CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -CONCYT-
SECRETARIA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -SENACYT-
FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGIA -FONACYT-
FONDO PARA EL DESARROLLO CIENTÍFICO Y TECNOLÓGICO –FODECYT-
UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA
FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS Y FARMACIA
INFORME FINAL
EVALUACIÓN DE FOCOS POTENCIALES DE PARAGONIMIASIS Y
DETERMINACIÓN MEDIANTE TÉCNICA MOLECULAR DE LA ESPECIE DE
PARAGONIMUS PRESENTE EN LOS DEPARTAMENTOS DEL ÁREA SUR DE
GUATEMALA.
PROYECTO FODECYT No. 63-2009
ANTONIETA RODAS RETANA
Investigadora Principal
GUATEMALA, AGOSTO DEL 2012.
AGRADECIMIENTOS:
La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro
del Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por La
Secretaría Nacional de Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional
de Ciencia y Tecnología –CONCYT-.
OTROS AGRADECIMIENTOS
La investigadora principal quiere agradecer a los investigadores que participaron como
equipo de trabajo del proyecto, los cuales fueron: Patricia Landaverde, Carlos
Montenegro, Vivian Monzón y Raquel Lima. Así mismo agradece, por el apoyo
financiero, a la Secretaria Nacional de Ciencia y Tecnología y al Consejo Nacional de
Ciencia y Tecnología, por su confianza en la investigación y sobre todo en nuestro
equipo. Queremos agradecer al Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología y
a la Escuela de Biología por su apoyo en la realización del proyecto tanto en
instalaciones, equipo y material como en asesoría y orientación, en especial a la Ph. D.
Carlota Monroy. Además agradecer al equipo del Laboratorio por su apoyo en el
desarrollo de la investigación. A la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la
Universidad de San Carlos de Guatemala por ser nuestro respaldo legal, en especial al
Ph. D. Oscar Cóbar.
El equipo de investigación, también, desea agradecer al Lic. Ghandi Ponce, Srita.
Ivonne Gómez y Lic Mauricio García. Personal de la Sección de Entomología, en su
asesoría para la parte molecular, estadística y logística del proyecto, además al Sr Carlos
Ramos por su valiosa colaboración en el Campo
Y a las personas que consulten este documento y les sea de utilidad.
INDICE DE CONTENIDOS
RESUMEN i
SUMMARY (ABSTRACT) ii
PARTE I 01
I.1 INTRODUCCIÓN 01
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 03
I.2.1 Antecedentes en Guatemala 03
I.2.2 Justificación del Trabajo de Investigación 04
I.3 OBJETIVOS E HIPÓTESIS 06
I.3.1 Objetivos 06
I.3.1.1 General 06
I.3.1.2 Específicos 06
I.3.2 Hipótesis 06
I.4 METODOLOGÍA 07
I.4.1 Localización 07
I.4.2 Variables 08
I.4.2.1 Variables dependientes 08
I.4.2.2 Variables independientes 08
I.4.3 Indicadores 08
I.4.4 Estrategia Metodológica 08
I.4.4.1 Población y Muestra 08
I.4.4.2 Unidades Muestrales 09
I.4.4.3 Unidades Experimentales 09
I.4.5 El Método 09
I.4.5.1 Colecta de cangrejos en los sitios de estudio 09
I.4.5.2 Búsqueda de Paragonimus y toma de datos de los
Hospederos intermediarios 09
I.4.5.3. Determinación de las especies de Paragonimus
presentes en las muestras colectadas 10
I.4.5.4 Extracción de ADN 10
I.4.5.5 Amplificación de ADN 11
I.4.5.5.1 Genoma mitocondrial 11
I.4.5.6 Visualización de las bandas 12
I.4.5.7 Purificación del ADN 12
I.4.5.8 Secuenciación 12
I.4.5.9 Análisis de Secuencias 12
I.4.5.10 Evaluación de coliformes 13
I.4.6 La Técnica Estadística 13
I.4.7 Los Instrumentos utilizados 13
PARTE II 14
MARCO TEÓRICO (CONCEPTUAL) 14
II.1 Paragonimus 14
II.1.1 Clasificación 14
II.1.2 Ciclo de vida de Paragonimus sp 14
II.2 Paragonimiasis 20
II.2.1 Patogenia y Fisiopatología 21
II.2.2 Manifestaciones Clínicas 21
II.2.3 Diagnostico 22
II.2.4 Epidemiología 25
II.2.5 Tratamiento 26
II.3 Control 26
II.4 Técnica molecular 27
II.4.1Identificación genética 27
II.4.2 Técnica de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 28
II.4.3 ADN mitocondrial 29
II.5 Enfermedades olvidadas 29
II.6 Factores Físicos y Químicos del Agua 30
II.6.1 Potencial de Hidrogeno (PH) 30
II.6.2 Dureza 30
II.6.3 Alcalinidad 31
II.6.4 Conductividad 31
II.6.5 Sólidos 31
II.6.6 Turbidez 32
PARTE III 33
III.1 RESULTADOS 33
III.1.1 Estadísticos 33
III.1.1.1 Regresión múltiple lineal 33
III.1.2 Estadísticos genéticos 33
III.1.2.1 Polimorfismos genéticos 33
III.1.2.2 Recombinación 33
III.1.2.3 Test de neutralidad 34
III.1.2.4 Haplotipos 34
III.1.2.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación 35
III.1.3 Análisis filogenéticos 36
III.1.4 Análisis de los Resultados de la Muestra de Agua 37
III.2 DISCUCIÓN DE RESULTADOS 39
III.2.1 Estadísticos Genéticos 39
III.2.1.1 Polimorfismo Genético 39
III.2.1.2 Recombinación 39
III.2.1.3 Test de Neutralidad 39
III.2.1.4 Haplotipos 39
III.2.1.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación 39
III.2.2 Relaciones Filogenéticas 40
III.2.3 Distribución 40
III.2.4 Estadísticos 40
III.2.5 Características Físicas y Químicas del Agua de los sitios
de Colecta 40
PARTE IV 41
IV.1 CONCLUSIONES 41
IV.2 RECOMENDACIONES 43
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 44
IV.4 ANEXOS 48
PARTE V 57
V.1 INFORME FINANCIERO 57
LISTA DE FIGURAS
Nombre de figuras Pag.
Figura 1: Ciclo de vida del Parasito Paragonimus sp. 15
Figura 2: Huevos de Paragonimus sp. Biopsia pulmonar de paciente. Tinción
H&E.
16
Figura 3: Huevo con opérculo bien definido 17
Figura 4: Imagen del estadío de Miracidio de Paragonimus sp. 17
Figura 5: Imagen del estadío de Cercaria de Paragonimus sp. 18
Figura 6: Fotografía del estadío Metacercaria de Paragonimus sp. tomada en el
laboratorio del LENAP. Crédito: Vivian Monzón.
18
Figura 7: Fotografía del crustáceo (hospedero intermediario) colectado en el
proyecto. Crédito: Raquel Lima.
19
Figura 8: Fotografía de Paragonimus mexicanus, identificado mediante técnica
molecular. Crédito: Vivian Monzón.
21
Figura 9: Enquistamiento pulmonar de Paragonimus sp. observado en
radiografía
23
Figura 10: Pulmón de Zarigüeya (Didelphis virginiana), infectado
naturalmente con Paragonimus mexicanus. Se observan múltiples granulomas
en los lóbulos caudales, de tamaños y pesos variables, con pared delgada, color
blanco-grisáceo y consistencia blanda.
24
Figura 11: Fotografía del material y reactivos de PCR, utilizados dentro del
proyecto. Crédito: Raquel Lima.
28
Figura 12. Árbol consenso de Máxima versosimilitud y Máxima parsimonia,
mostrando los valores de soporte de Boostrap.
36
Figura 13: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Escuintla de
Guatemala.
49
Figura 14: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Jutiapa de
Guatemala
50
Figura 15: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Retalhuleu de
Guatemala.
50
Figura 16: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de San Marcos de
Guatemala.
51
Figura 17: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Santa Rosa de
Guatemala.
51
Figura 18: Mapa de los sitios de muestreo positivos del departamento de Santa
Rosa de Guatemala.
52
Figura 19: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Suchitepéquez
de Guatemala.
52
Figura 20: Mapa general de los sitios de muestreo. 54
Figuras 21 y 22: Colecta de cangrejos en los ríos de los sitios de muestreo y
hospedero intermediario colectado. Créditos: Patricia Landaverde y Carlos
Montenegro.
55
Figuras 23 y 24: Toma de datos de los cangrejos colectaos y búsqueda del
Paragonimus en los hospederos intermediarios. Créditos: Vivian Monzón y
Raquel Lima.
55
Figura 25: Fotografía de una metacercaria de Paragonimus mexicanus,
extraída de los cangrejos colectados. Crédito: Vivian Monzón
56
Figura 26: Sitio de muestreo que presenta las condiciones ideales para la
presencia de cangrejos con posibilidad de infección con Paragonimus
mexicanus. Crédito: Patricia Landaverde.
56
LISTA DE TABLAS
Número y nombre de tabla Pag.
Tabla 1. Cebadores para amplificación del fragmento del citocromo b 11
Tabla 2: Clasificación de Paragonimus sp. 14
Tabla 3: Distintos tipos de aguas 31
Tabla 4: Regresión múltiple lineal para la presencia de Paragimus en cangrejos
de la costa sur de Guatemala. (p = 0.001724)
33
Tabla 5. Haplotipos encontrados para los individuos dentro de las poblaciones
de Paragonimus mexicanus de Guatemala y Ecuador. En negro se observan los
haplotipos encontrados en el presente estudio
34
Tabla 6. Valores de diferenciación genética, mostrando el grado de
diferenciación genetica entre los grupos. P.mexicanus-GuateR1; representa a
las poblaciones de P. mexicanus encontradas en el trabajo de campo del
presente estudio. P.mexicanus-GuateR2; representa a las poblaciones de P.
mexicanus encontradas en el estudio del 2003. P.mexicanus Ecuador;
representa a las poblaciones del 2003 obtenidas en Ecuador.
35
Tabla 7. Indices de diferenciacion globales para todos los grupos analizados de
Paragonimus mexicanus . Se excluyen las especies P. bangkokensis y P.
westermani.
36
Tabla 8. Promedio de los resultados del análisis microbiológico del agua en los
6 departamentos.
37
Tabla 9. Listado de los puntos de colecta realizados durante la investigación. 53
i
RESUMEN
La paragonimiasis es una enfermedad parasitaria causada por la duela Paragonimus y es
transmitida por el consumo del hospedero intermediario (cangrejos) crudo o mal cocido
La enfermedad puede llegar a afectar diversos sistemas de órganos que pueden ir desde
el sistema pulmonar hasta el sistema nervioso La enfermedad suele ser de difícil
diagnóstico ya que suele confundirse con tuberculosis o Histoplasmosis debido a que
presentan la misma sintomatología. Otro problema lo constituye el hecho de que incluso
el 20% de pacientes con paragonimiasis presenta radiografías de tórax El hospedero
final del parasito suele ser el humano, un mamífero silvestre o mamíferos domésticos
como perros, gatos, hámsters y cerdos, los cuales suelen ser vulnerables a contraer esta
enfermedad En Guatemala se conoció el primer caso de paragonimiasis en el año de
1945, encontrándose en pulmones de zorrillo y zarigüeya en la localidad de Cuilapa,
Santa Rosa. En el año 1986, se detectó el primer caso humano en un paciente que refirió
haber consumido cangrejos crudos en el área del Playón del río Los Esclavos, Santa
Rosa. Durante el año 1994 se evaluó la quebrada de San José en Cuilapa y el río San
Diego en Escuintla donde se encontró el parásito en los hospederos intermediarios;
cangrejos de río. Los parásitos encontrados se identificaron como Paragonimus
mexicanus .
Por esta razón investigamos en los 6 departamentos de la zona sur de Guatemala para
determinar el avance del parásito, pero para esto tuvimos que realizar numerosos
muestreos donde colectamos diferente numero de cangrejos ya que en los
departamentos de Escuintla, Suchitepequez Retalhuleu y San Marcos el numero de
cangrejos fue muy bajo ya que el pesticida con el que se rocía a la caña está afectando la
población de larva de cangrejos y sumado a eso el impacto humano, razón por la cual el
numero de cangrejos es significativamente menor comparado con la de los otros dos
departamentos Posterior a la colecta fueron evaluados en el laboratorio para verificar
en ellos la presencia de Paragonimus sp. Al constatar la presencia , fueron evaluados
molecularmente.
Los resultados obtenidos fueron satisfactorios ya que pudimos observar que el avance
de la presencia del parásito ha sido poco en relación con los años transcurridos desde el
último muestreo pero con relación a la abundancia de la infestación en dos ríos
podemos decir que el 100% de los cangrejos muestreados están infectados por lo que la
población circundante podemos decir que esta en un alto riesgo de contagio.
Adicionalmente la evaluación de las muestras de agua realizadas en cada río están
relacionadas proporcionalmente con la presencia y abundancia de cangrejos y a la vez
del parásito
Palabras claves: Paragonimus sp. Paragonimus mexicanus, paragonimus.
ii
ABSTRACT
Paragonimiasis is a parasitic disease caused by lung fluke Paragonimus, and the
transmission is caused by consumption of the intermediate host (crabs) raw or
undercooked. The disease can affect various organ systems that can range from the
pulmonary system to the nervous system. The disease is often difficult to diagnose
because it can be confused with tuberculosis or histoplasmosis, because they exhibit the
same symptoms. The final host of the parasite is usually human or mammals, wild or
domestic such as dogs, cats, hamsters and pigs, which are often vulnerable to this
disease. In Guatemala, the first known case of paragonimiasis was reported in the year
1945, found in the lungs of skunk and opossum in the town of Cuilapa, Santa Rosa. In
1986, was detected the first human case in a patient who reported having consumed raw
crabs in the area of Playon Río de los Esclavos, Santa Rosa. During 1994 was assessed
the San Jose creek and river Cuilapa San Diego in Escuintla where the parasite was
found in intermediate hosts, crabs. The parasites found were identified as Paragonimus
mexicanus.
For this reason we investigated in 6 departments of the south of Guatemala to
determine the progress of the parasite, but for this we had to make numerous samples.
Different numbers of crabs where collected in the departments of Escuintla,
Suchitepequez, Retalhuleu and San Marcos. In this places the number of crabs was very
low due to the pesticide that is sprayed into the cane plantations. This affect the
population of larvae crabs and added to that is the human impact, which is why the
number of crabs is significantly smaller than those of the other two departments. After
the collection the crabs were evaluated in the laboratory to verify the presence of
Paragonimus sp. If it was present the parasite, we proceed to the molecular evaluation.
The results were satisfactory because we observed that the advance of the parasite has
diminished in relation to the years since the last sampling. In relation to the abundance
of infestation in two rivers we can say that 100% of crabs sampled are infected with the
surrounding population that we can say that is a high risk of infection. Further
evaluation of the water samples taken at each river are proportionally related to the
presence and abundance of crabs and simultaneously to the parasite
Key Words: Paragonimus sp. Paragonimus mexicanus, paragonimus.
1
PARTE I
I.1 INTRODUCCIÓN
La paragonimiasis en una enfermedad causada por un trematodo del género
Paragonimus que es causante de una enfermedad principalmente zoonotica, pero se han
identificado ocho especies de Paragonimus en el ser humano, el que actúa como
hospedero final. La distribución del género Paragonimus se encuentra localizado
principalmente en zonas pacífico costeras de Asia, África y América (Blair, Xu, &
Agatsuma, 1999). Las especies de Paragonimus son altamente evolucionadas, los parásitos
con un ciclo de vida complejo que implica a los caracoles, crustáceos y mamíferos. Las formas
adultas de especies de Paragonimus residen en los pulmones de una gran variedad de huéspedes
mamíferos, incluyendo seres humanos. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21420222).
La enfermedad es de comienzo gradual y puede evolucionar a una forma crónica. Las
dos formas principales son: la paragonimiasis clásica, que afecta los pulmones, y la
forma no clásica, que origina el síndrome de larva migrans que ocasiona paroxismos de
tos que suelen expulsar esputo sanguinolento y pardo por la presencia de huevecillos de
la especie de Paragonimus. A veces aparecen derrame pleural, neumotorax,
bronquiectasia y fibrosis pulmonar. Los síntomas tienden a ceder después de cinco años,
pero a veces persisten incluso por 20 años (Chen, 1978; Kang et. al., 2000).
Se ha reportado la enfermedad en el Sistema Nervioso Central, peritoneo, pared
intestinal, piel, hígado, bazo, ganglios linfáticos, riñones, ojos, órganos reproductores,
entre otros. A este respecto, de acuerdo a su ubicación, la paragonimiasis extrapulmonar
se ha clasificado en 4 tipos: paragonimosis cerebral, torácica, abdominal y generalizada.
Existen infecciones asintomáticas.
Entre las manifestaciones iniciales de la paragonimosis (fase aguda y de migración) se
encuentran: dolor abdominal cambiante, predominantemente epigástrico, con
irradiación hacia mesogastrio y región lumbar, tos seca, náusea y vómito, fiebre,
urticaria y eosinofilia. La migración pleural puede dar lugar a pleuritis, pericarditis y
mediastinitis agudas o crónicas. El diagnóstico diferencial de la paragonimiasis
pulmonar debe considerar cuadros compatibles con tuberculosis pulmonar, cáncer
pulmonar, hemosiderosis pulmonar, neumonía e histoplasmosis, entre otros, de acuerdo
a las estimaciones de la OMS existen al menos 22 millones de casos.
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/paragonimosis.ht
ml.
La forma en que el ser humano suele infectarse con Paragonimus es por medio de la
ingesta de cangrejos crudos o mal cocidos infectados con la duela en su fase infectiva
denominada metacercaria. Debido a las costumbres alimenticias de sus habitantes, los
países asiáticos mantienen una constante vigilancia epidemiológica sobre las
infecciones de esta enfermedad. En Guatemala, la transmisión hacia seres humanos se
encuentra más reducida debido a una diferencia en la dieta con las poblaciones asiáticas.
Sin embargo, algunas comunidades guatemaltecas, cuya ubicación se encuentra aledaña
2
a ríos o cuerpos de agua, hacen de su dieta diaria el consumo de cangrejos, pudiendo
llegar a consumir cangrejos infectados con Paragonimus.
Guatemala es un país con un alto índice de enfermedades parasitarias, dentro de las
cuales se puede contar a la Paragonimiasis. Aun así, la enfermedad se considera como
una de las enfermedades olvidadas (descrita así por la OPS), y puede ser fácilmente
confundida con la tuberculosis, por tener una similar sintomatología (WHO, 2007).
A pesar de que existen algunos estudios que han identificado la presencia del parasito,
éstos solo se han realizado en pocas localidades de Guatemala (Rosas, 2000). De ahí
nació la inquietud del desarrollo y ejecución del presente proyecto, donde se pretendió
determinar la presencia de Paragonimus en nuevas comunidades en riesgo y tratar de
determinar la situación actual del parásito en los sitios donde ya ha sido reportada su
presencia. La identificación molecular del parásito también se realizó con el propósito
de comparar los análisis realizados en estudios anteriores, de hace más de diez años, con
el objetivo de verificar si efectivamente la especie identificada en ese entonces, es la
misma especie a la obtenida con este nuevo estudio, y de esta manera determinar la
presencia o no de nuevas especies de Paragonimus en Guatemala.
3
I.2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
I.2.1 ANTECEDENTES EN GUATEMALA
En 1946, Caballeros descubre Paragonimus sp., en los pulmones de un zorrillo y de un
tacuazín en el municipio de Guazacapán, Santa Rosa y a orillas del río Moca en
Suchitepéquez. Dicho autor los identifica como P. rudis pero posteriores estudios
determinaron que la especie era P. kellicotti (Rosas, 2000).
Aguilar, en 1955, identificó Paragonimus sp., en un tacuazín en el río María Linda
(Rosas, 2000). Peñalonzo et al. en 1986, identifican el primer caso de paragonimiasis en
un paciente procedente del área del río Los Esclavos en Santa Rosa. Al año siguiente,
Cruz realiza un estudio de trematodos en cangrejos en la misma localidad y otra vez se
reporta la presencia de Paragonimus sp. (Cruz, 1987).
Teni & Pinto (1993) demuestra de nuevo la presencia de Paragonimus sp., en la misma
área del río Los Esclavos. En este estudio se reporta el nombre de dos especies de
huéspedes intermediarios, un caracol (Aroapyrgus alleei) y un cangrejo
(Potamocarcinus c.f. guatemalensis). En ese mismo año, se reporta la prevalencia de P.
mexicanus en niños escolares en esta misma área.
Pérez (1994) utiliza el método de diagnóstico ELISA para detectar anticuerpos
específicos de Paragonimus en niños y adultos de dos poblaciones del departamento de
Santa Rosa. En sus resultados reporta la presencia del trematodo en dichas poblaciones.
En 1996, Pinillos realiza un estudio epidemiológico en el departamento de Santa Rosa
para determinar el porcentaje de huéspedes intermediarios infectados con Paragonimus
sp., en Chiquimulilla, Guazacapán y Taxisco. Además de reportar la presencia del
parásito, concluye que existe un alto consumo de cangrejos por parte de los habitantes
de estas áreas.
Rosas (2000) realizó un estudio de Paragonimus mexicanus en cinco afluentes del Río
Los Esclavos en Santa Rosa. En su estudio, colectó cangrejos para determinar la
presencia del parásito y de 312 cangrejos capturados, el 18.59% estuvo infectado.
Además inoculó artificialmente a cinco gatos para describir la sintomatología de la
enfermedad.
Iwagami et. al. (2003), realizaron un estudio filogenético y molecular basado en
secuencias de ADN de metacercarias de Paragonimus mexicanus de Guatemala y
Ecuador. Con el estudio se concluye que las especies de Paragonimus mexicanus, de
Guatemala y Ecuador, están genéticamente diferenciados probablemente al nivel de
subespecie.
4
I.2.2 JUSTIFICACIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
Más de 40 especies han sido descritas en el género Paragonimus., dichas especies han
sido reportadas en Asia, América y África. Infecciones humanas han ocurrido debido a
varias especies del género en distintas partes del mundo. Se ha estimado que más de 21
millones de personas alrededor del mundo se encuentran infectadas con éste parasito.
(Toscano et. al., 1995).
La paragonimiasis se encuentra dentro del grupo de las enfermedades olvidadas, este
hecho no hace que deje de ser importante ya que la presencia de este parásito afecta
tanto a la salud como a la economía de las comunidades. Para dicha economía
representa pérdidas, ya que debido a la sintomatología (fatiga, debilitamiento, pérdida
de peso, etc.) se produce un descenso considerable en la productividad humana. Las
poblaciones de bajos recursos son las que se encuentran más vulnerables a adquirir la
enfermedad; sin embargo, las poblaciones con un nivel de ingresos más alto no están
exentas de adquirir la enfermedad. Las poblaciones de bajos recursos, que habitan en
áreas aledañas a ríos o afluentes, son las más vulnerables ya que hacen del cangrejo o
camarón parte de su dieta cotidiana debido a que representa un costo bajo o nulo,
adquiriéndolo directamente de los ríos.
Además de afectar severamente la salud humana, Paragonimus puede llegar a afectar a
animales domésticos como cerdos, que si no son cocinados correctamente puede
constituir otro mecanismo de transmisión hacia el ser humano. Aparte de ser otro
mecanismo de transmisión, el hecho de estar infectados con el parásito puede hacer que
los animales no se desarrollen correctamente y morir antes de poder ser consumidos,
reduciendo de esta manera la alimentación disponible de las comunidades (Blair, Xu &
Agatsuma, 1999).
Los estudios realizados sobre el parásito y la enfermedad, se han llevado a cabo en
pocas partes del país (Tongu et. al., 1995; Rosas, 2000; Teni & Pinto, 1993). Por la falta
de información en la distribución del parásito, la enfermedad se puede diagnosticar
erróneamente como tuberculosis, generando un gasto extra al tratarla de manera
incorrecta. Es por ello que la información actualizada de la presencia de Paragonimus
en cangrejos consumidos por algunas comunidades puede ayudar a establecer nuevas
zonas de riesgo. Se debe tomar en cuenta el hecho de que la enfermedad no se encuentra
erradicada del país y aún puede generar problemas de salud en distintas comunidades y
gastos extras a entidades gubernamentales como el Ministerio de Salud. La información
de este estudio ofrecerá datos importantes sobre algunas áreas de distribución que
servirán para incrementar el conocimiento acerca de Paragonimus y para realizar
estudios comparativos.
Adicionalmente, es importante recalcar el hecho de que en los estudios anteriormente
desarrollados en el país, a pesar de que se realizaron técnicas moleculares para la
determinación de las especies del parásito, éstas identificaciones y reportes tienen más
de cinco años de haber sido realizados, por lo que nuevas determinaciones moleculares
pueden ratificar los reportes realizados con anterioridad e incluso pueden generar
5
nuevos reportes de distribución en el país. Autoridades como el Ministerio de Salud
pueden utilizar la información generada por este proyecto como una herramienta valiosa
para el combate de esta enfermedad, lo que facilitará la prevención o eliminación de
focos potenciales de paragonimiasis.
6
I.3 OBJETIVOS E HIPOTESIS
I.3.1 Objetivos
I.3.1.1 General
I.3.1.1.1 Evaluar focos potenciales de Paragonimiasis y determinación
mediante técnica molecular de la especie de Paragonimus presente en los
departamentos del área del Sur de Guatemala.
I.3.1.2 Específicos
I.3.1.2.1 Evaluar los posibles focos de Paragonimiasis y determinar
mediante técnica molecular la especie de Paragonimus presente en los
departamentos del área del Sur de Guatemala.
I.3.1.2.2 Determinar y evaluar la presencia de Paragonimus en ríos de los
departamentos de Jutiapa, Santa Rosa, Escuintla, Suchitepéquez,
Retalhuleu y San Marcos, durante el transcurso del año.
I.3.1.2.3 Determinar y evaluar la especie de Paragonimus presente en
hospederos intermediarios del área sur de Guatemala, utilizando ADN
mitocondrial.
I.3.1.2.4 Localizar y evaluar nuevas zonas de riesgo para la transmisión
de dicha enfermedad.
I.3.1.2.5 Realizar análisis microbiológicos (coliformes totales y fecales),
en los sitios de colecta seleccionados.
I.3.1.2.6 Divulgar a las autoridades, actores sociales e instituciones en el
campo de su competencia la información obtenida de la investigación.
I.3.2 Hipótesis
Paragonimus está presente en crustáceos colectados en ríos de áreas donde aún
no ha sido reportado para el país.
7
I.4 METODOLOGIA
I.4.1 Localización
Debido a que está enfermedad está muy asociada a las comunidades cercanas a ríos y
que en su dieta diaria requieren del consumo de cangrejos, se trabajó directamente con
personas que colectan cangrejos para su consumo personal. Se trabajó en los
departamentos de Jutiapa, santa Rosa, Escuintla, Suchitepéquez, Retalhuleu y San
Marcos, y en cada departamento se seleccionó dos comunidades cercanas a ríos, cuya
selección fue a través de la ubicación de los ríos por medio de fotointerpretación
utilizando sistemas de Información Geográfica (SIG), Se hizo de esta manera ya que el
acceso a los ríos a veces es limitado por su geografía, además por seguridad personal.
Las coordenadas de los sitios de muestreo fueron las siguientes:
Para el departamento de Jutiapa:
Jutiapa Amayito N 14°17´03.92" O 89° 56´58.55" 929 msnm
Jutiapa Paz N 14°17´9.21" O 89° 53´35.37" 889 msnm
Jutiapa Ostúa N 14°18´3.46" O 89° 54´22.78" 931 msnm
Jutiapa El salto N 14°17´2.29" O 89° 56´58.64" 928 msnm
Para el departamento de Santa Rosa:
Santa Rosa Usarin N 14°01´39.24" O 90° 25´54.13" 60 msnm
Santa Rosa Chiquimulilla N 14°05´23.98" O 90° 27.54.82" 244 msnm
Santa Rosa Guazacapán N 14°4´4.05" O 90° 24´56.14" 233 msnm
Santa Rosa El Astillero N 14°01´29.91" O 90° 25´22.30" 69 msnm
Santa Rosa Papaturro N 14°14´20.04" O 90° 19´33.65" 557 msnm
Santa Rosa Ixhuatán N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm
Santa Rosa Ixhuatán 1 N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm
Santa Rosa Ixhuatán 2 N 14°11´395" O 90° 16´05.98" 1240 msnm
Santa Rosa Maria Linda N 14° 6'53.53" O 90° 38' 24.45" 37 msnm
Para el departamento de Escuintla:
Escuintla El Baúl N 14°22´50.54" O 90° 0´57.03" 549 msnm
Escuintla La Laguneta N 14°17´14.65" O 90° 58´11.84" 290 msnm
Escuintla La Unión N 14°20´34.25" O 91° 3´48.87" 317 msnm
Escuintla Tierra Nueva N 14°15´54.65" O 90° 57´58.09" 239 msnm
Para el departamento de Suchitepéquez:
Suchitepéquez Río Negro N 14°32´43.38" O 91° 33.´35.03" 370 msnm
Suchitepéquez Sis N 14°30'42.85" O 91°34'41.13" 266 msnm
Suchitepéquez
Brazo del Vado
Hondo N 14° 33'10.54" O 91°27'29.60" 462 msnm
Suchitepéquez La Cascada N 14°32'46.81" O 91°34'02.91" 361 msnm
8
Suchitepéquez El Chiflón N 14° 33'40.79" O 91°30'21.94" 491 msnm
Para el departamento de Retalhuleu:
Retalhuleu Yuxiná N 14°32´52.01" O 89° 56´58.55" 275 msnm
Retalhuleu Brazo del Samalá N 14°34´21.23" O 91° 37´54.32" 330 msnm
Retalhuleu Yaxhá N 14°33´52.01" O 91° 40´55.89" 285 msnm
Retalhuleu Los Ajos
N 14° 35'18.52" O 91°35'48.93"
485 msnm
Para el departamento de San Marcos:
San Marcos Naranjo N 14°43´37.56" O 91° 52´24.11" 404 msnm
San Marcos La Isla N 14°44´05.38" O 92° 02´00.87" 80 msnm
San Marcos Nuevo Progreso N 14°47´39.68" O 91° 54´57.56" 594 msnm
San Marcos Los Pocitos N 14°46´41.47" O 91° 56´13.29" 477 msnm
San Marcos La Quebrada N 14°44´33.43" O 92° 02´32.58" 132 msnm
En el anexo 1 se muestra los sitios de muestreo en los ríos de los 6 departamentos del
área sur de Guatemala.
I.4.2. Variables
I.4.2.1. Variables dependientes
Los especímenes de Cangrejos colectados
I.4.2.2 Variables independientes
Los especímenes de Paragonimus obtenidos de los especímenes de
cangrejos
I.4.3. Indicadores
Presencia o ausencia de Paragonimus en hospederos intermediarios (cangrejos) y
Presencia o ausencia de los hospederos intermediarios (cangrejos) en los ríos y análisis
molecular de las especies.
I.4.4. Estrategia Metodológica
I.4.4.1. Población y Muestra
Población: Los hospederos intermediarios.
Muestra: Las metacercarias de Paragonimus.
9
I.4.4.2 Unidades muestrales
Los ríos
I.4.4.3 Unidades experimentales
Los cangrejos
I.4.5 El Método
I.4.5.1 Colecta de cangrejos en los sitios de estudio
Después de la selección de los sitios de muestreo se realizaron colectas casi
mensualmente durante el transcurso de 1 año La colecta se realizara a lo largo de los
ríos, seleccionando 5 puntos de muestreo. En cada punto se colectó a lo largo de
transectos de 10 metros y se espaciaron cada 5 metros. En cada punto de muestreo se
realizó una búsqueda de los hospederos intermediarios, cangrejos de río, durante un
total de 2 horas. La captura de cangrejos se realizó por medio de una colecta manual
buscando bajo las piedras y en agujeros al lado del río donde la tierra aún se encontraba
húmeda y con sombra (anexo 2).
Los puntos de muestreo fueron georreferenciados y se tomaron las muestras de agua
correspondientes a cada río. Por lo que se realizó el respectivo análisis microbiológico
(cantidad de coliformes) para evaluar el estado de conservación de los ríos que se
muestrearon.
Para el análisis de coliformes las muestras de agua se tomaron con envases de agua
pura nuevos (de medio litro) y al llegar al sitio de muestreo se vaciaron y se tomaron las
muestras de agua, se colocarán en la hielera y se trasladaran al laboratorio antes de 24
horas para su análisis.
Los cangrejos colectados se guardaron en recipientes herméticos de plástico con
tapadera, con capacidad máxima de 1 litro de agua, conteniendo hojarasca muy húmeda
para que de esta manera permanecieran vivos el mayor tiempo posible , donde fueron
trasladados al Laboratorio de Entomología Aplicada y Parasitología –LENAP- USAC,
en hieleras, para mantener a los cangrejos y a los trematodos vivos, el mayor tiempo
posible. Al llegar al laboratorio se sacrificaron quitando la caparazón del cangrejo y
sacando el hepatopáncreas.
I.4.5.2 Búsqueda de Paragonimus y toma de datos de los hospederos
intermediarios
En el laboratorio, los cangrejos que se colectaron fueron medidos de largo y ancho de
caparazón, se determinó el sexo y finalmente se le extrajo el hepatopáncreas. Se tomó
una muestra del hepatopáncreas con solución salina u se colocó entre dos portaobjetos
y se observaron al estereoscopio para la búsqueda de trematodos (anexo 3).
10
Cada trematodo que se encontró en la muestra del hepatopáncreas de los cangrejos se
extrajo y guardo en vacuntainer de 5ml en etanol al 95%, con la finalidad de mantener
la muestra como registro y como material disponible para pruebas de ADN.
I.4.5.3. Determinación de la especie de Paragonimus presente en las
muestras colectadas
La fuente de ADN para la identificación taxonómica se extrajo de las metacercarias
provenientes de los cangrejos (anexo 4). Las muestras se analizaron en el Laboratorio
de Entomología Aplicada y Parasitología, de la Escuela de Biología de la Universidad
de San Carlos de Guatemala. En el laboratorio de Biología Molecular del referido
centro de investigaciones, se trabajo todos los aspectos concernientes al trabajo de PCR,
desde la extracción del ADN de interés, la amplificación, la visualización y la
purificación del mismo.
I.4.5.4 Extracción de ADN:
La extracción de ADN de las muestras de metacercarias se realizó mediante el uso de
reactivos comerciales. En este caso, originalmente se iba a utilizar el kit DNeasy Tissue
kit, de QIAGEN. Sin embargo, se utilizó el método tradicional de extracción de ADN,
debido a que con el kit de extracción, no se obtuvo ADN de buena calidad. El
procedimiento que se lleva a cabo para la extracción del material genético se basa en la
lisis del tejido. El protocolo que se seguió para la extracción del material genético de las
muestras se detalla a continuación:
1. Alicuotar 100 µl de Buffer de maceración a un tubo de 1.5 ml. Macerar
completamente el parásito en el tubo con el buffer de maceración con ayuda de un
pistilo.
2. Centrifugar para homogenizar todo en el fondo del tubo.
3. Agregar 14 µl de K-Acetato 8M para obtener una concentración final de 1 M.
Mezclar bien. Después de centrifugar, incubar a 65ºC hasta que la muestra esté
completamente lisada. Se puede quedar incubando toda la noche.
4. Centrifugar por 10 minutos a velocidad máxima en una centrifugadora
refrigerada. Cuidadosamente transferir el sobrenadante. NO TRANSFERIR el
precipitado (descartable)
5. Agregar 200 µl de etanol al 95-100% en frío y mezclar bien. Incubar en hielo por
lo menos 10 minutos. Centrifugar a toda velocidad por 20 minutos en una
centrifugadora refrigerada. Descartar sobrenadante.
6. Enjuagar el pistilo con 100 µl de etanol frío al 70% después en 100 µl de etanol
frío al 95-100%.
11
7. Secar en aire o en una secadora al vacío. Disolver el precipitado en 50 µl de TE
estéril conteniendo 1U de ARNasa. Dejar sobre hielo por lo menos 1 hora.
8. Guardar las muestras en un congelador a -70°C si no se usarán inmediatamente.
(Dorn, 1997)
I.4.5.5. Amplificación de ADN
I.4.5.5.1. Genoma mitocondrial
Decidimos trabajar con el ADNmt debido a que es uno de los marcadores más
ampliamente utilizados para la identificación de especies según Avise (2004) y Mills
(2007). La amplificación de un fragmento del gen del citocromo c subunidad oxidasa 1,
cox 1, del ADNmt se llevará a cabo mediante PCR, técnica que envuelve la síntesis
enzimática in vitro de millones de copias de una secuencia específica de ADN (Pérez-
Sweeney et al., 2003). Para ello se utilizaron cebadores o primers específicos, los cuales
se unen mediante hibridación a regiones conservadas que delimitan las regiones
repetitivas. Se emplearon en este estudio un par de cebadores utilizados por Bowles et
al. (1993), los cuales amplifican para una región específica de aproximadamente 380
pares de bases, para lograr la identificación de las especies de tremátodos. La tabla 2
muestra los cebadores que utilizaremos.
La reacción en cadena de la polimerasa se aplicó siguiendo los protocolos utilizados por
Iwagami et al. (2000, 2003), quienes han trabajado en la identificación de diversas
especies de Paragominus de Asia, incluyendo un trabajo con muestras de Guatemala y
Ecuador, describiendo detalladamente los ciclos para el PCR.
Tabla 1. Cebadores para amplificación del fragmento del citocromo b
Secuencia de los
cebadores
FH5
5´-TTT TTT GGG CAT CCT
GAG GTT TAT-3´
FH3
5´-TAA AGA AAG AAC
ATA ATG AAA ATG-3´
Fuente: Iwagami et al., 2003b
El primer paso para el PCR, fue la preparación de la mezcla maestra, la cual contiene
los cebadores, la enzima polimerasa y el ADN de interés, además de otros reactivos
para mantener en óptimas condiciones la reacción. El siguiente paso es la amplificación
por medio del PCR en un termociclador, con la siguiente secuencia de pasos (Iwagami
et al., 2003b):
Primer paso: 94°C - 1 min.
Segundo paso: 30 ciclos de: 94°C - 1 min.
50°C - 1 min.
72°C - 2 min.
12
Los productos de amplificación o amplicones se almacenarán a 4°C hasta el momento
en que se procedió a la visualización de las bandas amplificadas.
I.4.5.6. Visualización de las bandas:
Después de la amplificación se debe comprobar la presencia de los fragmentos del ADN
de interés en los amplicones. Para ello se utilizaron geles de agarosa. Luego se observó
la banda de ADN obtenida, en un transiluminador a una longitud de onda de luz
Ultravioleta de 256 nanómetros (nm). Este método se lleva a cabo normalmente como
un paso para determinar si la amplificación fue exitosa. Las muestras que salió positiva
(es decir, que si amplificaron bien y por consiguiente se pudo observar su banda en el
gel) son las que se purificaron y posteriormente se enviarron a secuenciar.
I.4.5.7. Purificación del ADN de interés:
Después de haber obtenido el producto del PCR, debe realizarse una purificación del
ADN presente en los amplicones a partir de un kit comercial de purificación de
productos de PCR, el cual utiliza un proceso de purificación por medio de arrastre a
través de columnas. La purificación de ADN fue realizada por la universidad de
Washington a donde fueron enviadas las muestras.
I.4.5.8. Secuenciación:
Los productos obtenidos del ADN mitocondrial se mandaron a secuenciar. Debido a que
el proceso de secuenciación es un proceso muy complicado y extremadamente oneroso
de realizar, los fragmentos amplificados por PCR o amplicones se enviaron a un
laboratorio en la Universidad de Washington especializado en la técnica
I.4.5.9. Análisis de las secuencias
El primer paso después de obtener las secuencias es alinear y editar los fragmentos
mediante el software Clustal, con secuencias especificas de Paragominus (Iwagama et
al., 2000, 2003a y b). Luego, para determinar a qué especie pertenece una secuencia
determinada, la comparamos con secuencias de referencia de especies de Paragonimus,
las cuales están registradas en el GenBank, utilizando el programa BLAST. La
identificación de la especie se logra con el grado de similitud que presenta la secuencia
desconocida, en este caso proveniente de las metacercarias, con una secuencia conocida,
que proviene de la base de datos (Iwagama et al., 2000, 2003a y b).
Para obtener una identificación de especie más confiable y robusta (Farrell et al., 2000),
se calcularon distancias genéticas entre los fragmentos de ADN que provienen de cada
muestra de metacercaria y las secuencias de referencia, mediante el modelo de 2
parámetros de Kimura, utilizando el paquete PAUP versión 4.0 (Swofford, 2000).
Luego, realizamos un análisis cluster del tipo “neighbour joining” con un remuestreo
bootstrap de 1000 repeticiones, utilizando el software RDP Beta 4.13 (recombination
detection program) (Darren et al., 2010).
13
I.4.5.10 Evaluación de Coliformes:
Se recolectó el agua de los ríos como una muestra representativa de este y se envió al
Laboclip antes de 24 horas y fue allí donde se evaluó y en se dieron los diferentes
resultados para cada lugar. Pero sin embargo todas las muestras dieron un resultado de
agua no propicia para el consumo humano.
I.4.6 La Técnica Estadística
Se evaluó las diferencias entre peso y altitud de los cangrejos infectados y no infectados
por medio de una regresión lineal múltiple. Los modelos Lineales múltiples buscan
encontrar la relación entre dos o más variables. Por ejemplo, la relación entre el peso al
nacer con sobrevivencia o fecundidad, relación entre variables ambientales y tamaño
poblacional, etc. En este caso, se aplicó un modelo de regresión lineal múltiple, con el
fin de buscar una relación que explicara presencia de Paragonimus en los cangrejos.
Todo esto se realizó con el paquete estadístico R versión 2.13.0
I.4.7. Instrumentos utilizados.
I.4.7.1 Equipo e instrumentos
Azafates plásticos. Tape
Marcadores permanentes Lápiz.
Libreta de campo. Masking-tape.
Calentador. Bisturí
Pipetas de plástico. Porta objetos
Cámara digital. Cubre Objetos
Claves de identificación. Guantes de Látex
Mayordomo.
Guantes de Nitrilo Vacutainer
Eppendorf Puntas de diferentes medidas
Contenedores plásticos para el transporte de los cangrejos.
Hielera para el transporte de los cangrejos.
I.4.7.2 Cristalería
Erlenmeyers de 100 ml.
Varillas de agitación.
Beackers
14
PARTE II
MARCO TEÓRICO
II.1. Paragonimus sp.
II.1.1 Clasificación:
Tabla 2: Clasificación de Paragonimus sp.
Reino Animal
Subreino Metazoa
Filo Platyhelminthes
Clase Trematoda
Subclase Digenea
Familia Paragonimidae
Subfamilia Troglotreminae
Género Paragonimus
Fuente: Le et. al., 2006.
El taxón Digenea es importante tanto económicamente como médicamente. Los
digeneos son llamados comúnmente duelas y son endoparásitos comunes en
vertebrados. Existen aproximadamente 11,000 especies de digeneos. Su desarrollo es
indirecto y el ciclo biológico incluye por lo menos dos estados infectivos, de ahí su
nombre (dos generaciones). El primer hospedero intermediario es generalmente un
gastrópodo y el segundo hospedero intermediario generalmente es un crustáceo, como
el cangrejo (Ruppert & Barnes, 1996).
Se han reportado múltiples especies de Paragonimus, de las cuáles 9 se han identificado
como patógenas para el humano, más adelante se hace mención detallada de estas. La
validez taxonómica de algunas especies se ha puesto en duda debido a la variación
morfológica en los trematodos adultos (Acha & Szyfres, 2003).
II.1.2 Ciclo de Vida de Paragonimus sp.
En general podemos clasificar a Paragonimus por su especificidad: Decimos que es del
tipo EURIXENO porque es un parásito que no tiene especificidad alguna, ya que se
encuentra en una gran variedad de animales. Además dependiendo el ciclo evolutivo se
puede clasificar también como DIHETEROXENO, ya que requiere de dos hospederos
para completar su ciclo de vida (Llop, Váldes-Dapena, Zuazo; 2001).
El humano es un tipo de hospedero DEFINITIVO para el parasito debido a que este se
encuentra en estadío adulto en humanos. También se puede decir que es un
TRANSMISOR PASIVO, porque el hospedero definitivo (que puede ser humano)
busca al organismo (cangrejo) infectado con el parásito (Paragonimus sp.) (Llop,
Váldes-Dapena, Zuazo; 2001).
15
Figura 1: Ciclo de vida del Parasito Paragonimus sp.
Fuente: Llop, Váldes-Dapena, Zuazo; 2001.
En la figura 1 se visualiza el ciclo de vida del parasito Paragonimus sp. El parásito
adulto habita los bronquiolos de sus hospederos definitivos, en pequeñas cavidades
quísticas, generalmente viven en parejas, encerradas en una capsula fibrosa con
contenido hematopurulento. Es un parásito hermafrodita que mide 8-16 mm x 3-4 mm
de grosor. Es vesiculoso o fusiforme, rosado a pardo-rojizo, parecido a un grano de
café, con un aplanamiento en el sentido dorso-ventral. Tiene una cutícula transparente
provista en toda su extensión de múltiples espinas de forma y tamaños variables,
presenta una ventosa oral y un acetábulo. Posee ciegos intestinales flexuosos y no
ramificados. Los huevos son ovoides, de 85 por 55 µm. Se encuentran en los esputos y
son más o menos frecuentes en las heces fecales. Los adultos generalmente se
16
encuentran dispuestos en pares en cavidades quísitcas del pulmón, abdomen
(mesenterio, hígado, bazo) o el cerebro. Su longevidad es de alrededor de seis años
(Rosas, 2000). Para el caso de Guatemala se han reportado tres especies de
Paragonimus: P. mexicanus, P. westermani y P. kellicotti (Fuentes, 1993; Rosas, 2000).
El huevo y el miracidio son las primeras dos partes del ciclo de vida. Una vez dentro del
huésped final, los huevos (figura 2) llegan al exterior en las heces o el esputo, que en 2
semanas a 2 meses, según la temperatura, deja salir en el agua dulce y se desarrolla la
forma larvaria el miracidio, que al salir del opérculo del huevo (figura 3), en menos de
24 horas, debe encontrar un caracol que le sirva de primer hospedero intermediario, el
cual cuando lo localiza, lo penetra por la cabeza o el tegumento. Bajo la epidermis del
molusco, el miracidio (figura 4) se transforma en esporocisto, que se instala en el
pulmón, se redondea y pierde los cilios, formando la redia, la tercera parte del ciclo, la
cual produce redias hijas que se fijan en el hepatopáncreas del molusco (Llop, Váldes-
Dapena, Zuazo; 2001).
Figura 2: Huevos de Paragonimus sp. Biopsia pulmonar de paciente. Tinción H&E.
Fuente: http://www.gefor.4t.com/parasitologia/paragonimuswestermani.html
17
Figura 3: Huevo con opérculo bien definido.
Fuente: http://www.gefor.4t.com/parasitologia/paragonimuswestermani.html
Figura 4: Imagen del estadío de Miracidio de Paragonimus sp.
Fuente: Vélez, Velásquez & Vélez, 2003.
Luego forma la cercaria (figura 5), la cuarta parte del ciclo y la primera fase infectiva
del parasito. Esta es de es de forma elipsoidal y de corta vida y tiene una minúscula cola
característica en forma de muñón o estilete. Su superficie corporal está recubierta de
finas púas y sus movimientos en el agua se asemejan a un distoma libre, flotando y
serpenteando, buscando determinados camarones y cangrejos. (Rosas, 2000; Le et al.,
2006). Al momento de abandonar el caracol, penetran en el cuerpo del segundo
18
hospedero (un crustáceo) instalándose en los músculos del mismo, dando lugar a la
forma enquistada de metacercaria que se hace infectante a los 40-54 días.
Figura 5: Imagen del estadío de Cercaria de Paragonimus sp.
Fuente: http://158.83.1.40/Buckelew/Paragonimus%20westerman%20cercaria.htm
La metacercaria (figura 6) es la segunda fase infectiva del parásito y la quinta parte del
ciclo. Se instala en el hospedero secundario (el cangrejo) y vive en el hepatopáncreas.
Tiene forma alargada ovoidal y tiene movimiento ameboide. Pueden ser observados
macroscópicamente y pueden sobrevivir alrededor de 72 horas en tejido muerto o tres
semanas en el agua (Soulbsby, 1987).
Cuando este hospedero es consumido por un mamífero (hospedero definitivo), las
metacercarias quedan libres dentro del intestino delgado, lo perforan y caen a la cavidad
abdominal donde 30 días después viajan a la cavidad torácia. Después atraviesan la
pleura y pulmones para instalarse en los bronquiolos, donde se hace adulto. Aquí se
agrupan en pares de vermes y se hacen adultos de 5-6 semanas en cavidades quísticas en
el interior del hospedero y pone huevos que por vía aérea son expulsados al exterior con
los esputos, mientras que los huevos ingeridos salen al exterior por las heces,
recomenzando el ciclo (Aguilar, 1997).
19
Figura 6: Fotografía del estadío Metacercaria de Paragonimus sp. tomada en el
laboratorio del LENAP. Crédito: Vivian Monzón.
Fuente: FODECYT 63-2009
El ciclo de vida de Paragonimus sp., como ya fue mencionado, consta de dos
hospederos intermediarios para completarlo, lo que lo hace un parásito poliheteroxeno.
Los primeros hospederos son caracoles gasterópodos pulmonados de los géneros Brotia,
Pomacea, Semissulcospira, entre otros. Los segundos son cangrejos (figura 7) y
langostinos de río: Astacus, Potamon, Eriochier y Sesarma, entre otros. Los hospederos
finales o definitivos son el hombre, animales domésticos como el gato, cerdo y el perro,
animales silvestres, como la nutria, zorrillo, mapaches, lobos, pizotes y demás
carnívoros (Aguilar, 1997).
Figura 7: Fotografía del crustáceo (hospedero intermediario) colectado en el proyecto.
Crédito: Raquel Lima.
Fuente: FODECYT 63-2009
20
II.2 Paragonimiasis
Enfermedad conocida también como duela pulmonar, diastomiasis pulmonar y
hemotisis endémica o parasitaria. Está distribuida en Asia en los países de Filipinas,
Taiwan, Japón y Norte de China. En América se distribuye en los países de Canadá,
Estados Unidos, Cuba, Brasil, Costa Rica, Ecuador, México, Panamá, Venezuela,
Honduras, Guatemala, Nicaragua. En algunos países se considera endémica, como
Camerún, China, Ecuador, Japón, Perú y República de Corea (OMS, 1993; Aguilar,
1997). Su agente causal es el trematodo del género Paragonimus, para América se han
reportado casos que involucran a las especies P. mexicanus (P. peruvianus), P.
westermani y P. kellicoti (Fuentes, 1993; Heymann, 2004).
En Guatemala, la presencia de Paragonimus se ha comprobado en distintas localidades.
Se reportó en el año 1946, cuando Caballeros identifica por primera vez a Paragonimus
en el río Los Esclavos del municipio de Cuilapa, departamento de Santa Rosa; también
se ha reportado en Guazacapán (Santa Rosa), río Moca (Suchitepéquez, Sololá), río
María Linda (Santa Rosa), en el departamento de Escuintla en 1994 (Fuentes, 1993;
Tongu et. al., 1995; Rosas, 2000).
En una revisión más detallada se cree que existen aproximadamente 50 especies de ese
género, aunque no todas son válidas. A continuación aparecen las 9 especies de
Paragónimus que se han identificado en humanos:
1. P. africanus
2. P. heterotremus
3. P. kellicotti
4. P. mexicanus
5. P. miyazakki
6. P. ohirai
7. P. skrjabini
8. P. uterobilateralis
9. P. westermani
Las especies consideradas más relevantes para la salud humana por su alta distribución,
alta prevalencia y notable patogenicidad es P. westermani, seguida de P. heterotremus
y con menor frecuencia P. mexicanus (figura 8) (Acha & Szyfres, 2003).
21
Figura 8: Fotografía de Paragonimus mexicanus, identificado mediante técnica
molecular. Crédito: Vivian Monzón.
Fuente: FODECYT 63-2009
II.2.1 Patogenia y fisiopatología
El parásito adulto se encuentra en cavidades quísticas del pulmón en 98 % de los casos,
el abdomen (mesenterio, hígado y bazo) o el cerebro, generalmente por pares, y su
longevidad es alrededor de 6 años. Produce reacción neutrófila y eosinofilia en los
tejidos con formación de cápsula gruesa y exudado purulento color café, con huevos y
cristales de Charcot Leyden (Acha & Szyfres, 2003).
La enfermedad principal se debe al paso de las larvas por los tejidos, en los que
producen abscesos y pequeñas hemorragias. El adulto causa lesión de tipo inflamatoria
en un inicio y luego formación de quistes fibrosos rodeados de material necrótico, lo
que ocurre principalmente en los pulmones (Acha & Szyfres, 2003).
II.2.2 Manifestaciones clínicas
Los hallazgos clínicos dependen de la cantidad de parásitos y de los órganos afectados.
Las infecciones con escaso número de estos trematodos generalmente evolucionan con
ausencia de síntomas (Acha & Szyfres, 2003). Existen tres formas principales de
presentación de acuerdo con su localización:
1. Forma pulmonar: el período de comienzo es insidioso, ocasionalmente con
fiebre repentina y hemoptisis. En la etapa aguda, la tos y la hemoptisis son los
síntomas predominantes; en la fase crónica, hay tos seca que aparece por la
22
mañana acompañada de hemoptisis ligera, esporádica y abundante. En un bajo
porcentaje de casos, los esputos son café-rojizos y/o purulentos. Los signos
físicos hacen pensar en una neumonía, bronquiectasia o tuberculosis. Hay toma
del estado general, pérdida de peso y debilidad; si la afectación es extensa,
encontramos fiebre, disnea, anorexia, malestar y fatiga.
2. Forma abdominal: pueden haber signos de formación de absceso en hígado,
bazo o cavidad abdominal. En las localizaciones a nivel de la pared del intestino,
los quistes se rompen y pueden aparecer diarrea, sangre y huevos en las heces.
3. Forma cerebral: los síntomas agudos son los de una meningoencefalitis, con una
duración de 1 a 2 meses, pero pueden existir recaídas durante 2 años. En los
casos crónicos se presentan signos de lesión de masa ocupativa, o embolia
cerebral, con parálisis y convulsiones motoras localizadas. Puede acompañarse
de hemorragia cerebral, trastornos visuales, atrofia óptica y retardo mental;
cuando se afecta la médula espinal, episodio que ocurre rara vez, se observa
compresión de esta con paraplejía, monoplejía, debilidad de las extremidades y
trastornos sensoriales.
(Acha & Szyfres, 2003).
Pueden presentase otras localizaciones de este género; en la paragonimosis cutánea, hay
formación de nódulos en tejidos subcutáneos, que casi siempre son indoloros. Pueden
ser migratorios, ulcerados y formar abscesos. Resultante del daño renal, se observa en
ocasiones hematuria con presencia de huevos en la orina al localizarse a nivel del
escroto. Los daños pueden simular una epididimitis o hernia inguinal encapsulada; en
estos casos los síntomas dependen de los órganos que tengan formaciones quísticas
(Acha & Szyfres, 2003).
El pronóstico es favorable en las infecciones ligeras que pueden evolucionar a la
curación espontánea a los 5 ó 6 años; las infecciones intensas con tuberculosis o
infecciones piógenas sobreañadidas, así como la forma cerebral, resultan de pronóstico
severo (Acha & Szyfres, 2003).
II.2.3 Diagnóstico
El diagnóstico de Paragonimus específico se basa en el hallazgo de pruebas de
inmunodiagnosis (Quijada, Lima dos Santos & Avdalov, 2005), además de la
observación de huevos del tremátodo en esputo o heces o en las lesiones cutáneas
(Rosas, 2000). Aunque representa un problema mayor de salud pública en Asia, en
América es una efermedad zoonótica con casual repercusión humana, debido
probablemente a las diferencias culturales y hábitos alimentarios de la población
expuesta (Rosas, 2000). Los hospederos finales por lo regular son mamíferos. La
enfermedad suele persistir durante años y la persona infectada puede parecer sana, se
pueden alcanzar estados crónicos de 5 a 20 años y en casos extremos hasta 30 años
(Kang et. al., 2000).
23
La paragonimosis se confirma, una vez realizados los diagnósticos clínicos y
epidemioló-gico, con el hallazgo de los huevos en el material expectorado o en materias
fecales. También se puede realizar la identificación del parásito en el líquido peritoneal,
obtenido del derrame pleural o en ocasiones por examen histopatológico de muestras
quirúrgicas (Acha & Szyfres, 2003).
Los huevos de todas las especies de Paragonimus son similares, por lo que no se puede
identificar la especie vía este estadío. A través de rayos X y por sintomatología, la
enfermedad puede ser confundida con tuberculosis o histoplasmosis (Alvarado, Pariona,
Beltrán, 2004). Se cree que existen 21 millones de personas infectadas alrededor del
mundo (Quijada, Lima dos Santos & Avdalov, 2005). Los síntomas de la enfermedad
incluyen tos, hemoptisis, dolor pleurítico de pecho. A pesar de que los pulmones son los
órganos más afectados, la infección extra-pulmonar es relativamente común,
encontrándose al parasito en el sistema nervioso central, en tejidos subcutáneos, pared
intestinal, cavidad peritoneal, hígado, ganglios linfáticos y las vías genitourinarias
(Chin, 2001; Heymann, 2004). Los casos menos frecuentes, pero más graves de la
paragonimiasis se producen cuando el parásito viaja al sistema nervioso central en lugar
de los pulmones.
Existen reportes de enquistamiento en la pared abdominal, cerebro, hígado y rara vez
sub-cutáneamente, como elevaciones redondas pequeñas y sólidas (County of Orange
Health Care Agency, 2006). También se han reportado casos de problemas oculares al
invadir el sistema nervioso, ocasionando glaucomas secundarios (Fontenla, Grau & Pita,
sin año).
Figura 9: Enquistamiento pulmonar de Paragonimus sp. observado en radiografía.
Fuente: Rev. Perú. Med. Exp. Salud Pública 21(2), 2004.
24
Figura 10: Pulmón de Zarigüeya (Didelphis virginiana), infectado naturalmente con
Paragonimus mexicanus. Se observan múltiples granulomas en los lóbulos caudales, de
tamaños y pesos variables, con pared delgada, color blanco-grisáceo y consistencia
blanda.
Fuente: Vet. Méx v.41 n.1 México ene./mar. 2010.
El esputo generalmente contiene estrías de pigmento pardo anaranjado, a veces de
distribución difusa, en las que con el microscopio pueden verse masas de huevecillos
cuya presencia confirma el diagnostico. Sin embargo, los colorantes acidorresitentes
que se emplean para identificar a los bacilos de la tuberculosis destruyen los huevecillos
e impiden el diagnostico. Los huevecillos también pueden ser ingeridos, en especial por
los niños, y aparecer en las heces, cuando se utilizan algunas técnicas de concentración
(Chin, 2001; Heymann, 2004).
Como exámenes complementarios se emplean:
1. Pruebas serológicas: se utilizan pruebas sensibles y específicas como:
contrainmuno-electroforesis, reacción de fijación del complemento y los ensayos
inmunoenzimáticos sobre fase sólida e Inmunoblot, que resultan de valor
especial para las infecciones extrapulmonares. La prueba cutánea no puede
usarse para confirmar una infección activa, pero sí para llevar un control.
2. Radiología: la mayor parte de los pacientes muestra una radiografía de tórax
anormal, con diferentes tipos de reacciones. Se observan sombras en anillos,
infiltración lineal o nodular, manchas calcificadas, engrosamiento pleural y
derrames. Las cavidades se muestran mejor en las tomografías, broncogramas o
tomografía de pulmón o cerebral. Esta última permite localizar con precisión el
sitio de la lesión; si existen lesiones antiguas se observan calcificaciones. El
exámen radiográfico resulta de utilidad pero puede resultar negativo aún en
25
pacientes sintomáticos, además su identificación puede ser difícil en áreas no
endémicas, porque se puede confundir con la tuberculosis.
3. La tomografía computarizada puede mostrar las lesiones con más fidelidad. El
diagnóstico específico se basa en la identificación de los huevos en el esputo, la
materia fecal, el derrame pleural o las biopsias. Las formas cerebrales son fáciles
de confundir con tumores o con cisticercosis y las cutáneas con otras formas de
larvas migratorias. Por tales motivos ha habido interés en el desarrollo de
exámenes indirectos.
4. Una prueba cutánea de sensibilidad débil y especificidad cuestionable fue
ampliamente usada en el pasado con fines epidemiológicos. En una provincia de
China en 1961 se encontró positiva que el 24% de los examinados eran positivas
pero solo se confirmo la mitad de los casos.
5. La prueba más común es el ensayo de inmunosurción enzimática (ELISA) con
antígenos específicos.
(Acha & Szyfres, 2003).
Otros exámenes de laboratorio revelan la eosinofilia, sobre todo al inicio de la
enfermedad y el aumento moderado del conteo de leucocitos. El diagnóstico diferencial
de las formas pulmonares deberá hacerse con la neumonía lobar, tuberculosis,
espiroquetosis bronquial y bronquiectasia; siempre hay que tener en cuenta si el
paciente proviene de área endémica. Otras entidades que se deben descartar son las
neoplasias malignas e infecciones parasitarias que afectan el pulmón. La forma cerebral
se debe distinguir de meningoencefalitis, tumor cerebral y otras infecciones parasitarias
que afectan el cerebro, como la cisticercosis. Los quistes cutáneos y nódulos deben
diferenciarse de la migración larvaria cutánea, y el material producido por los huevos en
estas lesiones, del contenido de los nódulos originados por infecciones ocasionadas por
otros trematodos (Acha & Szyfres, 2003).
II.2.4 Epidemiología
La paragonimosis ha sido notificada en el Lejano Oriente, Asia Sudoriental, la India,
África y América. China en la actualidad es el principal país endémico y le siguen en
probabilidad Laos y la provincia de Manipur de la India Myanmar (antigua Birmania).
En Japón y Corea está prácticamente eliminada. En América Latina, el país más
afectado es Ecuador. Se han señalado casos en Brasil, Colombia, Perú, Venezuela,
Costa Rica y México. Es menos común en EE. UU. y Canadá (Acha & Szyfres, 2003).
Reservorio. Los seres humanos, los perros, los gatos y los carnívoros salvajes son los
huéspedes definitivos y actúan como reservorios (Acha & Szyfres, 2003).
Modo de transmisión. La infección humana se adquiere por comer cangrejos o
langostinos crudos, con cocción inadecuada, salados o en salmuera, costumbre muy
popular en diferentes culturas. En las áreas donde esto no ocurre, la infección resulta de
26
la contaminación de los dedos u otro alimento con metacercarias antes de que estos sean
cocidos. La contaminación del agua potable es también posible, pues las metacercarias
viven en el agua hasta 3 semanas, después de ser liberadas del crustáceo muerto o
lesionado. Las personas infectadas pueden expulsar huevos durante 20 años. No hay
transmisión de una persona a otra (Acha & Szyfres, 2003)..
Medidas preventivas:
1. Educar a la población, en las zonas endémicas, respecto al ciclo de vida del
parásito.
2. Insistir en la cocción completa de los crustáceos.
3. Eliminación sanitaria de los esputos y las heces.
4. Uso de molusquicidas en las zonas donde sea factible.
5. En zonas endémicas, ante la aparición incluso de pequeños grupos de casos, se
deben examinar las aguas de la localidad en busca de hospederos, así como
identificar los reservorios para establecer medidas de control apropiadas.
(Acha & Szyfres, 2003).
II.2.5 Tratamiento
El medicamento de elección es el praziquantel a la dosis de 25 mg/kg, tres veces al día
por 3 días. De esta forma se ha logrado hasta 100 % de curación. En los casos que exista
afectación cerebral, se deben administrar corticosteroides, pues puede empeorar la
situación debido a la reacción local grave por muerte del parásito (Acha & Szyfres,
2003).
Es efectivo también el bithionol en la afección pulmonar a la dosis de 40 mg/kg en días
alternos por 10 a 15 días con 90 % de curación. En ocasiones se requiere de más de un
esquema de tratamiento (Acha & Szyfres, 2003).
Es importante resaltar que las metacercarias permanecen viables en vinagre, miso (pasta
de frijol), salmuera, sake y shoyu (salsa de soya). Sumergidas en alcohol al 47% pueden
resistir hasta 5 días. En cambio, son destruidas al ser sometidas a desecación (3 - 4 min)
o al ser cocinadas en agua (55 °C /20 min).
http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/paragonimosis.html
II.3 Control
En las áreas endémicas las medidas de control deben dirigirse a interrumpir el ciclo
mediante las siguientes acciones:
a) Educar a la población para que no consuman cangrejos, camarones y langostas
insuficientemente cocidos.
27
b) Tratar a la población en forma masiva para reducir el reservorio de la infección.
c) Eliminar perros y gatos sin dueño, con el mismo porpósito.
d) Eliminar en forma sanitaria las expectoraciones y materias fecales para prevenir la
contaminación de los ríos.
e) Controlar a los caracoles con los molusquicidas en el área donde sea factible.
Para que un programa de control sea efectivo, debe abarcar el área completa de un
sistema fluvial y otras regiones (Acha & Szyfres, 2003).
II.4 Técnica Molecular
II.4.1 Identificación genética
La identificación genética es el uso de análisis moleculares para la identificación certera
de especies, individuos e inclusive, para determinar el origen de muestras biológicas
como tejido o sangre (Allendorf & Luikart, 2007). La identificación molecular y
clarificación taxonómica aplicados al estudio de zoonosis representan un avance en la
habilidad de diagnosticar parásitos, lo que es un aporte valioso en estudios ecológicos y
epidemiológicos (Blair et al., 1997; van Herwerden, Blair & Agatsuma, 1999; Iwagami
et al., 2000; Pérez-Sweeney, 2003; Iwagami et al., 2003b; Le et al., 2006; Allendorf &
Luikart, 2007).
El uso de marcadores moleculares en la identificación de individuos ofrece varias
ventajas comparado con los métodos tradicionales de rastreo, como basarse en fenotipos
naturales por ejemplo (Avise, 2004): todos los individuos de todas las especies “portan”
estos marcadores naturales; los marcadores son transmitidos a través de generaciones;
técnicas modernas de laboratorio, como el PCR, ofrecen la posibilidad de obtener
muestras biológicas no invasivas y no destructivas; la identificación de un individuo en
particular es muy confiable, si se usan múltiples loci hipervariables producto de la alta
variación genética poblacional en especies sexuales. Sin embargo se requiere de equipo
especializado y una buena cantidad de dinero para llevar a cabo este tipo de análisis.
El caso particular de la identificación de especies mediante técnicas moleculares surgió
como una herramienta que lograba generar datos más confiables que los aportados por
los análisis morfológicos. Muchos marcadores moleculares se están usando actualmente
para la identificación de especies. El más ampliamente utilizado es el ADN
mitocondrial (ADNmt), aunque también se usan marcadores nucleares como los
microsatélites (Allendorf & Luikart, 2007; Mills, 2007).
El tipo de marcador molecular que ha de utilizarse depende de la escala a la cual se
quiere trabajar. Para separar entre especies, los marcadores 12S y 16S del ARN
ribosomal, que se encuentran dentro de la molécula de ADN mitocondrial, han dado
28
buenos resultados (Mills et al., 2000; Balitzki-Korte et al., 2005; Imaizumi et al., 2007).
Otros marcadores utilizados a nivel interespecífico son el gen o parte del gen del
citocromo b, el de citocromo c oxidasa I –COI-, la región control –D-Loop-, ATPasa 8,
NADH 5, todos marcadores del ADN mitocondrial (Mills et al., 2000; Blair et al.,
2005; Doanh et al., 2007; Doanh et al., 2009; Iwagami et al., 2003a,b). A nivel
intraespecífico uno de los más utilizados es el marcador nuclear de secuencias
repetitivas en tandem o microsatélites. En este estudio utilizaremos parte del gen del
citocromo c subunidad oxidasa 1 –cox1-, para la identificación taxonómica de los
especímenes de Paragonimus.
II.4.2 Técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)
Este método requiere la síntesis enzimática in vitro de millares de copias de una
secuencia específica de ADN, utilizando ADN Polimerasas. El método se basa en dos
propiedades de la enzima ADN Polimerasa (Mertens y Ammersmith, 1998): 1) Todas
las ADN Polimerasas, producen una nueva molécula de ADN tomando como molde el
ADN que se tiene como muestra, en la dirección 5’ a 3’; 2) Ninguna ADN Polimerasa
puede iniciar la síntesis de una nueva molécula de ADN sin que antes el ADN molde
tenga grupos 3’ OH terminales (llamados oligonucleótidos cortos, iniciadores,
cebadores o primers) (Pérez-Sweeney, 2003; Mills, 2007).
Figura 11: Fotografía del material y reactivos de PCR, utilizados dentro del proyecto.
Crédito: Raquel Lima.
Fuente: FODECYT 63-2009
29
II.4.3 ADN mitocondrial
Los genes presentes en la mitocondria son diferentes a los que se encuentran en el
material genético del núcleo. El ADN mitocondrial codifica principalmente productos
para el funcionamiento de la célula (y también las proteínas que conforman a la misma
mitocondria). Otra diferencia con el núcleo es que el material genético mitocondrial es
haploide. Además, una característica ventajosa del ADNmt es que está presente en
múltiples copias idénticas dentro de una célula, por lo que el análisis de dicho ADN se
puede llevar a cabo con una pequeña cantidad de muestra, o muestras de poca calidad
(Mills, 2007).
Además, el ADNmt no sufre recombinación y su herencia es exclusivamente maternal,
por lo que es una buena fuente de información acerca de patrones de relaciones
maternales, estructura sexual poblacional, determinación de reducciones en el tamaño
poblacional e inferencias acerca de los sistemas de apareamiento (Allendorf & Luikart,
2007; Mills, 2007).
II.5 Enfermedades olvidadas
Se estima que al menos 1 millón de personas en el mundo –la sexta parte de la
población mundial- sufre de una o más de las enfermedades olvidadas. Las poblaciones
más afectadas por estas enfermedades son las de mayor pobreza y más vulnerables y se
encuentra mayormente en las áreas tropicales y subtropicales del mundo (WHO, 2007).
Estas enfermedades desatendidas suponen una enorme carga económica en términos de
pérdida de productividad y los elevados costes que genera la atención médica
prolongada (OMS, 2003).
Las Enfermedades cubiertas por el Departamento de Enfermedades Olvidadas de la
OMS abarca Cólera, Leishmaniasis, Lepra, Fasciolaisis, Buruliasis, Filariasis Linfática,
Dengue y Dengue Hemorrágico entre otras (WHO, 2007).
La paragonimiasis, al igual que otras enfermedades, se encuentra dentro del grupo de las
enfermedades olvidadas, ya que son enfermedades que atraen poca atención en el
mundo industrializado; son enfermedades problemáticas desatendidas durante mucho
tiempo por gobiernos, investigaciones y agencias de financiamiento (OMS, 2003).
En la actualidad la paragonimiasis, es una enfermedad que no presenta mayor relevancia
para las autoridades nacionales de salud. Sin embargo, este hecho no hace que deje de
afectar a las poblaciones, en especial las poblaciones de escasos recursos. El ser una
enfermedad desentendida, genera vacios de información con respecto a su distribución y
presencia actual en el país.
Existen numerosos trabajos científicos que tratan de la biología inmunología y genética
de los parásitos que causan estas dolencias. Sin embargo este nuevo conocimiento no es
posible revertirlo en herramientas terapéuticas para la población afectada. Por el
contrario, estas enfermedades han sido sistemáticamente relegadas por los responsables
30
de los programas de investigación, tanto del sector público como del sector privado.
Esto se debe al hecho, de que las personas que sufren de enfermedades olvidadas son
pobres y no representan un retorno lucrativo suficiente que justifique una inversión de la
industria farmacéutica en investigación y desarrollo de nuevos medicamentos para estas
enfermedades. Queda claro, por lo tanto, que la crisis de falta de medicamentos para las
enfermedades olvidadas no alcanzó la actual proporción por falta de conocimiento
científico, ni por la brecha que existe entre la investigación básica y la preclínica. Esta
crisis es tanto el resultado de la falta de políticas públicas para I+D de medicamentos de
interés nacional de los países en desarrollo, como la falla de mercado provocada por el
bajo interés económico que estos pacientes representan para la industria.
http://malaria2.enfermedadesolvidadas.com/sysMisc.php?action=imprint.
II.6 Factores Físicos y Químicos del Agua
En esta sección se presenta los factores físicos y químicos del agua comúnmente
analizados en las pruebas de calidad de agua.
II.6.1. Potencial de Hidrogeno – pH
El agua está compuesta de iones hidrógeno (H+) y de hidróxido (OH-), el pH (potentia
hidrogenii) indica la concentración de iones hidrógeno en el agua siendo una de las
pruebas más comúnmente usadas en análisis de agua ya que el pH regula muchos de los
procesos químicos y fisiológicos del sistema. La escala del pH oscila entre 0 y 14, el
valor de “7” representa a una solución neutra, un valor menor de 7 indica una solución
ácida y un valor mayor de 7 representa una solución básica.
El ámbito del pH para la mayoría de organismos acuáticos es de 5.6 a 8.5 y los niveles
normales del pH varían dependiendo de la entrada de minerales al sistema. El agua con
un pH ácido puede ser perjudicial para los organismos acuáticos afectando
especialmente a los invertebrados y a los embriones de los peces (Aguirre, 2006).
II.6.2.Dureza
La dureza representa una medida de la cantidad de metales alcalinotérreos en el agua,
fundamentalmente Calcio (Ca) y Magnesio (Mg) provenientes de la disolución de rocas
y minerales que será tanto mayor cuanto más elevada sea la acidez del agua. Es una
medida, por tanto, del estado de mineralización del agua.
Se suele expresar como mg/l de CaCO3 o como grados franceses, teniendo en cuenta
que 10 mg/l es igual que un grado francés.
En función de este estado de mineralización, podemos distinguir distintos tipos de
aguas:
31
Tabla 3: Distintos tipos de aguas.
CLASIFICACION DUREZA (mg
CaCO3/L)
Blandas 0 – 100
Moderadamente
duras
101 – 200
Duras 200 – 300
Muy Duras > 300
Fuente: Aguirre, 2006.
II.6.3 Alcalinidad
La alcalinidad del agua es la suma de las concentraciones de los iones carbonato
(CO32-), bicarbonato (HCO3-) y e hidróxidos (OH-) siendo estos últimos despreciables
frente al resto.
Estas especies producen en el agua un efecto tampón ya que absorben protones
manteniendo el ph en un valor muy estable. Esta propiedad es muy importante para los
seres vivos en determinados medios como el flujo sanguíneo ya que mantienen el valor
de pH a un valor muy constante y estable frente a posibles variaciones en el medio
(Aguirre, 2006).
II.6.4 Conductividad
La conductividad es una medida de la capacidad que tiene el agua para conducir la
corriente eléctrica. La conductividad está relacionada por un parámetro llamado fuerza
iónica que viene determinado por la concentración y la carga de cada ión presente en el
agua.
Los valores de conductividad vienen expresados normalmente en µS/cm (microsiemens
por centímetro) (Aguirre, 2006).
II.6.5 Sólidos
Podemos distinguirlos en sólidos sedimentables, sólidos en suspensión y sólidos
disueltos, siendo los sólidos totales la suma de todos ellos. Estos sólidos, además de
poder suponer la presencia de cuerpos u substancias extrañas que pudieran en algún
caso no ser recomendables, aumentan la turbidez del agua y disminuyen la calidad de la
misma (Aguirre, 2006).
Los sólidos sedimentables son sólidos de mayor densidad que el agua, se encuentran
dispersos debido a fuerzas de arrastre o turbulencias. Cuando estas fuerzas y
32
velocidades cesan y el agua alcanza un estado de reposo, precipitan en el fondo. Suelen
eliminarse fácilmente por cualquier método de filtración (Aguirre, 2006).
Los sólidos en suspensión se mantienen en el agua debido a su naturaleza coloidal que
viene dada por las pequeñas cargas eléctricas que poseen estas partículas que las hacen
tener una cierta afinidad por las moléculas de agua. Este tipo de sólidos como tales son
difíciles de eliminar siendo necesaria la adición al agua de agentes coagulantes y
floculantes que modifican la carga eléctrica de estas partículas consiguiendo que se
agrupen en flóculos de mayor tamaño para así poder separarlos mediante filtración.
Ciertos sistemas de tratamiento de agua como la ozonización ya suponen de por sí un
buen método floculante ya que se produce la oxidación del hierro, manganeso y
aluminio, óxidos que son los que verdaderamente ejercen un fuerte poder floculante en
el agua aumentando la eficacia del filtro y mejorando la transparencia del agua
(Aguirre, 2006).
Los sólidos disueltos están relacionados con el grado de mineralización del agua ya que
son iones de sales minerales que el agua ha conseguido disolver a su paso. Están
relacionados con la conductividad del agua ya que un aumento de estos iones aumenta
la capacidad conductiva (Aguirre, 2006).
II.6.6 Turbidez
La turbidez es un parámetro relacionado con el grado de transparencia y limpieza del
agua que a su vez depende de la cantidad de sólidos en suspensión del agua que pueden
ser resultado de una posible actividad biológica o simplemente una presencia de
componentes no deseables. Se mide mediante la absorción que sufre un haz de luz al
atravesar un determinado volumen de agua. Para eliminar esta turbidez y así mejorar la
calidad del agua se usan los distintos tipos de filtros que hay en el mercado, mejorando
el rendimiento con el uso de floculantes (Aguirre, 2006).
33
PARTE III
III.1 RESULTADOS
III.1.1 Estadísticos
III.1.1.1 Regresión múltiple lineal
En el cuadro 2 se puede observar la regresión múltiple lineal para la presencia de
Paragonimus en los cangrejos colectados, en donde se obtuvo un valor de p = 0.001724
lo que nos está indicando que al menos una variable no presenta pendiente igual a cero,
por lo tanto existe una relación lineal entre la presencia de Paragonimus y al menos una
de las variables evaluadas. Dicha variable es la altitud, ya que al observar el Pr(>t) =
0.000961 nos está indicando que existe una relación entre la presencia de Paragonimus y
la altitud.
Tabla 4: Regresión múltiple lineal para la presencia de Paragimus en cangrejos de la
costa sur de Guatemala. (p = 0.001724)
Estimado error std. valor t Pr(>t)
Intercepto -0.1818521 0.2509444 -0.725 0.470236
Peso -0.0101952 0.0126387 -0.807 0.42165
Altitud 0.0010579 0.0003115 3.396 0.000961
Fuente: FODECYT 63-2009
III.1.2 Estadísticos genéticos.
III.1.2.1 Polimorfismo genético.
Los sitios polimórficos encontrados fueron 108 sitios de los cuales 24 eran
sitios individuales de dos variaciones y 84 sitios parsimoniosamente
informativos. Se encontraron 24 sitios individuales en la secuencia con dos
variaciones (Singleton variables sites–two variants). Sin embargo, no se
encontraron sitios individuales con tres o más variaciones (singleton variables
sites –three and four variants).
III.1.2.2 Recombinación.
Se hizo la prueba de recombinación para determinar la existencia de la misma y
evitar inferencias basadas en errores. Sin embargo a pesar de que es encontraron
algunos eventos de recombinación (Mínimo número de eventos recombinantes
Rm: 5) lo cual es en cierta forma comun encontrar se puede concluir que no
presentaron recombinación.
34
III.1.2.3 Test de neutralidad.
Se realizaron test de Fu and Li's D y Tajima para determinar la existencia de
algún evento que violara la neutralidad que se asume poseen los datos. Sin
embargo ambos análisis mostraron que no existían valores que fueron
significativos para violar la neutralidad de los datos.
Fu and Li's F* test statistic: -0,52590 Statistical significance: Not significant,
P > 0.10
Tajima's D: -1,49144 Statistical significance: Not
significant, P > 0.10
III.1.2.4 Haplotipos.
Se encontraron 14 haplotipos como se muestra en el cuadro 3.
Tabla 5. Haplotipos encontrados para los individuos dentro de las poblaciones de
Paragonimus mexicanus de Guatemala y Ecuador. En negro se observan los haplotipos
encontrados en el presente estudio.
Haplotipo Individuos
Hap_1 1 [Rax12]
Hap_2 1 [Rax21]
Hap_3 3 [Rax25, Rax37, G6-P.mexicanus]
Hap_4 4 [Rax28, Rax31, Rax33, G4-P.mexicanus]
Hap_5 5 [Rax47, Rax35, 43012Rax11, 43026Rax48, G3-P.mexicanus]
Hap_6 3 [Rax39, Rax41, G2-P.mexicanus]
Hap_7 1 [43014Rax20]
Hap_8 2 [Ecuador-P.mexicanus, E3-P.mexicanus]
Hap_9 1 [E1-P.mexicanus]
Hap_10 1 [E2-P.mexicanus]
Hap_11 1 [E4-P.mexicanus]
Hap_12 1 [G1-P.mexicanus]
Hap_13 1 [G5-P.mexicanus]
Hap_14 1 [G7-P.mexicanus]
Fuente: FODECYT 63-2009
35
III.1.2.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación.
Tabla 6. Valores de diferenciación genética, mostrando el grado de diferenciación
genetica entre los grupos. P.mexicanus-GuateR1; representa a las poblaciones de P.
mexicanus encontradas en el trabajo de campo del presente estudio. P.mexicanus-
GuateR2; representa a las poblaciones de P. mexicanus encontradas en el estudio del
2003. P.mexicanus Ecuador; representa a las poblaciones del 2003 obtenidas en
Ecuador.
P.b
ankok
P.w
este
man
ii
P.m
exic
anus-
Guat
eR1
P.m
exic
anu
sEcu
ador
P.m
exic
anus-
Guat
eR2
P. bangkokensis 0 0,71695 0,97137 0,98068 0,96715
P.westemanii 0,71695 0 0,72009 0,75538 0,71731
P.mexicanus-
GuateR1 0,97137 0,72009 0 0,9104 0
P.mexicanus Ecuador 0,98068 0,75538 0,9104 0 0,89763
P.mexicanus-
GuateR2 0,96715 0,71731 0 0,89763 0
Fuente: FODECYT 63-2009
Se puede observar que los valores de diferenciación genética de la población de
Ecuador tiene valores similares a los que presentan P. bangkokensis y P. westermani
cuando se confrontan con las poblaciones de Guatemala. Lo que sugiere que P.
mexicanus de Ecuador tiene valores similares de diferenciación que las otras especies de
parásitos.
36
Tabla 7. Indices de diferenciacion globales para todos los grupos analizados de
Paragonimus mexicanus . Se excluyen las especies P. bangkokensis y P. westermani.
Δst 0,0142
γst 0,745
Nm 0,09
Nst 0,8524
Nm 0,04
Fst 0,8483
Nm 0,04
Fuente: FODECYT 63-2009
III.1.3 Análisis Filógeneticos.
Figura 12. Árbol consenso de Máxima versosimilitud y Máxima parsimonia,
mostrando los valores de soporte de Boostrap.
Fuente: FODECYT 63-2009
37
Como se observa, en la figura 12, hay una separación clara entre las poblaciones de
Ecuador y de Guatemala de Paragonimus.
En cuanto a las relaciones de parentesco entre todos los organismos estudiados pueden
mencionarse diversos factores peculiares. Las muestras que corresponden a las
producidas en el presente estudio se encuentran bajo el nombre de RaxXX. Los demás
individuos fueron secuencias obtenidas con anterioridad en otra investigación en 2003 y
son las que aparecen en cuadros amarillos (Iwagamia et al., 2003).
III.1.4 Análisis de los resultados de las muestras de agua
A continuación se presenta el promedio de los resultados microbiológicos de las
muestras de agua tomadas en los 6 departamentos del área sur de Guatemala.
Tabla 8. Promedio de los resultados del análisis microbiológico del agua en los 6
departamentos.
1. San Marcos
Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99
Recuento Heterotrófico
en Placa
6.0x102 UFC/ mL
˚ por 48
h. en PCA
NPL
Coniformes Totales 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Coniformes Fecales 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Escherichia coli 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
2. Retalhuleu
Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99
Recuento Heterotrófico
en Placa
6.0x10⁴ UFC/ mL ˚ por 48
h. en PCA
NPL
Coniformes Totales 16000
NMP/100 mL
NMP/100 mL < 2
Coniformes Fecales 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Escherichia coli 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
3. Suchitepequez
Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99
Recuento Heterotrófico
en Placa
6.0x10⁴ UFC/ mL ˚ por 48
h. en PCA
NPL
Coniformes Totales 16000
NMP/100 mL
NMP/100 mL < 2
Coniformes Fecales 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Escherichia coli 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
38
4. Escuintla
Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99
Recuento Heterotrófico
en Placa
2.0x10⁶ UFC/ mL ˚ por 48
h. en PCA
NPL
Coniformes Totales 50,000
NMP/100 mL
NMP/100 mL < 2
Coniformes Fecales 50,000
NMP/100 mL
NMP/100 mL < 2
Escherichia coli 50,000
NMP/100 mL
NMP/100 mL < 2
5. Jutiapa
Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99
Recuento Heterotrófico
en Placa
3.0x10⁶ UFC/ mL ˚ por 48
h. en PCA
NPL
Coniformes Totales 24,000
NMP/100 mL
NMP/100 mL < 2
Coniformes Fecales 5,000 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Escherichia coli 5,000 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
6. Santa Rosa
Análisis Resultado Dimensional NGO 001:99
Recuento Heterotrófico
en Placa
6.0x102 UFC/ mL
˚ por 48
h. en PCA
NPL
Coniformes Totales 000 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Coniformes Fecales 1600 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Escherichia coli <2 NMP/100
mL
NMP/100 mL < 2
Fuente: FODECYT 63-2009
Se observa una alta presencia de Coliformes totales y fecales en todos los ríos muestras
de los 6 departamentos en los que se desarrollo el proyecto.
39
III.2 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
III.2.1 Estadísticos genéticos.
III.2.1.1 Polimorfismo genético.
La cantidad de sitios polimorficos nos indican que el marcador es el adecuado para el
estudio de la diversidad genética en Paragonimus ya que no presenta singlenton de más
de tres o cuatro variaciones que nos podrían indicar la posibilidad de saturación y por lo
tanto el posible aumento de homoplasia en el marcador analizado.
III.2.1.2 Recombinación.
Los posibles sitios de recombinación encontrados son un indicativo de la posibilidad de
observar recombinación. Sin embargo, el programa utilizado en DNAsp tiende a
sobrevalorar los eventos de recombinación, por lo cual se realizó otro análisis con RDP
Beta 4.13 (recombination detection program)(Darren et al., 2010), y se pudo observar la
nula existencia de recombinación. Esto apoya al marcador COI con una herramienta
adecuada para el estudio de relaciones de parentesco en Paragonimus.
III.2.1.3 Test de neutralidad.
El test de neutralidad muestra que tanto el marcador como las poblaciones no se
encuentran bajo el efecto de ningún tipo de selección u otra fuerza que pueda desviar las
frecuencias génicas. Por lo cual se puede considerar al marcador como adecuado para el
estudio de las relaciones de parentesco y estructuración genética entre poblaciones.
III.2.1.4 Haplotipos.
En el presente estudio se encontraron tres nuevos haplotipos procedentes de las nuevas
regiones donde se encontró Pargonimus mexicanus, donde no se había encontrado con
anterioridad. Cuatro haplotipos se encuentran repartidos entre el nuevo sitio y el sitio
anterior y finalmente tres haplotipos son exclusivos del sitio que en el 2003 fue
muestreado para la investigación. Esto sugiere que existe cierto grado de diferenciación
entre las poblaciones de Paragonimus mexicanus dentro de Guatemala. Sin embargo a
este nivel el marcador genético no es suficiente pues se necesitaría un marcador con
mayor variación genética para estudiar la variación entre poblaciones, tal como es el
caso de microsatélites. Así mismo, los haplotipos observados para Ecuador son
exclusivos de esa región y no se encuentran mezclados con los de Guatemala.
III.2.1.5 Flujo génico y coeficiente de diferenciación.
Como se observa tanto en la cuadro 3 de diversos coeficientes globales, solo para los
grupos dentro de lo que se considera P. mexicanus, y en la tabla 2 los coeficientes por
pares para cada grupo estudiado, se puede observar que existe un valor de
diferenciación genética enorme. En especial P. mexicanus de Ecuador presenta valores
de diferenciación con respecto a las poblaciones de Guatemala similares a los que
40
presenta P. westermani y P. bangkokensis, lo cual sugiere que en realidad este grupo se
trata de una especie diferente con valores de diferenciación similares a los encontrados
para las demás especies de Paragonimus.
III.2.2 Relaciones filogenéticas.
Al observar los clados que se forman con los grupos estudiados y los valores de soporte
de boostrap encontrados, se apoya la hipótesis de que el grupo de Paragonimus
mexicanus de Ecuador es en realidad otra especie diferente a P. mexicanus con valores
de diferenciación similares a los encontrados para otras especies de Paragonimus.
Dentro de Guatemala, al analizar las muestras colectadas en este proyecto y en el 2003
por Monroy y reportado por Iwagamia, et al., (2003) se puede observar una mezcla de
haplotipos sin importar del sitio donde se colectaron, con una leve separación observada
en los clados pero no apoyada por valores de diferenciación genética que se observan
nulos entre ambas poblaciones en Guatemala.
III.2.3. Distribución
Es probable que la distribución de Paragonimus, no esté en la ruta que planificamos ya
que en la literatura se describe su distribución en la costa del Pacífico, sin embargo con
los muestreos hemos rectificado que no es cerca de la costa ya que el sitio donde se
encontró la metacercaria está a aproximadamente a 100km de la costa del Pacífico y a
una altura de más de 750 a 800 msnm (anexo 5). Esto a la vez sugiere que debemos
tomar otras rutas de búsqueda, quizás basándonos en la calidad de agua y altura del
lugar, la acción antropomórfica y la deforestación del bosque que lo rodea.
III.2.4 Estadísticos.
El análisis de regresión lineal múltiple nos muestra que existe una relación entre la
altitud y la presencia de Paragonimus mexicanus. Lo cual explica la ausencia del
parásito en los demás sitios de muestreo que no sobrepasan los 800 msnm. Iwagami y
colaboradores (2003) lo reportaron arriba de los 800 msnm, lo que coincide con
nuestros resultados.
III.2.5 Características físicas y químicas del agua de los sitios de colecta
En base a los resultados obtenidos puede observarse que las condiciones del agua en
todos los departamentos no son las óptimas ya que presenta un alto índice de
contaminación en el cual no se puede decir que son las condiciones necesarias para las
metacercarias. Debido a esto es probable que no estén en lugares contaminados.
Además la contaminación limita la supervivencia de las larvas de cangrejos y caracoles
que son hospederos intermediarios indispensables para la presencia de Paragónimus.
41
PARTE IV.
IV.1 CONCLUSIONES
1. Luego de un extenso muestreo a lo largo del área sur de Guatemala se determinó
la presencia del parasito Paragonimus en un solo departamento de los
evaluados, que fue el departamento de Santa Rosa, lo que demuestra una
enfermedad focalizada en una sola área.
2. A través de la técnica molecular y el ADN mitocondrial, utilizada dentro del
estudio, se logró determinar que la especies de Paragonimus presente en el país
es Paragonimus mexicanus, ya que el análisis genético y filogenético demostró
una alta relación de los Paragonimus muestreados con la especies mexicanus.
3. De todos los ríos muestreados a lo largo del desarrollo del presente proyecto se
logró determinar que los únicos ríos con un alto índice de presencia del parasito
Paragonimus fueron los ríos localizados en Santa María Ixhuatan del
departamento de Santa Rosa, presentando cangrejos infectados en un 95%.
4. En referencia a lo descrito como resultados de las metacercarias encontradas,
podemos decir que la población de Santa María Ixhuatan es la población con un
riesgo inminente para la transmisión de la enfermedad e Paragonimiasis, ya que
fue el único lugar de los muestreados que presenta cangrejos infectados en un
95% y en consecuencia, esto sube las probabilidades de que la enfermedad esté
presente en la población. Adicionalmente, se deduce que la zona de riesgo no se
ha ampliado a otros departamentos aparentemente, ya que no lo podemos
afirmar porque el muestreo no se realizó en todos los ríos del País.
5. A través de la evaluación de todas las muestras de agua tomadas en los ríos de
los sitios de muestreo, se logró determinar alta presencia de coliformes totales y
fecales en todos los ríos muestreados, lo que indica que una variable importante
para cerrar el ciclo de vida del parasito estaba presente en todos los sitios de
muestreo.
6. A través de la publicación generada por este proyecto, se alcanzara una
divulgación de los resultados obtenidos de este proyecto a las autoridades
competentes y locales, actores sociales e instituciones con relación en el tema.
La distribución de la publicación se realizará principalmente en el sitio donde se
encontró el parasito y en localidades que cumple con las características para la
posible presencia de este.
7. Una conclusión importante al observar el análisis genético y filogenético es que
el grupo de Ecuador se trata en realidad de otra especie con valores de
diferenciación muy marcados y que las poblaciones dentro de Guatemala, aun
con varios años de tiempo de muestreo, sugieren la existencia de un flujo génico
fuerte entre ambos grupos, lo cual indica que el parasito podría encontrarse
42
distribuido en otras áreas del país sin ningún problema y con buenas
posibilidades de sobrevivir al tener índices de diferenciación genética bajos que
sugieren que se trata de una gran población con flujo génico y dispersión.
8. Existe una relación directa entre la altitud y la presencia de Paragonimus
mexicanus en los cangrejos colectados.
9. Luego del análisis de los resultados de la presente investigación, se acepta
parcialmente la hipótesis planteada, ya que aunque no se encontró en los ríos de
5 de los 6 departamentos muestreados; se localizo el parasito en un río del
departamento de Santa Rosa, donde aún no había sido reportado.
43
IV.2 RECOMENDACIONES
1. Es necesario ampliar el muestreo del parasito Paragonimus a nivel nacional, con
la finalidad de apoyar o rechazar los resultados de la presente investigación.
2. Trabajar con los marcadores moleculares Microsatélites, ya que el alto
polimorfismo que éstos presentan podrían establecer el grado de diferenciación
entre las poblaciones de Paragonimus mexicanus dentro de Guatemala ya que a
este nivel el marcador genético no es suficiente.
3. Se deben realizar monitoreos mas precisos en todas las fuentes naturales de agua
cercanas a la población de Santa María Ixhuatan departamento de Santa Rosa, ya
que cerca de ésta fue que se encontró el foco de Paragonimiasis, con el fin de
tener mas herramientas con las que se puede hacer advertencias a las autoridades
de salud.
4. Se debe hacer un muestreo no solamente de cangrejos sino de mamíferos que
visitan los riachuelos donde fue localizado el parasito, ya que estos también son
hospederos definitivos para Paragonimus sp, y los siguientes en la cadena de
transmisión.
5. Deben realizarse sondeos, como la toma de muestras de heces, sangre, rayos X
y esputo para localizar a los pobladores con posibles afecciones de la
enfermedad. Ya que están expuestos a la transmisión del parasito presente en el
río cercano a la comunidad de Ixhuatán, Santa Rosa.
6. Establecer cuáles son las aldeas más afectadas y con ellos llevar a cabo los
análisis pertinentes y más específicos para monitorear la presencia de la
enfermedad en la región, ya que son aproximadamente 18,743 habitantes los de
municipio.
7. Es necesario revaluar los ríos con alta presencia de coliformes totales y fecales,
en búsqueda del parásito Paragonimus, ya que la presencia de los coliformes es
una característica importante para la existencia del parásito, y el ampliar el área
de los sitios de muestreo mejorara la colecta.
8. Es necesario ampliar la distribución de la publicación generada a través del
presente proyecto, ya que por lo menos, todas las autoridades nacionales de salud
deben estar al tanto de las características de la enfermedad, su distribución actual
y formas de transmisión.
9. Realizar una modelaje de nicho basado en la altitud para proponer una nueva ruta
donde pueda haber presencia de Paragonimus mexicanus, y evitar buscar en
lugares donde el parásito no se encuentre.
44
IV.3 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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56. http://www.facmed.unam.mx/deptos/microbiologia/parasitologia/paragonimosis.
html.
48
IV.4 ANEXOS
49
IV.4 ANEXOS
A continuación se presentan los anexos correspondientes a los que se hacen referencia
en el texto.
IV.4.1. Anexo 1. Mapa de los sitios de muestreo en los ríos de los 6 departamentos del
área sur de Guatemala.
Figura 13: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Escuintla de
Guatemala.
Fuente: FODECYT 63-2009
50
Figura 14: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Jutiapa de Guatemala.
Fuente: FODECYT 63-2009
Figura 15: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Retalhuleu de
Guatemala.
Fuente: FODECYT 63-2009
51
Figura 16: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de San Marcos de
Guatemala.
Fuente: FODECYT 63-2009
Figura 17: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Santa Rosa de
Guatemala.
Fuente: FODECYT 63-2009
52
Figura 18: Mapa de los sitios de muestreo positivos del departamento de Santa Rosa de
Guatemala.
Fuente: FODECYT 63-2009
Figura 19: Mapa de los sitios de muestreo del departamento de Suchitepéquez de
Guatemala.
Fuente: FODECYT 63-2009
53
IV.4.2. Anexo 2. Coordenadas y mapa de Guatemala señalando los sitios de muestreo.
Tabla 9: Listado de los puntos de colecta realizados durante la investigación.
Para el departamento de Jutiapa:
Jutiapa Amayito N 14°17´03.92" O 89° 56´58.55" 929 msnm
Jutiapa Paz N 14°17´9.21" O 89° 53´35.37" 889 msnm
Jutiapa Ostúa N 14°18´3.46" O 89° 54´22.78" 931 msnm
Jutiapa El salto N 14°17´2.29" O 89° 56´58.64" 928 msnm
Para el departamento de Santa Rosa:
Santa Rosa Usarin N 14°01´39.24" O 90° 25´54.13" 60 msnm
Santa Rosa Chiquimulilla N 14°05´23.98" O 90° 27.54.82" 244 msnm
Santa Rosa Guazacapán N 14°4´4.05" O 90° 24´56.14" 233 msnm
Santa Rosa El Astillero N 14°01´29.91" O 90° 25´22.30" 69 msnm
Santa Rosa Papaturro N 14°14´20.04" O 90° 19´33.65" 557 msnm
Santa Rosa Ixhuatán N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm
Santa Rosa Ixhuatán 1 N 14°14´679" O 90° 15´09.72" 771 msnm
Santa Rosa Ixhuatán 2 N 14°11´395" O 90° 16´05.98" 1240 msnm
Santa Rosa Maria Linda N 14° 6'53.53" O 90° 38' 24.45" 37 msnm
Para el departamento de Escuintla:
Escuintla El Baúl N 14°22´50.54" O 90° 0´57.03" 549 msnm
Escuintla La Laguneta N 14°17´14.65" O 90° 58´11.84" 290 msnm
Escuintla La Unión N 14°20´34.25" O 91° 3´48.87" 317 msnm
Escuintla Tierra Nueva N 14°15´54.65" O 90° 57´58.09" 239 msnm
Para el departamento de Suchitepéquez:
Suchitepéquez Río Negro N 14°32´43.38" O 91° 33.´35.03" 370 msnm
Suchitepéquez Sis N 14°30'42.85" O 91°34'41.13" 266 msnm
Suchitepéquez
Brazo del Vado
Hondo N 14° 33'10.54" O 91°27'29.60" 462 msnm
Suchitepéquez La Cascada N 14°32'46.81" O 91°34'02.91" 361 msnm
Suchitepéquez El Chiflón N 14° 33'40.79" O 91°30'21.94" 491 msnm
Para el departamento de Retalhuleu:
Retalhuleu Yuxiná N 14°32´52.01" O 89° 56´58.55" 275 msnm
Retalhuleu Brazo del Samalá N 14°34´21.23" O 91° 37´54.32" 330 msnm
Retalhuleu Yaxhá N 14°33´52.01" O 91° 40´55.89" 285 msnm
Retalhuleu Los Ajos N 14° 35'18.52" O 91°35'48.93" 485 msnm
54
Para el departamento de San Marcos:
Fuente: FODECYT 63-2009
Figura 20: Mapa general de los sitios de muestreo
Fuente: FODECYT 63-2009
San Marcos Naranjo N 14°43´37.56" O 91° 52´24.11" 404 msnm
San Marcos La Isla N 14°44´05.38" O 92° 02´00.87" 80 msnm
San Marcos Nuevo Progreso N 14°47´39.68" O 91° 54´57.56" 594 msnm
San Marcos Los Pocitos N 14°46´41.47" O 91° 56´13.29" 477 msnm
San Marcos La Quebrada N 14°44´33.43" O 92° 02´32.58" 132 msnm
55
IV.4.3. Anexo 3. Colecta de hospederos intermediarios (cangrejos en los sitios de
muestreo).
Figuras 21 y 22: Colecta de cangrejos en los ríos de los sitios de muestreo y hospedero
intermediario colectado. Créditos: Patricia Landaverde y Carlos Montenegro.
Fuente: FODECYT 63-2009 Fuente: FODECYT 63-2009
IV.4.4. Anexo 4. Toma de datos de los hospederos intermediarios (cangrejos) y
búsqueda de Paragonimus en el hepatopáncreas.
Figuras 23 y 24: Toma de datos de los cangrejos colectaos y búsqueda del
Paragonimus en los hospederos intermediarios. Créditos: Vivian Monzón y Raquel
Lima.
Fuente: FODECYT 63-2009 Fuente: FODECYT 63-2009
56
IV.4.5. Anexo 5. Metacercarias de Paragonimus mexicanus, extraídos de los cangrejos
colectados.
Figura 25: Fotografía de una metacercaria de Paragonimus mexicanus, extraída de los
cangrejos colectados. Crédito: Vivian Monzón.
Fuente: FODECYT 63-2009
Anexo.4.6. Anexo 6. Río que presenta las condiciones ideales para la colecta de
cangrejos.
Figura 26: Sitio de muestreo que presenta las condiciones ideales para la presencia de
cangrejos con posibilidad de infección con Paragonimus mexicanus. Crédito: Patricia
Landaverde.
Fuente: FODECYT 63-2009
57
Nombre del Proyecto:
Numero del Proyecto: 063-2009
Investigador Principal y/o Responsable del Proyecto: LICDA. ANTONIETA GUADALUPE RODAS RETANAMonto Autorizado: Q233,619.10 01/06/2010
Plazo en meses 12 MESES
Fecha de Inicio y Finalización: 01/06/2010 al 31/05/2011
Menos (-) Mas (+)
0 SERVICIOS PERSONALES
35 Retribuciones a destajo Q 3,880.00 Q 3,000.00 Q 880.00
1 SERVICIOS NO PERSONALES
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad 98,500.00Q 17,000.00Q 101,445.00Q Q 14,055.00
181
Estudios, investigaciones y proyectos de
factibilidad (Evaluación Externa de Impacto) 8,000.00Q Q 8,000.00
121 Divulgación e información 4,000.00Q 4,000.00Q Q -
122 Impresión, encuadernación y reproducción 500.00Q 500.00Q Q -
133 Viáticos en el interior 14,750.00Q 7,848.00Q Q 6,902.00
182 Servicios médico-sanitarios 18,000.00Q 17,000.00Q Q 1,000.00
185 Servicios de capacitación 8,000.00Q Q 8,000.00
189 Otros estudios y/o servicios 3,600.00Q Q 3,600.00
2 MATERIALES Y SUMINISTROS
241 Papel de escritorio 270.00Q 269.98Q Q 0.02
243 Productos de papel o cartón 200.00Q 95.50Q Q 104.50
244 Productos de artes gráficas 50.00Q 70.00Q 116.20Q Q 3.80
261 Elementos y compuestos químicos 34,986.00Q 13,870.00Q 19,324.70Q Q 1,791.30
262 Combustibles y lubricantes 4,000.00Q 2,461.07Q Q 1,538.93
267 Tintes, pinturas y colorantes 1,000.00Q 1,000.00Q Q -
268 Productos plásticos, nylon, vinil y pvc 8,000.00Q 984.56Q Q 7,015.44
272 Productos de vidrio 600.00Q Q 600.00
291 Útiles de oficina 580.00Q 580.00Q Q -
292 Útiles de limpieza y productos sanitarios 565.00Q 202.40Q Q 362.60
295
Útiles menores, médico-quirúrgicos y de
laboratorio 14,750.00Q 14,750.00Q 10,000.00Q 8,868.96Q Q 1,131.04
3
PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E
INTANGIBLES
329 Otras maquinarias y equipos 6,700.00Q 4,929.66Q Q 1,770.34
GASTOS DE ADMÓN. (10%) 21,238.10Q 21,238.10Q
233,619.10Q 45,620.00Q 45,620.00Q 176,864.13Q Q 56,754.97
MONTO AUTORIZADO 233,619.10Q Disponibilidad 57,654.97Q
(-) EJECUTADO 175,964.13Q
SUBTOTAL 57,654.97Q
(-) CAJA CHICA
TOTAL POR EJECUTAR 57,654.97Q
FICHA DE EJECUCIÓN PRESUPUESTARIA
LINEA:
FODECYT
"Evaluación de focos potenciales de Paragonimiasis y determinación mediante técnica molecular de la
especie de Paragonimus presente en los departamentos del área sur de Guatemala"
Orden de Inicio (y/o Fecha primer pago):
PRÓRROGA AL 31/08/2011
Pendiente de
Ejecutar Grupo Renglon Nombre del Gasto
Asignacion
Presupuestaria
TRANSFERENCIA
Ejecutado
PARTE V
V.1 INFORME FINANCIERO
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