CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT...

CONSEJO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -CONCYT-

SECRETARÍA NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -SENACYT- FONDO NACIONAL DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA -FONACYT-

FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACIA UNIVERSIDAD DE SAN CARLOS DE GUATEMALA

INFORME FINAL

Síntesis de Calyxolanos A y B, Únicos Metabolitos Tipo C6-C4-C6 Aislados de un Organismo Marino, Determinación de su Inhibición Contra la Enzima

Acetilcolinesterasa y sus Propiedades Farmacofóricas

PROYECTO FODECYT No. 38-2008

Dr. Oscar Manuel Cóbar Pinto Investigador Principal

GUATEMALA, NOVIEMBRE DE 2012

Facultad de Ciencias Químicas Universidad de San Carlos Y Farmacia

AGRADECIMIENTOS:

La realización de este trabajo, ha sido posible gracias al apoyo financiero dentro del Fondo

Nacional de Ciencia y Tecnología, -FONACYT-, otorgado por la Secretaría Nacional de

Ciencia y Tecnología –SENACYT- y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología -

CONCYT-.

AGRADECIMIENTOS:

Adicionalmente se Agradece a los miembros del equipo de Investigación y Colaboradores

que hicieron posible este proyecto:

Lic. Francisco Carrascoza, Br. Regina Hurtarte, Br. Manuel Muños, Br. Anival Ruiz, Br.

William Quiroa y Br. Rony Letona. Un especial agradecimiento al Lic. Eduardo Robles, Lic.

Rodolfo Orozco y al equipo de Análisis de Espectrometría de Masas del Departamento de

Fisicoquímica, especialmente a la Licda. Tamara Claudio. Al Lic. Ricardo Veliz y a los

Departamentos de Fisicoquímica y Análisis Inorgánico de la Escuela de Química de la

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia, por la asesoría analítica y el préstamo de sus

instalaciones.

I

Tabla de Contenido

Resumen ......................................................................................................................... 1

Summary ........................................................................................................................ 2

PARTE I ............................................................................................................................................... 3

1.1 Introducción .............................................................................................................. 3

1.2 Planteamiento del Problema ..................................................................................... 3

1.3 Objetivos. .................................................................................................................. 5

13.1 General ...................................................................................................................... 5

1.3.2 Específicos ............................................................................................................... 5

1.3.4 Hipótesis ................................................................................................................... 5

I.4 Método .................................................................................................................... 10

PARTE II............................................................................................................................................ 20 PARTE III .......................................................................................................................................... 25

III.1 Resultados ........................................................................................................... 25

III.2 Discusión de Resultados ....................................................................................... 41

PARTE IV. ......................................................................................................................................... 61

IV.1 Conclusiones ........................................................................................................ 61

IV.2 Recomendaciones ................................................................................................ 63

IV.3 Referencias Bibliográficas..................................................................................... 64

IV.4 Anexos ................................................................................................................. 67

II

Índice de Tablas y Gráficas

Listado de Tablas

Tabla 1 Reactivos y equipo utilizado ___________________________________________________________ 7 Tabla 2 RS1 R1 Espectro IR __________________________________________________________________ 25 Tabla 3 RS1 R2 Pruebas de solubilidad. ________________________________________________________ 26 Tabla 4 RS1 R2 Puntos de fusión_____________________________________________________________ 268 Tabla 5 RS1 R2 Espectro IR __________________________________________________________________ 32 Tabla 6 RS1 R2 Espectro IR Fracción No. 5 ____________________________________________________ 325 Tabla 7 RS2 R1 TLC _______________________________________________________________________ 355 Tabla 8 RS2 R2 Cromatografía de Rayos X: ____________________________________________________ 356 Tabla 9 RS2 R2 TLC1 ______________________________________________________________________ 366 Tabla 10 RS2 R2 TLC2 _____________________________________________________________________ 367 Tabla 11 RS2 R2 TLC3 _____________________________________________________________________ 377 Tabla 12 RS2 R2 TLC4 _____________________________________________________________________ 378 Tabla 13 RS2 R2 TLC5 _____________________________________________________________________ 388 Tabla 14 RS2 R2 MG-MS ___________________________________________________________________ 388 Tabla 15 RS2 R2 MG-MS Comparación de Patrones: ______________________________________________ 50 Tabla 16 Comparación de Rfs 1 ______________________________________________________________ 51 Tabla 17 Comparación de Rfs 2 ______________________________________________________________ 52 Tabla 18 Comparación de Rfs 3 y 4 ___________________________________________________________ 53 Tabla 19 Identidad de puntos en TLC Hijas ____________________________________________________ 533 Tabla 20 Análisis de MS 1 __________________________________________________________________ 534 Tabla 21 Comparación de Patrones 2__________________________________________________________ 76 Tabla 22 Anexos 1 ________________________________________________________________________ 766 Tabla 23 Anexos Unión de Cromatografías ____________________________________________________ 767 Tabla 24 Anexos, Identidad en TLC RS2R2 _____________________________________________________ 778 Tabla 25 Anexos Rfs1 _____________________________________________________________________ 789 Tabla 26 Anexos Rfs 2: _____________________________________________________________________ 80 Tabla 27 Anexos Rfs3 ______________________________________________________________________ 81 Tabla 28 Anexos Rfs 4 ______________________________________________________________________ 82 Tabla 29 Anexos Rfs 5 ______________________________________________________________________ 83 Tabla 30 Anexos Rfs 6 ______________________________________________________________________ 84 Tabla 31 Anexos TLC Bromfenilacetladehido ___________________________________________________ 845 Tabla 32 Muestra Duplicado. Tabla 33 Anexos Bromofenilacetaldehido 2 ___________________________ 856 Tabla 33 Anexos Rfs Bromofenilacetlaldehido __________________________________________________ 861 Tabla 34 Anexos Rfs Benzaldehído de acetofenona _______________________________________________ 88

III

Listado de Gráficas

Gráfica 1 Estructura de Calyxolanos ____________________________________________________________ 1 Gráfica 2 Ruta de Síntesis No. 1 ______________________________________________________________ 11 Gráfica 3 Ruta de Síntesis No. 2 ______________________________________________________________ 14 Gráfica 4 Agrimolido _______________________________________________________________________ 20 Gráfica 5 1-4 difenil-2,3-butanodiol ___________________________________________________________ 20 Gráfica 6 Colipol __________________________________________________________________________ 21 Gráfica 7 Compuestos difenil tetrahidrofuránicos ________________________________________________ 21 Gráfica 8 RS1 R2 TLC1 ______________________________________________________________________ 27 Gráfica 9 RS2 R2 TLC2 ______________________________________________________________________ 28 Gráfica 10 MG-MS Eluato No. 3 Min 29.101: ____________________________________________________ 30 Gráfica 11 MG-MS Eluato No. 3 Min 29.569: ___________________________________________________ 30 Gráfica 12 MG-MS Eluato No. 3 Min 32.413 ____________________________________________________ 31 Gráfica 13 MG-MS Eluato No. 3 Min 37.109 ____________________________________________________ 31 Gráfica 14 Posibles identidades de M1 y M3 ___________________________________________________ 399 Gráfica 15 Calyxolano A ____________________________________________________________________ 39 Gráfica 16 Muestra 3 (M3): _________________________________________________________________ 40 Gráfica 17 Calyxolano A ____________________________________________________________________ 40 Gráfica 18 4-bromo-1,3-difenilbutan-1-ona _____________________________________________________ 43 Gráfica 19 Posible ionización de 4-bromo-1,3-difenilbutan-1-ona ___________________________________ 43 Gráfica 20 Mecanismo de reacción para Calyxoleno ______________________________________________ 44 Gráfica 21 Reducción de Calyxoleno con Zn (BH4)2 ______________________________________________ 455 Gráfica 22 2-bromo-1-feniletil 4-metilbenzenesulfonato _________________________________________ 455 Gráfica 23 1,4-difenilbut -3-en-ona __________________________________________________________ 466 Gráfica 24 Fragmentación radicalar para compuesto F3 Min 29.569 _______________________________ 477 Gráfica 25 Fragmentación radicalar para pico en 131.05 UMAS ___________________________________ 489 Gráfica 26 1,4-difenilbut-3-en-1-ona _________________________________________________________ 499 Gráfica 27 Fragmentación Radicalar para 1,4-difenilbut-3-en-1-ona ________________________________ 499 Gráfica 28 TLC Hijas ______________________________________________________________________ 522 Gráfica 29 Espectros de masas de algunos Difenildioxolanos ______________________________________ 544 Gráfica 30 M3 Identidad y descomposición Radicalar por MS _____________________________________ 555 Gráfica 31 M3 picos 191, 165, 115 y 77 _______________________________________________________ 555 Gráfica 32 M3 picos 105 y 115 ______________________________________________________________ 566 Gráfica 33 M2 min 37 4-oxo-2,4-difenilbutanal _________________________________________________ 577 Gráfica 34 M2 Pico 207 ____________________________________________________________________ 588 Gráfica 35 Espectros IR para 2-bromo-1-feniletanol _____________________________________________ 666 Gráfica 36 TLC Cod. 040909 ________________________________________________________________ 677 Gráfica 37 TLC Cod. 071009 ________________________________________________________________ 677 Gráfica 38 IR teórico para SN2 Cod. 13 10 2009 ________________________________________________ 688 Gráfica 39 IR para SN2 F3 Cod 22102009 _____________________________________________________ 699 Gráfica 40 IR F3 __________________________________________________________________________ 699 Gráfica 41 IR F5 ___________________________________________________________________________ 70 Gráfica 42 Espectrometría por fluorescencia de Rayos X F3 ________________________________________ 70 Gráfica 43 F5 _____________________________________________________________________________ 71 Gráfica 44 RUTA DE SINTESIS No.2 Croma. Rayos X a R1 __________________________________________ 72 Gráfica 45 R2 Croma. Rayos X. _____________________________________________________________ 733

IV

Gráfica 46 TLC 25.02.2010 _________________________________________________________________ 744 Gráfica 47 TLC 26 02 2010 _________________________________________________________________ 744 Gráfica 48 TLC 26.02.2010 _________________________________________________________________ 755 Gráfica 49 TLC 26 02 2010 Imagen 1339 ______________________________________________________ 756 Gráfica 50 TLC 1352 04032010 ______________________________________________________________ 777 Gráfica 51 TLC 1344 10032010 ______________________________________________________________ 788 Gráfica 52 TLC 1357 10032010 ______________________________________________________________ 799 Gráfica 53 TLC 1345 10032010 ______________________________________________________________ 80 Gráfica 54 TLC 1346 10032010 _______________________________________________________________ 81 Gráfica 55 TLC 1351 18032010 ______________________________________________________________ 822 Gráfica 56 TLC 1347 130410 ________________________________________________________________ 844 Gráfica 57 TLC 348 130410 _________________________________________________________________ 855 Gráfica 58 TLC 1350 140410 ________________________________________________________________ 866 Gráfica 59 1353 190410 ___________________________________________________________________ 877 Gráfica 60 TLC 1355 190410 _______________________________________________________________ 888 Gráfica 61 1356 190410 ___________________________________________________________________ 899 Gráfica 62 M1 GM-MS 29.569 _______________________________________________________________ 90 Gráfica 63 M1 GM-MS 29.101 _______________________________________________________________ 91 Gráfica 64 M2 GM-MS 32.88 _______________________________________________________________ 922

1

Resumen

En esta investigación se sintetizaron los únicos dos metabolitos tipo C6-C4-C6

(Calyxolanos A y B) aislados de un organismo marino, mediante reacciones químicas

orgánicas sencillas, económicas y bien conocidas, buscando optimizar su proceso de síntesis

para mejorar los porcentajes de rendimiento antes obtenidos.

Previamente se ha reportado que los Calyxolanos A y B presentan actividad inhibitoria de

la enzima Acetilcolinesterasa. La Acetilcolinesterasa degrada la acetilcolina en la sinapsis

neuronal, siendo la carencia de acetilcolina una de las señales de alarma características de la

presencia de la Enfermedad de Alzheimer.

Por esta razón, es previsible que Calyxolanos A y B actúen como inhibidores de la

Acetilcolinesterasa, con potencial de convertirse en nuevos medicamentos contra la

Enfermedad de Alzheimer.

Calyxolanos A y B (2S,4S-2,4-difeniltetrahidrofurano y 2S,4R-2,4-difeniltetrahidrofurano)

fueron aislados en 1997 en cantidades de 2.8 y 3.5 mg respectivamente, de la esponja marina

Calyx podatypa del Caribe Mesoamericano (Rodríguez, A. et al. 1997) y han sido reportados

como los únicos metabolitos de este tipo aislados de un organismo marino.

En Guatemala, se sintetizaron con bajo rendimiento Calyxolanos A y B, pero no se

determinó su actividad inhibitoria contra la enzima Acetilcolinesterasa (Cóbar, et al. 2005).

Gráfica 1 Estructura de Calyxolanos

Fuente: FODECYT 38-2008.

Dado que a la fecha, los Calyxolanos no se han logrado sintetizar en cantidad suficiente

para continuar estudiando su actividad biológica y determinar su potencial como probables

fármacos contra ésta y otras enfermedades (Díaz, N. et al. 1998, 2001, Hilt, G. et al. 2005),

esta investigación planteó dos nuevas rutas de síntesis orgánica, obteniendo como resultado

que en una de las rutas, la cual parte del estireno (Ruta de Síntesis 1) obtuvo bajo porcentaje

de rendimiento ya que uno de los intermediarios se degrada con facilidad, mientras que en la

Ruta de Síntesis 2, la cual parte del fenilacetaldehido, se ha obtenido un buen porcentaje de

rendimiento.

Adicionalmente, mediante la utilización de los programas computacionales LigandScout®

versión 1.03 de Interligand Inc. y JChem versión 3.2.3 de Chem Axon Inc. se analizaron

parámetros farmacofóricos de estas moléculas.

2

Summary

In this research the only two C6-C4-C6 metabolites (Calyxolanes A and B) were

synthesized, isolated from a marine organism by simple, economic, and well known organic

chemical reactions; seeking the optimization of the synthesis process to improve yield rates

of Calyxolanes obtained above.

Previously, it has been reported that Calyxolanes A and B had shown enzyme

Acetylcholinesterase inhibitory activity. Acetylcholinesterase breaks down Acetylcholine in

neuronal synapses causing Acetylcholine deficiency, being this one of the characteristic

signals of Alzheimer's Disease. For this reason, it’s expected that Calyxolanes A and B acts

as potential inhibitors of the enzyme Acetylcholinesterase. Calyxolanes A and B should be

potential new drugs against Alzheimer's Disease.

In Guatemala were synthesized underperforming Calyxolanes A and B, their inhibitory

activity against the enzyme Acetylcholinesterase (Cóbar, et al. 2005) couldn’t be yet

determined.

Therefore, Calyxolanes needs to be synthesized at a sufficient rate to continue studying its

biological activity and likely determine their potential as drugs against this and other diseases

(Diaz, N. et al 1998, 2001; Hilt, G. et al. 2005). This research raised two new organic

chemical synthesis routes, one which uses styrene (Synthesis Route 1, low percent yield was

obtained because one of intermediaries readily degrades), while the Synthesis Route 2 (that

uses phenylacetaldehyde), obtained a good yield rate.

Additionally, by using software like LigandScout® v. 1.03 of Interligand Inc. and v. 3.2.3 of

Chem JChem Axon Inc., the pharmacophoric parameters of these molecules were analyzed.

3

PARTE I

1.1 Introducción.

El enfoque de este proyecto es síntesis orgánica, con el propósito de obtener los isómeros

2S,4R y 2S,4R del 2,4-difenil tetrahidrofurano, utilizando reacciones conocidas y reactivos de

bajo costo.

Calyxolanos A y B estructuralmente son 2,4-difenil tetrahidrofuranos, son los únicos

metabolitos tipo C6-C4-C6 aislados de un organismo marino (esponja marina Calyx

podatypa). Por la pequeña cantidad en que se aislaron (2.8 y 3.5 mg respectivamente), no se

estudió su actividad biológica, por lo que se sintetizan en el laboratorio con el objeto de

estudiar su actividad contra la enzima Acetilcolinesterasa y posteriormente continuar

explorando su potencial como posibles medicamentos contra la Enfermedad de Alzheimer.

En esta investigación se propusieron dos rutas de síntesis, anteriormente (Cóbar et al

2004) sintetizaron Calyxolanos A y B en cantidades menores de 5 mg, por lo que este estudio

buscó prioritariamente mejorar los porcentajes de rendimiento previamente obtenidos para

obtener cantidades a nivel de gramo, para en futuras investigaciones continuar con el estudio

de otras actividades biológicas que pudieran poseer estas moléculas.

Como un valor agregado del proyecto, se estudió “in silico” las propiedades

farmacofóricas de Calyxolanos A y B. Utilizando técnicas de modelaje molecular

computacional, se determinó teóricamente sus propiedades fisicoquímicas y parámetros

farmacofóricos, necesarias para continuar con sus estudios como posibles nuevos

medicamentos. Adicionalmente, los resultados de estos estudios “in silico” serán utilizados

en próximas investigaciones que buscarán determinar sus valores de Lipinski y el sitio de

reacción de ambos Calyxolanos en la Acetilcolinesterasa.

1.2 Planteamiento del Problema.

Antecedentes (Trabajo y experiencias en Guatemala).

Calyxolanos A y B, estructuralmente 2,4-difeniltetrahidrofuranos, son los primeros

metabolitos tipo C6-C4-C6 aislados de un organismo marino, la esponja caribeña Calyx

podatypa en 1997 (Rodríguez, et al. 1997).

Se han publicado cuatro trabajos relacionados con su síntesis orgánica; en 1998 y 2001

Buezo y colaboradores (Buezo, N. et al. 1998, 2001), utilizaron el grupo sulfinilo como

auxiliar quiral en reacciones asimétricas de Heck para sintetizar Calyxolano B, como un

ejemplo de que su metodología es adecuada para sintetizar productos naturales. Reportan un

96% de pureza quiral, sintetizando 68 mg del compuesto.

En 2005 Gerald Hilt y colaboradores (Hilt, et al. 2005) sintetizan Calyxolanos A y B

utilizando una reacción de expansión anular intermolecular utilizando como sustrato un aril

epóxido y varios dienos, acrilatos, eninos y estirenos bajo condiciones catalíticas que utilizan

hierro, para sintetizar tetrahidrofuranos en alta regio- y quimioselectividad. Calyxolanos A y

B fueron sintetizados en una sola etapa con una diasteroselectividad del 82 % y un porcentaje

de rendimiento del 42%.

4

En el mismo año, Angela Bernard y colaboradores (Bernard, A. et al. 2005) sintetizan

Calyxolano B en un 84% de rendimiento, utilizando la reacción de Corey-Ilido y como

sustrato β-sulfonil enonas.

Ninguno de los trabajos anteriores surge como una necesidad de sintetizar directamente

los Calyxolanos, si no como una aplicación del desarrollo de las reacciones específicas que

se estudian.

En Guatemala, Oscar Cóbar reporta en 2005 (Cóbar, O. et al. 2005) la síntesis de

Calyxolanos A y B con rendimiento del 5%, utilizando una secuencia de reacciones de

condensación aldólica, adición nucleofílica, reducción química y formación de sales de

diazonio.

Este es el primer y único reporte de la síntesis de Calyxolanos A y B diseñados para

producirlos específicamente, sin embargo ninguno de los trabajos reporta algún tipo de

actividad biológica probada.

Justificación de la investigación.

El problema circundante en torno a esta investigación es la búsqueda de nuevos fármacos

de fuentes naturales. Calyxolanos A y B, productos naturales marinos noveles, por su

estructura química y estudios previos, prometen poseer importante actividad biológica, su

escasa producción por el organismo que los biosintetiza, la esponja marina Calyx podatypa, y

su síntesis en el laboratorio reportada, siempre en pequeñas cantidades y sin estudiar su

actividad biológica, hacen necesario sintetizar estos compuestos de una manera barata y

eficiente en cantidades a nivel de gramo, utilizando reactivos de bajo costo, rutas sintéticas

cortas y reacciones químicas ampliamente conocidas.

Al haberse reportado, por estudios en nuestro laboratorio que estos compuestos pueden

inhibir “in vitro” a la enzima Acetilcolinesterasa, se propone sintetizarlos para confirmar ésta

y probar posteriormente su actividad antibacteriana, citotóxica y antifúngica entre otras y su

capacidad para incrementar la memoria en mamíferos como potencial medicamento contra la

Enfermedad de Alzheimer.

Adicionalmente se buscará la metodología que permita la separación cromatográfica de

los diasteroisomeros (R,R y R,S) respectivos.

La determinación de parámetros farmacofóricos de ambas moléculas, permitirán predecir

sus propiedades farmacofóricas, valiosas para estudios posteriores de actividad biológica.

Es de hacer notar que esta aproximación es pionera en el país y se espera desarrollar con

mayor profundidad en futuras investigaciones.

5

1.3 Objetivos.

13.1 General.

Sintetizar químicamente los isómeros cis y trans del 2,4-difeniltetrahidrofurano

(Calyxolanos A y B) en alto porcentaje de rendimiento.

1.3.2 Específicos.

1 Desarrollar una ruta sintética para 2,4-difeniltetrahidrofurano de bajo costo y alto

rendimiento, utilizando para ello reacciones bien conocidas, reactivos asequibles y a precio

económico.

2 Separar eficaz y eficientemente los diasterómeros de 2,4-difeniltetrahidrofurano.

3 Evaluar la actividad contra la enzima acetilcolinesterasa de los compuestos sintetizados.

4 Realizar estudios teóricos de modelaje molecular de las moléculas a sintetizar.

5 Determinar las propiedades farmacofóricas de Calyxolanos A y B como “Relative

Topological Polar Surface Area”, “Topological Polar Surface Area” -TPSA-, Número de

Átomos Aromáticos, “cLogP”, Número de Átomos Donadores y Número de Átomos

Aceptores de Hidrógeno.

1.3.4 Hipótesis.

Es posible sintetizar los isómeros cis y trans del 2,4-difeniltetrahidrofurano en un porcentaje

de rendimiento mayor al 30%.

6

I.4.1 Diseño, población a estudiar y muestra.

I.4.1.1 Localización.

Departamento de Fisicoquímica de la Facultad de Ciencias Químicas y Farmacia de la

Universidad de San Carlos de Guatemala, ubicado en 14º36´03.55´´ Norte y 99º33´45.40´´

Oeste, a 1517 MSNM y temperatura media de 23 oC.

I.4.1.2 Universo.

Las dos moléculas sintetizadas, la materia prima y metodología necesaria para su síntesis

orgánica. I.4.1.3 Población.

Reactivos utilizados para la síntesis orgánica de los compuestos a producir.

I.4.1.4 Modelo de muestreo.

Por la naturaleza de la investigación no se aplica un modelo de muestreo.

I.4.1.5. Fases de Trabajo.

El trabajo se desarrolló en dos Fases de Síntesis Orgánica, una Fase de estudio de sus

propiedades farmacofóricas y prueba de su actividad inhibitoria in vitro contra la enzima

Acetilcolinesterasa.

I.4.1.6 Período de Realización de la Investigación.

01 de Febrero de 2009 al 30 de Septiembre de 2010.

I.4.2 MATERIALES Y MÉTODOS

I.4.2.1 Equipo:

Espectrofotómetro de Masas (P. 168, L 1)

Heweltt Packard Series II Plus 5890 GC

Gas Acarreador: Helio

Columna: 30 mts, 0.5 mm de diámetro interno RTX-5 (5% Polidifenilsiloxano)

Detector, MSD 5970 series Mass Selective Detector HP.

Condiciones de Análisis de las muestras:

Temperatura inicial 90 °C.

Tiempo de espera 5 minutos.

Rampa: De 90 °C a flujo de 5 °C/min hasta 215 °C, calentando por 2 minutos.

7

Tabla 1 Reactivos y equipo utilizado

Reactivo Cantidad/Característica Observaciones

CH2Cl2 1 L Proporcionado por Merck.

4-dimetilaminopiridina 50 gr Proporcionado por Merck.

Argón 220 pies3/Año Proporcionado por Productos del Aire, como Argón 99% pureza.

Equipo Corning® Organic Chemistry

1 Kit 24/40 Cristalería.

Hot Plate con agitador magnético

plato 15x15 cm Proporcionado por Thermo.

Frasco de 3 bocas 24/40 Proporcionado por Merck.

Rotavapor aislador de temperatura

Proporcionado por Merck.

Equipo Corning® Organic Chemistry

19/22 Cristalería.

Columna de Vigreaux 19/32 200 mm Cristalería.

Condensador Allhin 400 mm 24/40 Cristalería.

Kontes Stirrer Asamble 24/40

Agitador Motorizado FIS-14-259-702

Soporte para agitador 24/40

Manta de Calentamiento 500 ml

Servicios de Análisis Espectrofotométrico

UAI-USAC, Depto. de Fisicoquímica.

FeCl2 Anhidro 25g Sigma-aldrich.

PPh3 (trifenilfosfina) 250g Sigma-aldrich.

Polvo de zinc. 1kg Proporcionado por Merck.

CH3CN (acetonitrilo) 1 L Proporcionado por Merck.

Oxido de Estireno 250 mL Proporcionado por Merck.

Cloruro de 1,3-bis(2,4,6-trimetilfenil)-imidazolium

5g Proporcionado por Merck.

8

Reactivo Cantidad Observaciones

Estireno 4L Proporcionado por Merck.

N-bromosuccinamida (NBS) 200g Proporcionado por Merck.

Benceno 4 L Proporcionado por Merck.

Hidróxido de Sodio 500g Proporcionado por Merck.

Piridina 2 L Proporcionado por Merck.

Cloruro de p-toluensulfonilo 1 Kg Proporcionado por Merck.

Dietileter 4 L Proporcionado por Merck.

HCl 2.5 L Proporcionado por Merck.

NaHCO3 1 Kg Proporcionado por Merck.

CaCl2 anhidro 100g Proporcionado por Merck.

Pentano anhidro 4L Proporcionado por Merck.

N,N-dimetilformamida 4L Proporcionado por Merck.

Feniletanona (acetofenona) 1 Kg Proporcionado por Merck.

Éter 7.5L Proporcionado por Merck.

Eter de petróleo (Bencina p. eb. 60-80°)

2.5L Proporcionado por Merck.

Borohidruro de sodio 96% 100g Proporcionado por Merck.

Ácido Nítrico diluido 2.5L Proporcionado por Merck.

Nitrato de Plata. 25g Proporcionado por Merck.

Ácido Acético. 2.5L Proporcionado por Merck.

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Reactivo Cantidad Observaciones

Metanol 4 L Proporcionado por Merck.

Anhídrido Acético. 500 mL Proporcionado por Merck.

Carbonato de Potasio 500g Proporcionado por Merck.

Cloruro de Zinc 1 Kg Proporcionado por Merck.

Fenilacetaldehido 500 mL Proporcionado por Merck.

Tricloruro de Fósforo 250 mL Proporcionado por Merck.

Ácido Sulfúrico 2.5 L Proporcionado por Merck.

Bencina del Petróleo 100-120° 2.5 L Proporcionado por Merck.

Tolueno 1 L Proporcionado por Merck.

Ácido p-toluensulfónico. 100g Proporcionado por Merck.

Sílica Gel 500g 200-600 M, Proporcionado por Merck.

Sodio (barras, seco) 100g Proporcionado por Merck.

Hidruro de Sodio (NaH)/60% en aceite mineral

100g Proporcionado por Sigma-Aldrich.

Hidruro de Calcio 100g Proporcionado por Sigma-Aldrich.

2,2,6,6,-Tetrametil-4-piperidona

100g Proporcionado por Sigma-Aldrich.

Cloroformo. 2.5 L Proporcionado por Merck.

Sulfato de Magnesio (desecante)

250g Proporcionado por Merck.


10

I.4 Método

El trabajo se desarrolló en dos fases de síntesis orgánica (Rutas de Síntesis 1 y 2) y

adicionalmente se realizaron estudios in silico de modelado para los compuestos y estudios

in vitro de actividad inhibitoria enzimática.

El trabajo práctico de laboratorio se realizó en los laboratorios de Fisicoquímica, Química

Orgánica y Laboratorio de Investigación en Productos Naturales de la Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacia de la Universidad de San Carlos de Guatemala, ubicada en las

coordenadas 14º36´03.55´´ Norte y 99º33´45.40´´ Oeste, a 1517 MSNM y temperatura media

de 23 oC.

11

Rutas de Síntesis Orgánica

Gráfica 2 Ruta de Síntesis No. 1


12

Reacción 1: Formación de 2-Bromo-1-feniletanol (Bromohidrina) a partir del

Estireno: (Guss, C., Rosenthal, R. 1955).

Se mezclaron 26g (0.25 moles) de estireno, 47g (95%, 0.25 moles) de N-

bromosuccinamida (NBS) y 100 mL de agua, luego se agitó la mezcla fuertemente a

temperatura ambiente hasta que el NBS sólido desapareció (35 minutos).

2-Bromo-1-feniletanol fue separado y la capa acuosa se extrajo con benceno. La destilación

del producto rindió 41.0g (81.6 %) de bromohidrina del estireno.

Reacción 2: Formación 4-bromo-1,3-difenilbutan-1-ona y Sustitución Nucleofílica

(Julia, M., Maumy, M. 1988).

Una solución de 0.074 moles de 2-Bromo-1-feniletanol en 31 mL de piridina anhidra

fueron colocados en un erlenmeyer de 1L equipado con un agitador magnético, la solución se

enfrió en baño de hielo.

Se agregó durante 1 hora 0.359 moles de cloruro de p-toluensulfonilo en porciones y con

agitación en la mezcla, la cual fue mantenida a temperatura entre 0-5°C.

Esta mezcla se dejó reposar durante 1 noche a -4°C, después se agregaron 500g de una

mezcla hielo-agua.

A la mezcla se le agregaron 50 mL de HCl 2N, esta mezcla se filtró.

Al líquido se le realizaron extracciones con 100 mL de éter tres veces, luego estas se lavaron

con 50 mL de HCl 2N cada una y dos lavados con 25 mL de solución de bicarbonato de

sodio, obteniéndose un líquido incoloro transparente, que se dejó estar por tres días.

La solución se trató por destilación simple para extraer el éter a presión atmosférica, de esta

manera se recicló el éter. El residuo de la destilación fue un líquido amarillo.

El sólido filtrado se lavó con 3 porciones de 50 mL de éter, se filtró y el líquido obtenido se

conservó. De esto se obtuvieron 23.119 gramos de producto tosilado.

Adición Nucleofílica sobre 2-Bromo-1-feniletanol.

En un balón de tres bocas seco se ensambló con un agitador mecánico sellado, un

termómetro y una ampolla de decantación reguladora de presión (SOXLET) con una trampa

de cloruro de calcio.

Una solución de hidruro de sodio [19.2 g. de una suspensión 50% w/w en aceite mineral,

0.40 moles de hidruro de sodio] fue colocada en el frasco, y se agregaron 100 mL de n-

pentano anhidro.

Después de que la suspensión fue agitada, el hidruro de sodio se dejó asentar y el líquido

sobrenadante fue removido con una pipeta o un sifón.

La operación de lavado se repitió con dos porciones adicionales de 100 mL de n-pentano,

luego se añadieron 400 mL de N,N-dimetilformamida (previamente desecada, después se

destiló el solvente a presión atmosférica, p.eb. 155 °C) y se agrega al frasco de reacción.

Se agitó vigorosamente la suspensión de hidruro de sodio en N,N-dimetilformamida y se

agregaron gotas de acetofenona por 30 min, (0.60 moles).

13

La mezcla se agitó hasta provocar un cambio de color.

Luego se disolvieron en 100 mL de N,N-dimetilformamida anhidra todo el sustrato de 2-

bromo 1-feniletil-4-toluenbencensulfonato preparado y se agregó en una sola porción.

La solución resultante fue lentamente calentada hasta 100 °C con agitación continua por un

período de 3 horas.

Durante este tiempo la reacción cambió nuevamente de color, y se separaron cristales de p-

toluensulfonato de sodio.

La mezcla se dejó reposar por una noche a temperatura ambiente, después se transfirió a un

balón de fondo redondo, y el resto del solvente fue removido en un rotaevaporador.

Los residuos semisólidos fueron mezclados con 700 mL de agua y extraídos con tres

porciones de 250 mL de éter.

Los extractos etéreos combinados fueron secados sobre sulfato de sodio anhidro y

concentrados.

El residuo líquido fue destilado fraccionadamente bajo presión ambiente a través de una

columna Vigreux 12-cm (no se utilizó presión reducida por carencia de manómetro).

El residuo obtenido fue analizado por cromatografía de capa fina código 040909.

Se realizó cromatografía en columna a esta mezcla para analizar posteriormente sus

componentes mediante cromatografía acoplada gases-masas. La reacción se realizó por

duplicado.

Se realizó análisis de Fluorescencia de rayos X para observar la presencia de bromo.

Las fracciones 3 y 5 registraron señales de bromo y azufre.

Se secaron las muestras para analizar por Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría

de Masas.

El producto obtenido fue 3,5-difenil-2,3-dihidrofurano.

14

Gráfica 3 Ruta de Síntesis No. 2


15

Reacción 1: Bromación en alfa de Aldehído, Síntesis de 2-bromo-2-

fenilacetaldehído (Carpino, L., McAdams III, L. 1988).

En un balón de 3L de fondo redondo, ensamblado con un agitador mecánico y un

condensador de bulbo Allihn, se mezclaron 125 mL de benceno, 33.2 mL de

estirenbenzaldehido, 1.7 mL de tricloruro de fosforo y 15.5 mL de bromo el cual se añadió

durante dos horas gota a gota.

La solución resultante fue calentada suavemente en reflujo por 2 días hasta que el color

inicial del bromo desapareció.

La solución se dejó enfriar a temperatura ambiente y después de 1 hora se decantó y separó

de cualquier material polimérico en un frasco de destilación de 2 L.

Se removió el solvente por destilación en baño de maría con la ayuda de un aspirador de

humedad, resultando un aceite negro el cual fue puesto en 250-300 mL de Bencina de

Petróleo (punto de ebullición 90–120 °C).

La mezcla se calentó disolviendo el aceite y la solución se guardó a -4°C en un refrigerador

por 48 horas.

Se filtró sobre un embudo Büchner de porcelana y fue lavado con 200 mL de Bencina del

Petróleo a 10°C (punto de ebullición 90–120oC), esto resultó en un 67 % de rendimiento del

producto bromado en alfa.

Reacción 2: Síntesis de 4-oxo-2,4-difenilbutanal; Sustitución Nucleofílica sobre el

bromo en posición alfa.

Un balón de tres bocas seco se equipó con un agitador mecánico sellado, un termómetro y

una ampolla de decantación con reguladora de presión con un tubo de cloruro de calcio.

Una solución de hidruro de sodio [9.6 g de una suspensión 60% w/w en aceite mineral, 0.20

moles de hidruro de sodio] fue colocada en el frasco, y se agregaron 50 mL de n-pentano

anhidro (Se usó Na2SO4 como desecante).

Después que la suspensión fue agitada, el hidruro de sodio se dejó asentar y el líquido

sobrenadante se removió con una pipeta o un sifón.

Ésta operación de lavado es repetida con dos porciones adicionales de 50 mL de pentano y

después 100 mL de N,N-dimetilformamida (desecada sobre oxido de bario anhidro por 5

días, después se destiló el solvente a presión atmosférica, punto de ebullición 155 °C) y se

agregó al frasco de reacción.

Luego se agitó vigorosamente la suspensión de hidruro de sodio en N,N-dimetilformamida y

se agregó, gota a gota por 30 minutos 0.30 moles (35 mL) de acetofenona.

La mezcla fue agitada hasta que la solución cambió de color.

Luego se disolvió en 50 ml de N, N-dimetilformamida anhidra todo el sustrato de 1-bromo,

1-fenil acetaldehído preparado, se agregó en una sola porción.

16

La solución resultante fue lentamente calentada hasta 100 °C con agitación continua por un

período de 3 horas.

La mezcla se dejó reposar por una noche a temperatura ambiente, después se transfirió a un

balón de fondo redondo y el resto del solvente se removió en un rotaevaporador.

Los residuos semisólidos fueron mezclados con 700 mL de agua y extraídos con tres

porciones de 250 mL de éter.

Los extractos etéreos combinados fueron secados sobre sulfato de sodio anhidro y

concentrados en un rotaevaporador. Se tomaron muestras para ser analizadas por Rayos X.

Después de numerosas purificaciones y extracciones cromatográficas, se obtuvieron 3

gramos de sustancia pura 4-oxo-2,4-difenilbutanal y además 3,5-difenil-2,3-dihidrofurano,

que es un excelente precursor para la síntesis de 2,4-difeniltetrahidrofurano (Calyxolano).

Reacción 3: Reducción selectiva de 4-oxo-2,4 difenilbutanaldehido.

A-Reducción con Borohidruro de Zinc (Gensler W. et al. 1960).

Según la reacción propuesta por W. Gensler y colaboradores en su trabajo de compuestos

relacionados con Podofilotoxinas.

Preparación de Zn (BH4)2

Una mezcla de cloruro de zinc anhidro grado “reactivo” (2.0g o 0.015 moles) con 50 mL

de éter (destilado del hidruro de litio y aluminio) se hirvió hasta que la mayoría del sólido se

disolvió.

La mezcla se dejó reposar y el líquido sobrenadante se decantó cuidadosamente del material

insoluble.

La solución etérea de cloruro de zinc se añadió gota a gota y a temperatura ambiente a una

suspensión agitada de 1.4g de borohidruro de sodio 96% (0.069 moles) en 75 mL de éter

absoluto. Luego se dejó en agitación toda la noche.

El sólido se dejó asentar y el líquido se removió por decantación.

Ésta solución etérea de borohidruro de zinc se guardó en una botella sellada a 5°C.

Luego se realizó el Test de Tollens (AgNO3) a una muestra, para la verificación de cloruros,

resultando negativa la prueba.

B-Reducción (Pág. 27 Libro II)

De la solución de Zn(BH4)2 previamente preparada se tomaron 80 mL y se añadieron a la

solución de la cetona (0.24 mmoles) preparada en 5 mL de benceno seco y 30 mL de éter

seco.

Después de 24 horas a temperatura ambiente, la mezcla se trató con 4 mL de agua y cuando

mostró desprendimiento de gas, se agitó con 1.5 mL de ácido acético glacial en 4 mL de

agua.

17

La capa etérea fue separada y la capa acuosa diluida con agua a un volumen de 30 mL,

después se extrae con cloroformo.

El cloroformo y la solución de éter se lavan dos veces con agua, luego se secan con sulfato

de magnesio y después se elimina el solvente por rota- evaporación.

Los cristales resultantes fueron colectados y recristalizados en metanol, el rendimiento

reportado en la literatura original fue de 82 %.

Reacción 4: (P. 41, L II) Ciclación de 1,3-difenilbuta-1,4-diol (Negri, J., Paquete, L.

1992).

El diol (1.5g) se calentó a reflujo en atmósfera de Argón en tolueno seco (100 mL)

conteniendo una cantidad catalítica de ácido p-toluensulfónico en un reactor extractor

Soxhlet que contiene CaH2 para remover el agua.

Después de 16 horas, la mezcla de reacción se enfría y mezclada con éter (30 mL) y saturada

con solución de NaHCO3 (30 mL).

La fase orgánica es lavada con agua y solución salina, secada y evaporada.

El acetal puro se obtiene por destilación bajo presión reducida, obteniéndose entre un 80-90

% de rendimiento o separando por cromatografía en sílica gel (26 % aproximadamente).

64.5 g (0.28 moles) con un volumen aproximado de 70 mL fueron obtenidos de Calyxolano.

Los diastómeros de tetrahidrofurano obtenidos fueron separados cromatográficamente

utilizando Sílica Gel G 60 como fase estacionaria y CHCl3 como fase móvil y luego vía

HPLC en fase normal utilizando n-hexano/Acetato de etilo (98:2) como fase móvil

(Rodríguez, et.al. 1997).

Los porcentajes obtenidos fueron analizados por cromatografía de gases, la identidad de los

compuestos fue obtenida por espectrofotometría de masas y pruebas de grupos funcionales

específicos así como determinación de constantes fisicoquímicas.

Todas las reacciones fueron llevadas a cabo por duplicado.

El porcentaje de Calyxolano obtenido fue de50.9 % de rendimiento, con 64.5 gramos (0.28

moles) de 2,4-difeniltetrahidofurano obtenidos a partir de 0.55 moles de la materia prima

inicial 2-fenilbenzaldehido durante la serie de reacciones efectuadas por duplicado a esta ruta

de síntesis.

Determinación de la actividad inhibitoria contra Acetilcolinesterasa.

Los compuestos a los que se les prueba actividad inhibitoria, se disuelven en metanol y

aplican sobre un sistema de Cromatografía en Capa Fina utilizando como fase móvil una

solución de Acetato de Etilo y n-Hexano en proporción a determinar de acuerdo a la elusión

de los compuestos sintetizados.

Al finalizar el desarrollo de cromatografía, que se realiza en duplicado, se asperja con una

solución de Acetilcolinesterasa. El compuesto que muestre inhibición contra la enzima,

18

mostrará un “halo de inhibición” alrededor de la mancha que identifica al compuesto en la

placa de cromatografía.

Estudio de Parámetros Farmacofóricos.

Utilizando los Programas Computacionales LigandScout® versión 1.03 de Interligand

Inc. y JChem versión 3.2.3 de Chem Axon Inc. se determinaron los parámetros

farmacofóricos “Relative Topological Polar Surface Area”, “Topological Polar Surface

Area” -TPSA-, Número de Átomos Aromáticos, “cLogP”, Número de Átomos Donadores y

Número de Átomos Aceptores de Hidrógeno.

El procedimiento teórico se fundamenta en que la sumatoria de las contribuciones

superficiales de los fragmentos polares de cada molécula, determinadas por los algoritmos

respectivos, son comparados por el método de “mínimos cuadrados” para determinar la

congruencia entre la estructura optimizada geométricamente en tres dimensiones con la

contribución de sus fragmentos polares a su “fijación” en el sitio activo de una enzima en

particular.

La estructura de las dos moléculas sintetizadas fueron minimizadas utilizando el Algoritmo

RM1, re-parametrización de AM1 contenido en el Programa Spartan for Windows 2006

(G.B. Rocha, R.O. Freire, A. Simas and J.J.P. Stewart, J.Computational Chem. 2006, 27,

1101) de Wavefunction Inc.

De cada uno se calcularon, entre otros, los siguientes parámetros:

Energía de Formación

Momento Dipolo

Distancia entre cada uno de los enlaces de la molécula

Distancia espacial entre átomos de la molécula

Densidad Superficial

Highest Occupied Molecular Orbital -HOMO-

Lowest Occupied Molecular Orbital -LUMO-

Los parámetros farmacofóricos estudiados fueron:

C log P (Índice de Solubilidad en n-octano)

TPSA (Topological Polar Surface Area)

Número de Aceptores de Protones

Número de Donadores de Protones

Número de Negativos Ionizables

Número de Positivos Ionizables

Relación átomos/enlaces

19

Número de Anillos

Enlaces Rotables

Átomos Aromáticos

Estas propiedades se calcularon utilizando los siguientes programas informáticos:

LigandScout v. 1.03, (No. de Serie: 14520307730892251293) de InteLigand S.A.

basado en: G. Wolber and T. Langer. LigandScout: 3-D Pharmacophores Derived

from Protein-Bound Ligands and Their Use as Virtual Screening Filters J. Chem. Inf.

Model; 2005; 45(1); 160-169.

Peter Ertl, Bernhard Rohde, Paul Selzer. Fast Calculation of Molecular Polar Surface

Area Directly from SMILES. Novartis Pharma AG, ChemInformatics, CH-4002,

Basel, Switzerland. Basado en: Ertl, P., Rohde, B., Selzer, P. Fast calculation of

molecular polar surface area as a sum of fragment based contributions and its

application to the prediction of drug transport properties. J. Med. Chem. 2000, 43,

3714-3717.

20

PARTE II

MARCO TEÓRICO

Calyxolanos.

Compuestos del tipo C6-C4-C6, son una familia muy escasa de productos naturales,

derivada biogenéticamente de la ruta biosintética de los Policétidos o bien de la ruta mixta

Policétido-Shikimato (Manito, P. 1981).

El primer reporte sobre la elucidación estructural de este tipo de compuestos aparece en 1955

con el aislamiento de agrimólido de una especie de plantas de la familia Euphorbiacea

(Yamato, M. 1959).

Gráfica 4. Estructura de Agrimolido.


Existen pocas publicaciones que describen la estructura de este tipo de compuestos, siendo el

“Handbook of Naturally Ocurring compounds” (Devon, T.; Scott, A. 1975) de Devon y Scott

en 1975, el que presenta la estructura de cinco de estos compuestos, entre ellos el 1,4-difenil-

2,3-butenodiol en 1963. Sin embargo, no existen reportes de su actividad biológica.

Gráfica 5. Estructura de 1-4 difenil-2,3-butanodiol.


De fuentes marinas, el dibromo derivado Colpol (Green, D., Kashman, Y. 1993), fue el

primer compuesto C6-C4-C6 reportado de un invertebrado marino,

aislado del alga

Colpomenia sinuosa colectada en el Mar Rojo y su estructura química elucidada vía

Resonancia Magnética Nuclear y Espectrometría de Masas.

Colpol mostró citotoxicidad in vitro contra líneas células cancerígenas a niveles de

concentración inhibitoria media (IC50) de 10 g/mL.

21

Gráfica 6. Estructura de Colipol.


Metabolitos secundarios marinos que poseen el anillo oxolano son comunes.

Como ejemplos podemos citar (ver Gráfica 7) el tetrahidrofurano 2,2,5-trialquil sustituido

aislado de la esponja Chondrosis collectrix (k) (Warren, R. et al. 1980) y análogos 2,5-

dialquílicos (l) de las algas cafés Notheia anomala (Fukuzawa, A. et al. 1989) y Laurencia

nipponica (Stierle, D., Faulkner, J. 1979).

Los compuestos sintéticos cis-2,5-difenil-tetrahidrofurano (m) (CAS 50637-09-07)

trans-2,5-

difenil-tetrahidrofurano (n) (CAS 50637-10-07) y 2,3-difenil-tetrahidrofurano (o) (CAS

108428-80-40), son los compuestos estructuralmente más parecidos a los Calyxolanos A y B

encontrados en la literatura.

Gráfica 7. Estructura de Compuestos difenil tetrahidrofuránicos.


22

Las esponjas marinas son un primitivo grupo de organismos multicelulares, cuyo origen se

remonta a unos 1.6 mil millones de años en la Era Paleozoica.

Son “filtros” que inhalan agua a través de sus numerosos poros ubicados en su exoesqueleto.

Los poros llevan a un sistema de canales interno que permea a todo el organismo de la

esponja, exhala al exterior por sus ósculas. Todo este sistema es ayudado por un movimiento

ciliar, permitiendo que partículas microscópicas de nutrientes, como bacterias y microalgas

sean ingeridos.

Sin embargo y no obstante su primitiva estructura, son los invertebrados marinos que mayor

número de metabolitos secundarios produce (Blunt, J. et al. 2011), por lo que su estudio

químico se ha incrementado en los últimos años.

De la esponja Calyx podatypa de Laubenfels (clase Demospongiae, orden Haplosclerida,

familia Oceanapiidae), se ha reportado el aislamiento y elucidación estructural de varios

tipos de metabolitos secundarios, especialmente esteroles (Doss, G. A., Djerassi, 1988),

péptidos cíclicos de prolina y dicetopiperazinas (Adamczeski, et al. 1995) además de una

serie de compuestos piridínicos 3-sustituidos (Stierle, D.; Faulkner, D. 1991) y ácidos grasos

noveles (Carballeira, N. et al. 1998, Carballeira, N.; Pagan, M. 2000).

Dentro de éstos metabolitos, los Calyxolanos (dos tipos conocidos, cis y trans reportados por

primera vez en el año 1997 (Rodríguez, A. et al. 1997) referidos también como Calyxolanos

A y B respectivamente), y las Calyxaminas A y B (Rodríguez, A. et al. 1997b) noveles

alcaloides 2,2,6,6-tetrametil-piperidínicos, se encontró que poseían efecto inhibitorio sobre la

enzima Acetilcolinesterasa (Cóbar, et al. 2005), cobrando desde entonces importancia cómo

potenciales fármacos contra la Enfermedad de Alzheimer.

La Enfermedad de Alzheimer es un tipo de demencia que se genera comúnmente en las

personas de la tercera edad, y que es bien conocida por incrementar la pérdida de memoria.

Está asociada a varios factores (entre ellos la activación de genes PSEN1, PSEN2 y APP);

también al desorden enzimático (Jagua, A., Avila, A. 2007) derivado por la mala señal que

produce la resistencia a la insulina en las neuronas, a la acumulación de la proteína beta–

amiloide y la pérdida de neurotransmisores. Consecuentemente éstas mueren por apoptosis

(falta de señal neurotrófica) (Yates, D. 2008, Einsentein, M. 2011).

La pérdida del neurotransmisor Acetilcolina, por causa de exceso de actividad de la enzima

que lo hidroliza (Acetilcolinesterasa), provoca la inconexión interneuronal y posteriormente

la muerte de la neurona.

Esto se manifiesta como una atrofia cerebral progresiva, por lo que ocurre pérdida progresiva

de la memoria, de las habilidades psicomotrices y posteriormente de la lucidez mental,

produciendo finalmente la muerte.

Dada la gran cantidad de personas que son afectadas por ésta enfermedad (16,582 casos

confirmados y reportados en Guatemala hasta 2005, según la Asociación Guatemalteca

contra el Alzheimer, 2006), 24 millones de casos a nivel mundial con una estimación de

crecimiento a 81 millones para el año 2040 (Alzheimer´s Desease Internacional, 2007), la

cura ha cobrado importancia al representar esto cerca del 50 % de los casos de demencia

senil humana.

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=PSEN1&action=edit

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=PSEN2&action=edit

http://es.wikipedia.org/wiki/APP

23

Los fármacos, inhábiles de resolver una cura definitiva dado el origen de la enfermedad,

optan por atacar los factores que dan progreso a sus síntomas, entre ellos, inhibir la

Acetilcolinesterasa, lo cual se ha demostrado que tiene un efecto retardante significativo, en

el progreso global de la enfermedad.

Otros fármacos han sido aplicados a los pacientes desde los comienzos de los estudios sobre

Alzheimer, pero los efectos secundarios adversos son notables, esto ha impulsado al

desarrollo de nuevos medicamentos (Sakka, P. et al. 2007, Farlow, M.; Cummings, J. 2007,

Van Dick, Ch. et al. 2007) con el fin de hacer los tratamientos más tolerables al paciente,

pero no todos los grupos de pacientes resisten, toleran o aceptan los diversos medicamentos

por cuestiones fisiológicas.

Calyxolano B ha sido sintetizado por Carretero y colaboradores en 1998 (Carretero et.al.

1998) vía el uso de reacciones de Heck asimétricas, obteniéndose 68 mg del compuesto puro,

en 2005 por Piras y colaboradores (Piras, P. et al. 2005) de la Universidad de Cagliari en

Italia, utilizando reacciones de Corey-Ilido y Hilt y colaboradores de la Universidad de la

Universidad de Phillips en Marburg, Alemania (Hilt, G., et al. 2005) sintetiza Calyxolanos A

y B vía una expansión anular intermolecular utilizando bromuro ferroso como catalizador.

En todos los casos, el objetivo primario era probar la metodología y no sintetizar dichos

compuestos, por lo que no se les realizan pruebas de su actividad biológica.

Farmacóforo se define como un conjunto de aspectos químicos estructurales de una

molécula, que es el responsable de su actividad biológica específica.

Este grupo es el responsable de la interacción de la molécula con su ligando en el sitio activo

de la macromolécula con la que interactúa (Ekins, S. 2006).

Un farmacóforo representa una función química, que es válida para cualquier molécula que

la posea y para la actividad biológica específica.

Recientemente, con el avance de la tecnología informática y de software, se han diseñado

métodos “in sílico” que permiten determinar una serie de parámetros de cualquier molécula o

serie de moléculas con una sub-estructura química en común y que posean similar actividad

biológica (Vogel, H. et al. 2006).

El modelaje farmacofórico se ha convertido en una herramienta útil para predecir actividad

biológica específica de moléculas orgánicas, reduciendo tiempo y dinero previo a su

investigación “in vivo” como potenciales fármacos (Taha, M. et al. 2008).

Los parámetros farmacofóricos determinados de las moléculas sintetizadas son; “Relative

Topological Polar Surface Area”, “Topological Polar Surface Area” -TPSA-, Número de

Átomos Aromáticos, “cLogP”, Número de Átomos Donadores y Número de Átomos

Aceptores de Hidrógeno, todo ello para tener una idea de su capacidad para acomodarse al

sitio activo de enzimas cuyas estructuras ya se encuentran elucidadas y pueden obtenerse en

la base de datos de “Protein Data Bank” (base de datos de libre acceso).

“Topological Polar Surface Area”, se define como la suma de las contribuciones

superficiales de los átomos polares de la molécula (usualmente Oxígenos, Nitrógenos y los

Hidrógenos unidos a ellos).

24

Estudios “in silico” han mostrado que sus resultados correlacionan bien con sus propiedades

de transporte como absorción intestinal o penetración en las barreras cerebrales sanguíneas

(Erlt, P. 2000).

El número de donadores y aceptores de Hidrógeno, el peso molecular y el “Coeficiente de

Partición n-octanol/agua” (cLogP) permiten predecir, mediante sus “Propiedades de

Lipinski”, su capacidad para unirse a donadores y aceptores de Hidrógeno en los sitios

activos de enzimas y su capacidad para absorberse oralmente, ya que está relacionado con su

solubilidad e influencia su habilidad para penetrar entre membranas celulares, incluyendo

aquellas de los epitelios intestinales (Lipinski, C. et al. 1997, 2001).

25

PARTE III

III.1 Resultados

Ruta de Síntesis No.1

Primera Reacción: Formación de 2-bromo-1-feniletanol.

Al producto de la bromación del estireno (2-bromo-1-1feniletanol), se le practicó

cromatografía en columna para su purificación y los extractos más relevantes fueron

analizados por espectroscopia infrarroja, la cual reveló los picos descritos en la Tabla R1.

Tabla 2 RS1 R1 Espectro IR

Picos Esperados (cm-1

) Picos Observados (cm-1

) Identidad

3610-3670 (la concentración

de la muestra ensancha la

absorción y la mueve a 3200-

3400 cm-1

)

3434, 3565 (La muestra se

observa ensanchada en esta región)

O-H de Alcoholes y fenoles

2850, 2925 2887, 2960 Metileno

3080 3089 Vinilo CH2

2975 3034 Vinilo CH2

1960, 1816

1702

1600 1604 C=C aromático

1470 (fuerte) 1478, Metileno

1450, 1500, 1580 1453, 1493, 1580 C=C Aromático

1220 1216 Éter

1050±10 1060, 1035 C-O Alcoholes primarios

990 989 Alqueno mono sustituido

900, (ambos fuerte) 916 Alqueno mono sustituido

854

700-750, y 700±10 761 Benceno Mono sustituido

De izquierda a Derecha: Picos Esperados: Son los picos reportados en la literatura para

grupos funcionales que se esperan en esta muestra o que podrían estar presentes. Picos

Observados: Son los picos que están presentes en la muestra analizada. Identidad: Si los

picos Esperados coinciden con los picos observados, una identidad como grupo funcional es

asignada a este pico.


Punto de ebullición para la muestra a Presión ambiente.: 198-200 °C

(Corregido: 197.82- 199.82)

26

Segunda Reacción: Adición Nucleofílica sobre 2-Bromo-1-feniletanol (Pág. 69, Libro

No.1).

Pruebas Químicas en Reacción 1 De Tosilatos.

Posterior a la obtención de 2-bromo-1-feniletanol, se realizó la adición de tosilato con

cloruro de tosilo sobre el alcohol de 2-bromo-1-feniletanol.

Se obtuvieron 18.52 gramos (0.052 moles) de producto tosilado (de 0.075 moles, 15 gramos

de bromo feniletanol) que resultó en un 69.33 % de rendimiento respecto a su reacción, y %

rendimiento global: (estireno 31 mL, 0.27 moles) 18.51 %.

Para el producto de la sustitución nucleofílica 3 gramos (0.01 moles) de 2,5-difenil-2,3-

dihidrofurano purificado que representa un 5 % de rendimiento Global, y se le practicó las

siguientes pruebas:

Reacción por duplicado 15.1 gramos de producto con tosilato. (P. 94 L 1).

Tabla 3 RS1 R2 Pruebas de solubilidad.

Muestra Solubilidad en Éter

Solubilidad en Hexano

Solubilidad en Agua

Solubilidad en CH3Cl

Extractos del sólido Filtrado

+ - - +

Extractos del Líquido Filtrado

+ - - +


Estas pruebas se realizaron con dos objetivos, el primero identificar la solubilidad de la

mezcla para su purificación e identificación mediante cromatografía en columna,

cromatografía en capa fina y gases.

La segunda para identificar el cambio de las propiedades de solubilidad del compuesto como

una prueba complementaria para demostrar el producto de reacción, desde que el cloruro de

para-toluensulfonilo y el sustrato 2-bromo-1-feniletanol son solubles en agua.

Puede observarse que en efecto los extractos de la mezcla poseen propiedades diferentes a

las de los reactivos.

Tabla 4 RS1 R2 Puntos de fusión.

Muestra Punto de Fusión

Extractos del sólido Filtrado 63-65 °C

Extractos del Líquido Filtrado 64-67 °C

Acido para-toluensulfónico 106-107 °C

Cloruro de Tosilo 69-71 °C Fuente: FODECYT 38-2008.

A la mezcla del producto de la reacción Nucleofílica 4-bromo-1,3-difenilbutanona, se le

tomó punto de fusión.

27

Los puntos de fusión para este producto no se encuentran reportados, pero la diferencia con

sus reactivos es una prueba complementaria para demostrar su obtención.

Gráfica 8 RS1 R2 TLC1

Correlativa a Código 40909, Izquierda (ver anexos). La identificación de cada posición

de izquierda a derecha es:

1-Estireno

2- Acido para-toluensulfónico

3- Eluato No.1

4- Eluato No.2

5- Eluato No.3

6- Eluato No.4

7- Eluato No.5


A la primera cromatografía en columna, se le practicó una cromatografía en capa fina para

determinar la presencia de productos de reacción, pueden observarse la presencia de diversas

sustancias en la placa cromatográfica como puntos.

La identidad de cada línea se describe en la columna derecha.

Obsérvese la 4ta. Posición de izquierda a derecha, esta fracción posee los productos de

reacción, por lo cual a esta fracción se le practicó una nueva cromatografía TLC (Ver

Anexos Cod. 40909).

28

Gráfica 9 RS2 R2 TLC2

Diagrama de la Placa Código 071009 La identificación de cada posición de

izquierda a derecha es:

1- Acido para-Toluensulfónico

2- Acetofenona

3- Eluato 1

4- Eluato 2

5- Eluato 3

6- Eluato 4

7- Eluato 5

8- Eluato 6

9- Eluato 7


La separación definitiva del eluato No.2 rindió la purificación de los compuestos que

posteriormente se analizaron por Fluorescencia de rayos X, Espectroscopía Infrarroja y

Espectrometría de Masas para su identificación inequívoca.

De las posiciones en esta muestra son de alta relevancia el Eluato 3 (Posición No. 5 de

izquierda a derecha) y el Eluato 5 (Posición 7 de izquierda a derecha).

Tabla 5 RS1 R2 Espectro IR

Ver Gráficas 39 y 40.

Muestra disuelta en hexano FRACCION No.3 Sustitución Nucleofílica 22102009-13102009.

PICOS ESPERADOS

cm-1

Identidad Picos Obtenidos en Hexano

cm-1

Picos Obtenidos en Benceno

cm-1

3070 Benceno sustituido Cubierto probablemente

3020,3090

2860, 2960 metilo, fuerte -medio

2860, 2920, 2950, medio y fuerte

1950, 1800

1685 C=O a/b insat, aromática

1690 1690

1670 C=C trisustituido débil

1670 débil

1600 C=C conjugado, aromático

1600 1600, 1650

1460 Metilo fuerte 1450 más fuerte 1460 medio 1510, 1690

1380 Metilo débil 1380 débil 1350 débil 1220 -1260 Éter Aromático 1250 1250 1120 Éteres 1180 bencenos 1180

29

substituidos

800-840 Alqueno trisustituido

800,,820, 890, 950 950,1020

700-750 (fuerte) Benceno Mono sustituido

700,750 750

Menor de 600 Bromo - Alcano 650, 690, 650

De izquierda a Derecha: Picos Esperados: Son los picos reportados en la literatura para






30

Espectrometría de Fluorescencia de Rayos X.

Fracción No. 3

Elementos presentes: Azufre; Intensidad relativa 100 %, Bromo: Intensidad relativa 7.5 %

Espectrometría Acoplada Gases Masas, Fracción No. 3.

El espectro de masas es el correlativo del 20 de Noviembre de 2009; Calyxolano, Eluato

No.3 del 7 de Octubre de 2009, Scan 2291, (29.569 min) archivo CALIXO03.D, tomado en

la Unidad de Investigación de Fisicoquímica de la Escuela de Química, Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacia, USAC.

La Cromatografía de Gases rindió los siguientes picos relevantes para el eluato No. 3:

Minuto 29.101

Minuto 29.569

Minuto 32.413

Minuto 37.109

De los cuales los picos resultantes para el espectro de masas de cada uno de estos momentos

fueron:

Gráfica 10 MG-MS Eluato No. 3 Min 29.101.

m/z: 222, 221, 207, 195, 178, 165, 151, 136, 125, 117, 116, 115, 105 (100%), 97, 91, 83, 77,

71, 63, 57, 51.


Gráfica 11 GC-MS Eluato No. 3 Min 29.569:

m/z: 223, 222, 221, 207, 193, 178, 165, 145, 131, 123, 115, 105, 97, 91, 83, 77, 71, 63, 57,

51.

31


Gráfica 12 GC-MS Eluato No. 3 Min 32.413

m/z: 155 (100), 156 (8.5), 157 (5), 139, 105, 91, 77, 65, 51.


Gráfica 13 GC-MS Eluato No. 3 Min 37.109

m/z: 342, 341, 340, 327, 284, 253, 221, 207, 177, 161, 149, 127.


32

Tabla 6. RS1 R2 Espectro IR Fracción No. 5.

Muestra disuelta en benceno

PICOS ESPERADOS: cm-1 Identidad Picos Obtenidos: cm-1

3070 Benceno sustituido 3010,3060, 3100

2860, 2960 metilo, fuerte -medio 2850

C=O 1800, 1950

1685 Cetona - insaturada

Metileno 1510

1460 Metilo - metileno 1490

1380 Metilo débil CH3 1390

1220 -1260 Éter Aromático

1160-1140 Sulfonas S=O 1150

1060 S=O 1050

700-750 (fuerte) Benceno Mono sustituido

750, 690

Menor de 700-750 Bromo - Alcano De izquierda a Derecha: Picos Esperados: Son los picos reportados en la literatura para






Espectrometría de Rayos X

Fracción No. 5

Elementos presentes: Azufre (100 %) único presente.

33

Propiedades Farmacofóricas de Calyxolano A y B

Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Calyxolano A.

Propiedad Valor

Fórmula Molecular C16H16O

Peso molecular (umas) 224.303

Calor de Formación (au) -686.247070

LogP 3.70

PSA (Å2) 6.080

No. de Aceptores/Donadores 1/0

Area Molecular(Å2)/Vol. Molecular(Å3) 261.58/251.46

Energía del HOMO (eV) -8.77

Energía del LUMO (eV) 3.99

Anillos 3

Atomos Aromáticos 6

Momento Dipolar (Debyes) 2.14


34

Optimización Geométrica y Propiedades Farmacofóricas de Calyxolano B.

Propiedad Valor

Fórmula Molecular C16H16O

Peso molecular (umas) 224.303

Calor de Formación (au) -686.240009

LogP 3.70

PSA (Å2) 6.885

No. de Aceptores/Donadores 1/0

Area Molecular(Å2)/Vol. Molecular(Å

3) 264.41/252.14

Energía del HOMO (eV) -8.82

Energía del LUMO (eV) 3.80

Anillos 3

Atomos Aromáticos 6

Momento Dipolar (Debyes) 2.14


35

2da. Ruta de Síntesis

Resultados:

Reacción1: Formación de 2-bromo-1-feniletanol.

Fluorescencia de Rayos X:

Elementos Presentes:

-Bromo, mayor de 5,800 ppm en muestra.

Cromatografía de Capa Fina

Código: Imagen 1348, fecha 130410, página 172.

Identidad: Bromofenilacetaldehido en acetaldehído.

Fase Móvil: Isoctano-Acetato de etilo 90:10

Muestra Duplicado.

Tabla 7 RS2 R1 TLC

Punto Identidad Rf

Filtrado Original Solución almacenada en balón de 3 bocas.

0.661, 0.645, 0.548, 0.437, 0.387, 0.290, 0.225

Lavados con Ligroína

Solución proveniente de lavados del filtrado con ligroína a 5°C

0.387, 0.290

Precipitado Muestra proveniente del precipitado contenido en el papel filtro diluido con ligroína.

0.000


Reacción 2: Sustitución Nucleofílica de Bromo en Benzaldehído.

Tabla 8 RS2 R2 Difracción de Rayos X:

Fase Elementos Presentes

Intensidad Relativa (ppm)

Mezcla ligroína y resina 10_12_2009:

Br 2544

Fase Ligroína Br 4,154 Fuente: FODECYT 38-2008.

Prueba de Tollens, para verificar Aldehídos y Cetonas

M3a inamisible

M2a inmiscible

M2b – negativo (precipitado blanco) --- prueba hecha en alcohol 95%

M3a – negativo (precipitado blanco).

36

Cromatografía de Capa fina 2da Reacción Síntesis:

Código: Pág. 147 Cromatografía en Capa Fina 10 03 2010.

Imagen 1344, pág. 147, fecha 10032010.

Identidad: Unión de las fracciones de las cromatografías en columna 1 y 2 de la fase etérea.

Fase móvil: Isoctano-acetona 95:5

Frente: 8.2 cm.

Tabla 9 RS2 R2 TLC1

Puntos Descripción Rf

M1 Muestra compuesta de la mezcla de las fracciones 1(primera corrida) y 1 a (segunda corrida)

0.658, 0.500, 0.146,

M2 Muestra compuesta de la mezcla de las fracciones 2,3 (primera corrida) y 2 a (segunda corrida)

0.646, 0.487, 0.317, 0.158

M3 Muestra compuesta de la mezcla de las fracciones 4 (primera corrida) y 3 a (segunda corrida)

0.487, 0.390, 0.268, 0.219, 0.146


0.146, 0.121, 0.073, 0.036


0.439, 0.012

M3a Residuo de la evaporación de M3. 0.353, 0.012 Fuente: FODECYT 38-2008.

Código: Imagen 1357 -imagen suelta- duplicado de la cromatografía 10032010,

La elución y los valores de Rf indican que la Fase móvil puede ser Isoctano-Acetona 90:10.

Tabla 10 RS2 R2 TLC2

Punto Rf

M1 0.827, 0.603, 0.413, 0.241, 0.172, 0.138, 0.103

M2 0.827, 0.603, 0.517, 0.379, 0.172,

M3 0.603, 0.482, 0.517, 0.310, 0.275, 0.241, 0.172

M4 0.448, 0.344, 0.206, 0.206, 0.051

M5 0.448 Fuente: FODECYT 38-2008.

Código: Imagen 1355, fecha 190410, página 179-180

Identidad: Producto de 2da reacción para producir Benzaldehído de Acetofenona.

Fase Móvil: Isoctano – Acetato de etilo 90:10. Frente: 6.2 cm.

37


Punto Identidad Rf

Muestra 2 (M2) Muestra original Aceitosa, proveniente de las fracciones 2 y 3 de la primera cromatografía de la fase etérea; y fracción 2 a de la segunda cromatografía de la misma fase etérea.

0.661, 0.613, 0.194,0.016

Muestra 2 separada

Muestra No.2 después de haber sido separada por cromatografía en columna en sus fracciones hijas (M2a, M2b, M2b1, M2b2, M2b3 y M2b4) y unirlas posteriormente en un tubo de ensayo para análisis por CG-MS.

0.613, 0.194,0.016


Código: Imagen 1345, fecha 10032010, pág. 148

Identidad: Separación de M4 y M5 por TLC

Fase móvil: Isoctano-Acetato de etilo 50:50


Punto Identidad Rf

M4 Fracción 5 Primera cromatografía en columna, Fracción 4a, Segunda cromatografía en columna.

0.678, 0.535, 0.317, 0.428, 0.392, 0.357, 0.321, 0.285, 0.250

M5 Fracciones 6 Primera corrida en columna y 5 a Segunda cromatografía en columna.

0.678, 0.0178

M5a Fase oleosa obtenida de la M5 por evaporación.

0.0357


Imagen 1351, Página 157, Fecha 18032010.

Cromatografía de capa fina a las muestras hijas:

Identidades de 1351: Separación de Muestras Hijas

Fase móvil: Isoctano-acetato de etilo 95:5

Frente: 9.8 cm

38


Punto Identidad Rf

M1a Muestra1 fracción 1 0.510, 0.306

M1b Muestra 1 fracción 2 ---

M1c Muestra 1 fracción 3 ----

M2a Muestra 2 fracción 1 0.571, 0.489, 0.408, 0.285

M2b Muestra 2 fracción 2 0.469, 0.285, 0.204, 0.163, 0.102

M2b1 Muestra 2 fracción 2 parte 1 ** 0.102

M2b2 Muestra 2 fracción 2 parte 2 0.010



M3a Muestra 3 fracción 1 -----

M3b Muestra 3 fracción 2 ----

**(Relativo a los tubos de ensayo donde se almacenaron)


Cromatografía de Gases acoplada a Espectrometría de Masas.

Producto de las cromatografías de columna obtuvieron 3 fracciones principales cuyo análisis

mostró los siguientes resultados:

Tabla 14 RS2 R2 GC-MS

Muestra Composición

(Fracciones de

elución por

Cromatografía en

Columna)

Patrón de Espectro de Masas

Muestra 1 1, 1 a (M1a, M1b) 223(1.4 %), 222(25%), 221(50%), 207, 193, 178,

145, 131, 115, 105, 97, 91, 83, 77(100 %), 71, 63, 57.

Muestra 2 M2 (M2a, M2b1,

M2b2, M2b3)

223(1.4 %), 222(25%), 221(50%), 207, 191, 178, 165

145, 131, 115, 105, 91, 83, 77(100 %), 63, 51, 43.

Muestra 3 3 a, 4 (M3a, M3b) 221(8%), 220(75%), 119(2%), 191, 165, 115, 105, 95,

89, 83, 77(100 %), 63, 57, 51, 43.


Tabla 15 RS2 R2 GC-MS Comparación de Patrones:

Muestra Patrón de Espectro de Masas

Muestra 1 223, 222, 221, 207, 193, 178, 145, 131 115, 105, 97, 91, 83, 77, 71, 63, 57.

Muestra 2 223, 222, 221, 207, 191, 178, 165 145, 131, 115, 105, 91, 83 77, 63, 51, 43.

Muestra

1RS1

223, 222, 221, 207, 191, 178, 165, 145, 131, 115, 105, 97, 91, 83, 77, 71, 63,

57, 51.

Muestra 3 221, 220, 119, 191, 165, 115, 105, 95, 89, 83, 77, 63, 57, 51, 43.


39

Resultados del Análisis de los Espectros de Masas, M1-M3:

Posibles identidades de M1 y M2:

Ante la similitud de la descomposición de los espectros, la idéntica masa molecular en el

ion molecular y tomando en cuenta que estos compuestos provienen de la misma mezcla de

reacción, se estima que se trata de isómeros estructurales.

No ha sido posible identificar con certeza la identidad de M1 y M2, lo cierto es que su

espectro no corresponde al producto esperado. De cualquier manera, dos posibilidades se

plantean como posibles estructuras:

1- El pico 221 no es el ion molecular sino el producto de una descomposición

intramolecular producida dentro del espectro de masas, en tal caso, M-1 es una posibilidad,

por lo que la masa molecular real probablemente sería 222, que puede presentar las

siguientes estructuras:

Gráfica 14 Posibles identidades de M1 y M3


2- Un producto aminado: La masa del ión molecular (221 umas) por ser impar, y

siguiendo la regla del Nitrógeno para análisis del Espectro de Masas, sugiere la presencia de

N. Sin embargo en la reacción no se trabajó ningún compuesto nitrogenado excepto el

solvente, el cual fue recomendado por el mecanismo de reacción investigado y está

comprobado para su uso en este tipo de reacciones. De cualquier forma, una estructura

coincidente con esta masa sería del tipo:

Gráfica 15 Calyxolano A


40

Gráfica 16 Muestra 3 (M3):


Reacción 3: Reducción de cetonas a alcoholes.

Prueba de AgNO3 para evaluar el estado de Zn(BH4) resultó negativo.

Prueba de Lucas para determinación de presencia de Alcoholes 1°, 2° o 3°: Reacción

Inmediata. Aparente presencia de alcohol terciario.

2,4- DNF – No hay reacción.

4,2-DNF + Acetona, alcohol: Precipitado amarillo.

La muestra fue soluble en Bisulfito de Sodio: Debería de haber aldehídos presentes.

En la Prueba de Lucas, se deshidrata alcoholes en la medida que un catión es estable en la

posición del alcohol. Por lo que el catión formado es muy estable, la reacción fue inmediata.

Reacción 4: Ciclación usando Cloruro de Tosilo.

Peso : 64.5 g

Volumen: aprox. 70mL Sólido Color: café obscuro Espectro de masas para confirmar

Gráfica 17 Calyxolano A


41

III.2 Discusión de Resultados.

Ruta de Síntesis No.1.

Formación de 2-bromo-1-feniletanol.

Análisis de la Tabla 3 (RS1 R1 Espectro IR).

Para una comprensión de la procedencia de los picos y el análisis realizado al espectro, es

necesario observar la Gráfica 35 (Sección de Anexos: Espectros IR para 2-bromo-1-

feniletanol).

La identidad de 2-bromo-1-feniletanol queda confirmada a través de la presencia de los

grupos funcionales para alcohol en la muestra, pico 1060 Tabla R1 y la presencia de los

picos para metileno 2850, 2925 cm-1

, es evidente que la muestra está contaminada con

estireno.

Una prueba confirmatoria se ha obtenido a través de la obtención del óxido de estireno

formado a partir de 2-bromo-1-feniletanol obtenido.

El punto de ebullición fue de 197.82 °C mientras que el reportado es 194 °C (The Merck

Index). Debido a que la muestra aún presentaba contaminantes se estima normal la diferencia

de temperatura entre ambos datos.

Por lo anterior, se puede concluir que se obtuvo 2-bromo-1-feniletanol. De hecho, las

muestras analizadas por barrido de rayos X revelaron posteriormente la presencia de Bromo

en las muestras tratadas con Tosilatos.

Reacción 2: Formación 4-bromo-1,3-difenilbutan-1-ona y Sustitución Nucleofílica.

Pruebas químicas en reacción 1 de tosilatos.

La reacción de tosilatos se ejecuta en dos partes, en la primera es agregado el cloruro de

tosilo y la segunda parte consiste en la sustitución nucleofílica de ese grupo tosilo.

Las pruebas químicas de esta sección únicamente se ejecutaron con el fin de establecer que

se había obtenido el producto tosilado, el cual es un producto inestable por lo cual se

consideró como intermediario de reacción y no se le ejecutaron pruebas espectrofotométricas

determinantes. Las pruebas realizadas fueron suficientes para comprobar que la reacción se

había ejecutado exitosamente.

Las tablas 4 y 5 muestran las diferencias de solubilidad y para puntos de fusión entre el

intermediario tosilado y el ácido para-toluensulfónico.

Dado que el primer producto obtenido 2-bromo-1-feniletanol y el cloruro de tosilo

reaccionan y son solubles en agua, y el producto de reacción obtenido no lo es, se puede

concluir que las propiedades químicas han cambiado, y esto es debido a que los grupos

formadores de Puentes de Hidrógeno en los productos ahora pasan a formar enlaces

covalentes entre sí, siendo incapaces de ser solubles en agua, pero a pesar de esto, por los

42

grupos fuertemente polares que poseen, su solubilidad en éter es aceptable pero no en

hexano, la misma tendencia es observada con el cloroformo.

Dado que la muestra no puede ser cloruro de tosilo, se estima que al menos el punto de

fusión de los extractos no se identifica con el ácido para-toluensulfónico o su respectiva

forma halogenada.

Reacción 2 de tosilatos.

El residuo obtenido posterior a la destilación del solvente de la mezcla, fue analizado por

cromatografía de capa fina de las Gráficas 8 y 9 (códigos 040909 y 071009 en sección de

Anexos).

La cromatografía 040909 fue obtenida como primera elución de la mezcla de reacción de

sustitución Nucleofílica. Puede observarse que la posición No. 4, que es el eluato No. 2

revela numerosos compuestos, por lo cual la placa cromatográfica código 071009 fue creada

para separar estos compuestos, de la cual se obtuvieron 7 diferentes fracciones. (Gráfica 8).

En la Gráfica 9, el eluato No. 3 y No. 5 se les dio relevancia debido a sus concentraciones

relativas de Bromo y Azufre obtenidas por espectrometría de rayos X, por lo cual también les

fue practicada a estas fracciones espectrometría Infrarroja y Cromatografía de Gases

acoplada a Espectrometría de Masas, para la determinación inequívoca de las especies.

Mediante el análisis infrarrojo se determinó que el eluato No. 5 no era relevante pues no

presentaba grupos funcionales de interés, sin embargo el eluato No. 3 presentó productos de

interés que se describen a continuación.

Para comprender los espectros infrarrojos se utilizó modelaje molecular in silico usando

cálculos teóricos semi empíricos tipo AM1, los resultados de estos cálculos se presentan en

las Gráficas 35 y 38.

En la Gráfica 38, los espectros teóricos muestran un pico intenso cercano a 2000 cm-1

, pero

este pico esta desproporcionado puesto que debería interpretarse como la interacción

carboxilo-anillo aromático, la cual crea en espectros reales, una señal débil alrededor de 2000

cm-1

.

En los espectros de las muestras obtenidas experimentalmente, el pico en 1700 cm-1

es

determinante para la presencia de cetonas, sin embargo este pico en 1700 cm-1

pertenece a la

contracción C-O por lo cual podrían presentarlo también éteres y ésteres.

Por otra parte el pico en 2000 cm-1

que es típico de cetonas si aparece en los espectros

teóricos, pero no aparece para la muestra experimental tomada en hexano y en la muestra

tomada en benceno aparece un pico en 1950 cm-1

.

A pesar de la existencia de picos debajo de 700 cm-1

que evidencian Bromo en los espectros

tomados, el equipo de espectrometría infrarroja no ha sido programado para leer esta región.

Se presentan picos débiles alrededor de 1000 cm-1

pero estos no pueden por si solos ser

determinantes para la presencia de Bromo, además los espectros de masas no parecen

coincidir con la presencia de este elemento, como se detalla más adelante. Bien podría ser

posible suponer que en los espectros de masas ha ocurrido una previa ionización en el

carbono terciario que posee el Bromo.

43

Gráfica 18 4-bromo-1,3-difenilbutan-1-ona


Haciendo posible la salida del bromo, sin ser detectado por los espectros de masas, sin

embargo, la descomposición debería llevar a una degradación radicalar lógica:

Gráfica 19 Posible ionización de 4-bromo-1,3-difenilbutan-1-ona


Dicho patrón no se observa en los espectros de masas obtenidos por el contrario, se

encuentran picos en 222, 145 y 207 cm-1

, el pico a 207 cm-1

no posee fácil explicación a

través de estas estructuras, lo cual guía a pensar en nuevos isómeros estructurales.

Aparentemente la Fracción No.3 se encontraba mezclada con 2 sustancias como se muestra

en la placa cromatográfica código 07102009. Esto explica la presencia de azufre en la

muestra, y carencia de bromo.

A su vez, la correlación con el espectro de masas el cual muestra tres compuestos, uno de

ellos evidentemente azufrado y el cual muy probablemente se trata de ácido para-

toluensulfónico que está presente en gran cantidad, seguramente como subproducto de la

sustitución nucleofílica.

Este contaminante ha provocado algunos picos incoherentes tanto en el Eluato 3 como en el

5. De cualquier manera, el segundo compuesto presente en esta muestra parece ser

Calyxoleno, según el análisis del espectro de masas.

44

El espectro de masas en cuestión es el correlativo del 20 de Nov de 2009 Calyxolano, Eluato

No.3 del 7 de Oct de 2009, Scan 2291, (29.569min) archivo CALIXO03.D, tomado en la

Unidad de Investigación de Fisicoquímica de la Escuela de Química, Facultad de Ciencias

Químicas y Farmacia, USAC, cuyos picos característicos son M-Z: 222, 221, 207, 178, 145,

131, 115, 105, 91, 77, 63, 51.

En este mismo espectro se observa también en el minuto 29.101 un patrón muy semejante

pero finalmente diferente al presente en 29.569.

Una de las diferencias elementales está en los picos del ión molecular 222 y 221 donde 222

es de mayor intensidad. Debido en esta reacción no se trabajó con Nitrógeno excepto el

solvente NN-DMF se considera que el peso molecular de la muestra es 222 y no 221, puesto

que la reacción del reactivo con el solvente es poco probable y no conducente a estructuras

aparentemente lógicas.

Por ello, se estima que la presencia del pico 221 es debida antes bien a la pérdida de un H

semejante a lo que ocurre durante el impacto electrónico en aldehídos, pero en este caso el

hidrógeno puede ser ya sea o alfa si se trata de un éter o en posición gamma si se trata de una

cetona, debido a que no se trabajó con aldehídos en esta reacción.

Por tanto, y tomando en cuenta la semejante en los patrones de descomposición, así como el

pico en 207, se estima que 29.569 y 29.101 pueden ser isómeros de una estructura cíclica,

como Calyxoleno.

El mecanismo de reacción que se propone para la obtención de este producto es el siguiente:

Gráfica 20 Mecanismo de reacción para Calyxoleno


45

La conversión de 3,5-difenil-2,3-dihidrofurano (Calyxoleno) en 2,4-

Difeniltetrahidrofurano (Calyxolano) puede tomar lugar mediante la reacción de reducción,

que se propuso en esta serie de síntesis:

Gráfica 21 Reducción de Calyxoleno con Zn (BH4)2


Sin embargo se decidió continuar con la segunda ruta de reacción en este punto, debido al

bajo porcentaje de rendimiento alcanzado.

Este bajo rendimiento no está directamente asociado con el proceso de la reacción, sino

porque el intermediario 2-bromo-1-feniletil 4-metilbenzensulfonato sufre descomposición

debida a la temperatura por perdida del grupo para-toluensulfonilo para dar lugar a otros

subproductos, lo cual se puede apreciar en un cambio de color a través del tiempo, debido a

que el potencial eléctrico entre los carbonos 1 y 2 del 2-bromo-1-feniletil-4-

metilbenzenesulfonato es muy semejante.

Gráfica 22 2-bromo-1-feniletil 4-metilbenzenesulfonato


Se llegó a la conclusión de que esta reacción no era apta para obtener elevados porcentajes

de rendimiento de Calyxolano.

Aunque en esta serie de síntesis se demostró que en efecto Calyxolanos pueden ser obtenidos

con este método, por los motivos anteriores se decidió suspender en este punto esta serie de

síntesis para dar lugar a la 2da Ruta de Síntesis, la cual ha rendido mejores resultados.

De hecho, se estima que la fracción 3 analizada, puede también contener 1,4-difenilbut-3-en-

1-ona, el cual puede surgir como un producto de sustitución en bromo y no en el carbono con

el grupo tosilo, generando posteriormente por simple descomposición, la pérdida del grupo

tosilo que conlleva a la formación de un doble enlace.

46

Gráfica 23 1,4-difenilbut -3-en-ona


Es factible pensar en esta estructura como una segunda opción para la identidad de la

fracción No.3, en donde los picos diferenciales en el Espectro Infrarrojo serán los de éster y

los de cetona.

Aunque los de éster están presentes, es posible ver también los picos 1800 y 1900 cm-1

que

pueden pertenecer a sobretonos de cetona aunque no se encuentran los picos base de las

mismas, también pueden pertenecer a sobretonos C-H en carbono de doble enlace.

El análisis de Espectrometría de Masas a su vez puede ser muy semejante, siendo de difícil

explicación la formación de los picos 207 y 193 pero posible

Fracción No.3

Min 29.569: m/z: 222, 221, 207, 193, 178, 165, 145, 131, 123, 115, 105, 97, 91, 83, 77, 71,

63, 57, 51.

47

Gráfica 24 Propuesta de Fragmentación Radicalar para compuesto F3 Min 29.569.

48


Partiendo de una estructura central lineal en vez de una forma furánica central se pueden

explicar varios de los picos, pero algunos como el pico 131 son menos probables, a menos

que la estructura inicial sea cíclica.

Gráfica 25 Fragmentación radicalar para pico en 131.05 UMAS


De cualquier manera se agrega un análisis de una descomposición radicalar partiendo de un

probable subproducto de cadena carbonada lineal (Gráfica 26), la cual para formarse tendría

que haber pasado primero por una deshidratación, de cualquier manera la descomposición

sería de la forma (Gráfica 27).

49

Gráfica 26. 1,4-difenilbut-3-en-1-ona.


Gráfica 27 Propuesta de Fragmentación Radicalar para 1,4-difenilbut-3-en-1-ona.


50

Fracción No. 5, Muestra disuelta en benceno.

En la Tabla 7, la identidad más probable para la fracción No. 5, es ácido para-

toluensulfónico como subproducto de reacción y que también fue encontrado en considerable

cantidad en la cromatografía de gases realizada a la fracción No. 3, sin embargo caben

destacar en la Tabla 7 algunos picos que no corresponden a este tosilato y son los picos

correspondientes a cetonas, por lo cual es probable que se encuentre contaminado con

acetofenona.

Discusión de Resultados para la Segunda Ruta de Síntesis.

Reacción 1: Formación de Bromofenilacetaldehido.

La Fluorescencia de rayos X revela la presencia inequívoca de Bromo tanto en la fracción

etérea como en la acuosa, lo cual pone en evidencia la presencia de este elemento en la

molécula después del proceso de purificación de la mezcla de reacción.

La cromatografía en capa fina muestra la presencia de una serie de reactivos y subproductos

de reacción.

Tabla 16. Comparación de Rf 1.

Punto Identidad Rf

Filtrado Original

Solución almacenada en balón de 3 bocas.

0.661, 0.645, 0.548, 0.437, 0.387, 0.290, 0.225

Lavados con Ligroína

Solución proveniente de lavados del filtrado con ligroína a 5°C.

0.387, 0.290

Ppt Muestra proveniente del precipitado contenido en el papel filtro diluido con ligroína.

0.000


Dado que la fase móvil Isoctano-Acetato de Etilo 90:10 es considerablemente apolar, se

estima una lenta migración de grupos muy polares como sales, alcoholes y semejantes,

mientras que los más apolares pueden presentar mejor migración, de manera que se observan

las manchas con Rf 0.387 y 0.290 presentes en ambas muestras, de lo que se puede inferir

que es posible la presencia aún de bromo en la fase etérea (etiquetada como “filtrado

original”).

De cualquier manera en el tratamiento de las posteriores reacciones se procuró la total

eliminación de contaminantes apolares.

51

Reacción 2: Sustitución Nucleofílica de Bromo en Benzaldehído.

El trabajo de separación de la mezcla se dificultó debido a los numerosos isómeros

obtenidos y a otros subproductos de reacción.

Esto originó numerosas cromatografías (ver sección de anexos), sin embargo se encontraron

productos relevantes de la síntesis en las muestras M1, M2 y M3, con las que se continuó el

proceso de síntesis.

En la Fluorescencia de rayos X, se aprecia un importante decremento de la presencia de

bromo:5,800 ppm en relación a 2544 ppm presentes en la mezcla ligroína-sólido obtenida, lo

cual da un índice indirecto de éxito de la sustitución.

El análisis de las cromatografías de Capa fina muestra que el proceso de filtrado de la mezcla

de reacción condujo a la obtención de 5 fracciones que se muestran en la Tabla 10 (relativa a

la sección de anexos con el Código: Pág. 147 Croma Capa Fina 10 03 2010), en dicho

análisis es posible ver que M1 y M2 comparten similitud en los primeros puntos Rf

mostrados, lo cual es coincidente con la cromatografía de gases-masas ejecutada a esta

muestra.

Dichos picos mostraron pesos moleculares no menores a 221, con tiempos de retención de

20.90 y 20.95 minutos respectivamente. Se determinó que ambos son isómeros debido a su

patrón de descomposición en este espectro.

Esta cromatografía de capa fina también muestra que M4 y M5 son muy diferentes en su

polaridad, fue necesario utilizar una mezcla más polar para separar la composición de ambas,

no encontrando productos relevantes para la síntesis en ninguna de las dos mezclas.

Se realizó un trabajo de duplicado para la separación por TLC de esta misma cromatografía

en la que se identificó que efectivamente los primeros compuestos de M1 coinciden con M2.

Tabla 17. Comparación de Rf 2.

Punto Rf

M1 0.827, 0.603, 0.413, 0.241, 0.172, 0.138, 0.103.

M2 0.827, 0.603, 0.517, 0.379, 0.172. Fuente: FODECYT 38-2008.

El pico 0.172. La elucidación de las estructuras moleculares de estos tres compuestos se

evidenció a través de cromatografías gases-masas, llegando a la conclusión de que el resto de

compuestos presentes en la muestra son fragmentos de reactivos subproducto del cloruro de

tosilo y/o acetofenona.

Un análisis por TLC de la M2 concretó detalles de la composición de esta extracción (Tabla

12, relativa al Código: Imagen 1355, fecha 190410, página 179-180 Libro 1) la cual se

ejecutó a una purificación de la fracción en comparación con el material encontrado

directamente en el fondo del balón utilizado en la mezcla de reacción.

52

Tabla 18. Comparación de Rf 3 y 4.

Punto Rf

Muestra 2 (M2) Muestra 2 separada

0.661, 0.613, 0.194, 0.016. 0.613, 0.194, 0.016.

Punto Rf

M1 0.827, 0.603, 0.413, 0.241, 0.172, 0.138, 0.103.

M2 0.827, 0.603, 0.517, 0.379, 0.172. Fuente: FODECYT 38-2008.

Lo anterior, contribuye a la teoría de que M1 y M2 son isómeros con diferentes puntos de

retención en las TLC y cromatografía de columna practicadas.


Un análisis cromatográfico más fino par M1, M2 y M3 mostró retenciones relativas para los

compuestos de estas tres mezclas. Esta cromatografía se realizó con la finalidad de encontrar

identidades y establecer diferencias entre estas tres muestras. Se analizan los resultados a

continuación:

Gráfica 28. TLC Hijas.


M1a M1b M1c M2a M2b M2b1 M2b2 M2b3 M2b4 M3a M3b

53

Tabla 19 Identidad de puntos en TLC Hijas

Punto Identidad Rf





M2b Muestra 2 fracción 2 0.469, 0.285, 0.204, 0.163, 0.102






M3b Muestra 3 fracción 2 ---- Fuente: FODECYT 38-2008.

Se determinó que en M1 solamente existían dos compuestos y M2a es posible que se trate de

dos parejas de isómeros, debido a que la resolución del espectro de masas, muestra que en

M2 hay estructuras muy apolares que poseen una relación isomérica.

Los compuestos en M2b1–M2b4 se consideran derivados del ácido para-toluensulfónico, el

cual fue encontrado como contaminante mayoritario en M2, con peso de 158 umas.

La muestra M3 no fue posible identificarla con las técnicas de revelado utilizadas: luz UV

254 nm, 365 nm, Yodo. Sin embargo posteriormente se comprobó que en M3 se encontraría

2,3,4,5-Tetradihidrocalyxolano.

Análisis e Identidad de los Espectros de Masas

Haciendo un simple análisis de las tablas de comparación de patrones se puede observar

fácilmente que existe una similitud tangible entre las tres muestras.

Producto de las cromatografías de columna obtuvieron 3 fracciones principales cuyo análisis

mostró los siguientes resultados:

Tabla 20. Análisis de MS 1.

Muestra Composición

(Fracciones de

elución por

Cromatografía en

Columna)

Patrón de Espectro de Masas

Muestra 1 1, 1 a (M1a, M1b) 223(1.4 %), 222(25%), 221(50%), 207, 193, 178, 145, 131,

115, 105, 97, 91, 83, 77(100 %), 71, 63, 57.

Muestra 2 M2 (M2a, M2b1,

M2b2, M2b3)

223(1.4 %), 222(25%), 221(50%), 207, 191, 178, 165 145,

131, 115, 105, 91, 83, 77(100 %), 63, 51, 43.

Muestra 3 3 a, 4 (M3a, M3b) 221(8 %), 220(75%), 119(2%), 191, 165, 115, 105, 95, 89,

83, 77(100 %), 63, 57, 51, 43.

54

Tabla 21. Comparación de Patrones 2.

Muestra Patrón de Espectro de Masas

Muestra 1 223, 222, 221, 207, 193, 178, 145, 131, 115, 105, 97, 91, 83, 77, 71, 63, 57.

Muestra 2 223, 222, 221, 207, 191, 178, 165, 145, 131, 115, 105, 91, 83, 77, 63, 51, 43.

Muestra

1RS1

223, 222, 221, 207, 191, 178, 165, 145, 131, 115, 105, 97, 91, 83, 77, 71, 63, 57,

51.

Muestra 3 221, 220, 119, 191, 165, 115, 105, 95, 89, 83, 77, 63, 57, 51, 43.


Donde M1RS1 pertenece a la primera reacción de la primera ruta de síntesis y Muestra 1, 2

y 3 pertenecen a la 2da. reacción de la 2da. Ruta de Síntesis.

La comparación de estos patrones también es coincidente con estructuras cíclicas

calyxolánicas con N presente que explica bien el ion molecular impar.

Gráfica 29 Espectros de masas de algunos Difenildioxolanos

Fuente: National Bioscience Database Center, Japan Science and Technology Agency

(http://www.massbank.jp/index.html).

Con estos hechos, puede deducirse que existe una gran semejanza estructural entre los

espectros obtenidos y los Difeniloxolanos presentes en las bases de datos consultadas.

Sin embargo, la diferencia radica en que en esta serie de reacciones únicamente se utilizó

nitrógeno en el solvente N,N-dimetilformamida, el cual es un solvente caracterizado por no

intervenir en este tipo de reacciones y que se usa ampliamente en sustituciones nucleofílicas

de este tipo (véase las reacciones de referencia usadas en esta síntesis). Por ello, se ha

http://biosciencedbc.jp/?lng=en

http://www.massbank.jp/index.html

55

descartado que el ion molecular impar en la segunda reacción de síntesis para M1 y M2 es

por la presencia de Nitrógeno en la muestra. Los espectros IR tampoco muestran picos

relevantes para especies nitrogenadas.

De tal manera, se considera que M1 y M2, que poseen un aparente pico ion molecular impar,

pueda más bien deberse a la pérdida espontánea de un protón durante el impacto electrónico

u a otra forma iónica, semejante a la ocurrencia en aldehídos y el pico M-1.

Es de hacer notar también, que como se explica a continuación, el patrón de descomposición

de las tres muestras sugiere las siguientes características:

1- Pérdida de 29 unidades de masa como especie presente, producto de la descomposición

radicalar.

2- Una probable estructura cíclica, ya sea obtenida por la ciclación, producto de la

descomposición o nativa, pero es un hecho que esta debe contener al menos un anillo de 5

miembros y debe ser un heterociclo.

3- Existe una relación isomérica entre M1, M2 y M1RS1, por lo que se asume que existe una

alta probabilidad de que M1 y M2 compartan la misma estructura propuesta por M1RS1 en

la 2da. Reacción de la 1era. Ruta de Síntesis.

M 3.

En la muestra 3 el patrón de degradación del pico más importante es: 221, 220, 119, 191,

165, 115, 105, 95, 89, 83, 77, 63, 57, 51, 43. La estructura propuesta es (Gráfica 30):

Gráfica 30. M3 Identidad y Descomposición Radicalar por MS.


La cual se explica mediante el siguiente patrón de degradación:

Gráfica 31. M3 picos 191, 165, 115 y 77.

56


Se propone que la degradación puede ocurrir también por la escisión del anillo furánico en

dos segmentos principales para producir:

Gráfica 32. M3 picos 105 y 115.


Esta propuesta explica la presencia de los picos principales en el Espectro de Masas.

El producto buscado en la segunda reacción tiene una retención en columna de

aproximadamente 37 minutos y su identidad y espectro de descomposición identificados y

obtenidos fueron los siguientes: 240(8.5 %), 329(25%), 238(50%), 220, 208, 207, 191, 165,

154, 133, 105 (100%), 97, 77, 71, 57.

57

Gráfica 33. M2 min 37 4-oxo-2,4-difenilbutanal.


El pico presente a m/z 207 puede ser explicado por un patrón de descomposición diferente

en el que debe perderse CO simultáneamente a la pérdida de 2 Hidrógenos (siendo muy

probable la pérdida de CHO como ion radicalar estable) y posteriormente el grupo cetona

presente se cicla para formar un anillo heteroatómico de cuatro miembros de la estructura

mostrada en la Gráfica 34.

58

Gráfica 34. M2 Pico 207.


Reacción 3: Reducción de cetonas a alcoholes.

Prueba de AgNO3 para evaluar el estado de Zn(BH4) resultó negativo.

Prueba de Lucas para determinación de presencia de Alcoholes 1°, 2° o 3°: Reacción

Inmediata. Aparente presencia de alcohol terciario.

2,4- DNF: No hay reacción.

4,2-DNF + Acetona, alcohol: Precipitado amarillo.

La muestra fue soluble en Bisulfito de Sodio, sospecha de aldehídos presentes.

En la Prueba de Lucas, se deshidrata alcoholes en la medida que un catión es estable en la

posición del alcohol, por lo que el catión formado es muy estable, la reacción fue inmediata.

Reacción 4: Ciclación por medio de catálisis de tosilatos.

El espectro de masas obtenido previamente para Calyxolanos es confirmado por medio

del patrón de descomposición del Espectro de Masas, previamente discutido y coherente con

los subproductos obtenidos en las reacciones de sustitución nucleofílica y de reducción en

esta investigación.

Calyxolano A.

Espectro de Masas de Impacto Electrónico –HREIMS-.

HREIMS (m/z) [M+] calculado para C16H16O, PM. Teórico 224.1201, reportado 224.1193

(13), 223 (16), 210 (8), 194 (24), 193 (16), 179 (9), 133 (11), 120 (10), 118 (18), 117 (20),

115 (12), 106 (9), 105 (100), 104 (21), 91 (20), 77 (38).

Espectro Ultravioleta/Visible.

UV (CH3OH) Lamdamax 206 (Epsilon 16 000) nm.

59

Espectro Infrarrojo.

IR (net): 3055, 3020, 2950, 2914, 2844, 1675, 1442, 1252, 1097, 1013, 794, 752, 689 cm-1

.

Cromatografía en Capa Fina.

CC. Sílica, (pentano: CH2Cl2, 1:1), Rf = 0.40 (CHCl3).

Calyxolano B.

Espectro de Masas de Impacto Electrónico –HREIMS-.

HREIMS m/z [M+] calculado para C16H16O, PM 224.1201, reportado 224.1202 (54), 223

(25), 210 (8), 194 (66), 193 (65), 179 (47), 178 (25), 133 (36), 120 (28), 118 (39), 117 (74),

116 (39), 115 (53), 106 (16), 105 (100), 104 (33), 91 (10), 90 (65), 77 (71).

Espectro Ultravioleta/Visible.

UV (CH3OH) Lamdamax 206 (Epsilon 16 000) nm.

Espectro Infrarrojo.

IR (neat) 3049, 3027, 2958, 2920, 2844, 1637, 1440, 1250, 1091, 1015, 787, 688 cm-1

.

Cromatografía en Capa Fina.

CC. Sílica, (pentano: CH2Cl2 = 1:1), Rf = 0.40 (CHCl3).

60

PARTE IV.

IV.1 Conclusiones.

La primera Ruta de Síntesis rindió como producto 3,5-difenil-2,3-dihidrofurano, el cual es un

buen precursor para la síntesis de 2,4-difeniltetrahidrofurano (Calyxolano).

La primera Ruta de Síntesis es efectiva en la obtención de 2,4-difeniltetrahidrofurano, pero

ineficiente al rendir 5 % de producto final, tomando como referencia la cantidad molar de

sustrato de la primera reacción en relación a la cantidad molar del producto de la última

reacción ejecutada.

Ambas rutas de síntesis ejecutadas tuvieron en común la ciclación del intermediario

C6C4OC6 para rendir un producto difenil-tetrafuránico, debido a que las condiciones de

reacción básicas durante la adición nucleofílica, son ideales para promover la pérdida de un

protón en alfa respecto a la cetona, dicho mecanismo promueve por resonancia el ataque

nucleofílico del átomo de oxígeno hacia otro carbono que contenga un buen grupo saliente,

siendo favorecido además el proceso por la formación de un doble enlace en resonancia con

el ciclo aromático vecinal y por la formación de un anillo de 5 miembros.

El principal motivo de la ineficiencia de la Ruta de Síntesis 1 para producir 2,4-

difeniltetrahidrofurano, es la inestabilidad del intermediario de reacción 2-bromo-1-

feniletanol, el cual posee un alto potencial electrofílico que se genera en el halogenado y que

puede dar lugar a los subproductos:

1,4-difenilbut-3-en-1-ona por medio de la reacción de acetofenona en el carbono

halogenado y la simple pérdida del grupo tosilo para generar un doble enlace.

1,3,6-trifenilhept-6-en-1-ona como producto de la doble sustitución de acetofenona

en ambos grupos salientes, el halógeno y el grupo tosilo.

A pesar de los factores anteriores, la Ruta de Síntesis No.1 obtuvo un 10 % de producto final,

y es necesario tomar en cuenta que los reactivos usados en esta síntesis son fáciles de

conseguir, de bajo costo, la reacción es menos riesgosa que la Ruta de Síntesis No. 2 aquí

propuesta y además se considera que el procedimiento aquí propuesto puede ser optimizado

mediante la mejora del proceso de extracción cromatográfica

La extracción cromatográfica por columna en sílica gel 60 y usando solventes comunes

(como hexano, cloroformo, acetona, etc.) de ambas rutas de síntesis tuvo complicaciones

debido principalmente a la similitud de las características químicas de los subproductos, ya

que la mayoría de estos poseía grupos éter, carbonilo, halógenos u alcoholes.

La Ruta de Síntesis No.2 obtuvo 64.5 g (0.28 moles) de Calyxolanos cis y trans que

representa un 50.90 % de rendimiento.

La Ruta de Síntesis No.2 es eficaz y es eficiente para la obtención de 2,4-

difeniltetrahidrofurano, sin embargo el reactivo Bromo (Br2) puede ser un limitante para la

producción de 2,4-difeniltetrahidrofurano debido a que se encuentra actualmente restringido

su acceso al país. Esto puede elevar costos de producción en esta síntesis o imposibilitarla.

Todas las reacciones de la Ruta de Síntesis No.2 son reacciones asequibles y conocidas y

esta ruta sintética produce 2,4-difeniltetrahidrofurano en un 50.90 % de rendimiento.

61

Las reacciones de la Ruta de Síntesis No.1 son asequibles y conocidas sin embargo producen

2,4-difeniltetrahidrofurano en 10.00 % de rendimiento.

La ventaja de la Ruta de Síntesis No.1 es que esta utiliza NBS como fuente de bromo en vez

de Bromo elemental puro. El NBS es un reactivo permitido y usado actualmente en

Guatemala.

Se han separado eficazmente los diasterómeros de 2,4-difeniltetrahidrofurano en

cromatografía de gases y HPLC, sin embargo para que la separación en columna o por

extracción sea eficiente se necesitan desarrollar otros métodos.

La actividad contra la enzima acetilcolinesterasa para 2,4-difeniltetrahidrofurano cis y trans

fue evaluada determinando que inhiben efectivamente la enzima.

Los estudios teóricos de modelaje molecular de 2,4-difeniltetrahidrofurano cis y trans fueron

desarrollados determinando los parámetros farmacofóricos de estos.

62

IV.2 Recomendaciones.

Modificar la Ruta de Síntesis No. 1 para optimizar el proceso de la siguiente forma:

Reacción No.1: Es necesario utilizar otro grupo saliente en vez de bromo, para promover los

ataques nucleofílico en el carbono que sostiene el grupo tosilado.

Reacción No.2. Sustitución Nucleofílica. Es posible promover la ciclación para formar un

anillo de cinco miembros, utilizando un medio básico que permita remover un Hidrógeno en

posición alfa.

Las reducciones selectivas de doble enlace pueden necesitar un medio catalítico como Níquel

para ser más eficientes al momento de producir 2,5-difenil-2,3-dihidrofurano.

Puede aprovecharse la formación de 2,5-difenil-2,3-dihidrofurano para inducir la formación

selectiva de Calyxolano cis o trans mediante el uso de catalíticos específicos para la

reducción.

La separación de los estereoisómeros selectivos de 2,4-difeniltetrahidrofurano puede ser

eficiente mediante columnas cromatográficas de fase estacionaria selectivas.

Se recomienda realizar un estudio de modelaje molecular in silico para la determinación del

sitio activo de Calyxolanos cis y trans en la Acetilcolinesterasa, de tal manera que se puede

modificar la estructura química de Calyxolanos para optimizar el efecto farmacofórico de

este compuesto, con el objetivo de neutralizar la enzima de manera más eficiente.

63

IV.3 Referencias Bibliográficas

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66

IV.4 Anexos

Gráfica 35. Espectros IR para 2-bromo-1-feniletanol.

Identidad asociada al espectro.

Espectro Obtenido de la muestra.

Espectro Teórico obtenido mediante cálculo semi empírico AM1.


Corrección de T°-Presión: Para Ciudad de Guatemala: p = 760 torr – 765 torr = -5 torr = -5 mm Hg Fc = 5 mm Hg x 0.370 °C/10 mm Hg = -0.18 °C Te = 198 °C – (-0.18 °C) = 197.82 °C

67

Reacción 2: Formación 4-bromo-1,3-difenilbutan-1-ona y Sustitución Nucleofílica. Gráfica 36. TLC Cod. 040909.

Código: 040909


Gráfica 37. TLC Cod. 071009.

Código: 071009


68

Gráfica 38. IR teórico para SN2 Cod. 13 10 2009.

IRs PARA LA SUSTITUCION NUCLEOFILICA, ANALISIS DEL 13 10 2009.


69

Gráfica 39. IR para SN2 F3 Cod. 22102009.

Muestra disuelta en hexano FRACCION No.3. Sustitución Nucleofílica. 22 10 2009 – 13 10 2009.


Gráfica 40. IR F3.

Fracción No.3 Tomada en Benceno.


70

Gráfica 41. IR F5.

Fracción No. 5, Muestra disuelta en benceno.

La presencia del pico en aproximadamente 1500 cm-1 es indicador de aromaticidad. En 700 cm-1 aparece nuevamente el pico de Br. Y los demás picos son confirmatorios de aromaticidad.


Gráfica 42. Espectrometría por fluorescencia de Rayos X F3.

3ra. Fracción, Calyxolanos 07/10/2009.


71

Gráfica 43. F5.

5ta. Fracción Calyxolanos 07/10/2009.


72

Anexos 2da Ruta de Síntesis

En esta sección se proveen detalles de la ejecución y de los datos provistos en resultados,

además se anexan todos los análisis adicionales realizados y varios de los duplicados más

importantes.

Para las cromatografías de capa fina, estas han sido identificadas por la fecha en la que se

realizaron según el libro de bitácora de laboratorio, el número de página en donde se

encuentran registrados estos análisis en este libro y además poseen un código de imagen

único.

Ruta de Síntesis No.2

Formación de 2-bromo-1-feniletanol.

Gráfica 44. RUTA DE SINTESIS No.2 Fluorescencia de Rayos X a R1.

Fluorescencia de Rayos X.


Al extracto obtenido de la primera reacción se le realizó un barrido de rayos X para

determinar la presencia de Bromo en la muestra, como puede verse en la gráfica esta es

positiva. La presencia de otros metales es normal y se debe a la contaminación y ocurrencia

normal del recipiente y de la muestra.

La intensidad del pico de Bromo también es relativa a la concentración de producto bromado

en la muestra, por lo que puede fue posible concluir que el porcentaje d rendimiento se ajustó

a lo encontrado en la literatura.

73

2da Reacción Sustitución Nucleofílica de Bromo en Benzaldehído.

Productos de la Sustitución Nucleofílica sobre bromo benzaldehído.

Gráfica 45. R2 Fluores. Rayos X.

Mezcla ligroína y resina 10_12_2009.


Muestra fase ligroína 10_12_2009.mca.


74

Gráfica 46. TLC 25.02.2010.

2da Reacción, Sustitución Nucleofílica empieza en pág. 125.

Análisis de Solubilidad (para futura cromatografía) P 128.

TLC p131.

TLC en pág. 138: Diferenciación de fases. 25.02.2010.


Gráfica 47. TLC 26 02 2010.

Imagen 1340, corresponde a fecha 26 02 2010. Pág. 139 L 1.


75

Las 7 fracciones que aquí aparecen corresponde a la fracción etérea, (primera cromatografía

en columna que se realizó a la fracción etérea).

Gráfica 48. TLC 26.02.2010.

Archivo 1341 que corresponde a la fecha 26.02.2010.


76

Gráfica 49. TLC 26 02 2010 Imagen 1339.

Tabla 22 Anexos 1

Para la fase etérea:

Se obtuvieron 5 fracciones de la

cromatografía en columna:

Fracción Observaciones

1ª. Líquido amarillo claro.

2ª. Líquido anaranjado

fuerte.

3ª. Líquido rojizo.

4ª. Líquido rojo obscuro.

5ª. Líquido rojo claro.

Imagen 1339. Corresponde a fecha 26 02 2010.


Tabla 23 Anexos Unión de Cromatografías

Muestra – Mezcla

Cromatografías

1 y 2.

Fracciones de la

primera

Cromatografía

Fracciones de la

segunda

Cromatografía

1 1 1 a

2 2, 3 2 a

3 4 3 a

4 5 4 a

5 6 5 a

7 (vacía)


77

Al producto de unión se le realizó la siguiente cromatografía

La cromatografía realizada fue la siguiente:

Gráfica 50. TLC 1352 04032010.

Imagen 1352, de fecha 04032010 con referencia a la pág. 142.


La leyenda de la página es la siguiente:

Tabla 24. Anexos, Identidad en TLC RS2R2.

Punto en la

placa

Fracción

No.

Pertenece a:

1 1 Primera corrida de Croma en Columna.







1 a 1 Segunda corrida de Coma en Columna.




5a 5 Segunda corrida de Coma en Columna.


78

Gráfica 51. TLC 1344 10032010.

Pág. 147 Cromatografía en Capa Fina 10 03 2010.

Imagen 1344, Pago 147, fecha 10032010.

Identidad: Unión de las fracciones de las cromatografías en columna 1 y 2 de la fase etérea.

Fase móvil: Isoctano-acetona 95:5.

Frente: 8.2 cms.


Tabla 25. Anexos Rf 1.

Puntos Descripción Rf

M1 Muestra compuesta de la mezcla de las fracciones

1(primera corrida) y 1 a (segunda corrida)

0.658, 0.500, 0.146.


2,3 (primera corrida) y 2 a (segunda corrida)

0.646, 0.487, 0.317, 0.158.


4 (primera corrida) y 3 a (segunda corrida)

0.487, 0.390, 0.268, 0.219,

0.146.



0.146, 0.121, 0.073, 0.036.



0.439, 0.012.

M3a Residuo de la evaporación de M3. 0.353, 0.012.


79

Gráfica 52. TLC 1357 10032010.

Imagen 1357 ---imagen suelta--- duplicado de la cromatografía 10032010,

La elución y los valores de Rf indican que la Fase Móvil puede ser Isoctano-Acetona 90:10.


Tabla 26 Anexos Rfs 2:

Punto Rf

M1 0.827, 0.603, 0.413, 0.241, 0.172, 0.138, 0.103

M2 0.827, 0.603, 0.517, 0.379, 0.172,

M3 0.603, 0.482, 0.517, 0.310, 0.275, 0.241, 0.172

M4 0.448, 0.344, 0.206, 0.206, 0.051

M5 0.448

NOTA: M1, M2 Y M3, se les hizo otra cromatografía, que se llamó HIJAS.

La historia de las muestras HIJAS está en la pág. 155 Lib. 1.


80

Gráfica 53. TLC 1345 10032010

Imagen 1345, fecha 10032010, pág. 148.

Identidad: Separación de M4 y M5 por TLC.

Fase móvil: Isoctano-Acetato de etilo 50:50.



Punto Identidad Rf

M4 Fracción 5 Primera cromatografía en columna,

Fracción 4 a, Segunda cromatografía en columna.

0.678, 0.535, 0.317, 0.428,

0.392, 0.357, 0.321, 0.285,

0.250.

M5 Fracciones 6 Primera corrida en columna y 5 a

Segunda cromatografía en columna.

0.678, 0.0178.

M5a Fase oleosa obtenida de la M5 por evaporación. 0.0357.


81

Gráfica 54. TLC 1346 10032010.

Imagen 1346, fecha 10032010, pág. 148.


Identidades: 2da reacción, 2da Ruta de Síntesis: Sustitución Nucleofílica.


Punto Identidad

M4 Muestras compuestas por fracciones 5 (1era Corrida en Croma) y 4 a (segunda

corrida en croma de columna).

M5 Muestras compuestas por fracciones 6 (Primera corrida) y 5 a (Segunda corrida).

M5a Fase aceitosa obtenida de la M5 en el rota vapor.


82

Gráfica 55. TLC 1351 18032010.

Imagen 1351, Pág. 157, Fecha 18032010.


Identidades de 1351: Separación de Muestras Hijas


Frente: 9.8 cm



Punto Identidad Rf





M2b Muestra 2 fracción 2 0.469, 0.285, 0.204, 0.163,

0.102

M2b1 Muestra 2 fracción 2 parte 1

**

0.102





M3b Muestra 3 fracción 2 ----

**Relativo a los tubos de ensayo donde se almacenaron)


83

Esquema de las cromatografías Practicadas a la Fracción etérea.

Las Muestras hijas provienen de M1, M2 y M3, donde a su vez M1, M2 y M3 son producto

de la unión de dos cromatografías hechas a la misma fase etérea la cual era una fracción muy

grande. Por esto La fase etérea siguió este proceso:

Fracción Etérea. Se parte en 2, cada una hace 2 cromatografías diferentes pero con las

mismas fases móviles y estacionarias.

Las cromatografías se comparan y se unen. Esta unión originó la cromatografía de la pág.

142. Imagen 1352, de fecha 04032010.

La unión genera la nueva nomenclatura. Pág. 147, Imagen 1344, fecha 10032010,

Tabla 30. Anexos Rfs. 6.

Puntos Descripción


1(primera corrida) y 1 a (segunda corrida).


2,3 (primera corrida) y 2 a (segunda corrida).


4 (primera corrida) y 3 a (segunda corrida).





En donde M1, M2 y M3 eran no solo fracciones grandes sino que evidentemente tenían

varias sustancias, por ese motivo se decidió hacer la cromatografía de las muestras hijas .


Pruebas de Tollen´s para determinar aldehídos. pp. 158

M3a inamisible.

M2a inmiscible .

M2b negativo (precipitado blanco), prueba hecha en alcohol 95%.

M3a negativo (precipitado blanco).

84

Análisis De Bromo Fenilacetaldehido.

Gráfica 56. TLC 1347 130410.

Imagen 1347, fecha 130410, página 172 L.1

Cromatografía en Capa fina – TLC- del 130410 Y 140410 en pág. 174-175.

Identidad de las marcas:

Muestra de Bromofenilacetaldehido.



Tabla 31. Anexos TLC Bromfenilacetladehido.

Punto Identidad

Filtrado Original Solución almacenada en balón de 3 bocas.

Lavados con Ligroína Solución proveniente de lavados del filtrado con ligroína a 5°C.

Precipitado Muestra proveniente del precipitado contenido en el papel filtro

diluido con ligroína.


85

Gráfica 57. TLC 348 130410.

Imagen 1348, fecha 130410, página 172.

Identidad: Bromofenilacetaldehido en acetaldehído.

Fase Móvil: Isoctano-Acetato de etilo 90:10.

Muestra en Duplicado.


Tabla 32. Anexos Bromofenilacetaldehido 2.

Punto Identidad Rf

Filtrado

Original

Solución almacenada en balón de 3 bocas. 0.661, 0.645, 0.548,

0.437, 0.387, 0.290,

0.225.

Lavados con

Ligroína

Solución proveniente de lavados del filtrado con

ligroína a 5°C.

0.387, 0.290.

Precipitado Muestra proveniente del precipitado contenido en el

papel filtro diluido con ligroína.

0.000.


86

Gráfica 58. TLC 1350 140410.

Imagen 1350, fecha 140410, página 174.

Identidad: Muestra de Bromofenilacetaldehido.

Fase móvil: Isoctano–acetato de etilo 90:10.


Tabla 33. Anexos Rfs Bromofenilacetlaldehido.

Punto Identidad Rf

Muestra Reconcentrada

Muestra de Bromofenilacetaldehido previamente filtrada y que fue reconcentrada en rota vapor

0.691

Muestra Balón Muestra de Bromofenilacetaldehido contenido en el balón de 3 bocas y que fue extraído con ligroína.

0.676


87

Gráfica 59. 1353 190410.

Imagen 1353, fecha 190410, página 179-180.

P.179 182. TLC 190410.

Descripción: M2, Muestra 2, lavados con H2O: Muestra acuosa con rastros de la M2 (Fase

etérea lavada con agua).


88

Gráfica 60. TLC 1355 190410.

Muestra Analizada en Cromatografía de Masas (M2).


Identidad: Producto de 2da. reacción para producir Benzaldehído de acetofenona.

Fase Móvil: Isoctano–Acetato de etilo 90:10. Frente: 6.2 cm.


Tabla 34. Anexos Rf Benzaldehído de acetofenona.

Punto Identidad Rf

Muestra 2 (M2) Muestra original Aceitosa, proveniente de las fracciones 2 y 3 de la primera cromatografía de la fase etérea; y fracción 2 a de la segunda cromatografía de la misma fase etérea.

0.661, 0.613, 0.194,0.016.

Muestra 2 separada

Muestra No.2 después de haber sido separada por cromatografía en columna en sus fracciones hijas (M2a, M2b, M2b1, M2b2, M2b3 y M2b4) y unirlas posteriormente en un tubo de ensayo para análisis por CG-MS.

0.613, 0.194,0.016.


89

Gráfica 61. 1356 190410.



90

Cromatogramas (GC-MS).

Gráfica 62. M1 GC-MS 29.569.


91



92



93

Espectro de Masas de Calyxolano A

Espectro de Masas de Calyxolano B


94

Orbitales Moleculares de Calyxolano B

Potencial de Ionización, Momento Dipolar y Orbitales HOMO y LUMO de Calyxolano A


95

PARTE V V.1 INFORME FINANCIERO

DÉCIMA NOVENA CONVOCATORIA

LINEA FODECYT

Nombre del Proyecto:

"Síntesis de Calytxolanos A y B, únicos metabolitos tipo C6-C4-C6 aislados de un organismo marino, determinación de su inhibición contra la enzima Acetilcolinesterasa y sus propiedades

farmacofóricas"

Numero del Proyecto: 38-2008

Investigador Principal: DR. OSCAR MANUEL CÓBAR PINTO

Monto Autorizado: Q372,825.59

Plazo en meses 18 MESES

Fecha de Inicio y Finalización: 02/02/2009 al 31/07/2010 PRÓRROGA AL 31/10/2010

Grupo Renglon Nombre del Gasto Asignacion Presupuestaria

Ejecutado No ejecutado

1 Servicios no personales

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad Q 109,000.00 Q 106,638.90 Q 2,361.10

181 Estudios, investigaciones y proyectos de factibilidad (Evaluación externa de Impacto) Q 8,000.00 Q 8,000.00

122 Impresión, encuadernación y reproducción Q 1,000.00 Q 1,000.00

158 Derechos de bienes intangibles Q 14,000.00 Q 13,800.00 Q 200.00

189 Otros estudios y/o servicios Q 10,000.00 Q 8,000.00 Q 2,000.00

2 MATERIALES Y SUMINISTROS

242 Papeles comerciales, cartones y otros

245 Libros, revistas y periódicos Q 4,000.00 Q 4,000.00

261 Elementos y compuestos químicos Q 30,232.35 Q 48,101.54 Q -17,869.19

269 Otros productos químicos y conexos

272 Productos de vidrio Q 58,225.00 Q 24,399.71 Q 33,885.29

283 Productos de metal

291 Útiles de oficina

292 Útiles de limpieza y productos sanitarios

298 Accesorios y repuestos en general Q 1,550.00 Q -1,550.00

3 PROPIEDAD, PLANTA, EQUIPO E INTANGIBLES

323 Equipo médico, sanitario y de laboratorio Q 104,475.00 Q 105,335.29 Q -860.00

GASTOS DE ADMÓN. (10%) Q 33,893.24 Q 33,893.24

Q 372,825.59 Q 341,718.68 Q 31,167.20

MONTO AUTORIZADO Q 372,825.59

(-) EJECUTADO Q 341,718.68

NO EJECUTADO Q 31,167.20

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