Download - Anàlisi dels glicans de l’alfa-1-glicoproteïna àcida ...

Transcript
Page 1: Anàlisi dels glicans de l’alfa-1-glicoproteïna àcida ...

I. Compte, E. Giménez, J. Barbosa, V. Sanz-NebotDepartament d’Enginyeria Química i Química Analítica, Universitat de Barcelona

IntroduccióLa glicosilació és una modificació post-traduccional (PTM) de lesproteïnes que juga un paper fonamental en molts processos biològics.L’alteració de l’estructura o de la composició dels glicans units a lacadena peptídica sovint està relacionada amb l’aparició de diversespatologies, entre d’altres el càncer.

Per aquest motiu, la correcta caracterització dels glicans d’unaglicoproteïna esdevé de gran importància per avaluar la seva utilitat coma possibles biomarcadors [1].

En aquest treball s’ha optimitzat una metodologia analítica µZIC-HILIC-TOF-MS, desenvolupada prèviament en el nostre grup de recerca, per ala caracterització dels isòmers dels glicans de l’alfa-1-glicoproteïna àcidahumana (AGP), actualment estudiada com a biomarcador potencial delcàncer de pàncrees [2 i 3]. S’ha avaluat una columna ZIC-cHILIC, ambdiferent selectivitat, per tal de millorar la separació dels isòmers delsglicans i s’ha modificat el procediment de purificació dels glicans,emprant microplaques d’elució amb rebliment HILIC, amb l’objectiud’augmentar el senyal de les mostres i aconseguir millores en els límitsde detecció que permetin l’aplicació del mètode a mostres biològiques.

Exemple de dos N-glicans units a una proteïna

Anàlisi dels glicans de l’alfa-1-glicoproteïna àcida humana. Optimització del’extracció i separació dels glicans per µZIC-cHILIC-ESI-TOF-MS

Referències[1] Varki, A., Kannagi, R., & Toole, B. P. (2009). Essentials of Glycobiology. Chapter 44.[2] Giménez, E., Balmaña, M., Figueras, J., Fort, E., Bolós, C. De, Sanz-Nebot, V., Rizzi, A. (2015). Analytica Chimica Acta, 866, 59–68.[3] Mancera-Arteu M., Giménez, E., Barbosa, J., Sanz-Nebot, V., (2016). Analytica Chimica Acta, Enviat.

Tractament de mostra

PGC (Hypercarb) 10 μg 4 μg 2 μg

HILIC μElution Plate 10 μg 4 μg 2 μg

Avaluació dels mètodes de purificació

μElution Plate, Waters

ConclusionsS’han optimitzat les condicions de separació dels N-glicans de l’AGP, optimitzant el pHi la força iònica de la fase mòbil. La columna ZIC-cHILIC permet separar millor elsglicans minoritaris.La millora de la sensibilitat obtinguda mitjançant la microplaca d’elució amb reblimentHILIC ha comportat disminuir els límits de detecció dels N-glicans dels digestos.El mètode permetrà analitzar mostres biològiques així com altres glicoproteïnes amb menor percentatge de glicosilació.

19 20 21 22 23 24

0.75

0.25

0.5

1

0

x105

Temps (min)

Inte

nsita

t

3Ant3SiA 2Ant2SiA

3Ant2SiA

19 20 21 22 23 24

0.75

0.25

0.5

1

0

x105

Temps (min)

Inte

nsita

t

3Ant3SiA

2Ant2SiA

3Ant2SiA

(Mostra: s’han escollit 2 μg de AGP ja que és una concentració propera al límit de detecció (LOD). S’ha digerit amb PNGase F i injectada a una concentració de 12,5 pmol/μL amb les condicions cromatogràfiques optimitzades)

Rebliment PGC Rebliment HILIC

Separació i caracterització dels glicans

4

S’afegeix als glicanssecs 10 μL d’unasolució de 0.35 Md’anilina-12C6 i 1 MNaCNBH3 en DMSOal 30 % d’àcid acètic.

3 Marcatge isotòpic

NH2‒

Glicà marcat amb Anilina-12C6

Els glicans són separats per cromatografiade líquids capil·lar d’interacció hidrofílicazwitteriònica (ZIC-cHILIC).

Fase estacionàriaZIC-cHILIC

Els glicans sónanalitzats perespectrometriade masses

Els digestos es purifiquen emprant dos mètodes diferents:

Purificació dels glicans

A) Mètode PGC B) Mètode HILIC

Cartutxos d’extraccióen fase sòlida (SPE)HYPERCARB, Thermo.(Rebliment de PorousGraphite Carbon, PCG)

Elució amb aigua al 60% de ACN i al 0.1 %d’àcid fòrmic

2

Microplaca d’elució, Waters.(Rebliment HILIC)Elució amb Tris-citrat sòdic 1mM

✓ Poca quantitat de mostra✓ Procés més ràpid

Digestió amb PNGase F

Les mostres es redueixenen una solució 50 mM deNa3PO4 al 0,5 % de SDS iβ-ME, es porten a ebulliciódurant 30 min.

S’afegeix el reactiu NP-40per preservar l’activitat del’enzim i 1 U de PNGase F.

1

Glicoproteïnaintacta

S’incuben a 70 ºCdurant 2 h.

Optimització de la separació de N-glicans

Optimització del pH de la fase mòbil

0

0.5

1

1.5

23 24 25 26 27 28 29

x105

Temps (min)

Inte

nsita

t

3Ant3SiA2Ant2SiA

3Ant2SiA

Temps (min)

023 24 25 26 27 28 29

3Ant3SiA 2Ant2SiA

3Ant2SiA0.5

1

1.5

x105

Inte

nsita

t

0

0.5

1

1.5

33 34 35 36 37 38 39

x105

Temps (min)

Inte

nsita

t

3Ant3SiA2Ant2SiA

3Ant2SiA

(Mostra: 25 μg de AGP digerida, digerida amb PNGase F i injectada amb la columna ZIC-cHILIC a una concentració de 12,5 pmol/μL)

Canvis en el pH de la fase mòbil no milloren la separació i la intensitat dels glicans es veu reduïda.Fase mòbil seleccionada amb el pH sense ajustar.

pH = 3 pH = no ajustat pH = 8

Optimització de la força iònicax108

10 12 14 16 18 20

1.0

0.5

0.75

0.25

0

Temps (min)

Inte

nsita

t

1.0

0.5

0.75

0.25

0

Inte

nsita

t

1.0

0.5

0.75

0.25

0

Inte

nsita

t

x108 x108

3Ant3SiA

2Ant2SiA

3Ant2SiA

20 22 24 26 28 30Temps (min)

32

3Ant3SiA

2Ant2SiA 3Ant2SiA

20 22 24 26 28 30Temps (min)

32

3Ant3SiA

2Ant2SiA 3Ant2SiA

(Mostra: 25 μg de AGP digerida, digerida amb PNGase F i injectada amb la columna ZIC-cHILIC a una concentració de 12,5 pmol/μL)

Com menys força iònica, més intensos i definits es veuen els glicans.Fase mòbil seleccionada: 1 mM de NH4Ac amb el pH sense ajustar.

1 mM NH4Ac 5 mM NH4Ac 10 mM NH4Ac

Inte

nsita

t

3Ant3SiA

2Ant2SiA

3Ant2SiA

x105

2

3

4

1

Temps (min)

016 17 18 19 20 21

4Ant4SiA

4Ant4SiA1Fuc3Ant3SiA1Fuc

4Ant3SiA1Fuc

20 21 22 23 24

x105

Inte

nsita

t

2

3

4

1

Temps (min)

0

3Ant3SiA

2Ant2SiA

3Ant2SiA

4Ant4SiA1Fuc

4Ant4SiA

3Ant3SiA1Fuc

4Ant3SiA1Fuc

ZIC-HILIC ZIC-cHILIC

Optimització de la columna cromatogràfica

Glicà2Ant2SiA 2Ant2SiA1Fuc 3Ant3SiA 3Ant3SiA1Fuc 3Ant2SiA 4Ant4SiA 4Ant4SiA1Fuc 4Ant3SiA1Fuc

2µg PGC2µg

HILIC

Amb quantitats de proteïna properes al límit de detecció (2 μg), alguns glicans minoritaris purificats amb PGCno s’observen, però sí que s’observen amb la purificació realitzada amb la microplaca HILIC.

Resultats i discussió

S’observa que els glicansminoritaris es troben més benseparats utilitzant la columnaZIC-cHILIC.

L’ordre d’elució varia entre les dues columnes degut al canvide la càrrega dels zwitterionsen la fase estacionària.

(Mostra: 25 μg de AGP digerida, digerida amb PNGase F i ajustada a una concentració

de 12,5 pmol/μL)

Glicans i proteïnaintacta

PNGase F

3x10

0

0.5

1

1.5984.6654

985.0017984.3300

985.3337

985.6686

Relació Massa/Càrrega (m/z)984 985 986 987

Inte

nsita

t