CURSO DE FORMACIÓN CONTINUADA A DISTANCIA
ACTUALIZACIONES EN EL LABORATORIO CLÍNICO
ACTUALIZACIÓN EN EL DIAGNÓSTICO
DE LA TUBERCULOSIS
CURSO 2007 - 2008 Nº 4
I.S.S.N.- 1988-7477 Título: Actualizaciones en el Laboratorio Clínico Editor: Asociación Española de Biopatología Médica Maquetación: AEBM Fecha de Distribución: Febrero 2008
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Actualización en el diagnóstico de la
Tuberculosis
Dr. Jerónimo Jaqueti Aroca.- Médico Especialista Análisis Clínicos. Titulado Superior Especialista en el Laboratorio de Análisis Clínicos. Hospital de
Fuenlabrada. Madrid
1.- Introducción
La tuberculosis es una enfermedad infecciosa de distribución mundial producida por
Mycobacterium tuberculosis. Debe su nombre a la formación de nódulos (tubérculos)
en los tejidos que afecta. Se estima que un 19-43% de la población ha sido infectada
por M. tuberculosis y que todos los años se producen más de 8 millones de casos
nuevos (1).
El genero Mycobacterium consta de más de 100 especies de bacilos ácido-alcohol
resistentes (BAAR) aerobios, no esporulados, inmóviles y no capsulados.
Clásicamente se han agrupado en virtud de su velocidad de crecimiento (lento,
mayor de una semana, y rápido, menor de una semana) y de la producción o no de
pigmentos cuando son expuestos a la luz (fotocromógenos, producen pigmento en
presencia de luz; escotocromógenos, producen pigmento en ausencia de luz; y no
cromógenos). El complejo Mycobacterium tuberculosis está formado por M.
tuberculosis, M. bovis, M. africanum y M. microti, y se incluye dentro del grupo de no
cromógenos de crecimiento lento (2). El desarrollo de estudios de genotipado ha
modificado algunos grupos y diferenciado nuevas especies (3,4). Una clasificación
sucinta de las micobacterias más frecuentes en humanos se recoge en la tabla 1.
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Tabla 1.- Clasificación de las micobacterias más frecuentemente aisladas en muestras clínicas. Crecimiento
Producción de pigmento
Especie
Fotocromógenas M. asiaticum M. kansasii M. marinum M. simiae
Escotocromógenas
M. flavescens M. gordonae M. scrofulaceum M. szulgai M. xenopi
Lento (mayor de 1 semana)
No cromógenas
M. avium complex (M. avium y M. intracellulare) M. gastri M. genavense M. haemophilum M. malmoense M. nonchromogenicum M. shimoidei M. terrae M. triviale M. tuberculosis complex (M. africanum, M. bovis, M.tuberculosis) M. ulcerans
Rápido (menor de 1 semana)
No cromógenas
M. fortuitum complex (M. fortuitum, M. mageritense, M. mucogenicum, M. peregrinum, M. septicum) M. chelonae-abscessus complex (M. chelonae, M. abscessus, M. immunogenum) M. smegmatis complex (M. smegmatis, M. goodii, M. wolinskyi )
Las micobacterias no pertenecientes al complejo M. tuberculosis, productoras de
procesos infecciosos denominados globalmente micobacteriosis, han recibido
distintos nombres a lo largo del tiempo con mayor o menor fortuna: micobacterias
atípicas (con características diferentes de la especie “típica”, M. tuberculosis), MOTT
(Mycobacteria other than tubercule bacilli), micobacterias oportunistas, micobacterias
no tuberculosas, micobacterias ambientales, etc… que se utilizan indistintamente (5).
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En este trabajo nos centraremos exclusivamente en el diagnóstico de la enfermedad
infecciosa causada por M. tuberculosis.
2.- Morfología, estructura y composición
M. tuberculosis suele tener una forma ligeramente curvada, de 1-4 micras de largo.
Se caracteriza por poseer una pared gruesa formada por varias capas de
glicopéptidos, polímeros de arabinosa y galactosa, ácidos micólicos y lípidos. Esta
estructura le conferiría la capacidad de resistir la acción decolorante de ácidos y
alcoholes una vez teñida.
3.- Patogenia y manifestaciones clínicas
El contagio se produce habitualmente por vía aérea a partir de pacientes con
lesiones pulmonares abiertas al exterior por un bronquio de drenaje. Los bacilos
expulsados con la tos pueden ser aspirados por otras personas, llegando hasta los
alvéolos y desencadenando la primoinfección. La transmisión digestiva de M. bovis
procedente de vacas enfermas ha desaparecido prácticamente gracias a la
pasteurización sistemática de la leche (6).
En la mayoría de las ocasiones, los escasos bacilos que llegan hasta los alvéolos son
fagocitados y destruidos por los macrófagos; sólo un pequeño porcentaje de las
personas infectadas (aproximadamente el 10 %) llegará a desarrollar la enfermedad;
la mitad de ellas a los pocos meses de la infección, mientras que la otra mitad
necesitará de un largo periodo, a veces de años, para que se produzca la
reactivación de lesiones aparentemente curadas que albergan en su interior
micobacterias.
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La llegada de M. tuberculosis a los alvéolos desencadena una serie de procesos de
respuesta tisular e inmunológica. En las 2-10 semanas posteriores a la infección se
produce una respuesta inmunológica celular desencadenada por los antígenos de la
membrana y del citoplasma de las micobacterias. Linfocitos, macrófagos, células
epitelioides y células gigantes de Langhans rodean a las micobacterias creando el
característico granuloma tuberculoso, que al cabo de un tiempo se reblandece en su
centro y deja un núcleo de necrosis caseosa (6).
En la mayoría de los casos se controla completamente la infección, reabsorbiéndose
el granuloma y quedando una pequeña cicatriz fibrosa que suele calcificarse. Si el
proceso no continúa, se habrá producido una infección sin enfermedad, con una
reacción positiva a la prueba de la tuberculina. En un 5% de los casos se producirá
una enfermedad activa, con signos síntomas radiológicos y clínicos y aislamiento de
las micobacterias (6).
En otro 5% de los casos se producirá una tuberculosis secundaria, habitualmente
debida a una alteración inmunitaria (malnutrición, administración de fármacos
inmunosupresores, diabetes, infección por VIH, etc…) que permite la reactivación de
micobacterias latentes (1). Esporádicamente, sobre todo en países con alta
endemicidad, se puede producir una reinfección exógena (6).
La primoinfección, más frecuente en niños y jóvenes, puede ser asintomática o con
síntomas leves de infección respiratoria, o presentar un cuadro más llamativo con
afectación del estado general, fiebre, hemoptisis, eritema nodoso, alteraciones
extrapulmonares, etc… En la mayor parte de los casos cura espontáneamente,
dejando evidencias radiográficas y positividad de la prueba de Mantoux. Más
raramente puede seguir un curso progresivo, con aparición de infiltrados pulmonares
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y cavitación, y diseminación broncógena y/o hematógena (con localizaciones en
pleura, meninges, hígado, riñón, peritoneo, sistema osteoarticular). La tuberculosis
secundaria se suele localizar inicialmente en el pulmón, en forma de infiltrado o
nódulos que tienden a caseificarse y drenarse a través de un bronquio produciéndose
una caverna. Con menos frecuencia la tuberculosis comienza como una neumonía
aguda. Las adenopatías mediastínicas pueden comprimir a los bronquios ocasionando
atelectasias. Las formas extrapulmonares (más frecuentes en los infectados por VIH)
pueden afectar al riñón, sistema osteoarticular, pericardio, sistema nervioso central,
peritoneo, piel, etc…, variando los síntomas en función de la localización y de la
progresión de la enfermedad (1,6).
4.- Diagnóstico de Laboratorio 4.1.- Infección La infección por M. tuberculosis se detecta estudiando la respuesta de
hipersensibilidad retardada frente a antígenos específicos del bacilo. Actualmente, se
utiliza un derivado proteico purificado (PPD RT-23 en España). La técnica más usada
es la intradermorreacción de Mantoux, en la que se inyectan 2 U de PPD RT-23 en la
cara anterior del antebrazo, por vía intradérmica. A las 48-72 horas se mide la zona
de induración, considerándose positivas todas las induraciones ≥ 5 mm en personas
no vacunadas.
La especificidad de la prueba esta condicionada por exposición previa a otras
micobacterias o a la vacuna con Bacilo de Calmette-Guérin, ya que los antígenos
presentes en el PPD son comunes con otras micobacterias. La sensibilidad de la
prueba esta condicionada por una buena técnica de realización y lectura, y esta
requiere que se vea al paciente 48-72 horas después de la administración.
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Recientemente se han desarrollado métodos de inmunodiagnóstico para cuantificar
esta respuesta inmunitaria, estimulando a los linfocitos con antígenos de las
micobacterias y determinando in vitro la liberación de interferon- (7). La técnica
alcanza un rendimiento mejor al sustituir el PPD por antígenos más específicos de M.
tuberculosis, como el early secretory antigen target-6 (ESAT-6) y la culture filtrate
protein 10 (CFP-10), ausentes en la vacuna antituberculosa y en micobacterias no
tuberculosas (8).
4.2.- Enfermedad El diagnóstico de la tuberculosis se ha basado clásicamente en la observación
microscópica tras tinción de las muestras y su cultivo (1). Desde hace una quincena
de años se están desarrollando métodos de biología molecular que permiten una
detección e identificación más rápida de las micobacterias (1,9).
4.2.1.- Tinciones
Las micobacterias se tiñen mal con los colorantes habituales debido al elevado
contenido de lípidos de su pared celular. Para lograr que el colorante primario
penetre en las micobacterias se recurre al calor o a determinados detergentes según
el método utilizado. Una vez dentro, el colorante no se altera tras la exposición a
soluciones de alcohol y ácido. Esta propiedad, llamada ácido-alcohol resistencia, es
útil para la visualización de este grupo específico de bacterias. Además, las
micobacterias son capaces de formar complejos estables con ciertos colorantes como
la auramina. Los métodos más utilizados para la tinción de las micobacterias son:
4.2.1.1.- Tinciones de Ziehl-Neelsen o Kinyoun, basadas en la utilización de fucsina
fenicada como colorante primario. La primera requiere calentar la preparación para
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permitir la entrada de colorante en las micobacterias, mientras que la de Kinyoun
utiliza cuerpos tensoactivos sin necesidad de calentar el colorante; y
4.2.1.2.- Tinciones de auramina o auramina-rhodamina, en las que las micobacterias
muestran fluorescencia bajo una luz ultravioleta.
La microscopía presenta una sensibilidad inferior al cultivo, oscilando entre un 22%
y un 80% (1). La sensibilidad es mayor al procesar muestras respiratorias; al
aumentar el volumen de muestra procesada (10); al concentrar las muestras, ya que
se precisa una concentración ≥10.000 bacilos/ml para que la muestra sea positiva
(9,11); o al utilizar tinciones de auramina, de sensibilidad similar a la de Ziehl-
Neelsen y más cómodas para el observador, y más sensibles que la de Kinyoun (12).
Cuando existan dudas con las técnicas fluorescentes se recomienda confirmar los
resultados mediante una tinción de Ziehl-Neelsen.
Los resultados falsos negativos suelen corresponder a muestras inadecuadas (saliva,
escaso volumen de orina, jugo gástrico sin neutralizar, etc...), errores en la técnica
(mala extensión y fijación, alteraciones en los colorantes, exceso de decoloración,
etc…), errores en la observación (pocos campos examinados, falta de atención, falta
de experiencia, cansancio, etc...). Los falsos positivos se deben a precipitados de los
colorantes, contaminación cruzada de los portaobjetos, contaminación del agua y
reactivos utilizados, y a la presencia de otros microorganismos ácido-alcohol
resistentes distintos de las micobacterias (corinebacterias, nocardias, actinomyces,
Rhodococcus, Tsukamurella, etc…) La presencia de bacilos ácido-alcohol resistentes
en muestras con cultivo negativo también puede deberse a tratamientos previos con
antibióticos, descontaminación excesiva de las muestras o a un escaso tiempo de
cultivo (1).
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Cuando la muestra se haya teñido con fucsina fenicada se deben examinar 300
campos con el objetivo de inmersión (x 1.000). En las tinciones fluorescentes se
puede trabajar con un aumento menor (x 200) y bastará con examinar 30 campos.
Es conveniente informar de la cantidad de BAAR encontrados (13).
4.2.2.- Identificación directamente en muestras clínicas Aunque no reemplacen al cultivo en el diagnóstico de la tuberculosis activa, las
técnicas basadas en la amplificación y reconocimiento de un fragmento de ARN o
ADN han mejorado notablemente aspectos como la rapidez en el diagnóstico inicial
de la tuberculosis (1). Se pueden dar resultados falsamente positivos al detectar
bacilos muertos, por lo que no se deben usar en pacientes con tratamiento
antituberculoso, y por contaminaciones de las muestras. Los falsos negativos se
pueden deber a muestras muy paucibacilares, a la presencia de inhibidores o a
problemas de extracción del ácido nucleico (14). A continuación se describen
brevemente las características de algunos métodos comercializados.
4.2.2.1.- Amplicor MTB assay (Roche Molecular System, Branchburg, NJ): El método
se puede realizar de forma manual o automatizada (excepto la preparación de la
muestra), y la automatizada dispone de un control interno que se amplifica al mismo
tiempo que la diana y permite detectar la presencia de inhibidores. La sensibilidad
(con respecto al cultivo y datos clínicos) parece ser muy elevada en las muestras en
las que se han detectado BAAR, ya sean pulmonares o extrapulmonares, mientras
que no lo es tanto en las muestras extrapulmonares (14). La sensibilidad del método
puede verse afectada por factores como la carga bacteriana la distribución de las
micobacterias o la presencia de inhibidores en las muestras. Algunos autores han
observado un aumento de la sensibilidad al estudiar tres muestras secuenciales de
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cada paciente (15). La especificidad es superior al 90%, y los falsos positivos suelen
deberse al uso de antibióticos o a reacciones cruzadas con micobacterias no
tuberculosas (14).
4.2.2.2.- Amplified M. tuberculosis Direct (AMTD2) assay (Gen-Probe, Inc., San
Diego, California): Es un método de amplificación isotérmica (42ºC). La sensibilidad
es también elevada en muestras pulmonares y extrapulmonares en las que se han
detectado BAAR (14). La sensibilidad es mejor cuando los pacientes se seleccionan
según la sospecha clínica de tuberculosis (16). La especificidad es superior al 90%, y
aumenta al elevar el punto de corte de la técnica sin que disminuya
significativamente la sensibilidad (17).
4.2.2.3.- LCx MTB assay, Abbott LCx probe system (Abbott Laboratorios, Illinois): Es
un método de amplificación que utiliza la reacción en cadena de la ligasa. El método
presenta una buena sensibilidad en muestras pulmonares con presencia de BAAR,
pero mucho menor en muestras sin BAAR y en muestras extrapulmonares (18,19).
Algunos autores han modificado el punto de corte, aumentando la sensibilidad sin
que disminuya prácticamente la especificidad (18).
4.2.2.4.- BD ProbeTec ET Mycobacterium tuberculosis Complex Direct Detection
Assay (DTB) (Becton Dickinson Biosciences, Sparks, Md.): Es una amplificación
isotérmica semiautomatizada (una extracción manual y laboriosa y una amplificación
y detección completamente automatizadas) basada en el desplazamiento de cadenas
de ADN (SDA, strand displacement amplification). Incluye un control interno para la
detección de inhibidores. Muestra muy buenas sensibilidad y especificidad tanto en
muestras pulmonares como extrapulmonares, siendo menor la sensibilidad en
muestras pulmonares en las que no se han detectado BAAR (14,20).
62
4.2.2.5.- INNO LiPA Rif.TB (Innogenetics, Ghent, Belgium): Es un método que
combina una hibridación con una amplificación para detectar al mismo tiempo M.
tuberculosis y resistencia a la rifampicina. En la detección directa, muestra una
elevada sensibilidad junto a una baja especificidad (21) La especificidad aumenta al
estudiar sólo muestras con presencia de BAAR (22).
4.2.2.6.- GenoType Mycobacteria Direct (GTMD) (Hain Lifescience GMBH, Nehren,
Germany): Es un método de amplificación basado en NASBA que detecta en el
mismo proceso M. tuberculosis y otras cuatro especies de micobacterias de
importancia clínica. La sensibilidad y especificidad son elevadas (23).
5.- Cultivos
El cultivo sigue siendo el estándar de oro para el diagnóstico de la tuberculosis
activa, pudiendo detectar una concentración <100 bacilos/ml. Además, el aislamiento
permite realizar estudios de sensibilidad frente a los fármacos antituberculostáticos.
La sensibilidad es del 80-85% con muy elevada especificidad (1)
Ya que la tuberculosis se puede producir en casi cualquier sitio del organismo, se
utiliza una gran diversidad de muestras para el estudio de micobacterias: esputo,
jugo gástrico, orina, líquido cefalorraquídeo, broncoaspirados, lavados bronquio-
alveolares, biopsias, etc...
Las muestras, correctamente identificadas, deben remitirse al laboratorio lo antes
posible. Es conveniente refrigerarlas si se preveen retrasos. Estas muestras no se
cultivan directamente, la mayor parte procede de áreas contaminadas por otros
microorganismos, mientras que en otras la concentración de bacilos es muy escasa.
Es necesario un tratamiento adecuado de las muestras, que comprende procesos de
homogeinización, concentración y descontaminación, antes de cultivarlas (1). Los
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métodos más utilizados para la licuefacción y descontaminación incluyen
combinaciones de N-acetil-L-cisteína e hidróxido sódico (NaOH), laurilsulfato sódico y
NaOH y fosfato trisódico y cloruro de benzalconio. También se pueden usar de forma
aislada NaOH, ácido sulfúrico y ácido oxálico (24).
El cultivo se realiza en medios selectivos tanto líquidos (Proskauer-Beck, Sauton,
Sula, Dubos, Middlebroock 7H9) como sólidos, con huevo (Löwenstein-Jensen,
Petragnani, Coletsos, Stonebrink), los más utilizados, y con agar (Dubos,
Middlebroock 7H10, Middlebroock 7H11). Los medios sólidos permiten una buena
recuperación de las micobacterias y reconocer sus características fenotípicas. Los
medios líquidos suelen estar muy enriquecidos, por lo que el cultivo es más rápido
que en los sólidos y se recupera un mayor número de micobacterias. No permiten
distinguir los cultivos mixtos ni la morfología y pigmentación de las colonias (24).
Algunos se leen manualmente, como el MB redox, en el que el crecimiento precipita
partículas rosas-violetas; y el MGIT (Mycobacterial growth indicador tube), un medio
basado en el Middelbrook 7H9 con un indicador fluorescente; pero en los últimos
años se ha impuesto el medio líquido de Middlebroock para el diagnóstico rápido
automatizado, existiendo diversos sistemas comerciales: BACTEC, MGIT, MB/Bact y
ESP (Extra Sensing Power) (1,9,24). Sus características principales se describen a
continuación.
5.1.- Sistema BACTEC 460TB: Es un sistema semiautomático que utiliza 14C para
detectar el crecimiento. Es más rápido y sensible que los cultivos en medio sólido,
tanto para M. tuberculosis como para otras micobacterias, pero su principal
inconveniente es el uso de isótopos radiactivos (25).
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5.2.- Sistema MB/BacT ALERT 3D: Es un sistema automatizado colorimétrico de
monitorización continua que detecta el crecimiento bacteriano por la producción de
CO2. El sistema avisa de la positividad del cultivo o del fin del periodo de incubación
fijado si es negativo. La sensibilidad y rapidez son mejores que con los medios
sólidos (26). La rentabilidad es similar a la del BACTEC (27), tanto en muestras
pulmonares como extrapulmonares (28), sin el inconveniente de la radioactividad.
5.3.- Sistema ESP Culture System II: Es un sistema automático no radiométrico de
monitorización continua que detecta el crecimiento mediante el consumo de oxígeno.
El sistema es más rápido y sensible que los medios sólidos, pero la sensibilidad es
algo menor que con BACTEC 460 (29) y similar a la del BACTEC MGIT, aunque el
tiempo de detección es más largo (30). No presenta el inconveniente de la
radioactividad.
5.4.- Sistema BACTEC MGIT 960: Es un sistema automatizado que utiliza el medio
MGIT y detecta el consumo de O2 mediante fluorimetría. No puede utilizarse con
muestras de sangre. La sensibilidad es algo menor que la del BACTEC 460, pero el
crecimiento es un poco más rápido (31), tanto en muestras con baciloscopia positiva
como negativa (32). No presenta el inconveniente de la radioactividad.
5.5.- Sistema BACTEC serie 9000: Es un sistema automatizado de hemocultivos
adaptado al cultivo de micobacterias mediante una modificación del programa
informático y el uso de un medio de cultivo y de un sensor de oxígeno específicos. El
rendimiento es similar al del BACTEC 460 (33), detectando peor las muestras con
baciloscopias negativas (34). Tampoco presenta el inconveniente de la
radioactividad.
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6.- Pruebas bioquímicas
Se ha utilizado un amplio número de pruebas para la identificación de las
micobacterias. Se recomienda usar un conjunto de pruebas seleccionadas en función
de un agrupamiento previo por características de crecimiento, pigmentación y
morfología de las colonias. Las básicas para la identificación de M. tuberculosis son la
prueba de la niacina, la de reducción de nitratos y las de la catalasa (13).
6.1.- Prueba de la niacina: Se basa en la liberación de niacina al medio de cultivo
por M. tuberculosis y algunos aislados de M. africanum, M. simiae y M. chelonae.
6.2.- Prueba de reducción de nitratos: Las micobacterias difieren en su
capacidad para reducir los nitratos a nitritos mediante la presencia de la enzima
nitratorreductasa. Es muy útil para diferenciar las especies de micobacterias de
crecimiento rápido, así como algunas de crecimiento lento (M. tuberculosis, M.
kansasii, M.flavescens y M. szulgai son positivas).
6.3.- Prueba de la catalasa: Todas las micobacterias, excepto algunos aislados de
M. tuberculosis y de M. bovis resistentes a la isoniacida producen catalasa. Las
especies se pueden diferenciar estudiando la cantidad de catalasa producida y su
termoestabilidad.
7.- Métodos de identificación cromatográfica
Permiten identificar especies mediante la determinación cualitativa de la
composición lipídica de la pared de las micobacterias. Las de mejor rendimiento son
la cromatografía de gases y la cromatografía líquida de alta resolución. Su coste y
complejidad han hecho que se vean relegadas frente a los métodos de detección
genética (24).
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8.- Métodos de amplificación de ácidos nucleicos
Utilizan la hibridación con sondas de ácidos nucleicos, la amplificación de secuencias
de ADN, la secuenciación de la unidad ribosomal 16S, la amplificación a tiempo real y
el uso de arrays.
8.1.- Hibridación: Permiten detectar el ARN ribosómico de las micobacterias a partir
de medios sólidos y líquidos (35,36). La técnica es rápida y específica, pero sólo
permite identificar una especie cada vez, por lo que se debería hacer un diagnóstico
presuntivo antes de comenzar la técnica, y sólo están comercializadas sondas para
un pequeño número de micobacterias (9).
8.2.- Amplificación de secuencias específicas: Las dianas más usadas corresponden al
gen hsp65 y a la subunidad ribosomal 16S. El análisis posterior se puede realizar
mediante polimorfismo de los fragmentos de restricción, hibridación y secuenciación
(37-39).
8.3.- Amplificación a tiempo real: Se basan en la realización de forma simultánea de
la amplificación de una diana y su reconocimiento mediante hibridación. Los sistemas
comercializados se basan en el desplazamiento de cadenas de ADN (SDA, strand
displacement amplification) y la detección por fluorescencia (40). El método presenta
muy buenas sensibilidad y especificidad (41)
8.4.- Arrays de ADN: Son conjuntos de sondas de ADN colocadas en un soporte
sólido con una disposición prefijada, lo que permite detectar simultáneamente
diferentes secuencias de ácidos nucleicos (42). Este método, precedido de una
amplificación, se ha aplicado a la identificación de las micobacterias, permitiendo la
identificación de varias especies a la vez (43,44).
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9.- Conclusión
Frente a los métodos clásicos, las técnicas de biología molecular permiten adelantar
un diagnóstico con una fiabilidad elevada. A pesar de los avances realizados en los
últimos años en este campo, el diagnóstico se sigue basando en la observación de
las muestras teñidas, el cultivo y la correlación con los datos clínicos.
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Bibliografía
1.- American Thoracic Society. Diagnostic Standards and Classification of
Tuberculosis in Adults and Children. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 1376-
1395.
2.- Casal Román M. Mycobacterium tuberculosis. En: Perea Pérez EJ, Ed.
Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica, Ed. Doyma, Barcelona, 1992: pág.
754-766
3.- Tortoli E. Impact of Genotypic Studies on Mycobacterial Taxonomy: the New
Mycobacteria of the 1990s. Clin Microbiol Rev 2003; 16: 319–354.
4.- Brown-Elliott BA, Wallace RJ, Jr. Clinical and Taxonomic Status of Pathogenic
Nonpigmented or Late-Pigmenting Rapidly Growing Mycobacteria. Clin Microbiol Rev
2002; 15: 716–746.
5.- Casal M. Cómo denominar a las micobacterias diferentes a Mycobacterium
tuberculosis y a M. leprae. Enferm Infecc Microbiol Clin 2003; 21: 296-8.
6.- Sauret Valet J. Tuberculosis. En: Rodés Teixidor J, Guardia Massó J, Eds.
Medicina Interna. Ed. Electrónica. Barcelona: Masson, S.A.; 1997: pág. 1141-1152
7.- Domínguez J, Ruiz-Manzano J. Prueba de la tuberculina: ¿es la hora del
cambio?. Arch Bronconeumol 2006; 42: 47-48
8.- Mori T, Sakatani M, Yamagishi F, Takashima T, Kawabe Y, Nagao K, et al. Specific
Detection of Tuberculosis Infection. An Interferon- –based Assay Using New
Antigens. Am J Respir Crit Car Med 2004; 170: 59-64.
9.- Palomino JC. Nonconventional and new methods in the diagnosis of tuberculosis:
feasibility and applicability in the field. Eur Respir J 2005; 26: 339-350.
69
10.- Warren JR, Bhattacharya M, De Almeida KNF, Trakas K, Peterson LR. A
minimum 5.0 ml of sputum improves the sensitivity of acid-fast smear for
Mycobacterium tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161: 1559–1562.
11.- Murray SJ, Barrett A, Magee JG, Freeman R. Optimisation of acid fast smears for
the direct detection of mycobacteria in clinical samples. J Clin Pathol 2003; 56: 613–
615.
12.- Somoskövi A, Hotaling JE, Fitzgerald M, O’Donnell D, Parsons LM, Salfinger M.
Lessons From a Proficiency Testing Event for Acid-Fast Microscopy. Chest 2001; 120:
250-257.
13.- Nolte FS y Metchoock B. Mycobacterium. En, Murray PR, Baron EJ, Pfaller MA,
Tenover FC, Yolken RH, edit; Manual of Clinical Microbiology. 6th ed, Washington CD:
ASM PRESS; 1995; pág. 400-437.
14.- Piersimoni C, Scarparo C. Relevance of Commercial Amplification Methods for
Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex in Clinical Samples. J Clin
Microbiol 2003; 41: 5355-5365.
15.- Rajalahti I, VuorinenP, Nienminen MM, Miettinen A. Detection of Mycobacterium
tuberculosis Complex in Sputum Specimens by the Automated Roche Cobas Amplicor
Mycobacterium Tuberculosis Test. J Clin Microbiol 1998; 36: 975-978.
16.- Catanzaro A, Perry S, Clarridge JE, Dunbar S, Goodnight-White S, LoBue PhA, et
al . The Role of Clinical Suspicion in Evaluating a New Diagnostic Test for Active
Tuberculosis. Results of a Multicenter Prospective Trial. JAMA 2000; 283: 639-645.
17.- Alcalá L, Ruiz-Serrano MJ, Hernangómez S, Marín M, García de Viedma D, San
Juan R, et al. Evaluation of the upgraded amplified Mycobacterium tuberculosis direct
70
test (gen-probe) for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in respiratory and
non-respiratory specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 2001; 41: 51-56
18.- Lumb R, Davies K, Dawson D, Gibb R, Gottlieb T, Kershaw C, et al. Multicenter
Evaluation of the Abbott LCx Mycobacterium tuberculosis Ligase Chain Reaction
Assay. J Clin Microbiol 1999; 37: 3102-3107
19.- Tortoli E, Tronci M, Trosi CP, Galli C, Lavinia F, Natili S, et al. Multicenter
evaluation of two commercial amplification kits (Amplicor, Roche and LCx, Abbott)
for direct detection of Mycobacterium tuberculosis in pulmonary and extrapulmonary
specimens. Diagn Microbiol Infect Dis 1999; 33: 173-179
20.- Piersimoni C, Scarparo C, Piccoli P, Rigon A, Ruggiero G, Nista D, et al.
Performance Assessment of Two Commercial Amplification Assays for Direct
Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory and
Extrapulmonary Specimens. J Clin Microbiol. 2002; 40: 4138–4142.
21.- Viveiros M, Leandro C, Rodrigues L, Almeida J, Bettencourt R, Couto I, et al.
Direct Application of the INNO-LiPA Rif.TB Line-Probe Assay for Rapid Identification
of Mycobacterium tuberculosis Complex Strains and Detection of Rifampin Resistance
in 360 Smear-Positive Respiratory Specimens from an Area of High Incidence of
Multidrug-Resistant Tuberculosis. J Clin Microbiol 2005; 43: 4880-4884.
22.- Tortoli E, Marcelli F. Use of the INNO LiPA Rif.TB for detection of Mycobacterium
tuberculosis DNA directly in clinical specimens and for simultaneous determination of
rifampin susceptibility. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2007; 26:51–55.
23.- Franco-Álvarez de Luna F, Ruiz P, Gutiérrez J, Casal M. Evaluation of the
GenoType Mycobacteria Direct Assay for Detection of Mycobacterium tuberculosis
71
Complex and Four Atypical Mycobacterial Species in Clinical Samples. J Clin Microbiol
2006; 44: 3025-3027
24.- Alcalde Fernández de Vega F, Esteban Moreno J, González Martín J, Palacios
Gutiérrez JJ. 9ª. Micobacterias. En: Cercenado E, Cantón R, eds. Procedimientos en
Microbiología Clínica. Madrid: Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y
Microbiología Clínica, 2005.
25.- Anargyros P, Astill DS, Lim IS. Comparison of improved BACTEC and
Lowenstein-Jensen media for culture of mycobacteria from clinical specimens. J Clin
Microbiol. 1990 June; 28(6): 1288-1291
26.- Palacios JJ, Ferro J, Ruiz Palma N, García JM, Villar H, Rodríguez J, et al. Fully
Automated Liquid Culture System Compared with Löwenstein-Jensen Solid Medium
for Rapid Recovery of Mycobacteria from Clinical Simples. Eur J Clin Microbiol Infect
Dis 1999;18:265-273.
27.- Harris G, Rayner A, Blair J, Watt B. Comparison of three isolation systems for the
culture of mycobacteria from respiratory and non-respiratory samples. J Clin Pathol
2000; 53: 615-618.
28.- Brunello F, Favari F, Fontana R. Comparison of the MB/BacT and BACTEC
460 TB Systems for Recovery of Mycobacteria from Various Clinical Specimens. J Clin
Microbiol 1999; 37: 1206-1209.
29. -Tortoli E, Cichero P, Chirillo MG, Gismondo MR, Bono L, Gesu G, et al.
Multicenter Comparison of ESP Culture System II with BACTEC 460TB and with
Lowenstein-Jensen Medium for Recovery of Mycobacteria from Different Clinical
Specimens, Including Blood. J Clin Microbiol 1998; 36: 1378-1381.
72
30.- Williams-Bouyer N, Yorke R, Lee HI, Woods GL. Comparison of the BACTEC
MGIT 960 and ESP Culture System II for Growth and Detection of Mycobacteria. J
Clin Microbiol 2000; 38: 4167-4170.
31.- Tortoli E, Cichero P, Piersimoni C, Simonetti MT, Ges G, Nista D. Use of BACTEC
MGIT 960 for Recovery of Mycobacteria from Clinical Specimens: Multicenter Study. J
Clin Microbiol 1999; 37: 3578-3582.
32.- Somoskövi A, Ködmön C, Lantos A, Bártfai Z, Tamási L, Füzy J, et al.
Comparison of Recoveries of Mycobacterium tuberculosis Using the Automated
BACTEC MGIT 960 System, the BACTEC 460 TB System, and Löwenstein-Jensen
Medium. J Clin Microbiol 2000; 38: 2395-2397.
33. – Zanetti S, Ardito F, Sechi L, Sanguinetti M, Molicotti P, Delogu G, et al.
Evaluation of a Nonradiometric System (BACTEC 9000 MB) for Detection of
Mycobacteria in Human Clinical Samples. J Clin Microbiol 1997; 35: 2072–2075.
34.- Pfyffer GE, Cieslak C, Welscher HM, Kissling P, Rüsch-Gerdes S. Rapid Detection
of Mycobacteria in Clinical Specimens by Using the Automated BACTEC 9000 MB
System and Comparison with Radiometric and Solid-Culture Systems. J Clin Microbiol
1997; 35: 2229-2234.
35.- Musial CE, Tice LS, Stockman L, Roberts GD. Identification of mycobacteria from
culture by using the Gen-Probe Rapid Diagnostic System for Mycobacterium avium
complex and Mycobacterium tuberculosis complex. J Clin Microbiol. 1988; 26: 2120–
2123.
36.- Badak FZ, Goksel S, Sertoz R, Nafile B, Ermertcan S, Cavusoglu C, et al. Use of
Nucleic Acid Probes for Identification of Mycobacterium tuberculosis Directly from
MB/BacT Bottles. J Clin Microbiol. 1999 May; 37(5): 1602–1605.
73
37.- Plikaytis BB, Plikaytis BD, Yakrus MA, Butler WR, Woodley CL, Silcox VA, et al.
Differentiation of slowly growing Mycobacterium species, including Mycobacterium
tuberculosis, by gene amplification and restriction fragment length polymorphism
analysis. J Clin Microbiol. 1992; 30: 1815–1822.
38.- Kirschner P, Springer B, Vogel U, Meier A, Wrede A, Kiekenbeck M, et al.
Genotypic identification of mycobacteria by nucleic acid sequence determination:
report of a 2-year experience in a clinical laboratory. J Clin Microbiol 1993; 31: 2882–
2889.
39.- Suffys PN, da Silva Rocha A, de Oliveira M, Dias Campos CE, Werneck Barreto
AM, Portaels F, et al. Rapid Identification of Mycobacteria to the Species Level Using
INNO-LiPA Mycobacteria, a Reverse Hybridization Assay. J Clin Microbiol. 2001; 39:
4477–4482.
40.- Little MC, Andrews J, Moore R, Bustos S, Jones L, Embres C, et al. Strand
Displacement Amplification and Homogeneous Real-Time Detection Incorporated in a
Second-Generation DNA Probe System, BDProbeTecET. Clin Chem 1999; 45: 777-
784.
41.- Wang SX, Sng LH, Tay L. Preliminary study on rapid identification of
Mycobacterium tuberculosis complex isolates by the BD ProbeTec ET system. J Med
Microbiol 2004; 53: 57-59.
42.- Doménech-Sánchez A, Vila J. Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de
ADN en la microbiología médica. Enferm Infecc Microbiol Clin 2004; 22: 46 - 54
43.- Park H, Jang H, Song E, Chang CL, Lee M, Jeong S, et al. Detection and
Genotyping of Mycobacterium Species from Clinical Isolates and Specimens by
Oligonucleotide Array. J Clin Microbiol 2005; 43: 1782–1788.
74
44.- Sanguinetti M, Novarese L, Posteraro B, Ranno S, De Carolas E, Pecorini G, et al.
Use of Microelectronic Array Technology for Rapid Identification of Clinically Relevant
Mycobacteria. J Clin Microbiol. 2005 December; 43(12): 6189–6193.
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