BIOLOGÍA MOLECULAR
Diana María Gualtero Leal
BIOL 3051L
Objetivos
Analizar el ADN Conocer los principios básicos de la
técnica de electroforesis y aplicarla al análisis del ADN
Describir cómo funcionan las enzimas de restricción para cortar el ADN
Biología Molecular
Estudia el ADN y los genes que contiene
El ADN muestra algunas similitudes entre organismos debido a que evolutivamente han partido de un ancestro común
La Biología Molecular permite estudiar las relaciones evolutivas entre los organismos
Tecnología del ADN recombinante:
Permite obtener copias de un segmento específico del ADN
Se introduce ADN foráneo en las células de un microorganismo
Una secuencia de ADN es amplificada o clonada
El ADN es cortado mediante enzimas de restricción
Enzimas de Restricción
También llamadas endonucleasas Enzimas bacterianas empleadas para
cortar el ADN en sitios específicos En las bacterias actúan como
mecanismo de defensa para degradar el material genético extraño que entra a la célula
Secuencias Palindrómicas: son secuencias reconocidas por las enzimas de restricción que se leen igual en ambas hebras del ADN en la dirección 5'→3‘
El nombre de las endonucleasas proviene de la bacteria de la cual fue aislada:
EcoRI→E= género Escherichia
co= especie coli
R= cepa RV 13
I= primera endonucleasa aislada
de esta cepa
HindIII: es derivada de Hemophilus influenzae
Tipos de Corte: Cohesivos (pegajosos): cortan la
doble hebra del ADN de manera escalonada
5‘-GAATTC-3‘ 5‘-GGATC-3‘3‘-CTTAAG-5‘ 3‘-CCTAGG-5‘
EcoRI BamHI
Abruptos: cortan las dos hebras del ADN en la misma posición
5‘-AAT AAT-3‘ 5‘-CCC GGG-3‘3‘-TTA TAA-5‘ 3‘-GGG CCC-5‘
SspI SmaI
Factores que afectan a las enzimas de restricción
Pureza del ADN: proteínas y altas concentraciones de sal
Temperatura y pH Amortiguador (buffer) adecuado:
provee el ambiente necesario para que la enzima trabaje adecuadamente
Electroforesis
Esta técnica permite separar macromoléculas (proteínas, polipéptidos, fragmentos de ADN o ARN) a través de un flujo de corriente eléctrico
Permite determinar el tamaño de los fragmentos de ADN
El ADN y el ARN migran hacia el polo positivo del campo eléctrico debido a que están negativamente cargado, debido sus grupos fosfato
Los fragmentos del ADN se separan de acuerdo con:
El tamaño de la molécula o masa Forma o conformación del ADN Tamaño o poro del gel Magnitud de la carga neta de la
molécula
Los fragmentos del ADN migran inversamente proporcional al logaritmo de su tamaño o peso molecular
El movimiento de los fragmentos del ADN genera un patrón de bandas
Cada banda corresponde a un fragmento de ADN de un tamaño particular
El tamaño de cada fragmento se determina por un marcador cuyos fragmentos tienen pesos moleculares conocidos
Los fragmentos separados por electroforesis pueden: Analizarse empleando otras técnicas Ser comparados con diferentes organismosInsertarse en genomas de otros organismos para crear un ADN Recombinante
Tipos de GelAgarosa Poliacrilamida
Polisacárido extraído de algas
Se generan al mezclar polímeros de acrilamida y bisacrilamida
No tóxico Tóxico
Se puede variar el tamaño del poro ajustando la concentración de agarosa
El tamaño de los poros depende de la concentración de acrilamida y bisacrilamida
Separa fragmentos de ADN de 200 a 50 mil pb
Separa mezclas de proteínas y fragmentos de ADN de menos de 500 pb y
Ejercicio 1. Preparación del Gel para Electroforesis
Materiales: Gel de Agarosa 100 ml de TBE (Tris base,ácido
bórico, EDTA) Guantes resistentes al calor Erlenmeyer de 250 ml Bandejas para gel
Procedimiento Preparación de la bandeja:1. Prepare la bandeja de electroforesis
primero y luego2. Suba las tapas de los lados de la
bandeja 3. Coloque la peinilla en la bandeja de
electroforesis4. Mezcle 1 g de agarosa con 100 ml
de TBE 1X en un Erlenmeyer limpio y caliéntelo en una hornilla. Use guantes resistentes al calor
5. Agite girando la mezcla de vez en cuando. Cuando empiece a burbujear y aclare, agite constantemente hasta que hierva y se vean burbujas en la superficie6. Remueva de la hornilla y deje enfriar hasta que lo pueda agarrar sin quemarse7. Vierta la mezcla en la bandeja de electroforesis empezando en una esquina y rompa las burbujas con una aguja de disección
Ejercicio 2. Practicando el Uso de las Micropipetas
1. Escoja un plato Petri ya preparado con gel solidificado que contiene fosas
2. Escoja una micropipeta y apoye el brazo que esté agarrando la micropipeta en una superficie firme
3. Utilice la mano contraria para apoyar la micropipeta
4. Con su micropipeta, obtenga un poco de la mezcla (agua, glicerina y tinte azul)
5. Coloque la punta de la micropipeta encima de la fosa, sin tocar el gel
6. Vierta el contenido en la fosa, presionando despacio el botón de la pipeta hasta el primer punto de resistencia
7. Practique este procedimiento varias veces
Ejercicio 3. Corrida del gel de Electroforesis
Materiales Aparato de electroforesis Fuente de energía Micropipetas y micropuntas Muestras de ADN TBE 1X Gel Tinte (loading die)
Procedimiento
1. A cada microtubo que contiene ADN añada 2 µl de tinte. El volumen total de cada microtubo es ahora de 12 µl
2. Con el gel solidificado,ponga la bandeja en cámara de manera que las fosas queden en el lado negativo (cátodo). Esto asegura que las muestras migren del cátodo hacia el ánodo
3. Añada TBE 1X hasta que cubra el gel
4. Remueva con cuidado la peinilla del gel
5. Utilizando una micropipeta coloque 12 µl del tinte en la primera fosa. Para las demás muestras coloque de cada una 12 µl en las fosas correspondientes. Para cada muestra utilice una micropunta diferente
6. Coloque la tapa sobre la cámara de electroforesis teniendo cuidado de no moverla para que no se salgan las muestras de las fosas
7. Para correr el gel
a. Conecte la cámara a una fuente de energía y encienda el aparato a una razón de 10 V por cada cm del gel (80V)
b. Asegúrese que el aparato esté leyendo en voltímetros y NO en miliamperios
c. Verifique que vea burbujas formándose en el amortiguador, y que NO se esté calentando
e. Deje migrar las muestras hasta que la línea del tinte se encuentre aproximadamente a un centímetro y medio del extremo positivo
f. Apague el equipo
8. Para teñir el gel:
a. Saque el gel y colóquelo en la bandeja de tinción
b. Cubra el gel con tinte
c. Deje por media hora y agite de vez en cuando
d. Saque el gel usando guantes desechabes y colóquelo en agua para lavar hasta que se destiña. NO BOTE EL TINTE
e. Saque el gel y colóquelo en el iluminador
Electroforesis
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