CULTIVO CELULAR
APLICACIONES EN MEDICINA
Centro Comunitario de Sangre y
Tejidos del Principado de
Asturias.
Unidad de Ingeniería Tisular
Sara Llames
CULTIVO CELULAR: mantenimiento, proliferación y/o
diferenciación de células in vitro en un medio artificial.
REQUERIMIENTOS MÍNIMOS DE UN LABORATORIO
DE CULTIVO:
Asepsia: cabina de flujo, esterilizador
Incubador
Nevera/congelador
Baño agitador
Centrifuga
Microscopio Invertido
MEDIO DE CULTIVO:
proporciona a las células los nutrientes necesarios.
BASAL: medio definido, adecuado al tipo celular.
SUERO: fuente de proteínas, minerales, lípidos,
hormonas, mitógenos.
ANTIBIÓTICOS
ADITIVOS: hormonas, factores de crecimiento, etc.
MEDIO DEFINIDO: sin suero, componentes conocidos,
reproducible.
MEDIO INDEFINIDO: con suero, variación entre lotes.
CONDICIONES DE CULTIVO:
pH: 7.4, tamponamiento 5% CO2
temperatura: 37ºC
humedad: 90-95% INCUBADOR
CONTAMINACIÓN BIOLÓGICA:
Bacteriana
Fúngica
MICOPLASMA
CULTIVO DE CONDROCITOS
Britterg y colaboradores 1994, condrocitos humanos
autólogos cultivados para el tratamiento de lesiones
completas de cartílago articular.
Desde 1997 condrocitos comerciales. Elevado coste.
Unidades hospitalarias de cultivo celular.
PROCESAMIENTO Y CULTIVO:
Fragmentación mecánica (bisturí)
Digestión enzimática (colagenasa)
Cultivo en presencia de suero autólogo
CONTROLES:
Bacteriológicos
Micoplasma: ELISA, PCR, Fluorocromo
Cultivo infectado por
micoplasma Cultivo negativo
Producción de matriz cartilaginosa
Tinción
Safranina
Tinción Azul Alcián Inmunodetección de
Colágeno II
Estudio de normalidad celular
Cariotipo Bandas G Hibridación Genómica
Comparada.
Viabilidad Celular
Azul Tripán
TRANSPLANTE Y/O CONGELACIÓN
Transplante: suspensión celular en
DMEM sin rojo fenol.
Congelación para uso posterior.
CULTIVO DE QUERATINOCITOS
PIEL ARTIFICIAL
CULTIVO DE EPITELIO AISLADO
Digestión
enzimática
Biopsia del
paciente Fragmentación
mecánica
Células aisladas
de piel + 3T3
radiados
Cultivo primario de
queratinocitos
Células del cultivo
primario + 3T3
radiados
Cultivo secundario de queratinocitos
Transporte y trasplante
LIMITACIONES DEL EPITELIO CULTIVADO:
Fragilidad
Dispasa daña la membrana basal
Formación de ampollas
Infección
Antisépticos
Resultados clínicos pobres
Escasa disponibilidad
Coste elevado
Modelo de piel artificial completa destinado al
tratamiento definitivo de grandes lesiones
epiteliales
Epidermis
Dermis
INGENIERÍA TISULAR
Biopsia
de piel
Fragmentación
mecánica
1ª Digestión
T/E
Células aisladas de
piel + 3T3 radiados
Cultivo de
queratinocitos
2ª Digestión
colagenasa
Cultivo de
fibroblastos
Cultivos Primarios
Cultivo de
fibroblastos
Cultivo de
queratinocitos
Plasma
humano
Dermis artificial basada
en plasma humano Piel cultivada
Cultivo Secundario
PREPARACIÓN DE LA PIEL ARTIFICIAL PARA
TRASPLANTE
Biopsias procesadas
(patologías)
0
2
4
6
8
10
12
Nº
de
pac
ien
tes
Año 2000 Año 2001 Año 2002 Año 2003 Año 2004
(agosto)
Quemados Nevus Úlceras CutáneasEICH Neurofibromatosis EpidermolisisTx familiar Retracción Fascitis Necrot.Mucosa oral
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