas ricas en el residuo Cisteína en mamíferos que se conocerían con el nombre de caspasas y que hasta el año de 2003 contaba con 14 proteínas en su lista, todas ellas cumpliendo con un rol fundamental en el proceso de apoptosis y haciendo cada vez más extenso y complicando el panorama de las rutas que rigen este fenómeno celular como se observa en la Figura 11 (Herrmann y Kalden, 2003).

Cada uno de estos receptores posee un dominio intracelular de 80 aminoácidos

localizados en el extremo C-terminal que funciona como un módulo de unión proteína-

proteína que reacciona diferencialmente con factores citoplasmáticos exclusivos para las

diferentes rutas del proceso apoptótico (Herrmann y Kalden, 2003).

Uno de los receptores de membrana tipo DEATH mejor caracterizados y con mayor

relevancia en la inducción de la vía extrínseca de la apoptosis es Fas, molécula

perteneciente a la superfamilia TNF/factor de crecimiento nervioso. Esta glicoproteína de

50

319 aminoácidos perteneciente al tipo l de proteínas transmembranales activa la

señalización apoptótica al unirse con su ligando natural, FasL o con anticuerpos agonistas

tanto en una célula vecina así como en la misma célula que está expresando y secretando

el ligando (efecto exocrino o autocrino, respectivamente).

Figura 11. Rutas apoptóticas establecidas e hipotéticas que involucran caspasas. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.

FasL es una proteína transmembranal tipo ll cuya forma activa es la proteína soluble.

Aunque principalmente es expresada por linfocitos T CD4+ y CD8+ activados, la mayoría

de las células modif icadas genéticamente o por una infección son capaces de expresarla

y secretarla. Después del rompimiento facilitado por metaloproteinasas, esta proteína es

clivada perdiendo su dominio de unión a membrana y se solubiliza en el medio

extracelular en forma de trímeros antes de unirse a Fas (Nagata et al., 1993). Una vez

FasL se une a Fas causa la oligomerización del mismo (Dixit et al., 1998). La estrategia

utilizada por Nagata y su grupo de colaboradores para describir las características

bioquímicas y la ubicación celular de FasL se basó en la utilización de una forma soluble

51

de su receptor (Fas) unido a la fracción cristalizable (Fc) de la inmunoglobulina humana

para su detección. Posteriormente una población celular con alta expresión de FasL fue

separada por citometría de f lujo y su ADNc fue aislado. Los análisis computacionales

revelaron que la secuencia de aminoácidos correspondía a una proteína transmembranal

tipo ll perteneciente a la familia TNF. Cuando el dominio oligomerizado de Fas es

activado por su unión con el ligando, el dominio intracelular recluta proteínas adaptadoras

como FADD (Fas Associated DD) que además de tener un dominio C-terminal similar al

del receptor DEATH (en este caso Fas) tiene un dominio de interacción proteína-proteína

en su extremo N-terminal conocido como el dominio ejecutor de muerte. En un

mecanismo que pareciera simular un rompecabezas, el dominio ejecutor de muerte de

FADD se une a un dominio ejecutor de muerte o también conocido como predominio de la

procaspasa 8 como se observa en la Figura 12. Esta unión forma el complejo DISC

(Death Induced Signalling Complex por sus siglas en inglés) o complejo de señalización

inducido por muerte que promueve la autocatálisis de la procaspasa 8 a su forma activa o caspasa 8, paso esencial de señalización que desencadena los procesos de proteólisis y

nucleólisis (Hellbardt et al., 1996) que continúan con la activación de las otras proteasas

corriente abajo como la caspasa 3 cuyo blanco proteolítico es la proteína inhibidora de la

enzima ribonucleasa activada por caspasa o CAD que se encuentra junto con la ICAD o

inhibidor de la enzima ribonucleasa activada por caspasa como un complejo inactivo cuya

activación como endonuucleasa –y por ende su entrada al núcleo y fragmentación del

ADN que conduce a la inminente muerte celular- depende del efecto proteolítico de la

forma activa de la procaspasa 3 (Nagata et al., 1998 y 1999 en Nature) mostrando la

relevancia que la forma activa de la caspasa 3 tiene como marcador molecular de

inminente MCP.

Por otro lado y a diferencia de Fas, los receptores TNFR1 y TNFR2 no poseen el dominio

citoplasmático de 80 aminoácidos característico de esta familia de proteínas aunque

TNFR1 reacciona con FADD bajo un mecanismo similar al de Fas. En lugar del dominio

citoplasmático poseen un mecanismo alternativo que involucra una proteína de

interacción con el receptor del tipo Serina-Treonina kinasa que promueve la apoptosis.

Adicionalmente estos receptores son algo más promiscuos que sus homólogos, pues por

ejemplo, TNF-a interactua tanto con TNFR1 (p55) como con el TNFR2 (p75) para

estimular multiples respuestas críticas en la célula receptora (Seed et al., 1999 y Dixit et

al., 1998).

52

Estos datos permiten inferir la compleja naturaleza del fenónemo apoptótico pues rutas

independientes a los receptores DEATH y/o sus moléculas ejecutoras actúan en paralelo

a los mecanismos DEATH-dependiente dependiendo del contexto celular y de la señal de

estrés que originó la señal apoptótica. Esto hace relación a los fenómenos que

promueven la supervivencia celular mediante el bloqueo de los dominios ejecutores de los

receptores DEATH.

Figura 12. Activación de la vía extrínseca de la apoptosis mediada por FasL y su receptor DEATH Fas (CD95). La unión de FasL promueve la oligomerización de Fas y su activación. Una vez activado, el dominio de muerte intracelular recluta a la proteínad de señalizació FADD y a su vez esta activa al complejo DISC donde la procaspasa 8 es transformada por autolsis en la proteasa caspasa 8. A su vez esta activa a la caspasa ejecutora o caspasa 3 cuyo blanco es el inhibidor de la endonucleasa CAD, enzima encargada de fragmentar el ADN como pasa crítico de la apoptosis. Adicionalmente está c-FLIP, una proteína homóloga a la caspasa 8 pero a diferencia de esta proteasa, encargada de fomentar la supervivencia celular mediante la activación de NF-kB promovida por la unión con molécular como TRAF1 y TRAF2. Figura tomada de Ralph Budd, 2002.

Uno de estos fenómenos se debe a la presencia una proteína de 55 KDa conocida como

c-FLIP (cellular Fas-Associated DD-Like Interleukin-1-converting enzyme inhibitory protein

53

por sus siglas en inglés) que es un homólogo enzimáticamente inactivo de la caspasa 8,

que se une mediante sus dos dominios ejecutores de muerte a FADD por un lado y con la

caspasa 8 por el otro. Esta unión bloquea la fusión FADD-caspasa 8 y por ende toda la

señalización apoptótica, promoviendo a su vez la supervivencia celular, como se observa

en la Figura 12 (Steiner et al., 1997). Uno de los mecanismos más efectivos de evasión

de la respuesta inmune y de subversión celular presente en los virus se basa en la

presencia de una proteína homológa conocida como v-FLIP. En estos casos, cuando la

apoptosis vía receptores DEATH está alterada, la célula contraresta este efecto mediante

la inducción de vías apoptóticas por caspasas asociadas a la mitocondria o mediante la

inducción de proteínas proapoptóticas pertenecientes a la familia Bcl-2 (Tomaselli et al.,

1998).

2.3.2. RUTA INTRÍNSECA

También conocida como la ruta apoptótica asociada a mitocondria, esta vía es crítica para

la correcta regulación de los fenómenos de apoptósis. Partiendo de las características

f isiológicas de la mitocondria como sitio del metabolismo oxidativo en los eucariota y

como el organelo proveedor de ATP mediante fosforilación oxidativa y citocromo c, es

correcto pensar que las características altamente oxidativas de este organelo están en

relación con el desecadenamiento de la respuesta apoptótica. La apoptosis vía 1 o

extrínseca se da en presencia de caspasa 9 y la apoptosis vía 2 o intrínseca se da en

presencia de caspasa 8. Tomaselli y su grupo de investigación identif icaron dos tipos celulares que utilizan el mecanismo de señalización apoptótica mediada por Fas de dos

formas diferentes. Las células tipo l se caracterizan por activar la caspasa 8 rápidamente

seguido por una activación de las caspasa 3 después de la unión Fas-FasL. Por otro lado,

las células tipo ll sufrieron la activación tanto de caspasa 8 y caspasa 3 aproximadamente

en 60 minutos después de la unión Fas-FasL. Sin embargo, ambos tipos celulares se

caracterizan por desencadenar fenómenos de pérdida del potencial transmembranal de la

mitocondria, aunque solo en las células tipo ll la sobreexpresión de Bcl-2 y Bcl-xL bloquea

la caspasa 8. Estos resultados permiten inferir que, aunque las vías apoptóticas

convergen para permear la membrana mitocondrial lo hacen aproximandose por caminos

diferentes donde el tipo l es dependiente de caspasa 8 y la activación de DISC mientras

que en el tipo ll la apoptosis parece ser independiente del complejo DISC (Tomaselli et al.,

1998).

54

Sin embargo la evidencia existente permite agregar otras funciones a la caspasa 8 dentro

del contexto apoptótico. En agosto del año de 1998 la revista Cell publicó un estudio muy

elegante realizado por el Doctor Jiangang Yuan y su grupo de trabajo de la Escuela de

Medicina de la Universidad de Harvard (Boston, Massachussets) donde por primera vez

se reportó a BID, una proteína de la familia Bcl2 proapoptótica, como un substrato para la

caspasa 8 en la ruta de señalización vía Fas. Existe una forma inactiva de BID que se

encuentra soluble dentro del citoplasma. Sin embargo la proteólisis mediada por caspasa

8 genera una proteína BID truncada (tBID) que es translocada a la membrana

mitocondrial donde su función es servir de proteína señalizadora de eventos apoptóticos

entre ellos el agrupamiento de la mitocondria alrededor del núcleo así como la liberación

de citocromo c (en un evento independiente de caspasas donde están involucradas las

proteínas Bak y Bax) y por ende la pérdida de potencial de membrana (delta Ψ m) y los

efectos f isionómicos que este hecho conlleva (contracción celular y condensación

nuclear). Estos dos procesos se observan de manera esquemática en la Figura 11.

Adicionalmente se comprobó que la coexpresión de BclxL inhibió todos los cambios de

tipo apoptótico inducidos por tBID (Yuan et al., 1998). Junto con BID la ceramida es otro

de los factores involucrados en la liberación de citocromo c de la mitocondria. Siguiendo

los parámetros generales no específ icos las ceramidas promueven la liberación de

citocromo c oxidándolo. Una vez liberado se reduce signif icativamente el consumo de

oxígeno, el delta psi m y la retención de iones bivalente de calcio (Rocha et al., 1999).

Una vez la mitocondria ha sufrido cambios en su membrana debido a moléculas como

tBID o las ceramidas, se liberan moléculas como citocromo c, AIF y Smac/DIABLO que

son las proteínas encargadas de desencadenar el fenómeno apoptótico. Por su parte, la

liberación de citocromo c es conocido por ser el paso limitante para la formación del

apoptosoma. Esta molécula de origen mitocondrial junto con el factor de apoptosis por

caspasas (Apaf1), la deoxiadenosina trifosfato (dATP) y la procaspasa 9 forman este

cuerpo proapoptótico. Específ icamente, una vez se libera el citocromo c del espacio

intramitocondrial y entra en contacto con Apaf 1 promoviendo la multimerización y

activación de esta molécula adaptadora. Dicha activación lleva al reclutamiento, lisis y

activación dATP-dependiente de la procaspasa 9 cuya función es activar la procaspasa 3, punto de convergencia de esta ruta con la ruta extrínseca que termina por desencadenar

el evento f inal de la apoptosis: la fragmentación del ADN nuclear (Harrington y Schultz,

2003).

55

Otros de los factores que se liberan debido al cambio de potencial y de permeabilidad de

la mitocondria son: la f lavoproteína conocida cmo AIF (Apoptosis Inducing Factor por sus

siglas en inglés), una proteína de origen nuclear similar a las oxidoreductasas bacterianas

y Smac/DIABLO (Smac en Humanos, DIABLO en Murinos), una proteína que elimina el

efecto inhibitorio sobre las caspasas que tienen las IPAs (IAPs por Inhibitor of Apoptotic

Proteins), una famila de proteína involucradas en la supervivencia celular cuya expresión

es promovida por el factor nuclear KB dentro del núcleo de la célula. Shi y su grupo de

investigación en la Universidad de Princeton (New Jersey, EEUU) publicó en Nature en

agosto de 2000 un interesante artículo describiendo las bases estructurales (mediante

cristalografía) y bioquímicas (mediante mutaciones dirigidas) de la activación apoptótica

mediada por Smac/DIABLO, la cual no solo se basa en activar proteolíticamente a la

procaspasa 3 sino también en modular la actividad enzimática de la caspasa 3 mediante

la interacción con las IPAs descrita anteriormente (Shi et al., 2000).

Curiosamente, más no en contraposición a los fenómenos y a la ruta descrita

anteriormente, citopatológicamente se ha observado que durante los fenómenos de

apoptosis la mitocondria permanece estructuralmente intacta –así existan cambios

apreciables de potencial, permeabilidad y bioquímicos- y no sufre los fenómenos de

contracción y destrucción que si sufren la membrana citoplasmática y nuclear (Wyllie,

1986). Otras moléculas importantes en el fenómeno apoptótico descrito anteriormente, y

que se revisarán con más cuidado en un capítulo posterior, son las proteínas de la familia

Bcl-2 pro y anti-apoptóticas que se localizan en la membrana exterior de la mitocondria y que juegan un papel fundamental en la delicada regulación de la apoptosis permitiendo o

previniendo la liberación de citocromo c. Por esta razón han sido señaladas como las

únicas proteínas con la capacidad de bloquear cualquier señal intra o extracelular que

vaya dirigida a desencadenar la apoptosis (Reed et al., 1994).

2.4. PROTEÍNAS PRINCIPALES EN LA APOPTOSIS 2.4.1. ASPECTOS GENERALES DE LAS CASPASAS En los capítulos anteriores se revisaron las características y procesos generales de la

apoptosis. En estos capítulos se mirará con más profundidad las familias de proteínas

más importantes y mejor estudiadas dentro del fenómeno de inducción y regulación de la

muerte celular programada.

56

Figura 13. Esquema general y simplificado de las vías apoptóticas y las proteínas involucradas. La vía extrínseca mediada por Fas y otros receptores tipo DEATH o receptores de muerte pertenecientes a la superfamilia TNF. La vía intrínseca mediada por las caspasas asociadas a la mitocondria. Con las caspasas 8 y 9 respectivamente, las dos vías convergen en la activación de la caspasa ejecutora o caspasa 3 que es la proteasa encargada de activar a la endonucleasa CAD mediante la proteólisis de su inhibor ICAD. Figura tomada de Harrington y Schultz, 2003 Aunque no existen criterios f ijos que definan la apoptosis, existen ciertas características

morfológicas que permiten diferenciarla de la necrosis. Entre estas se encuentran:

condensación de los cromosomas y de los organelos citoplasmáticos, fragmentación del

57

núcleo, decrecimiento del volumen citoplasmático, fusión del retículo endoplasmático con

la membrana celular y f inalmente la fragmentación de toda la célula en lo que se conoce

como “cuerpos apoptóticos” que son engolfados por las células circundantes para

posteriormente ser eliminados del espacio extracelular. Acompañando a estos cambios

morfológicos se presentan algunos indicadores subcelulares como el cambio de potencial

de membrana en la mitocondria y la exposición de fosfatidilserina en la membrana celular

externa. Sin embargo, todos estos cambios no son más que el resultado de la proteólisis

de substratos específ icos que es llevada a cabo por las caspasas. Algunas de estas

enzimas cumplen funciones diferentes a las apoptóticas durante la estimulación y

proliferación de linfocitos T vías Fas (para mayor información sobre los papeles no

apoptóticos de las caspasas revisar Budd et al., 1999), su principal se encuentra en

regular los procesos de MCP (Herrmann y Kalden, 2003). Algunos de estos substratos

son presentados en la Tabla 2.

Las caspasas se encuentran entre las proteínas que poseen una de las mayores

especif icidades entre las proteasas celulares debido a que siempre llevan a cabo su lisis

hacia el lado carboxil de los residuos de Aspartato. Adicional a esta característica estas

proteínas tienen la cualidad de tener dentro de su sitio catalítico posiciones conservadas y

específ icas para residuos de Cisteína, Glicina e Histidina, como lo reporta Salvesen y su

grupo en Cell Death and Differentiation en el año de 1999 (Salvesen et al., 1999).

Estructuralmente, las caspasas se encuentran como zimógenos monoméricos inactivos

solubles en el citosol que consisten de un predominio en su extremo N-terminal, una subunidad larga y una subunidad pequeña. El sitio de autoprocesamiento o de

procesamiento mediado por otras caspasas se da exactamente en los residuos de

Aspartato presentes en cada extremo. Seguido a este evento se da la formación de la

forma activa heterotetramérica consistente de dos subunidades largas y dos cortas con

dos sitios catalíticos diferentes. El procesamiento y ensamblaje se muestra

esquemáticamente en la Figura 14 (Raybuck et al., 1994 en Nature).

Los prodominios han sido caracterizados como las estructuras responsables de la

interacción con las proteínas adaptadoreas (como Apaf1 o FADD), y dependiendo de su

tamaño se ha observado que inteaccionan con Dominios Ejecutores de Muerte (DDE por

sus siglas en inglés) o con Dominios de Reclutamiento de Caspasas (CARD),

característica que en gran mediada influencia la ruta de activación de la apoptosis y la

posición de cada caspasa dentro de dicha ruta; donde las caspasas con prodominios

58

largos –como las caspasas 1, 2, 4, 5 y 8 a 13- son consideradas como iniciadoras y

aquellas con prodominios cortos –como las caspasas 3, 6, 7 y 14- son consideradas como

las ejecutoras del programa de muerte celular (Herrmann y Kalden, 2003).

Tabla 2. Principales Substratos Intracelulares de las Caspasas

Inv olucrados en la Reparación Celular Poli-ADP Ribosa Polimerasa Proteína quinasa dependiente de ADN MDM2 Inv olucrados en el Control del Ciclo Celular Retinoblastoma Quinasas dependientes de ciclinas Oncongen c-abl Inv olucrados en la Traducción de Señales PAK Inv olucrados en la Integridad Estructural de la Célula Lamininas Fodrina Gelsolina Actina

Tabla tomada de Anaya et al., 2005.

2.4.1.1. CASPASA 8 Caspasa 8 y la ruta de señalización mediada por Fas (CD95). Al igual que para los

capítulos referentes a las proteínas rabdovirales, estos capítulos iniciarán con un subtítulo

donde se resalta la relevancia de la molécula en revisión. Perteneciente a la familia de

receptores TNF o receptores DEATH, Fas (APO1 o CD95) es una proteína transductora

de señales que se activa tras su unión a FasL como se explicó en capítulos anteriores. La

asociación con la caspasa 8 se debe a que solo el procesamiento del complejo DISC

mediado por Fas activa los zimógenos de caspasa 8 (Dixit et al., 1998). Dependiendo del

contexto celular, el mecanismo de señalización mediado por la caspasa 8 toma dos vías

diferentes como se explicó en un capítulo anterior: la vía de las células tipo l (dependiente

de DISC) y la vía de las células tipo ll (independiente de DISC). La vía dependiente de

DISC resulta en la activación de la caspasa 3; mientras que en la variación de esta

cascada, la caspasa 8 corta y activa a la proteína BID que se encarga de la formación del

poro mitocondrial vía Bak o Bax.

59

Figura 14. Procesamiento y ensambleje general de las caspasas. Los homodímeros inactivos se componen de un predominio, una subunidad larga y una pequeña. El autoprocesamiento o procesamiento mediado por otras caspasas genera la fomación de un heterotetrámero compuesto por dos subunidades largas y dos pequeñas con dos sitios catalíticos diferentes. El sitio de procesamiento se caracteriza por poseer un residuo específico de Aspartato. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.

Así, aunque la activación apoptótica mediada por la mitocondria puede ocurrir en los dos

tipos celulares, en el tipo l generalmente ocurre por la vía estrictamente extrínseca

(dependiente de CD95). Regresando al mecanismo de acción de la caspasa 8, un trabajo

muy extenso realizado en agosto de 1998 por Davida Wallach y su grupo de

colaboradores del Instituto Weizman (Rehoboth, Israel) presentado en Immunity, reveló el

modelo linear de activación extrínseca de la apoptosis dependiente de caspasa 8

mediante la utilización de ratones knock out o nulos (caspasa 8 -/-) para esta proteasa. A

diferencia con ratones nulos para Fas, TNFR1, TNFR2 o BID los cuales se desarrollaban

normalmente y cuyos fenómenos apoptóticos revelaban la sobreexpresión de caspasa 8,

los resultados con este modelo nulo permitieron interpretar que esta caspasa es

fundamental para cualquier proceso de apoptosis, tanto por la señalización mediada por

receptores DEATH como por la ruta que involucra la liberación de citocromo c

(dependiente de BID). Continuando con las pruebas que han dado validez a este modelo,

en este mismo estudio se lograron ratones nulos para la molécula adaptadora de la

60

caspasa 8, FADD bajo el mismo sistema de mutagénesis dirigida. Los resultados

mostraron que el fenotipo de los ratones FADD-/- era bastante similar al de los ratones

caspasa 8 -/-, caracterizados por la letalidad embrionaria (Wallach et al., 1998).

Mediante las mismas estrategias de ratones nulos para Fas, para otros receptores

DEATH, para FADD y para la misma caspasa 8, se ha podido determinar el papel de esta

proteasa en la regulación de otros fenómenos complejos como la selección negativa de

las poblaciones linfocitarias en el timo. Los resultados han podido esbozar el panorama

que rige este fenómeno como un proceso delicadamente balanceado entre una apoptosis

parcial y una supervivencia parcial muy pronunciada. Por una parte, ratones nulos para

Fas, TNFR1 y TNFR2 mostraron procesos de eliminación normales de los timocitos

autoreactivos (Boehmer et al., 1992), postulando que el proceso de desarrollo dentro del

timo es independiente de la vía extrínseca; mientras que ratones nulos para FADD

mostraron procesos acelerados de selección negativa y una proliferación desmesurada en

el estadío de diferenciación CD4- y CD8- a CD4+ y CD8+ (Strasser et al., 1998 y Winoto

et al., 2001) permitiendo establecer que los fenómenos de diferenciación linfocitaria en la

periferia son dependientes de los receptores DEATH y de la vía extrínseca. Estas

características de la vía regulada por la caspasa 8 y su molécula adaptadora FADD

permite esclarecer muchos de los fenómenos que rigen patologías tan complejas como

ciertos tipos de cáncer y los desordenes autoinmunes.

2.4.1.2. CASPASA 3 Caspasa 3 o Caspasa Ejecutora. Como se ha venido resaltando a través de estos

capítulos, la caspasa 3 es considerada como el “punto de no retorno” de la respuesta

apoptótica. Ubicada en la posición central esta proteasa es conocida por ser la única

caspasa esencial para que el proceso de apoptosis se lleve a cabo totalmente, debido a

que a ella convergen tanto la ruta extrínseca mediada por la caspasa 8, como la ruta

intrínseca mediada por la caspasa 9 (Harrington y Schultz, 2003). La procaspasa 3 es

activada por: la caspasa 3, la caspasa 8, la caspasa 9, la caspasa 10, la proteína

activadora de proteosoma CPP32, la granzima B entre otras. Una vez activada la forma

activa o caspasa 3 se encarga de activar a la procaspasa 6 y la 9, así como a proteínas

como la DNA-PK, PKCy, PARP, D4-GDI, el elemento de respuesta a esteroides, ICAD,

etc. A nivel de genética molecular, debido a fenómenos de unión diferencial (splicing) del

ARNm, se traducen en todos los tejidos humanos una forma completa y una caspasa más

61

corta conocida como caspasa-3S que parece proteger a las células de la apoptosis

mediada por la inhibición del proteosoma (Yuan et al., 2002).

Sin embargo, aunque la función de la caspasa 3 esta bastante clara en los fenómenos

apoptóticos y de maduración de las poblaciones linfocitarias, recientemente se ha

establecido que existen mecanismos de compensación que soportan la ausencia de la

caspasa 3 mediante la sobreexpresión de caspasas alternativas como la caspasa 6 y la

caspasa 7 (Flavell et al., 2000). En el contexto de desarrollo de las subpoblaciones de

linfocitos T, la caspasa 3 parece no tener gran influencia como lo demostraron estudios

donde se inhibió la acción de esta proteasa mediante la adición del inhbidior de caspasas

zVAD a cultivos de primarios de timocitos murinos. Sin embargo en este mismo estudio

se probó que el desarrollo correcto depende de otras proteínas como p53 y la proteína

asociada a la ruta intrínseca de la apoptosis, Bcl-2. En este trabajo se reportó que ni la

caspasa 1 ni la caspasa 3 son esenciales para el proceso de apoptosis espontánea de

timocitos (STA por sus siglas en inglés) aunque se activen durante este (Glant et al.,

2000). Adicionalmente en otro estudio, utilizando la enterotoxina estafilococia A en

ratones caspasa 3-/- se encontró una respuesta inmune normal en cuanto a la

proliferación de los linfocitos T específ icos durante la inoculación del antígeno bacteriano,

sin embargo al momento de reducir la población linfocitaria cuando el antígeno ha sido

neutralizado completamente, los índices de apoptosis no son tan eficientes como en los

ratones silvestres (Herrmann y Kalden, 2003).

2.4.1.3. CASPASA 9

Activación mitocondrial y formación del Apoptosoma. En los capítulos anteriores se

han descrito de forma breve algunos estudios que han permitido conocer más a fondo los

mecanismos y fuciones por los cuales y de que forma las caspasas 8 y 3 activan las rutas

apoptóticas durante procesos de desarrollo o infección. En el mismo estudio donde se

describió por primera vez a BID como substrato de la caspasa 8 y como miembro de la vía

apoptótica dependiente de mitocondria, los resultados mostraron indicios sobre la

relevancia en apoptosis de la caspasa 9. A estos mismos extractos celulares -de

crecimiento normal- se les adicionó dATP. Sorprendentemente la adición de esta

molécula aceleró los procesos de activación de la caspasa 3 y la subsecuente

fragmentación del ADN (Yuan et al., 1998). Análisis bioquímicos posteriores realizados

por Gabriel Nuñez y su grupo de investigación de la Universidad de Michigan permitieron

62

establecer que el reclutamiento y activación de la procaspasa 9 se da exclusivamente en

la presencia de un complejo formado por la proteína Apaf1 y citocromo c durante la

activación de la vía intrínseca, y que este complejo solo se forma como resultado de

hidrólisis de dATP. Mediante la utilización de ADNc identif icaron la proteína Apaf-1 de

1248 residuos con dominios para la hidrólisis de ATP (ATPasa) que mediante la hidrólisis

de dATP se unía al citocromo c para el reclutamiento y procesamiento de la procaspasa 9.

Adicionalmente se comprobó que la activación de la caspasa 9 genera la señal para el

reclutamiento y procesamiento de la procaspasa 3 en el proceso de inducción de la

apoptosis. A partir de la interpretación de estos resultados ellos proponen el modelo que

se presenta en la Figura 15 (Nuñez et al., 1999 en The EMBO Journal).

Figura 15. Mecanismo de formación del apoptosoma y activació de la procaspasa 9. La hidrólisis de dATP y la unión de citocromo c genera cambios conformacionales en Apaf-1 que le dan la capacidad de oligomerizarse. Posterior a su dimerización adquiere la capacidad de reclutar y procesar a la procaspasa 9. Una vez activada, la caspasa 9 inicia la formación del apoptosoma mediante el reclutamiento y activación de la procaspasa 3 y posiblemente la procaspasa 7. Modelo propuesto y Figura tomad de Nuñez et al., 1999.

Aunque generalmente las caspasas poseen dominios autocatalíticos, el procesamiento de

la procaspasa 9 no incrementa su capacidad catalítica. A diferencia de las demás

caspasas, el requerimiento para activarse se basa fundamentalmente en su asociación

con sus proteínas cofactores: Apaf-1 y citocromo c. Estas tres proteínas juntas forman

una holoenzima como se muestra en la Figura 15 conocida como el apoptosoma. (Mak et

al., 1998). En 1999 Rodriguez y Lazebnik encontraron que la actividad proteolítica de la

caspasa 9 en complejo con Apaf-1 era varios ordenes de magnitud mayor que la de la

caspasa libre, proponiendo a Apaf-1 como el regulador alostérico de la subunidad

catalítica caspasa 8. Además en este mismo estudio corroboraron la importancia de la

dATP como molécula inductora de la formación del complejo (Rodríguez y Lazebnik,

1999). Así, ensayos de TUNEL para ratones Apaf-/- y/o Caspasa 9-/- muestran una

ausencia total de apoptosis inducida por la vía intrínseca o dependiente de la mitocondria

63

en conjunto con una proliferación maligna de células post-mitóticas con un fenotipo muy

similar al que presentan los ratones Caspasa 3-/- –con malformaciones cerebrales y

letalidad embrionaria- pues de hecho, la ausencia de caspasa 9, estando corriente arriba

en la cascada enzimática, conlleva a la no acitivación de la caspasa 3 (Flavell et al.,

1998).

Sorprendentemente y en contraste con el efecto crítico que tiene la caspasa 9 en los

procesos de apoptosis inducida dependiente de mitocondria, el desarrollo linfocitario en

ratones nulos para Apaf-1 y/o para Caspasa 9 es normal. Adicionalmente, al someter

estos modelos (Apaf-1 y Caspasa 8 -/-) a estímulos apoptóticos que dañan la integridad

mitocondrial se observa que son completamente resistentes a la apoptosis pero, al

someterlo a estímulos que involucran la activación de la vía Fas son igual de susceptibles

que sus parentales silvestres. Estos resultados permiten establecer que la vía por la cual

se lleva a cabo el desarrollo, maduración y regulación de la proliferación de los linfocitos

T fuera del timo involucra al menos en parte a los receptores tipo DEATH y es por ende

independiente de la caspasa 9 y Apaf; hipótesis que se relaciona con lo establecido para

la ruta regulada por la caspasa 8 y por la proteína adaptadora FADD (Flavell et al., 1998).

Sin embargo, un estudio posterior parece ir en contra de lo que han establecido los

modelos de Flavell y su grupo. Mediante la utilización de ratones knock out (nulos) para

Apaf-1 y para Caspasa 9 se observó que los fenómenos de apoptosis que regulan la

selección negativa de linfocitos inmaduros dentro del timo se veía afectada como

consecuencia de un papel putativo de estas dos proteínas corriente abajo de la ruta de apoptosis dependiente de p53 (Low e et al., 1999). Es bien conocido que p53 puede

promover la apoptosis en respuesta a la expresión de oncogenes durante la mitosis.

Igualmente, durante el proceso de maduración de los linfocitos T en el timo el factor de

transcripción E2F1 controla la expresión de p53 para la eliminación de las células

autoinmunes (DeGregori et al., 1999). Lo realmente interesante del trabajo de Low e y su

grupo fue que los resultados mostraron una gran similitud en el desarrollo de hiperplasia

en el timo tanto en los ratones nulos para p53, como para Apaf 1 o para caspasa 9.

Finalmente y con la intención de introducir el próximo capítulo, la evidencia ha mostrado

que la vía de activación mitocondrial de la apoptosis no está controlada exclusivamente

por la caspasa 9 y Apaf. La existencia de la familia Bcl-2 –que comprende miembros pro

y antiapoptóticos- ha revelado que la vía de MCP dependiente de mitocondria puede estar

regulada de una manera más fuerte por estas proteínas. Ratones deficientes para la

64

proteína antiapoptótica Bcl-2 presentan letalidad postnatal pero con un desarrollo

linfocitario inicial regular. En contraste los ratones deficientes para Bcl-xS (proapoptótica)

y para Bcl-xL (antiapoptótica) sufren un daño apoptótico neuronal y linfocitario muy

marcado que les causa la muerte en el estado embrionario (Fujii et al., 1995). Por otro

lado, la ausencia del otro miembro de la familia, Bim (proapoptótico) conlleva al aumento

en linfocitos inmaduros, a hiperplasia y a desarrollar un síndrome autoinmune (Strasser et

al., 1999). Si se comparan los efectos generados por la ausencia de la caspasa 8 y Apaf

1 con los generados por la ausencia de los miembros de la familia Bcl-2, claramente se

observa que la apoptosis vía mitocondrial no es un evento que dependa de la activación

de la procaspasa 9 y que por el contrario las moléculas de la familia Bcl-2 juegen un papel

más importante en este fenómeno.

2.4.2. PROTEÍNAS Bcl-2 Como se introdujo en el capítulo anterior, las proteínas del tipo Bcl-2 son una familia de

factores con actividad tanto pro como antiapoptótica que comparten características

f ilogenéticas y genéticas, funcionales y estructurales (ver Figura 17) que les permiten

agruparse en una gran familia así sus funciones antagónicas, como se observa

esquemáticamente en la Figura 16.

Figura 16. Diagrama esquemático representativo de la familia de proteínas Bcl.2. La homología entre estas proteínas se conocen como BH (Bcl-2 Homology) mientras que el dominio transmembranal que también comparten se conoce como TM (Transmembrane). Figura tomada de Packham y Stevenson, 2005.

Las proteínas de la familia Bcl-2 se caracterizan por la presencia de hasta cuatro

secuencias cortas de menos de 20 residuos con altísima homología y que son conocidas

65

como dominios de homología Bcl-2 (BH por sus siglas en inglés), así el contenido total de

aminoácidos muestre una homología casi nula. A la fecha se han descrito más de 20

miembros que con el f in de facilitar su estudio se han dividido en tres subfamilias con

base en características funcionales y estructurales, tal como se observa en la Figura 16.

La subfamilia anti-apoptótica esta conformada por Bcl-2 y Bcl-xL y se caracterizan por

poseer los cuatro dominios BH (BH1 a BH4) así como por Mcl-1 que aunque está

involucrada en fenómenos de supervivencia celular no presenta el dominio BH4 clásico

que sí comparten Bcl-2 y Bcl-xL.. En el dominio BH4 parece residir toda la actividad que

fomenta la supervivencia. Este dominio tiene la propiedad de unirse a proteínas no

pertenecientes a la familia Bcl-2 incluyendo calcineurina, una fosfatasa dependiente de

calcio involucrada en la activación de linfocitos T mediando la sobreexpresión de CD4 en

la superficie celular.

Figura 17. Estructura tridimensional de la estructura general de las proteínas pertenecientes a la famila Bcl-2. En esta figura se muestra específicamente la proteína antiapoptótica Bcl-xL con sus tres de sus cuatro dominios BH así como el dominio de unión a Bak, la proteína encargada de inhibir su función antiapoptótica. Figura tomada de Packham y Stevenson, 2005.

Por otro lado estan las proteínas pro-apoptóticas como Bax, Bak, Bok, Bim, Bad y Bid de

las cuales las tres primeras conforman la subfamila conocida como multidominio y

caracterizada por la presencia de BH1, BH2 y BH3; mientras que las tres últimas son la

subfamilia que solo posee BH3. El dominio BH3 ha probado ser el responsable de la

66

liberación de citocromo c del espacio intramembranal así como de la unión a estructuras

lipídicas conocidas como rafts involucradas en mecanismos de señalización y tráfico de

proteínas.

Un estudio realizado por Ayllon y su grupo de investigadores demostró mediante técnicas

de inmunocoprecipitación y microscopía confocal que una forma truncada de la proteína

Bad -constituída únicamente por su dominio BH3- tenía la propiedad de unirse a estos

rafts lipídicos en cultivos celulares solamente bajo la estimulación con IL4 dando como

resultado la inhibición de la apoptosis. Estos resultados permitieron concluir que existen

vías alternativas de regulación apoptótica dependiendo del contexto celular y del tipo de

señalización de estrés que la célula reciba (Ayllon et al., 2002); en el contexto de Bad,

evitando que esta proteína se una a Bcl-2 e inhiba cierto tipo de respuestas

antiapoptóticas. Adicionalmente, un estudio realizado por Cottin en 2002 reveló que no

solo moléculas pertenecientes a la famila Bcl-2 tenían la capacidad de ser reguladas por

la acción de los rafts lipídicos. También el dominio intracelular del receptor TNF-a (CD120

o TNFR1) posee secuencias específ icas que son reconocidas por estos rafts y cuya

interacción controla la activación de la apoptosis vía extrínseca (Cottin et al., 2002).

Adicionalmente algunas de las proteínas Bcl-2 poseen un dominio transmembranal en su

extremo C-terminal que es el responsable de su localización celular.

Historicamente, la proteína Bcl-2 humana (homóloga a la ya descrita CED-9 en

C.elegans) fue identif icada y descrita como el primer protooncogen hace ya 20 años; su

función es proteger a las células del fenómeno de la apoptosis. Mediante una estrategia estándar de obtención del ADNc del gen bcl-2 fusionado a una inmunoglobulina debido a

la translocación conocida como t(14:18) que solo se presenta en algunos linfomas

foliculares de los linfocitos B, se lograron describir acertadamente algunas de las

características estructurales y funcionales de esta proteína. La translocación a la que se

hizo referencia anteriormente fusiona el marco de lectura abierta del gen bcl-2 con

algunas secuencias reguladoras de las imununoglobulinas causando la sobreexpresión de

la proteína Bcl-2 intacta, fenómeno muy apropiado para la obtención de ADNc a partir de

los mensajeros de ARN (Sklar et al., 1986). Tanto en los mamíferos como en C.elegans,

Bcl-2 se encuentra localizada generalmente sobre la membrana exterior de la mitocondria,

característica que parece tener mucha relación con la liberación de citocromo c y la

regulación apoptótica de la vía intrínseca (o dependiente de mitocondria), pero también –

por razones que hasta el momento no han sido aclaradas- es usual hallarla en la

67

membrana del retículo endoplasmático o sobre la membrana de la membrana nuclear,

como lo presenta la revisión hecha para Science por Cory y Adams en 1998 (Cory y

Adams, 1998). A raiz del descubrimiento de Bcl-2 y en virtud que el fenómeno apoptótico

estaba siendo descrito de manera general como una delicada cascada enzimática, un año

más tarde fue descrita la primera proteína proapoptótica asociada a Bcl-2: Bax (Bcl-2

Associated protein X ). Esta proteína promotora de muerte celular, así como las otras

pertenecientes a esta familia, actúan de forma concomitante formando heterodímeros y

ocasionalmente homodímeros. Estudios más profundos han permitido establecer que el

mecanismo por el cual estas proteínas sufren el fenómeno de heterodimerización esta

gobernado por una titulación funcional, sugiriendo que la concentración relativa de las

diferentes proteínas de esta familia en un evento celular dado, es la clave para la

activación de la apoptosis o por el contrario de la supervivencia celular (Harrington y

Schultz, 2003). Una de las características funcionales más importantes de las proteínas

Bcl-2 es que su regulación está mediada por citoquinas y otro tipo de moléculas de

señalización y se puede dar durante cualquier paso dentro del fenómeno de inducción de

la MCP. Una vez se han iniciado los fenómenos citopatológicas característicos de la

apoptosis como la fragmentación y contracción de la membrana citoplasmática y nuclear y

la fragmentación del ADN se ha probado que Bcl-2 es capaz de bloquearlo por completo

mediante la regulación de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la inhibición de

la liberación de la proteína AIF y de citocromo c como resultado de un control sobre el

tráfico del dATP (Korsmeyer et al., 1990 y Cai et al., 1997). Sin embargo, también es bien conocido que junto con Apaf-1 y su cofactor citocromo c, AIF y dATP son fuertes

inductores de la vía intrínseca de la apoptosis. Interesamente se ha visto que moléculas

supresoras de la muerte celular como Bcl-2 causan efectos radicalmente diferentes

dependiendo de la membrana celular donde se localicen. Mediante la utilización de

modelos celulares, específ icamente MDCK y Rat-1/Myc, sobreexpresando Bcl-2 humana

por acción retroviral, se observó que esta molécula se localiza sobre diferentes organelos

citoplasmáticos. Al restrigir su expresión mediante proteínas de fusión recombinantes

(cambiando el extremo C-terminal de Bcl-2 por dominios de unión específ ica a organelos

como el del citocromo b5 y el de ActA) exclusivamente a organelos como el retículo

endoplasmático (RE) y la mitocondria, los investigadores observaron que en cada uno de

los tipos celulares la ubicación intracitoplasmática determinaba la protección

antiapoptótica. En las células MDCK solo la proteína silvestre o unida a mitocondria

68

poseía acción antiapoptótica, mientras que en las células Rat-1/Myc solo la ubicación en

el RE promovía la supervivencia celular. Estos resultados permitieron establecer la

hipótesis que no solo la unión de Bcl-2 a la proteína Bax era la causante de la inhibición

apoptótica (Andrew s et al., 1996 en The EMBO Journal).

2.4.3. FACTOR DE TRANSCRIPCIÓN Nk-B El término NF-kB hace referencia a una familia de proteínas involucradas en las

reacciones inflamatorias, desarrollo de los órganos linfoides y en la activación de la

respuesta inmune innata y adaptativa. Estas proteínas se caracterizan por ser un factor

de transcripción de genes de conformación activa dimérica que en respuesta a estímulos

celulares son liberadas por sus factores de inhibición (IkBs) como homo e heterodímeros

y migran del citoplasma al núcleo donde se terminan de activar debido a la presencia del

ADN. Dentro de la familia NF-kB existen hasta la fecha cinco miembros reconocidos: p50

(NF-kB1), p52 (NF-kB2), c-Rel, Rel-A y Rel. (Maniatis et al., 2001).

En relación con la apoptosis y sus proteínas asociadas, se ha probado que Bcl-3, un

miembro de la familia Bcl-2 es un IkB que interactua con NF-kB1 y NF-kB2 y promueve su

localización nuclear. Bajo un estímulo proapoptótico como una infección viral o la

presencia de interleuquinas este IkB se fosforila como resultado de su interacción con

proteínas conocidas como IKKs (IkB Kinase complex por sus siglas en inglés) y sus

proteínas adaptadoras y se transloca al núcleo donde promueve la sobreexpresión de

muchos genes involucrados en la respuesta inmune como se observa en la Figura 18. En este mismo contexto apoptótico se sabe que las señales para que las IKKs se activen

dependen de la señalización mediada por TNFR, la proteína fuertemente involucrada con

la transducción de señales proapoptótica vía extrínseca. En un escenario apoptótico claro

como lo es la eliminación de las células malignas causantes del cancer, algunos trabajos

han mostrado que las regiones codicantes de las proteínas NF-kB están involucradas en

rearreglos cromosomales y amplif icación de ciertos genes involucrados en la inhibición y

regulación de la muerte celular (Li et al., 2002). Es sabido que la unión de TNF a su

receptor promueve la activación de NF-kB y subsecuentemente la activación de genes

antiapoptóticos mediante un mecanismo que involucra la inactivación de la caspasa 8. Lo

interesante de este trabajo publicado en Science radica en que por primera vez

identif icaro las moléculas que mediaban este fenómeno: los factores asociados al TNFR

TRAF1 y TRAF2; cIAP-1, cIAP-2, xIAP, Bcl-x y A1. (Baldw in Jr et al., 1998).

69

Adicionamente algunos estudios han mostrado que NF-kB colabora en la activación

transcripcional de la que es responsable p53, una proteína muy estudiada por estar

fuertemente relacionada con fenómenos de reparación del ADN, por ser una molécula

supresora de cáncer y por ser una reguladora de la expresión de los genes que codif ican

para los receptores DEATH. Bajo esta hipótesis algo paradójica, se podría proponer que

la activación de los receptores de muerte promueven la actividad antiapoptótica mediada

por p53 y NF-kB. Lo que puede inferirse es que existen una serie de substratos

diferenciales que activan una u otra vía dependiendo de su origen y naturaleza en dentro

del contexto celular.

Figura 18. NF-kB y la activación por TNFR1. En este modelo el complejo IKK se activa debido a la transducción de señales mediada por el receptor DEATH TNFR1. Paradójicamente, la activación de NF-kB vía TNFR1 promueve la expresión de genes antiapoptóticos. Figura tomada de Maniatis et al., 2001.

70

2.5. REMOCIÓN DE LAS CÉLULAS APOPTÓTICAS 2.5.1. TRANSPORTADORES ABC

La apoptosis, además de eliminar células no viables, es el mecanismo encargado de

refinamiento de la estructura neuronal, de la formación de los tejidos y f inalmente de la

remoción del material inservible y de las células muertas. En los casos cuando las células

mueren víctimas de fenómenos apoptóticos en respuesta a infecciones, debe existir una

relación íntima entre las señales apoptóticas y los mecanismos de respuesta para que los

patógenos no se diseminen una vez la célula se ha eliminado. Desde C.elegans hasta los

mamíferos superiores, se han encontrado una molécula encargada de relacionar estos

dos fenómenos: CED-7 o ABCA1 (para C.elegans y mamíferos respectivamente), una

proteína perteneciente al grupo de transportadores ABC.

ATP-Binding Cassette o los transportadores ABC son una de las familias más grandes de

proteína de membrana y su función radica en el transporte de una serie de substratos

mediante un mecanismo dependiente de ATP. Estructuralmente esta familia se

caracteriza por poseer un par de dominios de unión a nucleótidos (NBDs) así como otro

par de dominios membranales compuestos por 6 hélices transmembranales como se

observa en la Figura 19.

Figura 19. Representación topológica para el transportador ABC de la clase A al cual pertenecen las proteínas CED-7 en C.elegans y la proteína ABCA-1 en humanos. Se caracterizan por poseer dos dominios intracelulares de unión a nucleótidos (NBDs) y dos grandes dominios membranales, cada uno compuesto por 6 hélices transmembranales. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003

A la fecha se han descrito 48 genes ABC dentro del genoma humano, mientras que para

otros organismos como levaduras y plantas el número de genes supera el medio centenar

y el centenar, respectivamente. De estos 48 genes solo se han identif icado 17 proteínas

71

codif icadas como transportadoras, pero de estas 17 solo 1 proteína (AtAOH1 homóloga a

la proteína humana ABCA1) esta organizada como un transportador completo y cuyo

origen es la codif icación lineal de un solo gen. Adicionalmente, 14 de estos genes

putativos para transportadores ABC han sido asociados con desórdenes genéticos entre

los que se incluyen principalmente la f ibrosis quística , la degeneración neuronal, defectos

en el metabolismo de lípidos, resistencia a la insulina y hasta anemia (Herrmann y

Kalden, 2003). En el contexto apoptótico la asociación de estas proteínas de transporte

con el fenómeno de muerte celular programada, se logró establecer a mitad de los 90s

por Chimini y Luciani, quienes reportaron la presencia de un número elevado de

transcritos (ARNm) del gen que codif ica para ABCA1 durante los procesos apoptóticos y

desarrollo celular mediante técnicas de hibridización in Situ (Chimini y Luciani, 1996).

Inicialmente los transportadores ABC habían sido descritos como proteínas involucradas

en la adquisión del fenotipo fagocítico, propiedad que permitía asociar a estas moléculas

con procesos de endocitosis, fagocitosis o engolfamiento de moléculas. Y desde el punto

de vista estructural, la presencia o ausencia de ABCA1 en la membrana celular, modif ica

el arreglo f isiológico y el transporte de las especies lipídicas a lo largo de la bicapa; entre

estas la fosfatidilserina (FS) que necesita ser transportada de la cara interna a la externa

de la membrana celular quizás bajo la inf luencia del transportador ABC.

Estas hipótesis, permitieron a este grupo de investigadores proponer a estas moléculas

como mediadoras del estadío f inal de la apoptosis: la remoción de los cuerpos

apoptóticos. Sorprendentemente, mediante ensayos de neutralización utilizando anticuerpos (Acs) anti-ABCA1 se observó que las células fagocíticas tratadas perdían la

capacidad de engolfar los residuos de las células apoptóticas sin alterar su capacidad de

fagocitar patógenos, en este caso levaduras (Klein et al., 1999). Teniendo en cuenta

estos trabajos preeliminares y las propiedades intrínsecas de esta molécula

transportadora, Hamon y su grupo de colaboradores publicaron en Nature un modelo que

explica el papel de las moléculas transportadoras ABC como ABCA-1 en los fenómenos

de engolfamiento de los cuerpos apoptóticos y que se resume en la Figura 20.

Básicamente este modelo se fundamenta en la capacidad que poseen las proteínas

transportadores ABC para modif icar local y transitoriamente las propiedades biofísicas de

los lípidos de membrana, explicando adecuadamente como es que moléculas como CED-

7 son capaces de modif icar la movilidad lateral de los receptores involucrados en el

reconocimiento de las células apoptóticas. Así, en una situación basal los receptores de

72

engolfamiento membranales se encuentran uniformemente distribuidos sobre la superficie

de la célula fagocítica. Una vez en contacto con un cuerpo apoptótico sufren una

reorganización facilitada por las proteínas transportadoras ABC que le permite a esta

célula acelerar los procesos de fagocitosis así como de señalización para el

reconocimiento de la célula apoptótica.

Figura 20. Modelo esquemático propuesto por Hamon en 2000 para explicar el fenómeno de engolfamiento de las células apoptóticas mediado por las proteínas transportadoras de la familia ABC. En este modelo los receptores fagocíticos (R) sufren una reorganización facil itada por los transportadores ABC que les permite entrar más rápido y fácil con los cuerpos apoptóticos catalizando su eliminación y promoviendo una cascada de reacciones que permiten a la célula caracterizar el residuo como apoptótico. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.

2.5.2. RECONOCIMIENTO Y REMOCIÓN

De la gran cantidad de fosfolípidos distribuidos en la membrana de las células viables solo

la FS aniónica esta localizada totalmente sobre una sola cara de la membrana,

específ icamente solo sobre la cara intracitoplasmática. Por esta razón nunca está en

contacto con el medio extracelular y por ende fuera del alcance de los componentes

sanguíneos. Sin embargo, durante los procesos f inales de la apoptosis esta fosfatidil se

transloca al espacio extracitoplasmático y queda completamente expuesta. Una vez allí,

este fosfolípido sirve como señal apoptótica de reclutamiento de macrofagos y

especialmente Células Dendríticas (CDs) que se encargan de eliminar las citoquinas

liberadas así como cualquier sustancia autoreactivas. Si estas células no reciben la señal

apoptótica inmediatamente, la liberación de sustancias tóxicas y proinflamatorias, así

como un evento secundario de necrosis de estos cuerpos apoptópticos, provoca una

respuesta violenta mediada por la rama humoral y celular de la respuesta inmune

73

(Harrington y Schultz, 2003). Sin embargo, no todas las CDs tienen las características

que permiten ubicarlas dentro del fenómeno apoptótico. Una de esta características es

que las células encargadas de eliminar los cuerpos apoptóticos no seguen los parámetros

normales de maduración a diferencia de los macrófagos y las CDs que eliminan células

necróticas (Albert et al., 1998).

De manera general, las CDs (dendrítico signif ica “dividido de”) son un grupo de células

con una enorme capacidad de presentar antígenos y modular la respuesta inmune celular

mediante su interacción con los linfocitos T y B. La ingestión de células apoptóticas y la

toma de antígenos mediada por las CDs se limita a un estado de desarrollo temprano de

esta población celular debido a que en este estado de maduración estas células expresan

de una manera muy baja el grupo de proteínas que conforman el CMH así como las

moléculas estimuladoras de respuesta inmune mediada por linfocitos T. Sin embargo

durante la eliminación de los cuerpos apoptóticos se ha observado que las CDs expresan

receptores pertenecientes a la superfamilia de lectinas tipo-C. Este tipo de lectinas se

caracterizan por poseer un dominio de unión a un tipo específ ico de carbohidrato

mediante un mecanismo dependiente de Calcio, propiedad muy importante si se

considera que muchos de los fenómenos apoptóticos son desencadenados por la

presencia de patógenos intracelulares perfil específ ico de carbohidratos en sus

membranas. Sin embargo, estos carbohidratos no parecen ser presentados como

antígenos para la activación de la respuesta inmune lo que permite inferir que existen

mecanismos ajenos al estado de maduración de las CDs que les permiten -una vez en el sitio donde está ocurriendo la muerte celular- diferenciar si el proceso es una necrosis o

apoptosis. Uno de estos mecanismos puede estar relacionado con la secreción y

expresión de la molécula proinflamatoria IL12. Cuando una célula sufre fenómenos de

infección bacterial o viral que conllevan a la necrosis, eleva los niveles de IL12 como

mecanismo de señalización para la producción de IFN. Bajo este criterio se ha observado

que IL12 tiene un efecto exocrino y autocrino sobre las CDs, y que solo la exposición a

esta molécula le permite a estas células madurar y funcionar como verdaderas células

presentadoras de antígeno y por ende modular la respuesta inmune celular (Tadokoro et

al., 2000). En un contexto diferente se ha visto que la CDs sufren fenómenos apoptóticos

acelerados para garantizar que la respuesta inflamatoria del hospedero no sea excesiva y

resulte en un daño tisular descontrolado. Mediante la adición de LPS bacteriano se

comprobó que una vez las CDs son estimuladas por los antígenos (Ags) migran de las

74

zonas marginales hacia las zonas con presencia de linfocitos T para acelerar la respuesta

inmune.

Figura 21. Reconocimiento fagocítico de las células apoptóticas. Aunquen en la actualidad se desconoce la totalidad de las interacciones entre los fagocitos y los cuerpos apoptóticos, se han podido describir moléculas de importancia como la fosfatidilserina y otros fosfolípidos aniónicos y la moléculas de adhesión intracelular (ICAM3) del lado de los cuerpos apoptóticos, así como la molécula transportadora de la familia ABC (ABCA1), el receptor de vitronectina (CD36) mediado por trombospondina y CD14 del lado del fagocito. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003. Sin embargo, una vez en dicha localización y habiendo presentado los Ags sufren

fenómenos acelerados de apoptosis (Leo et al., 1998). Estudios posteriores permitieron

asociar estos fenómenos apoptóticos en la CDs con la molécula transmembranal tipo ll de

40 KDa asociada a la familia de receptores DEATH TNF, TRAIL. Las células que sufren

apoptosis vía TRAIL han mostrado una gran dependencia de la expresión de reacciones

que involucren a la familia de proteínas Bcl-2 y a la activación de la vía mitocondrial que

esta familia promueve. Con respecto a las CDs se comprobó que este tipo celular es

mucho más sensible a sufrir apoptosis vía TRAIL que a las vías extrínsecas asociadas a

Fas o a TNFR (Sneller et al., 1999). Para f inalizar, en la Figura 21 se presenta

esquemáticamente como se lleva a cabo el proceso de reconocimiento y remoción de los

células apoptóticas.

75

2.6. LA APOPTOSIS Y LAS INFECCIONES

El fenómeno apoptótico se caracteriza en gran parte por la ausencia de moléculas pro-

inflamatorias y por ende por la ausencia de respuesta inmune. Esta propiedad de “pasar

desapercibida” frente al sistema inmune es una de las estrategias que utilizan los

microorganismos para dispersarse sin ser combatidas. Sin embargo esta estrategia

puede ser considerada como la más elemental y menos evolucionada, pues como se

tratará a profundidad en el último capítulo de esta revisión, algunas infecciones virales se

caracterizan por llevar a cabo un programa de subversión celular altamente evolucionado

que evade por completo tanto la respuesta apoptótica como inmunológica. De igual

manera ocurre durante las infecciones parasitarias por protozoos como Trypanosoma

cruzi donde el fenómeno apoptótico es aprovechado para la dispersión y liberación del

parásito. El parásito promueve la apoptosis de los neutrófilos que infecta en el primer

paso de su ciclo. Una vez la respuesta mediada por macrófagos se inicia, T.cruzi utiliza

los cuerpos apoptóticos de los neutrófilos como “Caballos de Troya” para entrar en su

hospedero definitivo que parece no activarse adecuadamente post-infección. Así el

proceso apoptótico es aprovechado en una doble vía: inicialmente como señal para atraer

a la célula hospedera y adicionalmente como mecanismo de evasión de la respuesta

inmune (Freire-de-Lima et al., 2000).

En un contexto general, los patógenos intracelulares capaces de elicitar respuesta

inmnune activan los linfocitos T citotóxicos (CTLs por sus siglas en inglés) mediante un

mecanismo que involucra la “busqueda” de los antígenos presentados en la superficie de la célula infectada mediante el sistema CMH clase l. Sin embargo, los patógenos

extracelulares también pueden elicitar esta respuesta CTL (CD8+) mediante los procesos

de fagocitosis, migración hacia los nódulos linfáticos y presentación alternativa vía CMH

clase l que llevan a cabo las Células Presentadoras de Antígeno (CPAs) como

macrófagos y CDs las cuales se derivan de la médula ósea como precursores inmaduros

(Rock et al., 1999). Sin embargo esta claro que las CPAs capaces de presentar

antígenos exógenos vía CMH clase l poseen una característica especial: la expresión de

un transportador funcional asociado al sistema de procesamiento de antígenos conocido

como TAP. Una vez el patógeno extracelular es detectado por una CD o un macrofago, se

inicia un proceso el proceso de fagocitosis y de formación del proteasoma en el

citoplasma que conduce a la destrucción dell microorganismo y permite la generación de

los péptidos antigénicos o sus precursores. En este punto, TAP se encarga de transportar

76

los Ags hacia el Retículo Endoplasmático (RE) donde se asocian con las moléculas del

CMH clase l que están siendo sintetizadas. Durante muchos años se creyó que

solamente el dímero formado por la microglobulina Beta 2 (b2m) era necesario para el

correcto ensamblaje del CMH al Ag. Sin embargo a raiz de los estudios en CPAs se logró

establecer que TAP1 y TAP2 así como la tapasina, una proteína de membrana codif icada

por genes CMH, eran subunidades esenciales para la correcta presentación de antígenos.

El modelo propone que antes de la unión del péptido, la b2m forma un complejo junto con

TAP, la tapasina, la chaperona calretuculina y la oxidoreductasa ERp57 dentro del RE

(revisado por Dierich et al., 1999). Esta teoría representa la respuesta de como células

que han sufrido apoptósis como resultado de una infección intracelular pueden

desencadenar indirectamente una respuesta inmune patógeno-específ ica y generar una

cascada de reacciones linfocitarias restringidas al CMH clase l mediada por linfocitos T

CD8+ o al CMH clase ll mediada por linfocitos T CD4+. Para corroborarla esta hipótesis

se han publicado estudios independientes, donde se ha demostrado que células

apoptóticas infectadas con el virus Influenza, con Citomegalovirus, con el Virus Epstein-

Barr o con Salmonella typhimurium son substratos apropiados para CDs y que como

resultado de esta fagocitosis se produce una respuesta inmune tanto celular como

humoral específ ica para el patógeno en estudio (revisado por Harrington y Schultz, 2003).

En un estudio realizado por Marie Larsson y su grupo de investigación de la Escuela de

Medicina de la Universidad de Nueva York y publicado en The European Journal of

Immunology en diciembre de 2001 se comprobó que la eficiencia a la que una célula dendrítica toma Ags pertenecientes al virus Vaccinia en una célula apoptótica equivale a

la adición de 10 nM de péptido sintético mostrando la gran eficiencia de este mecanismo

de presentación con la subsecuente activación de linfocitos T CD8+ y la secreción de IL-2

e IFN-gama (Larsson et al., 2001). Aunque se acepta que cuando una CD fagocita a una

célula apoptótica infectada existe un reconocimiento directo de los Ags vía TLRs (Toll Like

Receptors) la evidencia ha mostrado que existen señales adicionales para este proceso

entre las que se encuentran las citoquinas como IL-1 o TNF involucradas en la respuesta

inmune innata inflamatoria que genera como resultado el reclutamiento de más células

fagocíticas y las Proteínas de Shock Térmico (HSPs), que son expresadas por la célula

infectada como resultado del estrés que esta genera y que estan involucradas en los

fenómenos de maduración de las CDs mediante su interacción con proteínas de

membrana de estos fagocitos y en procesos de limitación de la respuesta

77

inmunosupresora (Gough et al., 2001). Precisamente en este estudio se postula la

participación de estas moléculas señalizadoras en la transmisión de la información que les

permite a las células fagocíticas diferenciar entre una célula que sufrió fenómenos de

apoptosis debido a una infección y una que la sufrió como resultado de un proceso normal

de desarrollo y control celular.

Todos estos resultados de estudios independientes permiten sugerir, que aunque en un

principio, la apoptosis como resultado de una infección parece no tener funcionalidad

alguna en la eliminación del parásito, existen mecanismo celulares algo más

evolucionados que mediante la existencia de células centinelas como las CDs permiten

descubrir a los patógenos ocultos tras la cortina apoptótica. Sin embargo, la evidencia

también muestra que entidades como los virus han evolucionado de una manera

asombrosa para evitar cualquier tipo de respuesta durante la infección, entre ellas, la

apoptosis. Esta afirmación introduce el tema del capítulo f inal de esta revisión: el

fenómeno de evasión de los sistemas de control de la MCP y de respuesta inmune

mediada por el RABV en el SNC.

2.6.1. ARN COMO INDUCTOR DE APOPTOSIS Debido a que muchos virus, incluyendo el RABV, poseen genomas compuestos

exclusivamente por ARN, esta revisión creyó pertinente tocar aunque fuera brevemente al

ARN como una molécula activadora de procesos apoptóticos y altamente antigénica

según el contexto y el estado de desarrollo y estrés celular. Aunque hace unas décadas pareciera descabellado proponer a un ácido ribonucleico como un elemento involucrado

en la muerte celular, desde el descubrimiento en 1998 del fenómeno de ARN de

interferencia o ARNi (para más información revisar Mukherjee et al., 2003) la hipótesis

que lo postula como un neoepitope está ganando bastante fuerza. Adicionalmente,

durante los procesos apoptóticos se ha observado una modif icación sustancial de las

estructuras de ARN celular y que los ácidos nucleicos virales en conjunto con proteínas

del hospedero o proteínas propias están activando esta respuesta celular apoptótica de

maneras alternativas. Algunas de estas respuestas son altamente específ icas y

selectivas en relación al tipo de ARN que procesan y sorprendentemente, se ha

observado que las proteínas encargadas de procesar este material genético son las

caspasas a las cuales hasta el momento se les ha reportado actividad ARNasa (Cohen

GM, 1997). Así, aunque la función del ARN desnudo, su localización dentro de la

78

cascada enzimática y sus modif icaciones exactas durante el proceso del apoptosis son

comprendidas parcialmente, la Figura 22 presenta esquemáticamente lo descrito hasta el

año 2003.

2.6.2. REGULACIÓN DE LA APOPTOSIS POR VIRUS Aunque la apoptosis es un mecanismo que no induce respuesta inmune per se la

presencia de patógenos activa una respuesta igual o más agresiva que la presentación de

antígenos sin presencia de apoptosis. Bajo este criterio, la apoptosis no es el mecanismo

adecuado para evitar la respuesta inmune del hospedero. Para solucionar esta estrategia

defensiva los virus han desarrollado estrategias subversivas aún mejores que

complementan los mecanismos moleculares de interacción célula-virus como: la

disrupción de las funciones celulares normales, las interacciones ARNv/ADN con

proteínas celulares como la proteína La (que interactúa con el material genético de virus

como el HCV, el HIV y el EBV), las interacciones proteína viral-proteína celular, las

modif icaciones de proteínas celulares por acción de enzimas virales y f inalmente la

respuesta inmune y apoptótica como resultado de la infección (Herrmann y Kalden, 2003).

Sin embargo estas estrategias se basan en la especialización de proteínas virales y

aparentemente multifuncionales como se ha comenzado a describir para el RABV en el

cual se consideraba que las 5 proteínas eran exclusivamente de carácter estructural. Sin

embargo los estudios moleculares de la última década proponen que para muchas de

estas proteínas papeles adicionales en la regulación de la respuesta de las neuronas infectadas, un ejemplo son los trabajos realizados por Blondell y colaboradores en la

fosfoproteína P (Blondell et al, 2005).

A lo largo de este capítulo se ha observado que la apoptosis contiene una serie de pasos

individuales y un virus determinado solo tiene que influenciar uno solo de estos pasos

para afectar el progreso del proceso de MCP. Adicionalmente muchos virus,

especialmente los de ARN, llevan a cabo una estrategia aún mucho más simple:

replicarse rápidamente antes que una respuesta inmune sea activada o por el contrario,

mantener tasas de replicación muy bajas, en lo que se conoce como una infección

críptica, para que la infección no sea advertida.

79

Figura 22. ARN, mimetismo molecular y neoepítopes. Las infecciones virales introducen ARN foráneo al medio celular. Además de activar el mecanismo de ARNi este ARN viral induce la producción de anticuerpos con ayuda de linfocitos T ayudadores (Th). Adicionamente algunos linfocitos B permanecen como células de memoria inmunológica. En otro contexto, cuando una célula infectada sufre procesos de apoptosis o necrosis sirve de blanco para la acción de los linfocitos T citotóxicos y células fagocíticas. La granzima B introducida a estas células genera fragmentos antigénicos de ARN que pueden dar origen a anticuerpos ARN. Sin embargo en episodios de mimetismo molecular y autoreactividad, las células que han sido activadas contra ARN foráneo pueden reconocer ARN ribosomal (ARNr) y desencadenar fenómenos de apoptosis. Finalmente, un linfocito B puede internalizar un complejo ribonucleoprotéico y presentar separadamente tanto ARN como proteínas a los l infocitos T reactivos quienes inducen la maduración de la célula B. Figura tomada de Herrmann y Kalden, 2003.

Entre las estrategias más utilizadas por los virus están la inhibición de los mediadores de

señalización de la ruta extrínseca de la apoptosis como TNF y Fas. En particular, las

proteínas E3-10.4K y E3-14.5K de los Adenovirus reducen la expresión del Fas en la

membrana de la célula infectada. Por otro lado, algunos virus inhiben el mecanismo IFN

como el HSV, virus que afecta esta ruta de respuesta innata mediante la inhibición tanto

de la kinasa PKR así como de la ARNasa L, enzimas que normalmente se activan por la

presencia de ARN de cadena doble. La evidencia existente también ha permitido

80

descubrir que algunos Adenovirus bloquean la apoptosis mediada por los miembros pro-

apoptóticos de la familia Bcl-2, como Bad o Bax. La proteían E1B-19K inhibe una forma

específ ica de Bax y como resultado bloquea la ruta de MCP mediado por TNF-a. De igual

manera la proteína BHRF1 (17KDa) del EBV cumple un papel similar al de la proteína del

Adenovirus. De igual manera existen proteínas virales que cumplen con funciones como:

suprimir la acción de las caspasas, manipular el ciclo celular (oncoproteínas virales),

regular el estrés oxidativo o modif icar la función de algunos factores de transcripción

celulares. Para una lista detallada de las proteínas virales que modif ican el fenómeno de

MCP y sus blancos moleculares, la revisión publicada por el Journal of General Virology

en el año 2002 (vol 83, páginas 1547 a 1564) por Stew art Hay y George Kannourakis es

una excelente y actualizada fuente (Hay y Kannourakis, 2002).

Esta estrategia evolutiva no podía obviar uno de los mecanismos más críticos para la

eliminación de patógenos en los eucariota: la apotosis. Por ejemplo, el virus de la viruela

bovina. Dentro del genoma de este se encuentra la secuencia para codif icar crmA, una

proteían antiapoptótica que inhibe potencialmente la actividad de las caspasas mediante

el bloqueo de los receptores Fas y TNF (Cunnion KM, 1999). Otros virus como el HHV-8

(Herpervirus asociado al Sarcoma de Kaposi) expresan una proteína altamente homóloga

a c-FLIP (ver Figura 13) conocida como v-FLIP que se encarga de bloquear la activación

de la procaspasa 8 mediante su interacción con el complejo DISC. De igual manera otros

virus codif ican moléculas homólogas a las IAPs celulares (ver capítulo 2.3.2) con la

capacidad de bloquear la activación de las caspasas (Medema et al., 1999 y Glykofrydes et al., 2000). En otro casos como en el HHV-8 o el EBV la actividad antiapoptótica se basa

en la inhbición del factor de transcripción NF-kB; y una vez se desbloquea este factor las

células infecadas y tumorales desaparecen como resultado de la reactivación del

fenómeno apoptótico (Keller et al., 2000).

En el caso específ ico del EBV se ha identif icado la proteína responsable del fenotipo

antiapoptótico que conduce a los desordenes linfoproliferativos: LMP-1 (Latent Membrana

Protein-1 por sus siglas en inglés). Esta oncoproteína se une a los factores asociados a

TNF así como al dominio de muerte del mismo TNFR para prevenir la muerte celular y a la

vez promueve la supervivencia celular mediante la sobreregulación de proteínas Bcl-2

(Schultheiss et al., 2001).

Por otro lado, aunque el mecanismo por el cual el HHV-8 desregula la activada de NF-kB

no está descrito totalmente Friborg y su grupo de colaboradores reportaron en Nature que

81

la proteína viral LANA (Latency-Associated Nuclear Antigen por sus siglas en inglés) tenía

la capacidad de de reprimir la expresión de p53 y promover la supervivencia cellular

(Friborg et al., 1999). Adicional a la capacidad del HHV-8 de codif icar proteínas

inhibidoras, este virus contiene diferentes marcos de lectura abiertos (Open Readings

Frames u ORFs por sus siglas en ingles) que codif ican para una serie de factores

conocidos como vIRFs encargados de regular la expresión de las proteinas involucradas

en la respuesta vía IFN (Mamane et al., 1999). Finalmente, al igual que en el EBV en el

HHV-8 se ha descrito la existencia de una molécula análoga a Bcl-2 que no se

heterodimeriza con Bax y no procesada por las caspasas celulares, características que le

permiten a esta proteína viral interferer fuertemente con el proceso de MCP (Sarid et al.,

1997). Así, además de promover un proceso de replicación viral más efectivo –lo cual ya

es nocivo para el hospedero- estas proteínas convierten el tejido infectado en tejido

canceroso. En un contexto similar, muchos de estos virus codif ican también para

proteínas homólogas a factores de crecimiento celular y para receptores de estos factores

(comentado por Richard F. Ambinder, 2000 en America Journal of Pathology). En la

Figura 23 y 24 se resume de forma esquemática los mecanismos más comunes utilizados

por los virus para la evasión de la respuesta apoptótica.

A diferencia de los virus con genoma ADN, los virus ARN como el HTLV-1 posee una

cantidad mucho inferior de genes. Sin embargo aunque su ARN o complejos

ribonucleoproteícos pueden despertar reacciones de muerte celular como se propuso en

el capítulo inmediatamente anterior, pueden codif icar para proteínas de subversión de la respuesta celular como en el caso de este virus causante de leucemia –de ahí su nombre

Human T Leucemia Virus Type l- la proteína Tax, una fosfoproteína celular que

transactiva factores asociados a NF-kB y elementos de respuesta al AMPc,

desequilibrando tanto la respuesta celular como su patrón de expresión genética (Yoshida

M, 2001).

82

Figura 22. Regulación viral de la ruta extrínseca de activación apoptótica. Los eventos de bloqueo de la señalización vía TNF y sus receptores asociados es una estrategia altamente utilizada por los poxvirus. Este tipo de virus producen receptores falsos que aunque sufren procesos de unión no desencadan señalización alguna y a su vez bloquean posibles señales futuras. Otro mecanismo altamente util izado es la síntesis de FLIP viral (o vFLIPs) que al igual que su contraparte celular contiene dominios de interacción con moléculas adaptadoras como FADD o con las procaspasas 8 y 10. Adicionalmente el CMV produce una proteína conocida como vICA que se une directamente a la procaspasa 8 evitando su activación. Por otro lado, virus como el EBV codifican para productos como la proteína LMPl que se auto-agrega a moléculas como TRAF y TRADD dando como resultado la activación de la paradójica ruta antiapoptótica mediada por NF-kB (ver capítulo 2.4.3). Finalmente, los Adenovirus codifican en su región E3 para proteínas que forman un complejo heterogéneo encargado en facil itar la remoción de receptores tipo DEATH com Fas, TRAILR1 y TRAILR2, fenómenos con los cuales la célula se hace “inmune” a cualquier tipo de señalización extrínseca que la induzca a activar proteínas apoptóticas. Figura tomada de Ware et al., 2002.

83

Figura 23. Regulación viral de la ruta intrínseca de activación apoptótica. Virus oncogénicos como el HPV y ciertos Adenovirus bloquean vías intrínsecas de activación apoptótica mediante la síntesis de tipos específicos de inactivadotes de sensores de estrés celulares como p53. Adicionalmente muchos virus codifican para proteínas ortologas a las proteínas antiapoptóticas de la familia Bcl-2 (ver capítulo 2.4.2) que antagonizan fuertemente con las proteínas proapoptóticas. Finalmente están las proteínas virales IAPs (vIAPs) que mediante intearacciones la proteína Smac/DIABLO cambian el equilibrio hacia la superviencia celular; o mediante interacciones con las procaspasasa inhiben su potencial apoptótico. Figura tomada de Ware et al., 2002.

84

3. NEURONAS SENSORIALES

Las neuronas sensoriales de los mamíferos han ocupado un lugar especial en el estudio

de la neurología debido a que son las encargadas de transmitir toda la información desde

la periferia hacia el SNC. La médula espinal (ME) se comunica con el sistema nervioso

periférico a través de las raíces anteriores y posteriores de cada segmento medular.

Estas, se unen a cada lado de la médula para formar los nervios raquídeos que salen del

canal vertebral a través de los agujeros de conjunción. La raíz anterior o ventral se

continúa con la médula por el asta anterior o ventral y consiste principalmente en f ibras

eferentes de cada segmento originadas en su mayoría en las grandes células motoras del

asta anterior. La raíz posterior o dorsal presenta una región llamada ganglio de la raíz

dorsal (GRD) o ganglio espinal que se localiza en los agujeros intervertebrales (Squire et

al.., 2002). Los GRD son agregados celulares ubicados en los espacios intervertebrales a

lo largo de las secciones cervicales, torácicas, lumbares, sacras y coccígeas a cada lado

de la médula como se observa en la Figura 24.

Debido a que los GRD son de gran tamaño y de fácil disección, han servido como modelo

para el estudio de la estructura y función de los receptores sensoriales y de otras

funciones neuronales que van desde los canales de transporte iónicos, hasta la

dependencia de factores neurotrópicos específ icos. Esta completamente claro que dentro

de este gran grupo de las “sensoriales” existe una gran variedad de subpoblaciones

definidas morfológica, f isiológica y bioquímicamente; y aunque han sido caracterízadas,

es claro para la comunidad científ ica comprometida con este tema que las características individuales son completamente ignoradas, afirmación que complica pero a la vez abre el

panorama en el estudio de las interacciones bioquímicas existentes para el transporte

sensorial y en lo que concierne a esta revisión, a los fenómenos de interacción entre virus

altamente neurotrópicos como el RABV y este tipo de neuronas. Debido a que durante

décadas se han estudiado las diferentes características celulares de esta población

neuronal y a la fecha se cuenta con una cantidad apreciable de información, en este

capítulo se hace una revisión sobre los hallazgos más relevantes en neurobiología

sensorial basados principalmente en el libro Sensory Neurons: Diversity, Development

and Plasticity (Oxford Press, 1992) que la Doctora Sheryl A. Scott del Departamento de

Neurobiología y Comportamiento de la Universidad Estatal de Nueva York publica en

colaboración de un gran número de colegas a lo largo de Europa, Norte América y

Cercano Oriente.

85

3.1. NEURONAS DEL GANGLIO DE LA RAíZ DORSAL

Estas neuronas constituyen junto con las neuronas de la raíz ventral la base de la

comunicación a través de la columna vertebral. En el siglo XIX Charles Bell (1811) y

Francois Magendie (1822) hicieron dos de los aportes más importantes para el

entendimiento de la organización y funcionamiento del sistema nervioso en los mamíferos.

Estos científ icos propusieron que cada segmento de la columna vertebral tenía una raíz

dorsal de tipo sensorial y una raíz ventral de tipo motor estableciendo lo que se conoció

como la Ley Bell-Magendie que establece el principio básico del transporte y conducción

aferente hacia el SNC. Estudios de carácter f isiológico y anatómico ligaron a los GRD

como un tipo específ ico de neuronas a los cuerpos celulares con las terminaciones

intervertebrales, las f ibras nerviosas periféricas y las terminales aferentes en los órganos

periféricos.

Si fuera necesario resumir en un solo concepto la función de las neuronas de los GRD,

podría decirse con certeza que son transductoras y transmisoras de información. Cada

una de las neuronas sensoriales del GRD junto con su proceso dendrítico, su f ibra

aferente y su terminal receptiva periférica, sus contactos sinápticos y su ramificación

axonal central, conforma una unidad aferente o unidad concerniente. En conjunto cada

una de estas unidades colabora para llevar el estímulo sensorial hacia el SNC lo que

permitió inferir desde el siglo XIX especialmente con Von Frey en 1897 y con Blix y

Goldscheider en 1884, que estas unidades dif ieren f isiológicamente así conforme un gran

sistema genérico. Mediante estudios anatómicos y sensoriales, Von Frey dio inicio a la definición funcional y estructural de estas unidades. Utilizando diferentes estímulos como

temperatura, dolor y contacto, este científ ico identif icó puntos específ icos que luego

correlacionó con la distribución diferencial de terminaciones neurológicas

morfológicamente diferentes. Posteriormente, una definición más concreta sobre estas

diferencias resultó de los trabajos realizados por Erlanger y Passer en la primera mitad del

siglo XX donde se encontró que las velocidades de conducción y potencial de acción de

las neuronas sensoriales periféricas estaban en estrecha relación con el diámetro de las

f ibras aferentes de cada unidad. Adicional a esta característica morfológica, Erlanger y

Passer, encontraron entre 1950 y 1955 que las neuronas con mayor tamaño

concentraban un mayor patrón de mielinización y que a lo largo del SNP este patrón

cambiaba, estableciendo así una diferenciación preeliminar con base en la velocidad de

transmisión como resultado del tamaño de las f ibras neuronales y la cantidad de mielina

86

presente (Pearl ER en Scott SA, 1992). A partir de este punto los estudios condujeron,

desde la segunda mitad del siglo XX a un análisis más profundo de tipo morfológico,

f isiológico y f inalmente bioquímico con la intención ahondar en las características básicas

que definieran las subpoblaciones neuronales y no neuronales presentes en el intrincado

sistema nervioso sensorial y específ icamente en los GRD.

3.2. CLASIFICACIÓN DE LAS SUBPOBLACIONES NEURONALES Las neuronas sensoriales son de carácter exclusivamente sensorial y con un tamaño que

varía entre los 20 y los 100 µm en modelos murinos, su desarrollo tiene origen en la

cresta neural desde donde migran como neuroblastos bipolares en estados iniciales del

desarrollo nervioso y tisular. Una vez establecidos adquieren características bipolares o

seudounipolares. Después del desarrollo estas f ibras neuronales se dividen en dos

ramas, una medial o central que forma la raíz dorsal que penetra la médula para

establecer conexión con las neuronas presentes en el asta dorsal, y otra lateral o

periférica que se une a la raíz ventral medular formando el nervio raquídeo y

posteriormente se dirigen a la periferia para dar origen a los diferentes receptores

sensitivos en músculo, articulaciones, piel u otros órganos (conocidos como vísceras) de

donde, en forma libre o encapsulados en células especializadas, captan cada uno de los

estímulos del medio y los convierten en impulsos nerviosos aferentes (Martin JH, 1996).

El avance logrado en histología durante más de 100 años permitió en la segunda mitad

del siglo XX definir que los GRD se componían de dos tipos celulares donde el primero y más común eran las neuronas y el segundo se componía de células no neuronales como

fibroblastos encargados de producir la matiz extracelular presenta en el tejido conjuntivo

del ganglio, y células satélites como las células de Schwann.

La función de estas últimas se puede definir como de protección debido a que son la glía

del SNP y por ende se encargan de cubrir cada uno de los axones de las neuronas

sensoriales del ganglio y definir su patrón de mielinización según su localización y función

(Law son SN en Scott SA, 1992). Por fuera de esta capa, las neuronas están rodeadas

por f ibras del tejido conjuntivo y tejido conjuntivo vascularizado (Escobar et al.., 1998).

87

Figura 24. Distribución de los GRD. El centro del ganglio está ocupado por fibras neuronales formadas por las prolongaciones medial y lateral. Las prolongaciones laterales de cada ganglio se dirigen a la periferia para dar origen a los receptores sensitivos para captar, convertir y transportar los estímulos del medio. Figura tomada de Microsoft Corporation.

Posteriormente los trabajos en neurobiología establecieron una clasif icación más rigurosa

de las poblaciones y subpoblaciones neuronales presentes en los GRD a nivel tanto morfológico, como fisiológico y bioquímico, esta última como resultado de la identif icación

de moléculas marcadoras expresadas de forma diferencial entre las neuronas de tamaño

pequeño –asociadas a nocicepción o al dolor- y neuronas medianas y grandes –

asociadas a mecanorecepción y proiocepción- (Martinez et al.., 2000). Como lo propone

Hali y su grupo de trabajo en la revisión publicada en The Journal of Neuroscience en

1997, la diversidad a cada uno de estos niveles está determinada por delicados factores

de regulación genética, más sin embargo los estímulos que los generan todavía son parte

de la investigación y discusión en neurobiología (Hali et al.., 1997).

La identif icación de las características bioquímicas y estructurales como resultado de la

búsqueda de parámetros clasif icatorios es de gran importancia al momento de trabajar

modelos tanto in vitro como in vivo. Es razonable pensar que un conocimiento profundo

88

del modelo celular sobre el cual se esta trabajando, conduce sin duda al establecimiento

de hipótesis acertadas sobre el comportamiento de ciertas interacciones como la del

RABV con las neuronas sensoriales durante el transporte retrógrado y con marcadas

características de entrada, inmunosupresión y subversión de la respuesta apoptótica

neuronal que definitivamente están en estrecha relación con la constitución bioquímica y

genética de la célula hospedera.

3.2.1. CLASIFICACIÓN MORFOLÓGICA

Las observaciones que se han llevado a cabo desde hace más de 100 años han

establecido y aceptado que la principal división morfológica de las neuronas presentes en

el GRD se define en dos tipos: las neuronas claras y grandes (L por sus siglas en inglés) y

las neuronas oscuras y pequeñas (SD por Small Dark). Esta clasif icación obtenida por

técnicas de microscopía de luz a mediados de los 90 por Andres KH quien las designara

incialmente como neuronas A y B (Andres KH, 1961), sin embargo recientemente se

definieron como neuronas L y SD. Estudios estadísticos llevados a cabo en 1984 por

Law son y sus colaboradores en GRD de ratas adultas, confirmaron que estas neuronas

tiene una distribución normal esperada en relación a su tamaño, donde las neuronas

claras son exclusivamente grandes y las neuronas oscuras exclusivamente pequeñas

(Law son et al.., 1984). Posteriormente se descubrió por microscopía de contraste de

fases y microscopía electrónica que esta característica de coloración estaba dada por la

presencia, dispersa en las neuronas L y concentrada en las neuronas SD, de unos agregados de RE rugoso a los que se les dio el nombre de sustancias de Nissl.

Adicionalmente se comprobó que Nissl se distribuía de una manera irregular en las

células L debido a la presencia de microtúbulos y altas concentraciones de neurofilamento

(NF), mientras que lo hacía de una manera compacta en las células SD debido a la alta

densidad de organelos citoplasmáticos así como a la poca cantidad de NF (Yamadori T,

1970). El estudio ultraestructural de estas poblaciones morfológicamente definidas se fue

ampliando y logró definir patrones diferenciales de impregnación con sustancias con

Osmio yodado de Zinc que permitieron a Rambourg y su grupo incluir una nueva

subpoblación neuronal conocida como C y que se caracterizaba por ser la más pequeña

de las neuronas dentro del GRD (Rambourg et al.., 1983).

Unos años después, estudios ultraestructurales y citoquímicos pudieron definir en un

modelo murino tres tipos de neuronas clasif icadas como A, B y C, cada una dividida en

89

los sutptipos A1 a A3, B1 a B3 y C morfológicamente divergentes e independientes de la

actividad y/o estimulación, mostrando que la divergencia morfológica y funcional es un

patrón establecido con posterioridad al desarrollo y gobernado por fenómenos genéticos y

epigenéticos. A nivel bioquímico, se encontró que estos tipos divergían de igual manera

según la actividad de la anhidrasa carbónica y la fosfatasa ácida, la distribución de los

organelos citoplasmáticos y la acumulación y respuesta al neurotransmisor Glutamina

(Sommer et al.., 1985), como se expondrá en un capítulo posterior. Aunque todas las

subpoblaciones están presentes en los GRD, se coincide en afirmar que las neuronas

medianas y pequeñas son predominantes debido quizás a que las células precursoras de

las neuronas grandes detienen su división mucho antes de lo que lo hacen las células

precursoras de las medianas y pequeñas. El desarrollo de los dos grandes subtipos

neuronales está relacionado con la distribución de las células según tamaño, y dicha

distribución ha permitido establecer que el destino tanto de neuronas L como de neuronas

SD desde la cresta neural depende del día de su nacimiento que es de aproximadamente

24 horas de diferencia entre las L y las SD (Law son et al.., 1979). A partir de esta gran

subdivisión se han podido establecer diferencias que sorprendentemente siguen

mostrando una gran brecha entre claras y oscuras tanto a nivel funcional como

bioquímico, demostrando que la división hecha ya hace casi 50 años por microscopía de

luz es un reflejo de las íntimas diferencias moleculares existentes entre las neuronas

sensoriales del GRD.

3.2.2. CLASIFICACIÓN FISIOLÓGICA Como fue establecido anteriormente, la clasif icación de tipo morfológico fue el primer paso

para mostrar que las diferencias que observadas “a simple vista” solo eran un reflejo de

las discrepancias funcionales y por ende bioquímicas y moleculares entre los diferentes

tipos neuronales presentes en los GRD. Según el sitio de recepción (piel, músculo o

vísceras) y el tipo de información sensorial que procesen y según la velocidad de

conducción a la que la transmiten dicha información, las neuronas pueden ser

caracterizadas y posteriormente clasif icadas bajo un criterio funcional como nociceptivo,

mecanoreceptivo o propioceptivo. Sorprendentemente los estudios en el área han

revelado que el tamaño del soma, el grosor de la f ibra axónica y la localización neuronal

están en una estrecha relación con su funcionalidad, estableciendo así el parámetro

f isiológico de clasif icación dentro del GRD. Estudios electrofisiológicos en asociación con

90

propiedades detectadas por inmunocitoquímica, mostraron que las neuronas grandes o L

(NF+ y f ibras mielínicas) poseían f ibras axónicas tipo A, caracterizadas por ser de

conducción rápida; mientras que las neuronas pequeñas o SD (NF- y f ibras amielínicas)

mostraban la presencia de f ibras C caracterizadas por ser de conducción lenta. Adicional

a esta velocidad de conducción se encontró que en las neuronas del GRD se presentaban

dos tipos principales de potencial de acción (PA o AP por sus siglas en inglés), uno de

larga duración caracterizado por inf lexiones en la fase de descenso así como por

corrientes de entrada de Na+ insensibles a Ca2+ y a la Tetrodotoxina (TTX), y un AP de

corta duración sin la presencia de dichas inflexiones y con sensibilidad en sus corrientes

de Na+ a la TTX. Posteriormente se encontró que este PA tenía una relación con la

velocidad de transmisión, pues solo las neuronas con f ibras tipo C poseían un PA con

inflexiones mientras que las neuronas con f ibras tipo A poseían los dos tipos de PA

(Yoshida et al.., 1979). Estudios f isiológicos y bioquímicos realizados a partir de

preparaciones intactas de segmentos periféricos del GRD donde los receptores podían

ser fácilmente aislados y caracterizados pudieron establecer una correlación entre la

clasif icación electrofisiológica, la velocidad de conducción, el potencial de acción y el tipo

de receptor presente. Las f ibras gruesas mielínicas de rápida conducción componen los

grupos funcionales l, ll y lll asociados generalmente al transporte de la información

propioceptiva y mecanoreceptiva, mientras que las f ibras delgadas amielínicas de lenta

conducción componen los grupos lV y V asociados a la conducción de las señales

nociceptivas y termoreceptivas (Law son et al.., 1985). Visto hasta el momento, las neuronas sensoriales exhiben diferentes propiedades a

muchos niveles lo que permite sugerir que esta divergencia es el resultado de

características intrínsecas que les permiten cumplir funciones diferentes pero

dependientes unas de otras para un correcto transporte de las señales nerviosas. A nivel

f isiológico estas diferencias parecen estar basadas en los patrones eléctricos de

conducción y potencial característicos y estos a su vez relacionados con las propiedades

morfológicas y de mielinización. A un mayor nivel, se ha sugerido que esta

especialización a nivel f isiológico central puede estar determinada en parte por las

propiedades membranales de las terminales y del soma neuronal (Koerber HR y Lorne

MM en Scott SA, 1992).

91

3.2.3. CLASIFICACIÓN BIOQUÍMICA La identif icación y clasif icación de péptidos, enzimas y carbohidratos específ icos dentro

de los diferentes tipos neuronales dentro del GRD, ha tenido un gran avance debido a la

técnicas de inmunocitoquímica e inmunohistoquímica. Sin embargo, y como lo expone

Weihe y su grupo de investigación en una revisión de 1989 que referenciada por Sally

Law son en el Capítulo 2 del libro de Sheryl Scott, han existido una serie de problemas en

la interpretación de los resultados debido a la alta reactivada cruzada de los anticuerpos

utilizados, tema que debería considerarse con mayor frecuencia en los estudios

inmunoquímicos. Para solucionar este problema en investigación en neurobiología, y

como una técnica que ha tomado mayor fuerza en la última década, la hibridización de

ARNm in situ (Law son SN en Scott SA, 1992) ha permitido el descubrimiento de una

cantidad adicional de moléculas neuronales específ icas además de sus patrones de

expresión en cada subpoblación, dando luces en los sistemas de regulación que

determinan la morfología y f isiología neuronal de los GRD.

3.2.3.1. NEUROFILAMENTOS Como fue descrito anteriormente los patrones de inmunoreactivadad que presenta el NF

hacen posible una distinción adicional entre las neuronas sensoriales tipo L y tipo SD

dentro del GRD. El citoesqueleto de las neuronas está formando por tres grupos de

f ilamentos altamente conservados f ilogenéticamente que se clasif ican según su diámetro

en: microtúbulos o neurotúbulos que tiene un diámetro promedio de 25 nm, en f ilamentos intermedios o neurofilamentos que poseen un diámetro hasta de 10nm y f inalmente en

microfilamentos que tienen un diámetro de tan solo 5 nm (Naves et al., 1996).

Los neurofilamentos son proteínas estructurales codif icadas por tres genes similares y

cuya función es mantener la morfología neuronal y regular el diámetro axonal.

Específ icamente se han descrito una serie de anticuerpos que reconocen de manera

diferencial epítopes en los diferentes tipos neuronales, al menos en un modelo murino.

Por una parte el anticuerpo RT97 reconoce específ icamente la forma fosforilada del NF en

la subunidad de 200 KDa en las neuronas tipo L (grandes) mientras que otros anticuerpos

reconocen cualquiera de las otras tres subunidades presentes tanto en neuronas L como

SD (pequeñas) pero con un patrón de fosforilación y distribución diferente donde

cualquiera de las subunidades fosforiladas tiene una mayor prevalencia en las neuronas L

(Perry et al., 1991). Los estudios f isiológicos descritos anteriormente mostraron que el

92

patrón de neurofilamentación estaba asociado a la velocidad de conducción del impulso

nervioso así como al potencial de acción neuronal: las neuronas grandes, con f ibras

mielínicas (tipo A) y de conducción rápida son positivas para NF mientras que las

neuronas pequeñas, con f ibras amielínicas (tipo C) y de conducción lenta son negativas

para NF. Además del NF existen otros f ilamentos intermedios como la periferina. Esta

proteína se encuentra exclusivamente en neuronas NF- así como proyectada hacia la

periferia, característica que además de darle valor agregado al momento de clasif icar las

células, parece estar relacionado con el estado de desarrollo neuronal (Troy et al., 1990).

3.2.3.2. NEUROPÉPTIDOS Desde que las técnicas en inmunoquímica y en separación, purif icación e identif icación de

proteínas lo permitieron, los neuropéptidos han sido los marcados bioquímicos más

importantes y eficaces para la clasif icación de las subpoblaciones neuronales en el GRD.

Son moléculas involucradas en la transmisión de los impulsos nerviosos desde la periferia

hasta el SNC, en la inflamación neurogénica que promueve la liberación de histamina vía

monocitos, la regulación del f lujo sanguíneo y la sobreexpresión de neurotrofinas

especiales en respuesta a lesiones de los nervios periféricos y f inalmente en la respuesta

inmunológica actuando como factores quimiotácticos e inmunes sobre las células inmunes

(revisado por Castellanos JE, 2002). A continuación se describirán de algunos de los

neuropéptidos que muestran una clara distribución diferencial entre las neuronas

sensoriales anteriormente clasif icadas como subtipos divergentes, conectando así los tres parámetros de clasif icación.

Taquicininas

Este tipo de neuropéptidos hace relación a un gen conocido como el gen

preprotaquikinina A que es expresado en la totalidad de las neuronas sensoriales

primarias como tres ARNm diferentes que dan origen a productos proteínicos que

contienen dentro de sus secuencia la sustancia P (SP). Los productos completos son la

neurokinina A producida por dos de los ARNm y el neuropéptido K producido por el

mensajero restante (Weihe et al., 1989). Interesantemente, altas concentraciones de

ARNm de este gen fueron encontradas dentro de las neuronas pequeñas en relación a la

densidad de mensajero encontrado en las células grandes. Específ icamente la sustancia

P, es el neuropéptido por el cual se pueden clasif icar las neuronas dentro del GRD debido

93

a que se encuentran principalmente en neuronas de diámetro pequeño y mediano.

Además de haber sido el primer neuropéptido en ser descrito en los GRDl como

neurotransmisor, sus porcentajes varían según la sección vertebral analizada, con

porcentajes mayores al 30% en los ganglios dorsales lumbares y menores al 10% en las

regiones cervicales, mostrando un patrón de distribución muy similar al del péptido

intestinal vasoactivo (VIP) (Anand et al., 1983). Junto con la SP se encuentran otro tipo de

neuropéptidos como el péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP), la

somatostatina (SOM) y el VIP, lo que plantea una posible relación funcional entre estos

marcadores bajo un contexto dependiente de especie, dado que estas relaciones son más

fuertes en modelos felinos que en modelos murinos. Por otro lado, los estudios que

intentan asociar este neuropéptido con otros marcadores como enzimas o carbohidratos

no han mostrado ningún patrón claro de sobrelapamiento. En humanos, los porcentajes

de neuronas inmunoreactivas para SP en tejido de individuos mayores de 60 años ha

mostrado valores que superan los establecidos en ratas (44%), lo que permitiría asociar

preliminarmente (debido a la ausencia de tejido humano joven como control) los

fenómenos de senescencia con la disminución en las neuronas sensoriales grandes que

como resultado mostraría un porcentaje total mayor de neuronas pequeñas y medianas y

por ende unos resultados como los obtenidos por Holford y su grupo de colaboradores en

1994 (Holford et al., 1994). Sorprendentemente, los valores in vitro contrastan con los

datos anteriores. En cultivos de GRD, el número de neuronas positivas para SP

disminuye a valores cercanos al 28% por la ausencia de factores neurotróficos como en NGF (Neural Growth Factor o Factor de Crecimiento Nervioso) y otras moléculas que

regulan y mantienen el fenotipo neuronal que in vivo son suministrados por las células de

soporte periférico (Muldery PK, 1994) y que si son suministrados a cultivos de GRD en

desarrollo retoman sus niveles de reactividad a SP normales (Ninomiya et al., 1994). Por

otra parte, estudios mecanoceptivos y nocioceptivos han mostrado que la SP es liberada

durante fenómenos de inflamación desde las terminales periféricas en neuronas

desarrolladas, y desde las terminales centrales de las neuronas aferentes primarias en

procesos todavía no esclarecidos, lo que permite establecer, junto con datos que

muestran hasta cuatro veces más SP en terminales periféricas, que la función principal de

las sustancia P está relacionada con funciones periféricas más que centrales (Law son SN

en Scott SA, 1992).

94

Péptido relacionado al gen de la Calcitonina (CGRP) Presente entre el 30% al 50% de las neuronas del GRD en murinos, el CGRP se

encuentra mayoritariamente en neuronas pequeñas. Adicionalmente también presenta

una mayor densidad en este tipo de neuronas como lo demuestra la intensidad descrita

después de tratamientos de tinción citoplasmática (Castrignano et al., 1990). De las dos

isoformas existentes, aCGRP es predominante en neuronas grandes mientras que

bCGRP se encuentra en mayor proporción en las células pequeñas y medianas. Al igual

que la sustancia P este neuropéptido se encuentra en coexistencia con otros muchos

(SOM, VIP, FRAP, bombesina, etc) dependiendo de la especie de mamífero y sección

vertebral analizada. En relación a las velocidades de conducción (f ibras C y f ibras A) no

parece existir patrón alguno, pues sin importar la concentración o isoforma del CGRP las

velocidades cubren un amplio rango. Sin embargo, se ha visto que las neuronas

medianas y grandes con presencia de aCGRP son también RT97 positivas (NF+), poseen

f ibras principalmente del tipo A y poca SP en contraste con las neuronas pequeñas en las

cuales la concentración de SP es mayor, poseen tanto aCGRP como bCGRP y el

porcentaje de f ibras A y C parece ser igual . Funcionalmente se ha observado que el

CGRP también es sobreexpresado y liberado preferencialmente en comparación con

otros neuropéptidos en episodios de inflamación neurogénica (Law son SN en Scott SA,

1992) debido a que puede inhibir la endopeptidasa encargada de desactivar a la SP (Ju et

al., 1987).

Somatostatina Presente principalmente en la región lumbar y tan solo entre un 5% a un 15% de la

totalidad de las neuronas del GRD, la somatostatina o SOM está presente

mayoritariamente en la neuronas sensoriales pequeñas o medianas (Garry et al., 1989).

A diferencia del sobrelapamiento de casi todos los neuropéptidos en los diferentes

subtipos de neuronas, se ha observado que SOM se encuentra en ausencia con RT97 y

de CGRP, permitiendo corroborar los datos de Garry y colaboradores sobre la presencia

de este neuropéptido exclusivamente en un tipo de neuronas pequeñas probablemente

con presencia de f ibras C. Sin embargo, estos resultados también permiten plantear que

existen varios subtipos de neuronas pequeñas que utilizan por lo menos tres

neurotransmisores diferentes (Nagy et al., 1982). En cuanto a su localización tisular, se

ha visto la presencia de SOM en las neuronas de las terminaciones cutáneas, poca

95

presencia en la población muscular y casi nula en la visceral lo cual podría relacionarse

con una de las funciones de este péptido a nivel periférico: la atenuación de la respuesta

hiperinmune (O´Dorisio et al., 1985). Por otro lado, se ha visto a nivel central que la SOM

está involucrada en fenómenos de neurotransmisión termoreceptiva más no

mecanoreceptiva (Tiseo et al., 1990).

Otros Neuropéptidos Entre estos se encuentran polipéptidos como VIP (Péptido Intestinal Vasoactivo),

galanina, bombesina o péptido liberador de gastrina, colecitokinina (CKK), Arginina

vasopresina, oxitocina, serotonina/5HT, péptidos opioides, el péptido natriurética atrial y el

factor liberador de la hormona de crecimiento. Sin embargo la información es muy

limitada y nuevamente se ha corrido con resultados poco concluyentes debido a la

presencia de la reactividad cruzada.

La molécula VIP se encuentra involucrada en la glicogenólisis y la utilización de glucosa

en neuronas dañadas (Shehab et al., 1986) así como en fenómenos de vasodilatación, de

ahí que su hallazgo no sea generalizado a lo largo de los GRD. Sin embargo, localización

con la tinción colchicina ha revelado que se encuentra preferencialmente en neuronas

medianas y pequeñas de la sección torácica coexistiendo con la SP y CGRP, aunque

estudiado en modelos animales diferentes.

La galanina o GAL se encuentra principalmente en neuronas pequeñas, comprometiendo

el 15% de la población total de neuronas sensoriales, y ubicada en la región lumbosacral. Con un bajísimo porcentaje de colocalización con SP (0% al 2%) se ha visto que la GAL

está involucrada en la inhibición de la liberación de su transmisor clásico evitando

fenómenos de transmisión desde neuronas dañadas.

La Arginina vasopresina y la oxitocina han sido reportadas mediante el uso de técnicas de

radioinmunoensayo (RIA) en el 50% de las neuronas del GRD, principalmente en

neuronas RT97 negativas (Kai-Kai MA, 1989). Por otro lado y debido quizás a la falta de

técnicas más sensibles, hasta el año de 1992 los resultados para estas moléculas a nivel

de expresión del péptido o de presencia de su ARNm eran muy contradictorios y poco

concluyentes con lo que la interpretación de su funcionalidad queda por establecer.

Ciertos péptidos opioides como la prodinorf ina A y B así como la leuenkefalina han sido

identif icados hasta en el 7% de las neuronas del GRD, especialmente en células primarias

aferentes de diámetro pequeño. Análisis de RIA en GRD humanos han demostrando que

96

la concentración de derivados de la leuenkefalina es mucho mayor que la de la

prodinorf ina y adicionalmente que el 95% de las neuronas positivas para dinorf ina lo eran

también para SP (Wehie et al., 1989).

De los neuropéptidos descritos al inicio de este capítulo, algunos no cuentan con

información concluyente o relevante por lo cual se han obviado. Sin embargo, uno de los

objetivos de esta sección es mostrar que existen una serie de parámetros bioquímicos

que aunque a veces parecieran contradictorios o parcialmente irrelevantes, si se colocan

juntos y se relacionan con las características funcionales y morfológicas adquieren una

gran utilidad al momento de describir exactamente una neurona del GRD; y tratando de

plantear una homología, como lo hiciera una clave dicotómica en biología evolutiva.

3.2.3.3. ENZIMAS Mediante anticuerpos monoclonales y el uso de técnicas de inmunocitoquímica e

inmunohistoquímica, se han encontrado neuropéptidos específ icos en las neuronas

sensoriales del GRD. De igual manera se han encontrado también algunas enzimas que

varían sus concentraciones, isoformas y umbrales de catálisis según los tipos de

neuronas previamente clasif icadas según parámetros morfológicos y f isiológicos. A

continuación se describirán algunas de estas proteínas catalíticas con base en lo descrito

por Sheryl A Scott (Scott SA, 1992).

Acetil Colinesterasa (AChE) y Colina Acetiltransferasa Como su nombre lo indica, esta enzima está involucrada en la regulación del

neurotransmisor acetilcolina. Debido a que este neurotransmisor se encuentra asociado

principalmente a neuronas motoras, el papel dentro de las diferentes subpoblaciones

neuronales dentro del GRD es todavía tema de discusión. Sin embargo su producto de

reacción –que refleja la presencia de la enzima en al menos el 50% de las neuronas- se

encuentra principalmente en neuronas de diámetro pequeño con o sin mielina, como lo

demostraron estudios realizados por Pannese y su grupo en 1974 y reportados por

Law son SN en 1992 (Scott SA, 1992). Adicionalmente, mediante la utilización de un

anticuerpo monoclonal para la enzima colina acetiltransferasa se pudo comprobar la

existencia de neuronas colinérgicas dentro del GRD que comprenden alrededor del 66%

de las neuronas sensoriales de diámetro pequeño (Sann et al., 1995). Juntos, estos

estudios demostrarían que las neuronas sensoriales del GRD usan la acetilcolina como

97

neurotransmisor y además son capaces de sintetizarla. Sin embargo la función de este

neurotransmisor en neuronas sensoriales es a la fecha motivo de discusión.

Fosfatasas Ácidas Identif icadas en la mayoría de las neuronas pequeñas del GRD, son en su mayoría

isoenzimas extralisosomales que se encuentran presentes en las neuronas SD y solo en

ausencia de los neuropéptidos SOM y SP. Dentro de este grupo se encuentra FRAP

(Fluoride Resistant Acid Phosphatase) que solo hasta hace unos años fue identif icada

como la misma TMP o tiamina monofosfatasa debido a su actividad y distribución dentro

de las subpoblaciones neuronales. Estudios posteriores mostraron que otros nucleótidos

podían servir como substratos para FRAP, constituyéndose como 5´GMP, 5´IMP y

5´AMP. A lo largo del nervio sensorial se ha encontrado la presencia de FRAP en

neuronas proyectadas hacia el tejido muscular y de la piel (Law son SN en Scott SA,

1992).

Adenosina Deaminasa (ADA) y Proteínquinasa C La enzima ADA se ha reportado en una pequeña proporción de neuronas SD del GRD

que comprende del 7% al 13% en un modelo murino. Debido a sus características

catalíticas, su presencia presupone que estas neuronas pequeñas utilizan las purinas

como transmisores y co-transmisores. Al igual que para enzimas como la fosfatasa ácida

FRAP, la presencia de ADA se caracteriza por no sobrelapar con neuropéptidos como SP, pero a diferencia de esta primera, todas las neuronas con marcaje inmucitoquímico para

ADA lo mostraron también para SOM lo que podría establecer relaciones funcionales

entre enzimas y neuropéptidos (Nagy et al., 1985).

Por otro lado, la Proteínquinasa C se ha encontrado en altas concentraciones en

aproximadamente el 45% de las neuronas grandes de los GRD lumbares y especialmente

en f ibras con presencia de mielina, lo que podría relacionar la actividad catalítica de esta

enzima con fenómenos de conducción neuronal. (Roivainen et al., 1990).

Tirosina Hidroxilasa (TOH) Esta enzima se encuentra relacionada con la síntesis de los neurotransmisores del grupo

de las catecolaminas como la dopamina. Estas moléculas son sintetizadas principalmente

en la médula de la glándula suprarrenal y son considerados como los neurotransmisores

98

de la mayoría de las f ibras nerviosas simpáticas postganglionares. Las moléculas

sintetizadas por la TOH actúan sobre las células efectoras al unirse a unos receptores

específ icos del tipo adrenérgicos que intervienen en la relajación intestinal, la

vasoconstricción, la dilatación de las pupilas, en el aumento de la frecuencia y

contractilidad cardiacas, la vasodilatación, la broncodilatación y la lipólisis. En el contexto

del GRD se ha observado que esta enzima participa en los fenómenos de desarrollo

neuronal y posiblemente en respuesta a neurotransmisión de carácter quimioceptivo y

propioceptiva debido a que se encuentra exclusivamente en neuronas pequeñas

dopaminérgicas y en concentraciones limitadas no mayores al 5% en secciones espinales

específ icas (Price et al., 1983 y Katz et al., 1985).

Anhidrasa Carbónica (CA) Esta enzima se encuentra presenta en una gran variedad de GRD. Hasta mitad de los 80

se creía que estaba presente exclusivamente en células gliales, sin embargo técnicas de

microscopía electrónica mejorada mostraron su presencia y localización entre el 20% y

38% de las neuronas grandes y medianas del GRD. Adicionalmente se ha probado que

aproximadamente el 95% de las neuronas CA+ son NF+ (probadas con el anticuerpo

RT97) y con presencia de mielina. La función de esta enzima, como de la mayoría de las

enzimas marcadoras neuronales, es incierta, pero se postula que está involucrada en

reacciones de decarboxilación en la síntesis de neurotransmisores y en la salida de estos

de la célula. Adicionalmente se cree que la CA también ayuda a regular el pH intracelular y los niveles de Cl- y H+ durante procesos metabólicos como la glicólisis y de

neurotransmisión (revisado por Castellanos JE, 2002).

Prostaglandina D Sintetasa La Prostaglandina D2 (PGD2) es el neuromodulador sintetizado por esta enzima. En un

contexto general, estas moléculas son derivados de los ácidos grasos que se encuentran

en casi todos los tejidos del cuerpo humano. Identif icadas por primera vez en 1935 por el

f isiólogo sueco Ulf von Euler, las investigaciones sobre su composición, estructura,

funciones y utilidad médica comenzaron a f inales de la década de 1960. En 1971, el

farmacólogo británico John Robert Vane demostró que las múltiples aplicaciones médicas

de la aspirina derivan de su capacidad para bloquear la producción de ciertas

prostaglandinas. A f inales de la década de 1970 se demostró que la acción de las

99

prostaglandinas era la causante del dolor, de los calambres musculares, de procesos de

inflamación y de la regulación en la coagulación sanguínea (Squire et al., 2002). Dentro

de las neuronas del GRD se ha encontrado que la PGD2 actúa sobre las f ibras

nocioceptivas tipo C (de conducción lenta) inhibiendo la conducción de Potasio activada

por Calcio así como promoviendo la liberación de neuropéptidos como la SP (Vesin y

Droz, 1995 en Castellanos JE, 2002).

3.2.3.4. RECEPTORES Y OTRAS MOLÉCULAS Receptor para Neurotrofinas Dentro del grupo de las neurotrofinas -proteínas de carácter heterogéneo encargadas de

mantener la homeóstasis neuronal y promover los procesos de desarrollo y diferenciación,

supervivencia y mantenimiento de neuronas centrales y periféricas-, la más conocida y

estudiada es el Factor de Crecimiento Nervioso (NGF). Sin embargo estudios

ontogénicos del SNP han demostrado que durante los diferentes estados de desarrollo

neuronal se encuentra la presencia diferencial de otras neurotrofinas como la Neurotrofina

3 (NT3) y el Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF), y que la ausencia de estas

promueve fenómenos apoptóticos (Rich KM, 1992 y Mannes et al., 1994 en Castellanos

JE, 2002). En relación a los receptores para estas proteínas, se han descrito dos tipos

principales: los receptores de alta afinidad caracterizados por la presencia de un dominio

tirosina quinasa (Trk A para NGF, Trk B para NT3 y Trk C para BDNF) y los receptores de

baja afinidad como p75NTR. Dentro de las neuronas pequeñas (CGRP+, SOM- y TMP-) aproximadamente el 40% son inmunoreactivas para el receptor de NGF (Trk A) lo que

coincide con los niveles de ARNm que varían entre el 35% y el 40%. Los otros dos

receptores se encuentran entre el 5% y el 17% de las neuronas sensoriales,

especialmente grandes y medianas. Todas las neuronas positivas para alguno de los

receptores de neurotrofinas muestran marcaje para el receptor de baja afinidad, lo que

permite postular que p75NTR esta asociado con la formación y funcionalidad de los Trk

(Kashiba el al, 1997 en Castellanos JE, 2002).

Receptor Nicotínico de Acetilcolina (RNACh) A nivel molecular se han descrito 11 genes diferentes que se expresan exclusivamente a

nivel neuronal que codif ican para las subunidades que forman los diferentes isotipos de

este receptor (Castellanos et al., 2001). En neuronas de todos los tamaños dentro de los

100

GRD se ha encontrado mediante técnicas de hibridización in situ, la presencia de la

subunidad a3 en el 19% de las neuronas y a4 en el 8% de las mismas. Desde esta

perspectiva el RNACh parece no tener las características necesarias para constituirse

como un parámetro de clasif icación de las subpoblaciones del GRD, sin embargo,

estudios más profundos podrían encontrar diferencias en la constitución del RNACh entre

las diferentes subpoblaciones de neuronas en los GRD.

Receptor de Glucocorticoides Los glucocorticoides son hormonas esteroides derivadas de la corteza de las glándulas

suprarrenales. Son moléculas esenciales para el metabolismo y la reacción del organismo

ante situaciones de estrés. También inhiben diferentes mecanismos del sistema inmune a

múltiples niveles. Son potentes antiinf lamatorios e inmunosupresores, características que

podría relacionarlos con neuropéptidos como la SP y el CGRP. Estas hormonas son

empleadas en cuadros clínicos graves como asma, enfermedades autoinmunes o rechazo

de transplantes. En el GRD el receptor para esta hormona se encuentra en neuronas

GAL+, SP+ y CGRP+ con porcentajes de localización que varían entre el 30% y el 50%

(revisado por Castellanos JE, 2002) lo que lo relaciona con neuronas de diámetro

pequeño.

Serotonina y Glutamato

También conocida como 5-Hidroxitriptamina la Serotonina es un neurotransmisor que interviene en la transmisión de mensajes a través de las sinapsis o uniones entre células

nerviosas adyacentes. Actúa como vasoconstrictor, inhibe la producción de ácido

clorhídrico en el tracto digestivo y estimula la contracción de la pared intestinal. Su función

en el sistema nervioso central y sus efectos en los cambios de comportamiento están

siendo objeto de distintos estudios de investigación. La serotonina se forma a partir del

triptófano y en el proceso de neurotransmisión es liberada de una célula nerviosa o

neurona a otra, dando lugar a la formación de un impulso nervioso, que puede traducirse

en la estimulación o inhibición, según los casos, de una actividad celular. La serotonina,

después de su actuación, pasa de nuevo del espacio sináptico a la neurona que la liberó,

para ser reciclada y reutilizada en otra ocasión, o bien es procesada y convertida en una

molécula inactiva. Durante mucho tiempo se creyó que las neuronas del GRD no

presentaban Serotonina. Sin embargo, en 1983 mediante el uso de una prueba de

101

f luorescencia con triptófano marcado se encontró que una pequeña cantidad de células

utilizaba este neurotransmisor (DiCarlo V, 1983). Sorprendentemente, dentro del GRD no

solo las neuronas presentan niveles considerables de Serotonina. Los mastocitos, células

no neuronales presentes en el ganglio, también son inmunoreactivas para esta molécula.

Debido a que el fenotipo de estos mastocitos es muy similar al de las neuronas pequeñas

fue necesario implementar el método de coloración con Azul Alción al 1% en el que a pH

ácido solo las células no neuronales pequeñas se tiñen. Bajo este criterio se pudo

estimar que entre el 7% y 9% de la población total de neuronas en los GRD utilizan este

neurotransmisor, posiblemente durante fenómenos de transmisión sensorial nocioceptiva

(Kai-Kai et al., 1985 en Castellanos JE, 2002). Estudios llevados a cabo a principios de

las década de los 90 mostraron que en modelos In vitro de GRD los porcentajes de

Serotonina se elevaban a valores superiores al 40% quizás en relación a fenómenos de

regeneracion neuronal. In vivo, se ha probado que la expresión de Serotonina es inhibida

por el contacto de las células del ganglio con secciones vertebrales más externas (Sheryl

SN en Scott SA, 1992).

En cuanto al Glutamato, sintetizada por la enzima Glutamina sintetasa, los estudios no

han sido muy concluyentes, pues como es de esperarse, la presencia o ausencia de un

aminoácido esencial dentro de un subtipo neuronal definido no puede ser considerado

desde el punto de vista funcional. Sin embargo este aminoácido se ha encontrado en

neuronas grandes del GRD de la sección lumbar mediante el uso de anticuerpos dirigidos

hacia un conjugado coloidal glutamato- oro y entre el 16% al 18% de las neuronas pequeñas de las secciones torácicas y cervicales mediante el uso de un anticuerpo

dirigido hacia un conjugado glutamato-hemocianina así como mediante la determinación

indirecta mediante la cuantif icación de la enzima Glutamina sintetasa o Aspartato

aminotransferasa (Cangro et al., 1985 en Castellanos JE, 2002). Por otro lado, dentro de

las poblaciones no neuronales del ganglio se ha encontrado la presencia en el 53% de las

mismas en forma de L-Glutamato que es convertido a L-Glutamina y transferido al 40% de

las neuronas SD donde vuelve a su forma original (Duce et al., 1983 en Castellanos JE,

2002).

GAP-43/Neuromodulina y Proteínas de Unión de Calcio

GAP-43 (o B50) es una fosfoproteína asociada al desarrollo y crecimiento neuronal así

como en la regeneración del GRD. Análisis de hibridización In Situ han mostrado la

102

presencia de ARNm para GAP-43 en correlación con el ARNm para NGF corroborando

así su función complementaria en el desarrollo neuronal. Sin embargo, como parámetro

de clasif icación neuronal no es muy útil pues se ha demostrado que virtualmente todas las

neuronas del GRD expresan esta proteína (Verge et al., 1990 en Scott SA, 1992).

La calbindina y la parvalbúmina son las dos proteínas de unión a Calcio de mayor

importancia en el contexto de clasif icación neuronal. La primera de estas se encuentra

principalmente en neuronas pequeñas en relación con la segunda, mientras que la

parvalbúmina se encuentra exclusivamente en neuronas tipo L (o grandes). Se ha

propuesto que estas proteínas están involucradas en los fenómenos de conducción de

señales eléctricas a través de las neuronas mediante la regulación de los iones Ca2+

(Carr et al, 1989), propiedad que podría relacionar la presencia de estas proteínas con el

patrón de mielinización de las neuronas y la presencia de f ibras axónicas tipo C y tipo A

(ver capítulo 3.2.2).

Moléculas de Superficie Celular Principalmente oligosacáridos, estos marcadores membranales son ampliamente

utilizados en la identif icación y clasif icación de subpoblaciones neuronales en el GRD

debido a su alta reactividad ante lectinas y anticuerpos de unión específ ica. Durante

muchos años se ha sugerido que estos glicoconjugados están involucrados en la

recepción y transmisión de señales de desarrollo neuronal y axonal mediante

interacciones célula-célula específ icas determinadas por la presencia de epítopes únicos (Scott et al, 1990). Esta última característica es de especial interés en el contexto de

clasif icación neuronal. Trabajos llevados a cabo con la ayuda de técnicas

inmunocitoquímicas, han revelado que las terminaciones lactosa son predominantes en

las neuronas pequeñas del GRD mientras que las terminaciones glucosa son expresadas

en neuronas de tipo mediano y grande. Aunque existen una gran cantidad de anticuerpos

y lectinas –de origen vegetal, especialmente granos- para la identif icación de las neuronas

en relación a sus moléculas no proteínicas de membrana, la mayoría solo corroboran los

resultados que fueron resumidos en función de terminaciones lactosa o glucosa (Regan et

al, 1986 en Castellanos JE, 2002).

103

3.3. DESARROLLO DE LAS NEURONAS SENSORIALES

El origen de los GRD se remite a la cresta neural. Trabajos publicados en la mitad del

siglo XIX hacían referencia a la cresta neural como cresta gangliónica, a raíz de estudios

ontogénicos que relacionaban estas dos estructuras. Sin embargo, solo hasta 1924 se

pudo comprobar la relación directa. RG Harrison reprodujo modelos anfibios sin la

presencia de GRD tras la extirpación de la parte más dorsal del tubo neural en etapas

iniciales del desarrollo. Sin embargo, solo las técnicas de marcaje específ ico con timidina

H3 logradas a mitades del siglo pasado pudieron trazar con exactitud el desarrollo y

distribución del precursor neural y su relación con la formación y desarrollo de los cuerpos

espinales (Teillet et al., 1992).

3.3.1. BASES CELULARES Y MOLECULARES Los métodos clásicos de substitución de secciones específ icas del precursor neural por

una contraparte generalmente isotópica, abrió las puertas para la descripción de los

fenómenos de desarrollo desde una perspectiva general del GRD como órgano del SNP

que conduciría con los años al entendimiento del fenómeno a nivel celular y molecular.

En el curso de la tercera semana de desarrollo en los mamíferos se forma el tubo neural,

precursor del sistema nervioso. En la cara dorsal del embrión empiezan a formarse masas

de tejido muscular llamadas somitas, de las que surgirán los principales órganos y

glándulas. Con un origen ectodermal, las células que han de dar origen a cada uno de los

GRD provienen de la cresta neural y colonizan cada una de las secciones anteriores de las somitas (Teillet et al., 1987). El fenómeno de colonización es un fenómeno de

migración lateral y longitudinal desde la cresta neural y la somita anterior hacia el tejido

muscular nuevo, corroborando la hipótesis sobre la intrincada red que rige el SNP.

Recientemente se ha probado la existencia de macromoléculas específ icas cuya función

está fuertemente relacionada con la correcta migración de las células precursoras desde

la cresta neural a través de los cuerpos somíticos. Muchas de estas moléculas han sido

descritas desde hace un par de décadas y comprenden grupos heterogéneos de enzimas,

proteínas estructurales o proteínas con funciones putativas de receptores.

Específ icamente, la enzima butirilcolinesterasa, la laminina, las proteínas extracelulares

tenascina/citotactina y los epítopes relacionados a adhesión HNK-1/L2 han sido descritas

durante la fase migratoria de las células de la cresta neural en una localización tanto

rostral como caudal. Aunque hipotéticas, sus funciones se han visto relacionadas con la

104

regulación en la migración celular y axonal y la inhibición del sobrecrecimiento neuronal,

así como en la regulación del tamaño f inal del GRD. De igual manera, el entorno somítico

que rodea las células precursoras de la cresta neural determina la morfología y f isiología

de las neuronas que han de dar origen al GRD. La segregación celular parece estar

determinada por un tipo de precursor que da origen a la línea sensorial y a la línea

adrenérgica (autonómica). Después de la migración del precursor bipotencial, la

gangliogénesis da origen a células sensoriales cerca del SNC de donde obtienen

probablemente un patrón de factores de crecimiento específ ico y a células no neuronales

inespecíf icas provenientes de la línea adrenérgica. Por otro lado, las células que se

encuentran fueran del perímetro bioquímico establecido por el SNC, son principalmente

del tipo adrenérgico pero sin embargo, en esta localización esta línea precursora da

origen a células del sistema neuronales pertenecientes al sistema nervioso autónomo. A

nivel bioquímico se ha reportado que factores como BDNF, NGF, NT3 y bFGF (Factor de

Crecimiento de Fibroblastos) son en parte los encargados de dirigir a las poblaciones

pluripotenciales que migran desde la cresta neural hacia un fenotipo de neurona sensorial

y fomentar la supervivencia de las células y sus prolongaciones neuríticas (Teillet et al. en

Scott SA, 1992).

3.3.2. REGENERACIÓN Y PLASTICIDAD IN VITRO La capacidad de regeneración neurítica en las neuronas del GRD es una característica

esencial que favorece la representatividad de los cultivos que se obtienen. Así, las neuronas sensoriales primarias generan alteraciones celulares seguidas del daño axónico

periférico. Dentro de estas alteraciones se encuentra la reorganización del metabolismo

del soma, la reducción de la síntesis de sustancias asociadas con la transmisión neuronal

y un aumento en la expresión de proteínas, neuropéptidos y otras moléculas asociadas al

crecimiento axónico; así como una posible sobreexpresión de moléculas antiapoptóticas

que favorecen la supervivencia celular. Hay una sobreregulación en la síntesis y

transporte axonal de actina y tubulina y una desregulación de la síntesis y transporte de

NF. Así, la desintegración parcial del citoesqueleto formado por NF axónico conduce a

una extensión de las ramificaciones terminales, al mismo tiempo que la sobreregulación

de la actina, tubulina y periferina provee la base para la producción de nuevos elementos

axónicos (Scott SA, 1992).

105

Los cultivos de GRD representan un buen modelo para el estudio de la función de las

terminales sensoriales primarias, las cuales son de difícil acceso debido a su tamaño, así

como para estudios de comportamiento neuronal como la plasticidad, supervivencia y

regeneración. Así mismo, son útiles para el estudio de la función de factores de

crecimiento, sustancias tóxicas y patógenos, especialmente virales.

Los GRD pueden ser extraídos a partir de diversos animales y diferentes estados de

desarrollo. Inicialmente fueron muy utilizados los GRD de embriones de pollo, ya que

estos proporcionan una alta cantidad de neuronas por ganglio y la remoción y disección

de los embriones es muy fácil de realizar, además, de su fácil mantenimiento y

disponibilidad. Luego se empezaron a utilizar los cultivos de ratones, los cuales aunque

ofrecían menos neuronas por cada ganglio pero de tamaño relativamente mayor. Aunque

los cultivos embrionarios de ratón son ampliamente usados para muchos estudios

relacionados principalmente con el desarrollo y diferenciación del sistema nervioso, los

estudios de adultos también ofrecen numerosas ventajas para otros tipos de estudios,

como el de factores extrínsecos que controlan la regeneración nerviosa, y los implicados

con variaciones del ambiente, estados de una enfermedad y efectos de la edad en el SN.

Además, a diferencia de los embrionarios, los cultivos de ratón adulto presentan células

no neuronales que proliferan a una tasa muy baja durante los tres primeros días del

cultivo y las neuronas se degeneran menos que en ratones embrionarios haciendo a este

modelo más representativo. Para estudios de interacción con receptores virales, por

ejemplo, es más conveniente el uso de ratones adultos pues los cultivos de ratones neonatales o embrionarios necesitan suplementos como factores tróficos cuyos

receptores pueden ser los mismos que para los virus estudiados (Castellanos et al, 2002

en Corso X, 2004).

106

4. VIAS APOPTÓTICAS Y DE SUPERVIVENCIA NEURONAL ACTIVADAS POR INFECCIÓN CON VIRUS RABIA Los capítulos anteriores tuvieron como objetivo servir de marco general para abordar

desde una perspectiva celular, bioquímica y genética el problema que desde hace unas

décadas viene desarrollando la investigación con el RABV. La rabia es una de las

enfermedades de las que se tienen registros más antiguos, y actualmente aunque los

casos de infección reportados son menores que en otras enfermedades virales, sigue

cobrando más de 50000 vidas humanas anuales según estimaciones de la OMS, sin

considerar el millón de personas que reciben tratamiento post-exposición (Strauss, 2002).

Además de su carácter letal, el RABV posee una característica muy especial de la cual se

hará cargo este capítulo: se transporta desde la periferia a través de las neuronas tanto

sensoriales como motoras hasta el encéfalo sin despertar ningún tipo de respuesta

antiviral: sea apoptótica, inf lamatoria o inmune. Una vez en el encéfalo se manif iesta

violentamente a través de una encefalitis letal en el 100% de los casos.

Aunque la vacuna profiláctica ha sido efectiva desde el año de 1885 y los casos de

enfermedad rábica post-vacunación han sido extensamente estudiados debido a su poca

prevalencia, solo hasta hace un par de décadas se ha estudiado el papel de la respuesta

inmune en la patogénesis de la enfermedad. Adicionalmente, hace un poco más de 20

años que la encefalitis viral por RABV es considerada como el resultado inmediato y

directo de una disfunción neuronal severa como lo revelan los estudios electrofisiológicos en el encéfalo (Chopra et al, 1980). En la f isiopatología de la infección, es necesario

aclarar que la infección por este Rabdovirus se manif iesta de dos formas clásicas: rabia

paralítica causada posiblemente por un virus poco neurotrópico e inductor de apoptosis y

subsecuentemente de respuesta linfocitaria en el SNP y rabia furiosa causada por lo

general por un virus altamente neurotrópico y con patrones de evasión de la respuesta

apoptótica e inmune elevados.

La manifestación paralítica durante mucho tiempo se ha venido diagnosticando

erróneamente como síndromes como el de Guillain-Barré o con desórdenes autoinmunes

de los nervios periféricos, pues aunque las Imágenes de Resonancia Magnética (MRI por

sus siglas en inglés) son bastante útiles en el diagnóstico, no puede considerarse como la

prueba estándar de infección por RABV ni tampoco explica la gran diversidad de síntomas

de la rabia humana, pues existen imágenes MRI muy similares en infecciones con

107

sintomatología paralítica con f lavivirus, poliovirus o el virus del Nilo Oriental (Hooper C,

2005); Por otro lado, ni la distribución de antígenos virales ni la reacción inflamatoria

explica en las infecciones por RABV las anormalidades observadas en la MRI. Otro

hecho muy intrigante en la f isiopatología de la infección por RABV es la demielinización

de las neuronas y por ende la disminución en la velocidad de transmisión que se ha

presentado en algunos casos de infección rábica del tipo paralítico. Sin embargo, todavía

no se puede determinar si esta demielinización es una causa directa de la alteración del

citoesqueleto de actina causado por su interacción con el complejo RNP. Por otra parte y

en contraposición al electrodiagnóstico de la rabia paralítica, los hallazos en pacientes con

rabia furiosa demostraron que los patrones de mielinización y de conducción motora y

sensoriales permanecieron normales. En relación al fenómenos de MCP, en la infección

con una cepa altamente neurotrópica del RABV (CVS o Challenge Virus Standard, una

cepa de laboratorio o “f ija” y altamente neuroadaptada) se ha encontrado que las

motoneuronas de la médula espinal son resistentes a la citolisis y tienen deregulado el

proceso apoptótico en comparación con las células del hipocampo (Guigoni y Coulon,

2002). Por otro lado, estudios a nivel de respuesta inmune han mostrado que en los

casos de rabia paralítica se presentan diferentes grados de infiltración linfocitaria,

principalmente linfocitos T CD3+ e inflamación en la raíz dorsal y los nervios espinales

mientras que, en los casos de rabia furiosa la inflamación fue mucho menor y la presencia

de infiltrados linfocitorios y/o células mononucleadas fue prácticamente nulo.

Como lo resaltan los alemanes Finke y Conzelman en una reciente revisión sobre las estrategias de replicación del RABV, la evasión de la respuesta apoptótica e inflamatoria

es de vital importancia para la diseminación f inal del virus dado que debe ir acompañada y

da como resultado una completa integridad de la red neuronal (Lafon M, 2005),

característica que hace suponer que este virus recurre a mecanismos de transporte y de

replicación no convencionales para migrar desde las extremidades hasta el SNC sin

alterar a las neuronas que infecta. Hasta hace muy poco se creía que el daño que se

presenta en algunas poblaciones neuronales del encéfalo era de tipo necrótico, pero las

diferencias genéticas, bioquímicas y estructurales que fueron establecidas para este

fenómeno en relación con la apoptosis permitieron establecer que el daño neuronal dentro

del SNC pertenecía a este segundo tipo de muerte.

108

4.1. FENÓMENOS DE APOPTOSIS EN LA INFECCIÓN POR RABV Desde hace muchos años se sabe que la Glicoproteína G del RABV es la proteína de

unión del virus a su célula hospedera. En la actualidad se han descrito a los receptores

neuronales nAChR, NCAM y p75NTR como los responsables de la entrada y patogénesis

del RABV. Un estudio presentado a principios de 2002 en Journal of Virology por Faber y

Dietzchold de la Universidad Thomas Jefferson (Pennsylvania, EEUU) demostró,

mediante el uso de técnicas de inmunoprecipitación y análisis por citometría de f lujo, que

un virus obtenido a partir de una cepa vacunal de ADNc conocida como SPNB (ver Figura

25) construído para expresar dos unidades idénticas de glicoproteína G, además de

expresar dos veces más proteína que su contraparte parental, inducía una activación muy

marcada la caspasa 3 así como un disminución notable de la oxidación mitocondrial,

signos características de la actividad apoptótica. A diferencia de este virus recombinante

(pSPBNGA-GA) el parental silvestre infectaba células de una manera exitosa sin

despertar reacción alguna, confirmando la hipótesis que son los dominios de G así como

su expresión, los factores determinantes de la activación de la MCP y de una respuesta

inmune mediada por anticuerpos neutralizantes (Faber et al, 2002).

Aunque los resultados permiten reconocer a la proteína G como un fuerte factor inductor

de apoptosis, no permiten establecer como es que su deregulación conduce a los

fenómenos de evasión de la apoptosis y de la respuesta inmune.

Figura 25. Diagrama esquemático del genoma del virus recombinante util izado por Faber y colaboradores para comprobar que la glicoproteína del RABV está involucrada, según su concentación, en la inducción de apoptosis y posterior respuesta inmune. El vector SPBNGA contiene una secuencia adicional exacta a su parental. Figura tomada de Faber et al, 2002.

109

A su vez, estos resultados permiten postular una de las hipótesis más referenciadas en

muchas de los reportes de investigaciones en RABV: que las cepas virales más

neuropatogénicas son las de más baja inducción de apoptosis y con las tasas más

atenuadas de replicación y transcripción viral. Así, las cepas virales que producen

grandes cantidades de proteínas o de ARNm inducen la activación apoptótica y son

fácilmente eliminados del contexto celular mediante la generación de altas

concentraciones de anticuerpos neutralizantes (Conzelman et al, 2005).

De ahí que cepas del virus no neuroadaptadas y/o parcialmente atenuadas fueran

utilizadas en el pasado como cepas vacunales debido a la gran respuesta inmune que

despiertan y en situaciones patológicas generen cuadros de parálisis crónica no fatal que

hasta hace muy poco se relacionó con procesos de disfunción y muerte de las neuronas

motoras periféricas fenómeno in vivo que puede estar relacionado en parte con la

respuesta que se desencadena en las células gliales (astrositos y microglia) de la médula

espinal como resultado de la infección (Coulon et al, 2002). Los trabajos de Jackson

desde el año de 1997 permiten postular que la patogénesis del RABV en el SNC puede

deberse en parte debido a apoptosis en algunas subpoblaciones neuronales o que como

resultado de una disfuncionalidad, estas células inducen su apoptosis. Esta última

hipótesis surge a raíz de la evidencia electrofisiológica y el descubrimiento de diferentes

serotipos de RABV en murciélagos pone en duda esta afirmación. Aunque en algunos

estudios, la infección con cepas f ijas del virus muestran por lo general altas tasas de

fragmentación del ADN como signo inconfundible de apoptosis (Jackson y Rossiter, 1997). Inesperadamente, un estudio de inducción de apoptosis hecho en ratones

inoculados con un serotipo del virus conocido SHBRV (Silver Haired Bat Rabies Virus)

mostró niveles muy bajos de fragmentación a pesar de que los individuos infectados

mostraban signos clínicos de la enfermedad muy similares a los de los ratones inoculados

con virus CVS (Yan et al, 2001). Este último estudio pone en evidencia la hipótesis más

aceptada sobre la neuropatología del virus: daño electrofisiológico que conduce a una

encefalitis fatal. Sin embargo, el fenómeno apoptótico sigue siendo un patrón en los

ratones infectados experimentalmente con la cepa f ija CVS y, al menos en el SNC, es

más fuerte en la medida que se han identif icado más factores apoptóticos entre los que se

encuentran: el producto del gen Nedd-2 que ha sido catalogado como un gen sobre-

regulador de la respuesta apoptótica en procesos de desarrollo neuronal pero que se

reactiva durante infecciones por RABV, la enzima inducible oxido nítrico sintasa (iONS)

110

cuyo producto fue recientemente identif icado como un promotor de la muerte celular y el

complejo Fas/FasL que media la ruta extrínseca de la apoptosis clásica. En el primer

reporte sobre apoptosis y neuroinvasión por RABV, células de adenocarcinoma prostático

de rata (AT3) fueron infectadas con la cepa CVS. Las características morfológicas de la

infección mostraron condensación citoplasmática y de la cromatina al igual que

fragmentación del ADN mediante la prueba de TUNEL y sobreexpresión de la proteína

pro-apoptótica Bax. En el mismo estudio ratones ICR inoculados intracerebralmente con

esta misma cepa compartían estas características de apoptosis especialmente en la

región del hipocampo y la corteza cerebral (Jackson y Rossiter 1997). A partir de este

punto, Jackson y colaboradores han explorado diferentes cepas y mutantes de diferentes

cepas del RABV con el f in de describir las diferentes bases moleculares de la propagación

y patogénesis viral. Así, esta evidencia podría signif icar que la MCP está relacionada con

la patogénesis de la enfermedad rábica en estadíos f inales de la disfuncionalidad

neuronal, proponiendo la apoptosis como resultado de la disfunción y no como causa. Sin

embargo, estudios más profundos se necesitan para comprobar esta hipótesis.

Como lo demostró el estudio realizado por Faber y colaboradores en 2002, la activación

de caspasa 3 está mediada por la proteína G, al menos en virus recombinantes vacunales

no neuroadaptados. Esta misma clase de cepas virales atenuadas, como la cepa Pasteur

(PV) o la cepa Evelyn Rotkitniki Abelset (ERA) han mostrado la capacidad de activar

factores proapoptóticos como las AIF, mientras que las cepas altamenta patogénicas

como la CVS fomentan la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 como se muestra en la Figura 26, diagrama perteneciente al trabajo realizado por Thoulouze y colaboradores en

el 2003. Sorprendentemente, el mecanismo de sobreexpresión de Bcl-2 parece ser

utilizado por el virus para controlar la supervivencia de las células que infecta. En este

estudio reportaron por primera vez a las cepas neurotrópicas del RABV como entidades

subversivas que regulaban de forma natural la expresión de esta proteína anti-apoptótica,

al menos en cultivos celulares de células de origen linfoide (Jurkat T) transfectadas con

una copia del gen humano bcl-2. Eventualmente este mecanismo de evasión de

respuesta apoptótica debe estar controlado directa o indirectamente por alguna proteína

viral para el establecimiento de una infección a largo término como lo propone Thoulouze

en este trabajo. Sin embargo, hasta el momento los estudios no han establecido la

naturaleza de dicha relación.

111

Figura 26. Modelo propuesto por Thoulouze et al, 2003 para la inducción de apoptosis en cepas no neurovirulentas de RABV. La infección por RABV no patogénico activa dos rutas apoptóticas secuenciales: la translocación de la proteína independiente de caspasas AIF (24H p.i) seguida por la activación de las vías dependientes de caspasa (72H p.i). Ambas rutas son inhibidas por la sobreregulación de Bcl-2 en infecciones con cepas RABV neuroadaptadas. Figura tomada de Thoulouze et al, 2003. Debido a la gran dif icultad que conlleva la obtención de cultivos primarios de neuronas

sensoriales y la interpretación de los resultados debido a las múltiples subpoblaciones

presentes en estos (como es el caso de los cultivos de GRD), las técnicas de genética

reversa y de proteínas virales f luoro-marcadas han permitido dar un paso importante en la descripción de la biología molecular de la infección por RABV. De momento se cree que

este Rabdovirus previene la muerte celular en el SNP mediante una interferencia directa

con factores apoptóticos, mediante la sobreregulación de moléculas antiapoptóticas y

f inalmente bajo una estrategia de subversión basada en mantener los niveles de

expresión de los genes virales por debajo de los estándares óptimos con lo que

garantizaría pasar desapercibo ante moléculas de respuesta a infecciones como Nf-kB.

Trabajos de trazado neuronal de la infección llevados a cabo hace más de 10 años

encontraron que el movimiento del RABV está acompañado por una asombrosa

preservación de las funciones neuronales que va acompañada por hallazgos de ARNm

muy limitados de proteínas. Desde hace varios años, y basados generalmente en el VSV

112

como modelo, se ha visto que la atenuación en la expresión de los genes virales está

relacionada directamente con la posición que cada uno de ellos ocupa dentro del genoma

y las regiones adyacentes –conocidas como regiones intergénicas (RIG) o gene borders-

que poseen secuencias específ icas como se observa en la Figura 27 y por ende

estructuras de ARN secundario especiales que promueven una mayor o menor afinidad

por la polimerasa viral L y posteriormente por los ribosomas (Rose et al, 1981). Este

concepto se relaciona directamente con la teoría de la infección viral críptica, donde

muchos virus evitan la respuesta de defensa apoptótica mediante la regulación de sus

replicación y transcripción (ver capítulo 2.6).

Figura 27. Secuencia de las IGR o señales de transcripción en el RABV. Estas son secuencias consenso para el codon de parada y poliadenilación y el codon de inicio indicados en un orientación positiva. Figura tomada de Finke y Conzelman, 2000. Trabajos en genética molecular realizados por Finke y Conzelman en el año 2000

encontraron que el remplazo de tan solo 2 nucleótidos en la RIG que separa N y P y de 5

nucleótidos en la RIG P/M o M/G generaba cambios en la expresión que comprendían el

78% y 81% de subregulación genética, indicando que la atenuación está relacionada con

la longitud de la RIG. Adicionalmente encontraron que en cepas atenuadas como la SAD

(L16, TigGL, T y T2) las regiones intergénicas estaban involucradas en la mayor

expresión de proteínas virales, mayores títulos virales e inducción de efectos citopáticos.

En este estudio se hace énfasis en la regulación de la polimerasa viral L que ofrece

ventajas tanto a las cepas silvestre y cepas de laboratorio neuroadaptadas mediante su

113

subregulación, controlando la tasa de transcripción y replicación viral como un

mecanismo para evadir respuesta inmune y apoptótica (Finke y Conzelman, 2000).

Además de la glicoproteína G, que ya fue descrita como una fuerte inductora de

apoptosis, los virus recombinantes obtenidos a partir de ADNc desde 1995 han permitido

demostrar la importancia de otras proteínas virales en la inducción de apoptosis. La

primera en ser descubierta fue la proteína de matriz M. En 2004 se descubrió que un

mecanismo de inducción de apoptosis en neuroblastoma estaba dado por una ruta

extrínseca dependiente de TRAIL y caspasa 8. Se demostró que la decapsidación

(pérdida de G) y la presencia de proteína M en el citoplasma durante fenómenos de

replicación son factores determinantes para la inducción de la apoptosis vía TRAIL.

Aunque antes se había descrito a la proteína M como un factor regulador del switch entre

la transcripción y la replicación, este estudio postuló por primera vez a la proteína de

matriz como la responsable de activar una vía apoptótica en las células infectadas a

través de la deregulación del transporte citoplasmático y de la expresión celular al unirse a

la nucleoporina Nup98 (Kassis et al, 2004). Sin embargo hasta el momento no se ha

establecido con claridad la función de la proteína M dentro del programa de evasión de la

MCP y solo se puede afirmar que en concentraciones bajas evitan la activación

apoptótica, al igual que para la proteína G. No existen datos experimentales que prueben

mecanismos de interferencia de las proteínas virales con las cascadas apoptóticas, así

que el fenómeno de subregulación de la transcripción y la replicación, o infección críptica,

puede ser considerado como la esencia misma de la evasión de la apoptosis. En un contexto general, la proteína M es un factor viral encargado de regular la síntesis del ARN

evitando así respuestas inmunes basadas en el reconocimiento de epítopes de ARN o

mecanismos como el ARN de interferencia. La proteína M interactúa con el complejo

RNP disminuyendo la actividad de transcripción al tiempo que promueve la replicación

viral. Específ icamente, la capacidad de balancear estos dos procesos parece encontrarse

en la presencia de un solo aminoácido: la arginina en la posición 58 de M (Finke and

Conzelman, 2003). El mecanismo por el cual esta proteína promueve el cambio de

transcripción a replicación es motivo de estudio pero se postula que está en íntima

relación con las concentraciones de proteínas virales así como con estructuras

secundarias en el ARNv.

Adicionalmente se ha encontrado que la fosfoproteína viral P también juega un papel

determinante en la supervivencia del virus dentro de las neuronas así como en el

114

mantenimiento de la estructura celular. En el año 2000 Raux y Blondel así como Jacob y

su grupo encontraron independientemente mediante la técnica de interacción proteína-

proteína conocida como Yeast Two-Hybrid, que la fosfoproteína viral posee características

de unión a la Cadena Liviana de la Dineina (LC8), una proteína citoplasmática que forma

un complejo motor involucrado en el transporte retrogrado axonal. El hecho que sea una

proteína del complejo RNP la que está en contacto con este mecanismo de transporte

permitiría plantear que el RABV se transporta intracelularmente desde las neuritas hasta

el soma como un agregado RNP. Adicionalmente, fue propuesto por estos mismos

autores que la unión del RNP a la LC8 podía constituírse como un mecanismo de evasión

de la respuesta apoptótica más que un mecanismo de transporte, pues en 1999 se

estableció que esta molécula motora se unía al factor pro-apoptótico de la familia Bcl-2

conocido como Bim para formar un complejo dentro del citoesqueleto encargado de

monitorear la actividad y el bienestar celular. Bajo algunos tipos de estrés, el

citoesqueleto pierde su integridad y en ese caso el complejo Bim-LC8 es liberado y se

dirige a bloquear la acción antiapoptótica de Bcl-2 (Raux et al., 2000; Jacob et al., 2000).

Adicionalmente, Jackson y colaboradores probaron que la unión P-LC8 no estaba

relacionada exclusivamente con el transporte celular. La exposición a una cepa parental

altamente patogénica –al menos en ratones lactantes- obtenida a partir de ADNc -

conocida como SAD-L16 y derivada de la cepa original SAD-B19 o cepa Street Alabama

Dufferin- y un mutante para el dominio de unión con LC8 presentaba patrones similares

de dispersión y de encefalitis que la cepa parental, donde la única diferencia se constituía en la infección tardía y más sectorizada en el encéfalo (Jackson et al, 2005). Sin

embargo evidencia directa que vincule la unión P-LC8 con un fenómeno de subversión

celular todavía no está disponible y tan solo se pueden plantear hipótesis atractivas que

relacionen el fenómeno de transporte axonal retrogrado con la inhibición de la apoptosis

vía Bim. Recientemente Blondel y colaboradores han presentado más evidencia que

relaciona a la fosfoproteína del RABV con el fenómeno de evasión de la respuesta

antiviral. Dentro de las estrategias más utilizadas por los virus para evadir la respuesta

inmune se encuentra la inhibición del sistema Interferon (IFN). Algunos virus han

desarrollado mecanismos de inhibición física del IFN, de deregulación de los genes

responsables de su síntesis, de inhibición de los factores de transcripción que promueven

su producción o indirectamente mediante el bloque de la transducción de las señales que

los IFN generan. Siguiendo la misma técnica de interacción proteína-proteína este grupo

115

encontró una interacción física con STAT (Signal Transducer and Activator or

Transcription 1), una proteína cascada abajo de la respuesta vía IFN y encargada de

servir como factor de transcripción de genes antivirales como 2´-5´-OAS, PKR o PML.

Esta interacción P-STAT1 efectivamente bloqueó la respuesta IFN mediante la inhibición

de la acumulación de STAT en el núcleo debido a que la fosfoproteína se ubicó sobre el

dominio de unión al ADN de STAT1 (Blondel et al, 2005). Adicionalmente, Blondel

describió en el año 2002 la interacción de algunas de las formas truncadas de P con

proteínas de los cuerpos celulares que han sido identif icadas como factores inductores del

sistema IFN (Blondel et al, 2002). Durante muchos años se ha establecido que uno de los

mecanismos más utilizados por los virus y más eficientes para evitar la respuesta inmune

es mediante la inactivación del JAK/STAT y por ende del componente IFN. Por primera

vez se demuestra que además del mecanismo descrito por Lafon y Baloul en el 2003, el

RABV utiliza estrategias altamente evolucionadas de subversión inmune.

Sorprendentemente, la simplicidad de este virus de ARN de cadena sencilla que solo

codif ica para 3 proteínas estructurales, una polimerasa y un cofactor, contrasta con la

versatilidad molecular que permite sin duda ubicarlo como un modelo más de evasión viral

de la respuesta inmune. Sin embargo, la estrategia esencial de interrupción del programa

apoptótico todavía sigue siendo un misterio, y aunque se tienen descritos los procesos

que el RABV promueve, todavía no se sabe que proteína viral y bajo que condiciones

celulares, se está generando esta respuesta.

4.2. FENÓMENOS DE RESPUESTA INMUNE EN LA INFECCIÓN POR RABV Pasando ahora a un plano más general, los trabajos de Baloul y Lafon en el 2003

probaron de manera cuantitativa los fenómenos de evasión de la apoptosis y su estrecha

relación con la evasión de la respuesta inmune, agrupando y corroborando muchas de las

hipótesis que separadas formaban el rompecabezas de la patogénesis e

inmunopatogénesis del RABV. Mediante el uso de técnicas en inmunohistoquímica y RT-

PCR se logró establecer que las cepas altamente neurotrópicas (como la cepa CVS o las

cepas silvestres) no solo evitan la apoptosis mediante subversión intracelular sino que

también limitan la respuesta inflamatoria característica de la activación inmune mediante

la eliminación vía apoptosis de los linfocitos que migran hacia las células infectadas, al

mismo tiempo que promueven la expresión de moléculas neuroprotectoras como la IL-6.

La estrategia de inmunosubversión está determinada por la expresión irregular del

116

complejo Fas/FasL. Como lo demostró este estudio, las neuronas infectadas disminuyen

notablemente la expresión de Fas en su membrana -lo que las convierte en neuronas

virtualmente inmunes a la ruta extrínseca de la apoptosis- y al mismo tiempo promueven

la expresión de FasL soluble en el medio extracelular. Este ligando genera la eliminación

de los linfocitos T que han sido reclutados al sitio de infección en respuesta a citoquinas

como TNF-a, que son secretadas por las neuronas infectadas. El modelo propuesto por

Lafon se muestra esquemáticamente en la Figura 28 (Lafon M, 2004). Simultáneamente,

y como había sido probado años atrás por Thoulouze en un modelo con células Jurkat T

in vitro, junto con la desregulación del sistema Fas/FasL las neuronas del SNP infectadas

también sobreexpresan la molécula antiapoptótica Bcl-2 (Thoulouze et al, 2003).

Adicionalmente, en el 2001 existían datos que vinculaban el progreso de la enfermedad

rábica con una desregulación por apoptosis de las poblaciones linfocitarias. Sitprija y su

grupo de colaboradores del Centro para la Investigación de la patogénesis por RABV de

Bangkok (Tailandia) reportaron, tras la inoculación de ratones con una cepa silvestre de

RABV, la disminución substancial de las poblaciones de timocitos y linfocitos en paralelo a

la detección del antígeno viral en el cerebro. Adicionalmente estos investigadores

hallaron una severa atrofia del bazo y el timo sin la evidencia de presencia viral. Se

postuló para ese entonces que simplemente las neuronas infectadas promovían la muerte

apoptótica en los linfocitos (Sitprija et al, 2001). Más tarde, los estudios de Lafon

permitieron establecer que esa muerte era dependiente de FasL de origen neuronal.

Aunque el mecanismo molecular no está descrito y no parecen haber indicios del tipo de proteína viral involucrada, este avance es sólida evidencia que el RABV posee estrategias

altamente evolucionadas para infectar y transportarse a través del SNP sin dañar la

estructura neuronal de su hospedero y llegar a su órgano blanco donde se disemina

anterogradamente a prácticamente todos los órganos, incluídas las glándulas salivares

que son el sitio más efectivo de diseminación.

La experiencia a lo largo de dos décadas ha descrito de una manera precisa los

mecanismos que rigen la activación inmune en respuesta a las infecciones virales y a los

mecanismos de apoptosis. La experiencia con el RABV ha mostrado que las cepas poco

neurovirulentas son aquellas inductoras de apoptosis en los estados iniciales de infección

y por ende importantes inductoras de respuesta celular vía macrófagos, CDs y linfocitos T

CD8+ que f inaliza con la generación larga y duradera de anticuerpos neutralizantes

específ icos tanto para la proteína G como para el complejo RNP.

117

Figura 28. Modelo de neuroinvasión e inmunosubversión del RABV. Los linfocitos T activados cruzan la barrera sanguínea hacia el sitio de la infección en respuesta a citoquinas como TNF-a que son secretadas por las neuronas infectadas. Al mismo tiempo, ocurre un fenómeno de desregulación en la relación Fas/FasL donde las neuronas infectadas reducen la presentación en membrana del receptor y promueven la expresión y secreción del l igando. Este patrón de expresión vuelves a las neuronas infectadas inmunes a esta vía de inducción apoptótica al mismo tiempo que elimina a todas las células T que llegan a combatir la infección en la periferia. Figura tomada de Lafon M, 2004.

Sin embargo, y en directa relación con los resultados de inducción de apoptosis, las cepas

neurovirulentas que no inducen apoptosis inducen una baja respuesta inmune. Estos

datos permiten inferir que la respuesta inmune efectiva es una consecuencia natural de la

apoptosis y que como lo demostraran Baloul y Lafon en el 2003, de una correcta

estrategia de subversión apoptótica depende una evasión inmune exitosa.

Al respecto, en el año de 1992 se publicó un estudio donde se comprobó la influencia de

las poblaciones linfocitarias en el desarrollo de la enfermedad rábica paralítica. La

administración de una cepa silvestre del RABV a ratones nulos para la producción de

linfocitos T mostró la ausencia total de parálisis de sus extremidades. En contraste, al

118

reconstituir a estos individuos con células linfocitarias inespecíf icas, el 100% murió

mostrando una parálisis aguda. Sin embargo la administración de células específ icas

anti-RABV a estos ratones inmunosuprimidos provocó una respuesta positiva que se

reflejó en la supervivencia total de la muestra y la ausencia de parálisis, demostrando que

la parálisis inducida por la infección con RABV es un efecto dependiente de la activación

de los linfocitos T. La interpretación de estos resultados permite plantear que una vez las

neuronas son infectadas con cepas virales poco neurovirulentas, liberan citoquinas y otras

moléculas inmunoactivadoras que conducen a la proliferación de linfocitos T y otras

células como macrófagos presentes en la glía que atacan las neuronas, las destruyen y

alteran la integridad de la red neuronal dando como resultado una parálisis crónica no

fatal (Lodmell et al, 1992). Bajo este supuesto, la muerte neuronal es un resultado de la

activación inmune, hipótesis completamente antagonista con los resultados de Lafon y

Baloul del 2003. Sin embargo, estos datos fueron obtenidos hace ya más de diez años y

sin duda constituyen las bases experimentales que dieron pie a la construcción del

panorama de la inmunopatogénesis del RABV. Comparaciones cualitativas de los

genomas virales de cepas inmunosubversivas (como la CVS) y de las inmunoactivas

(como las SAD) han mostrado diferencias apreciables en la cantidad de glicoproteína y

demás productos virales como resultado de variaciones signif icativas en el número y

secuencia de nucleótidos en sus RIG (revisado por Harty y Licata, 2003).

Adicionalmente, la enfermedad ocular causada por el virus después de su acceso al

cerebro es una patología causada exclusivamente por el virus pero que está en estrecha relación con la infiltración de neutrófilos y otras células de sistema inmunes al sitio de la

infección. Mediante la utilización de ratones knock out para el receptor de p55 TNF-a

(p55TNF-aR) este grupo comprobó que la severidad de la enfermedad en la retina está

inversamente relacionada con el patrón de infiltración de neutrófilos y la presencia de

linfocitos T activos. Los ratones nulos para este receptor mostraban un patrón de

infiltración de células inmunes mucho menor que sus contrapartes silvestres y sometidas

a una infección con la cepa viral CVS mostraban un mayor progreso y severidad de la

enfermedad rábica (Camelo et al, 2001).

A diferencia del modelo de infección desde la periferia hasta el SNC donde la respuesta

inmune es un proceso desfavorable para la integridad neuronal, la retinitis muestra los

beneficios en la eliminación del virus mediante respuesta celular inmune. Los resultados

obtenidos en este estudio refuerzan la hipótesis que las neuronas involucradas en el

119

transporte retrógrado del virus desde la periferia hasta el cerebro poseen características

f isiológicas y bioquímicas especiales que facilitan las estrategias inmunosubversivas de

este Rabdovirus.

Así, aunque existe el acuerdo general de que son los mecanismos inmunopatogénicos los

causantes de los resultados clínicos de la presentación paralítica de la rabia y la ausencia

de los mismos de la presentación furiosa de la rabia, tampoco existe duda que esta

respuesta inmune específ ica es el resultado de la cepa viral infectante, la verdadera

causa de la inmunopatogenia de la infección por RABV; y en última instancia y como

causa coyuntural de la enfermedad, las propiedades estructurales de la glicoproteína viral.

Las diferencias en la glicoproteína G alteran de manera signif icativa la unión a los

receptores celulares en el sitio de inoculación (con nAchR) y a través del SNP y SNC

(p75NTR) de ahí la importancia que se le ha dado al residuo de arginina en la posición

333 (Wunner, 2002). La evidencia encontrada y las características de la glicoproteína han

podido construir la teoria que se resume en el artículo que publicaran Morimoto y sus

colaboradores en el año 1999: la patogenicidad de las diferentes cepas del RABV se

relaciona inversamente con la expresión de la glicoproteína y con la inducción de

apoptosis, al menos en cultivos neuronales primarios (Morimoto et al, 1999).

Así, se puede definir a la glicoproteína como la molécula más antigénica del RABV pero

también como la proteína cuya constitución, estructura y nivel de expresión es

determinante en la evasión o activación de la respuesta apoptótica, y como resultado de

esta muerte neuronal sectorizada, en la evasión o activación de la respuesta inmune. Sin embargo, los estudios de interacción de P con LC8 realizados por Jackson en el 2005

poseen un historial contradictorio en los estudios de Mebatsion en el 2001, donde

modif icando el dominio de unión con LC8 y/o la posición 333 de la glicoproteína en la

cepa vacunal SAD-L16 se redujo de una manera signif icativa la dispersión del virus en el

SNP. Aunque las cepas mutantes para Arg333 o LC8/Arg33 se replicaron forma similar

que sus parentales en cultivos celulares, la cepa mutante para Arg333 mostró ser igual de

patogénica -en ratones lactantes, pues en adultos SAD-L16 es utilizada como vacuna-

que la cepa parental vía inoculación intramuscular; mientras que la cepa mutante

LC8/Arg333 inoculada intramuscularmente redujo su patogenicidad 30 veces, pero se

mantuvo enteramente patogénica si se inoculaba intracerebralmente (Mebatsion, 2001).

Estos resultados, junto con la distribución de antígeno viral en CNS encontrada por

Jackson cuatro años después, aunque no explican totalmente las diferencias básicas de

120

la rabia paralítica con la furiosa, permiten plantear, aunque sea parcialmente que no

exclusivamente la variante viral, sino también los patrones de expresión diferencial del

hospedero, son determinantes en la presentación de la enfermedad y el tipo de respuesta

generada. Durante episodios de rabia en humanos, algunas citoquinas pro-inflamatorias

podrían afectar indirectamente los niveles de neurotrofinas, factores de crecimiento o

neurotransmisores en el cerebro mediante la activación de la glia, del sistema inmune o

del tejido vascular, como lo mostraron estudios de expresión genética específ ica llevados

a cabo en el 2003 (Prosniak et al, 2001 y 2003) e indirectamente esta perturbación, ser la

responsable de la disfunción neuronal.

Queda claramente establecido que las característica neutrotrópicas de la cepa viral

infectante son determinantes para el curso de la enfermedad, su presentación clínica y el

tipo de respuesta a nivel celular e inmunológico que se lleva a cabo. Cepas altamente

neurotrópicas y patogénicas desencadenan una respuesta apoptótica e inmune casi

inexistente, mientras que las cepas atenuadas generan la producción de altos títulos de

anticuerpos neutralizantes como resultado, en parte, de fenómenos de MCP que permiten

la presentaciónd de antígenos a las poblaciones gliales e inmunes circundantes. Sin

embargo, en las infecciones por RABV la respuesta inmune adecuada no puede

considerarse la más adecuada pues generalmente está acompañada de muerte celular

anticipada en el SNP que conlleva a presentaciones paralíticas crónicas de la

enfermedad, estableciendo un delicado balance entre lo que se puede considerar como

inmunidad protectiva e inmunopatogénesis (Hooper C, 1995).

121

5. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS Como lo observamos a través de toda esta revisión, la biología celular y molecular concerniente a los fenómenos transcripcionales y replicativos del RABV, así como a la activación de la MCP o al desarrollo y características de las neuronas sensoriales, es el resultado de un delicado balance que ha tomado millones de años en establecerse. Se puede concluir que:

El RABV es un virus con genoma ARN de sentido negativo altamente neurotrópico. Las características moleculares de las cepas del RABV neurotrópicas y altamente patogénicas para el SNC le han permitido desarrollar estrategias de evasión de la apoptosis y de la respuesta inmune mediante un conjunto diverso de estrategias individuales. La compresión total del mecanismo molecular, genético y bioquímica de diseminación de las cepas del RABV neuotrópicas y patogénicas en el SNC y de la evasión de la MCP y de la respuesta inmune hasta ahora se ha comenzado a vislumbrar. Nuestro sistema nervioso e inmune son sin duda dos de los logros más maravillosos de la evolución, más sin embargo, las entidades más antiguas en el planeta, los virus ARN como el

RABV, han aprendido a utilizar y alterar la exquisita perfección de sus componentes con resultados tan fatídicos como 50000 muertes humanas al año por una mieloencefalítis de rápido y agudo progreso a la cual no hemos podido combatir. Desde que se describió al fenómeno de MCP como el causante de esta patología y se contó con las herramientas moleculares adecuadas, ha comenzado una carrera que a la fecha arroja muchos resultados de los cuales solo unos cuantos son concluyentes. La ausencia de resultados concluyentes y que expliquen a cabalidad los fenómenos de diseminación y evasión a través del SNP se deben en gran medida a la ausencia de un modelo in vitro que simule el comportamiento del RABV dentro de las neuronas por donde se

transporta desde la periferia y en las cuales lleva a cabo el fenómeno de evasión de la apoptosis y de la respuesta inmune. El establecimiento de un modelo de cultivo primario del GRD de ratones adultos para la infección por RABV ha sido un gran paso para el descubrimiento de las bases moleculares que gobiernan la patogénesis viral. Conociendo quien es el agente etiológico de la enfermedad rábica, los principios del fenómeno de muerte celular que está alterando, las características de la célula blanco de replicación, transcripción y perpetuamiento, en conjunto con un modelo adecuado de análisis in vitro, el mecanismo de patogénesis, evasión de la apoptosis y el fenómeno de inmunoevasión del RABV puede llegar a ser descrito totalmente.

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6. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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