Curso de Inmunologa General Laboratorio Semestre 2015-1 EJERCICIO EXPERIMENTAL 3 Curva de precipitacin en capilar OBJETIVO Determinar la presencia de anticuerpos especficos en contra de la toxina tetnica en suero de individuos sanos. CMO? Mediantelareaccindeprecipitacinencapilar,queconsisteenmezclarelantgenosoluble (toxoidetetnico)consuanticuerpoespecfico(suerodeindividuossanosconanticuerpos especficos) para formar un precipitado, que vara segn la proporcin de reactivos INTRODUCCIN Dadalaespecificidaddelareaccinantgeno-anticuerpo,estahasidoutilizadaendiferenciare identificarmicroorganismos,antgenossolubles,ascomoenlainvestigacinycuantificacinde anticuerpos sricos, sobre todos con fines de diagnstico. Enlainteraccininvitrodeunantgenoconsucorrespondienteanticuerposedistinguedos etapas. La reaccin primaria que consiste en la unin del antgeno con el anticuerpo (fenmeno no visible)ylareaccinsecundaria,quesiguealaanteriorysecaracterizaporlaaparicindeun fenmeno visible como la aglutinacin o precipitacin. La reaccin de precipitacin ocurre cuando se combina un anticuerpo, por lo menos bivalente, con unantgenosolubleyestoconllevaalaformacindeagregadosqueprecipitan.Paraquela precipitacin ocurra en forma mxima se necesita que tanto el antgeno como el anticuerpo estn en concentraciones ptimas (cantidades equivalentes),cuando el antgeno o el anticuerpos estn en exceso no se pueden formar grandes agregados antgeno-anticuerpo. Ab = K Curso de Inmunologa General Laboratorio Semestre 2015-1 MATERIAL 7 capilares de 75 X 1.2 mm. 1 placa de dilucin de 96 pozos. 1 pipeta de 1 mL. 1 portaobjetos Plastilina Solucin Amortiguadora de Fosfatos. (PBS) Toxoide tetnico NIBSC Aventis Pasteur MSD [4.5mg/mL] Lote: EN63QG. METODOLOGA 1.Diluciones seriadas (2X) del estndar de toxoide tetnico en PBS : Rotular6pozosdeplacadedilucionespararealizardilucionesseriadasdelantgeno (toxoide tetnico) Colocar 50 L. de solucin amortiguadora de fosfatos (PBS) en cada uno de los pozos. AlpozoNo1agregar50Ldelestndardetoxoidetetnicoymezclarconlamisma pipeta (dilucin 1:2). Transferir 50 L del pozo No 1 al pozo No 2 y mezclar perfectamente (dilucin 1:4) Repetir el procedimiento hasta el tubo nmero 6. (Dilucin 1:8 a 1:32) 2.Marcar los capilares a 2 y 4 cm. a partir de un extremo, con un marcador indeleble. 3.Tomaruntubocapilaryabsorberporcapilaridadunvolumendesueroproblemahasta llegaralaprimeramarcadeltubocapilar(2cm),ymanteniendoeldedondiceenel extremo del capilar, limpiar la parte externa con papel absorbente. 4.Quitando el dedo ndice del extremo, permitir que ascienda por capilaridad la solucin de toxoide tetnico (tubo 1) de tal manera que el volumen total llegue hasta la segunda marca del capilar (4 cm.). Limpiar nuevamente la parte externa del capilar con papel absorbente. 5.Mezclarlassolucionesmoviendoellquidodeunladoalotroyrotandoelcapilar simultneamente 15 veces. 6.Coneldedondicetaparunodelosextremosdelcapilarycentrarellquidodentrodel capilar, colocando el dedo ndice en un extremo.7.Insertar el capilar verticalmente sobre un portaobjetos cubierto con plastilina, dejando unos mm con aire entre la mezcla y la plastilina para evitar desnaturalizacin de los reactivos por contacto con sta. 8.Repetirelprocedimientoparacadaunodeloscapilarescorrespondientesalasotras diluciones del toxoide tetnico. 9.Realizar todo el procedimiento para cada uno de los sueros problema, cada equipo contar con dos muestras problema. 10.Incubar los capilares 24 horas a temperatura ambiente. 11.Medir la longitud del precipitado en el tubo capilar 12.Conlosdatosobtenidosconelsueropositivo(sueroquetieneanticuerposanti -toxoide tetnico)construir lacurvade precipitacin. Graficandoconcentracinde toxoidetetnico (abscisas) contra la cantidad de precipitado formado expresado en mm (ordenadas).