IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 1
Identificación Molecular de Levaduras Asociadas a la Fermentación de Cacao Artesanal en
el Departamento de Santander
Laura Katherine León Díaz
Universidad de Santander
Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Agropecuarias
Programa de Microbiología Industrial
Bucaramanga
2021
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Identificación Molecular de Levaduras Asociadas a la Fermentación de Cacao Artesanal en
el Departamento de Santander
Laura Katherine León Díaz
Trabajo de grado presentado como requisito para optar por el título de Microbióloga
Industrial
Director
Nohora Juliana Rueda Forero, Msc. PhD (c)
Codirector
Claudia Johanna Sandoval Lozano, M. Sc
Universidad de Santander
Facultad De Ciencias Exactas, Físicas y Agropecuarias
Programa de Microbiología Industrial
Bucaramanga
2021
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Agradecimientos
Agradezco a Dios por permitirme culminar uno de los más grandes proyectos en mi vida,
por permitirme vivir esta experiencia al lado de muchas personas que aportaron algo en mí.
A Nohora Juliana, M. Sc PhD (c) por acompañarme en este proceso, por ser paciente,
amiga y por aportarme los conocimientos que sacaron este proyecto adelante.
También a mi Profesora Claudia por ser una gran persona, darme la oportunidad de
conocerla y aprender de ella.
A mis amigos Andrés, Julián, Brandon por ser el punto de alegría en mi vida, por tantos
años de amistad, algún día seremos más que grandes.
A mis amigas Wendy, Juliana, Yaren, sin ustedes este trayecto largo de universidad no
habría sido el mismo, gracias por cada momento vivido.
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Dedicatoria
Dedico esto a Dios que ha sido mi guía, refugio y compañía en todo y en estos años de
carrera en los que a veces he sentido duda.
A mis padres, pilares fundamentales en mi vida, las personas que más me conocen, que
con mucho amor y cariño me han apoyado en todo lo que he logrado.
A mi hermano que amo tanto por ser la persona que más me escucha, por ser el impulso
en mi vida, espero verlo triunfar.
Al amor de mi vida, Daniel que ha estado ahí acompañándome con su amor en cada
momento, en cada cosa que hago, porque ha sido lo mejor que me he cruzado en el camino,
A mis abuelos Nubia y Ovidio que son la principal razón por la que estoy aquí, por
hacerme saber siempre que soy su mayor orgullo.
A mis mascotas, mi apoyo emocional que le dan ese toque de alegría, amor y descanso en
mi vida.
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Tabla de Contenido
pág.
Introducción .............................................................................................................................. 16
1. Planteamiento del Problema .................................................................................................. 19
2. Justificación .......................................................................................................................... 21
3. Objetivos ............................................................................................................................... 24
3.1 Objetivo General ................................................................................................................. 24
3.2 Objetivos Específicos .......................................................................................................... 24
4. Marco Referencial ................................................................................................................. 25
4.1 Estado del Arte .................................................................................................................... 25
4.2 Marco Teórico ..................................................................................................................... 30
4.2.1 Proceso de Fermentación del Cacao .................................................................................. 30
4.2.2 Roles de los Microorganismos Involucrados en la Fermentación ...................................... 32
4.2.2.1 Levaduras ...................................................................................................................... 32
4.2.2.2 Bacterias ........................................................................................................................ 35
4.2.3 Métodos de Identificación Molecular ................................................................................ 36
4.2.3.1 Métodos Basados en el Análisis de Regiones Ribosómicas. .......................................... 37
4.2.3.1.1 Secuenciación de Regiones Ribosómicas .................................................................... 38
4.2.3.1.2 Polimorfismo de Longitud en los Fragmentos de Restricción del rDNA/rRNA (RFLPs)
.................................................................................................................................. 38
4.2.3.1.3 PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) ............................................. 39
4.2.3.1.4 PCR en Tiempo Real .................................................................................................. 39
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4.3 Marco Legal ........................................................................................................................ 40
5. Hipótesis ............................................................................................................................... 42
5.1 Hipótesis Nula ..................................................................................................................... 42
5.2 Hipótesis Alternativa ........................................................................................................... 42
6. Método .................................................................................................................................. 43
6.1 Diseño del Estudio .............................................................................................................. 43
6.2 Metodología ........................................................................................................................ 43
6.3 Materiales y Métodos ................................................................................................ 44
6.3.1 Cultivo de Levaduras de Interés ........................................................................................ 44
6.3.2 Extracción y Cuantificación de ADN Genómico ............................................................... 44
6.3.2.1Amplificación por PCR .................................................................................................. 45
6.3.2.2 Electroforesis................................................................................................................. 46
6.3.2.3 Purificación de PCR ...................................................................................................... 47
6.3.2.4 Secuencia y Filogenia.. .................................................................................................. 47
7. Resultados ............................................................................................................................. 49
7.1 Extracción, Cuantificación y Purificación de ADN Genómico ............................................. 49
7.2 Amplificación por PCR ....................................................................................................... 50
7.3 Análisis de Secuencia y Filogenia para cada Aislado ........................................................... 52
8. Discusión .............................................................................................................................. 61
9. Conclusiones ......................................................................................................................... 67
10. Recomendaciones ................................................................................................................ 68
Referencias Bibliográficas......................................................................................................... 69
Apéndices ................................................................................................................................. 77
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Lista de Tablas
pág.
Tabla 1 Concentración de ADN Levaduras Analizadas.............................................................. 49
Tabla 2 Resumen Identificación Levaduras de Interés ............................................................... 55
Tabla 3 Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 246 en la Región ITS-NL
del ADNr .................................................................................................................................. 56
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Lista de Figuras
pág.
Figura 1 Estructura del ADN Ribosómico Nuclear .................................................................... 38
Figura 2 Esquema General de la Metodología ........................................................................... 43
Figura 3 Electroforesis Gel de Agarosa Primer Set de Levaduras .............................................. 51
Figura 4 Electroforesis Gel de Agarosa Segundo Set de Levaduras............................................ 51
Figura 5 Análisis de Control de Calidad (Qualitycheck) para la Secuencia Obtenida de 29A NL-
1F ............................................................................................................................................. 53
Figura 6 Relaciones Evolutivas de Taxones ............................................................................... 57
Figura 7 Árbol Filogenético ...................................................................................................... 59
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Lista de Apéndices
pág.
Apéndice 1. Electroforesis......................................................................................................... 77
Apéndice 2. Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Torulaspora
Delbrueckii Levadura 195 ......................................................................................................... 80
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Abreviaturas
µl Microlitos (1 x 10 litros)
BAA Bacterias ácido-acéticas
BAL Bacterias ácido-lácticas
g Gramos
l Litros
min Minutos
ml mililitros (1 x 10-3 litros)
mM milimolar (1 x 10-3 molar)
pb Pares de bases
rADN Ácido desoxirribonucleico ribosomal
PCR Polymerase Chain Reaction (siglas en inglés)
sp Especie
YGC Agar al extracto de levadura dextrosa y cloranfenicol
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Resumen
Título: Identificación Molecular de Levaduras Asociadas a la Fermentación de Cacao
Artesanal en el Departamento de Santander
Autor: León Díaz, Laura Katherine
Palabras clave: Cacao, levaduras fermentadoras, ADN ribosomal
Descripción:
El cacao ha sido priorizado en Colombia como uno de los productos agropecuarios con
mayor potencial gracias al reconocimiento mundial de la calidad de los genotipos que se cultivan
en el país (cacao criollo, forastero e híbrido) ya que cuenta con las condiciones adecuadas para el
cultivo de este fruto. La fermentación es un proceso de reacciones químicas, mediante las cuales,
los azúcares contenidos en la pulpa se transforman en productos como agua, alcohol etílico y
ácido acético, entre otras sustancias, por la acción de microorganismos como las levaduras.
En este estudio se realizó una caracterización e identificación molecular de levaduras
relacionadas a la fermentación de cacao (Theobroma cacao L) mediante PCR punto final de las
regiones 5.8S ITS y 26S (dominio D1/D2) del ADN ribosomal (ADNr) utilizando dos pares de
cebadores específicos para cada región (ITS y NL) empleando así los siguientes ITS1 (5'-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'); NL-1F (5’-
GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) y NL-4R (5’-GGT CCG TGT TTC AAG
ACG G-3’) realizando un análisis filogenético para las regiones y determinar su género y
especie.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 13
Se identificaron un total de 40 aislados destacándose Hanseniaspora opuntiae, Pichia
kluyverii y Torulaspora delbrueckii como las levaduras dominantes en este estudio, seguidas de
Cándida parapsilopsis, Cándida sobosivorans, Criptococcus sp, Hanseniospora meyeri, Pichia
kluyverii, Pichia kudriavzevii, Pichia mashurica, Pichia occidentalis, Rhodotorula acuta,
Rhodotorula mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, y Wickerhamomyces anomalus, todas
estas con capacidad productoras de compuestos volátiles que le aportan propiedades
organolépticas a los granos de cacao.
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Abstract
Title: Molecular Identification of Yeasts Associated with the Fermentation of Artisan
Cocoa in the Department of Santander
Author: León Díaz, Laura Katherine
Keywords: Cocoa, fermenting yeasts, ribosomal DNA,
Description:
Cocoa has been prioritized in Colombia as one of the agricultural products with the
greatest potential thanks to the worldwide recognition of the quality of the genotypes that are
cultivated in the country (Creole, foreign and hybrid cocoa) since it has the appropriate
conditions for cultivation. of this fruit. Fermentation is a process of chemical reactions, through
which the sugars contained in the pulp are transformed into products such as water, ethyl alcohol
and acetic acid, among other substances, by the action of microorganisms such as yeast.
In this study, a molecular characterization and identification of yeasts related to cocoa
fermentation (Theobroma cacao L) was carried out by end-point PCR of the 5.8S ITS and 26S
regions (D1 / D2 domain) of ribosomal DNA (rDNA) using two pairs of specific primers for
each region (ITS and NL) thus using the following ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 ')
and ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'); NL-1F (5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAG
GAA AAG-3 ') and NL-4R (5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3') performing a
phylogenetic analysis for the regions and determining their gender and species.
A total of 40 isolates were identified, highlighting Hanseniaspora opuntiae, Pichia
kluyverii and Torulaspora delbrueckii as the dominant yeasts in this study, followed by Candida
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 15
parapsilopsis, Cándida sobosivorans, Criptococcus sp, Hanseniospora meyeri, Pichia
kluyhurria, Pichia kluyverria, Pichia kluyhurria occidental , Rhodotorula acuta, Rhodotorula
mucilaginosa, Saccharomyces cerevisiae, and Wickerhamomyces anomalus, all of these with the
capacity to produce volatile compounds that provide organoleptic properties to cocoa beans.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 16
Introducción
El cacao es uno de los productos agrícolas de mayor exportación en el mundo,
constituyéndose como la economía más importante que sostiene algunos países de Latinoamérica
y África; reportes de los años 2017/2018 por la Organización Internacional del Cacao (ICCO)
mencionan que alrededor de más de 400 toneladas son producidas en todo el mundo. Santander
principal departamento cacaotero de Colombia, según cifras de Federación Nacional de
Cacaoteros (Fedecacao, 2013) se ha caracterizado por ser productor de un fruto fino y de
agradable aroma, además de obtener una mezcla de sabores frutales e intensos dejando liberar
lentamente y por un largo tiempo el sabor de un extraordinario chocolate criollo. Posterior a la
obtención de los granos, se requiere de una serie de procesos fundamentales para el sabor del
producto como fermentación y secado, seguido de tostado, conchado, templado y molido.
Durante la fermentación las bacterias y levaduras actúan en una sucesión microbiana
definida y compleja, en la que el comportamiento de las diferentes especies impulsa la
degradación de la pulpa de frijol que contribuye como precursor del sabor a chocolate (Afoakwa
et al, 2011). En particular, las levaduras son los primeros microorganismos que crecen al
comienzo de la fermentación y dominan durante las primeras 30 a 40 h; se consideran
fundamentales para la fermentación del grano de cacao, desempeñando diferentes roles
importantes como: la descomposición del ácido cítrico presente en la pulpa, la secreción de
pectinasas que provocan la degradación de la pulpa, la producción de etanol a través de la
fermentación de azúcares (principalmente glucosa) bajo condiciones de bajo oxígeno, que
eliminan los cotiledones del grano de cacao, la producción de diferentes ácidos orgánicos por
diferentes vías metabólicas y la producción de importantes compuestos orgánicos volátiles que se
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 17
difunden al interior de los granos y reaccionan con las sustancias responsables del sabor del
producto final durante el proceso de tostado posterior (Ludlow et al, 2016).
Durante la fermentación, la temperatura aumenta entre 48-52 ° C durante 57 y 80 h, y
solo se observa un crecimiento marginal de levaduras. Después de la fermentación, los granos de
cacao se secan al sol o en secadores mecánicos hasta aproximadamente un 5% de humedad en
los cotiledones y un 7% de humedad en la cáscara (Mota et al, 2018).
Este proceso se subdivide en tres fases, durante la primera actúan las levaduras gracias a
las condiciones iniciales en la pulpa del grano de cacao como el ambiente anaeróbico y el bajo
nivel de pH. En esta fase, se lleva a cabo una fermentación alcohólica y aparecen entre 5 y 6
especies diferentes de levaduras como Dedaryomyces, Hansenulaa, Kloeckera, Rhodotorula, y
Torulopsis que luego desaparecen dejando su lugar a Hanseniaspora que es la predominante
durante las primeras 24 horas, Saccharomyces y Pichia priman durante las 36-38 horas y
Cándida suele encontrarse durante todo el proceso de la fermentación o al final. Las especies
encontradas con mayor frecuencia son S. cerevisae, C. krusei, K. apiculata, H. anomala Pichia
fermentans, y Schizosaccharomyces pombe. Por último, cuando se llega a una temperatura de
50ºC las levaduras dejan de crecer y son sustituidas por bacterias acéticas de los géneros
Acetobacter y Gluconobacter que aprovechan la aireación y el etanol para producir ácido acético
dando paso a la segunda y tercera fase de la fermentación. (Romero et al, 2012)
Diferentes autores han estudiado la biodiversidad de las levaduras implicadas en la
fermentación del cacao. En particular, la presencia de varias especies, entre las cuales las más
frecuentes pertenecen al género
andida, Kluyveromyces, Hansenula, Hanseniaspora, Kazachstania,
Meyerozyma, Pichia, Rhodotorula, Saccharomyces, Saccharomycopsis, Schizosaccharomyces, W
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 18
ickerhamomyces, y Cryptococcus spp. (Maura et al, 2016). Sin embargo, muy pocos autores
exploraron la biodiversidad después del secado. Identificar las levaduras presentes durante el
proceso de fermentación permitirá establecer los actores principales y contrastarlos con las
características organolépticas del producto terminado. Generando valor agregado en el proceso
productivo.
Este estudio identifica las levaduras fermentadoras de cacao artesanal del departamento
de Santander amplificando las regiones ITS y NL del ribosoma, a través de PCR punto final, las
secuencias obtenidas posterior a los análisis computacionales permiten identificar cada una de
estos aislados, contrastándolas con las secuencias depositadas en el NCBI (Blastn), a su vez se
realizó un análisis filogenético que enriquece la identificación para finalmente generar un
panorama de los géneros y especies de levaduras que predominan en la fermentación del cacao
artesanal en Santander.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 19
1. Planteamiento del Problema
En Colombia, se han desarrollado estudios donde se ve reflejada la influencia de la
fermentación sobre las características de calidad del grano; sin embargo, la caracterización de los
microorganismos presentes durante la fermentación del cacao no es abundante, detallando
escazas investigaciones acerca del papel que cumplen los microorganismos en este tipo de
procesos. (Cardona, 2016).
En este proceso los microorganismos como las levaduras juegan un papel importante ya
que existe una relación entre las variaciones de temperatura, pH y humedad, la formación de
alcoholes, ácidos y compuestos polifenólicos que pueden disminuir el sabor amargo
produciéndose reacciones bioquímicas que forman el chocolate. (López et al, 2015).
Se requiere ir más a fondo sobre la capacidad que tienen las levaduras en la producción
de compuestos aromáticos en cacao, pues algunos trabajos, han establecido el impacto de los
compuestos volátiles sobre el aroma de los granos, reflejando la importancia de la fermentación
y el secado en la expresión de los materiales en la calidad aromática (Payne et al., 2010). A su
vez, la etapa del procesamiento del grano, aún necesita de estudio, pues el ecosistema
microbiano que participa no es controlado y sigue siendo una fase empírica en las producciones
artesanales del departamento de Santander.
Además de que se desconoce la caracterización de los grupos de levaduras que actúan en
el proceso de fermentación de cacao artesanal que pueden estar funcionando en el desarrollo de
aromas y texturas distintivos que le confieren un valor agregado en la tecnificación del proceso.
La identificación y caracterización a nivel molecular de estos microorganismos fermentadores
que proporcionan dichas características, son de gran interés pues permiten una tecnificación en
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 20
cuanto al proceso de fermentación y las características del producto terminado, facilitando la
generación de productos con aromas distintivos, planeados meticulosamente especialmente por
el control y formulación de consorcios microbianos para este fin. (Camu et al 2010).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 21
2. Justificación
Los cultivos iniciadores o “starter” consisten en una especie o combinación de especies
microbianas que una vez adicionados a un producto originan un conjunto de transformaciones en
los componentes básicos (glúcidos–proteínas–lípidos) con un resultado final que se manifiesta en
el cambio de la textura, color y sabor del producto final, incrementando su poder de
conservación y en ocasiones aportan efectos benéficos para la salud del consumidor.
Los microorganismos empleados como cultivos iniciadores pueden ser bacterias,
levaduras y mohos individualmente o una mezcla de ellos (bacteria-bacteria; bacteria-levadura;
bacteria-moho; moho-moho; moho-levadura; levadura-levadura). (González et al, 2013)
Este tipo de iniciadores permitirían la producción de granos de cacao uniformemente
fermentados, con características organolépticas distintivas, estos criterios de éxito han sido
aludidos a una descomposición acelerada de la pulpa con el objetivo de reducir la acidez de las
semillas, limitando la cantidad de sustratos (azúcares de pulpa) disponibles para la producción de
ácidos orgánicos y aumentando la aireación de la masa de fermentación (Schwan, 2014). El
resultado que se obtiene gracias a las levaduras son los numerosos compuestos volátiles cuya
mezcla compleja define sus atributos sensoriales.
Los compuestos volátiles tienen diferente origen: a) Pueden estar contenidos en la
materia prima y variar entre especies, regiones geográficas y entre condiciones climáticas de
cultivo; o b) pueden generarse durante la fermentación en función de la cepa, características del
mosto y condiciones del proceso, incluyendo durante la maduración del producto (Rodríguez,
2011).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 22
Aprovechando la relevancia económica que presenta el departamento de Santander, en
conjunción con los pocos estudios que abordan la caracterización de las levaduras iniciadoras de
la fermentación, se hace necesario comprender y caracterizar estos actores fundamentales del
proceso y a su vez valorar la contribución de especies de levaduras que le proporcionan
características de textura, olor y sabor al proceso de transformación de cacao. El rol de los
microorganismos presentes en este proceso hablando de la diversidad de los tipos de cacao podrá
ofrecer desarrollo al momento de realizar un cultivo óptimo para mejorar la fermentación,
adquirir aromas deseados en el chocolate, obtener productividad constante en la fermentación y
una excelente calidad en condiciones controladas.
La caracterización de estos actores fundamentales permitirá desarrollar cultivos
iniciadores comerciales que perfilen características deseadas durante el proceso de fermentación
modulado por las levaduras proporcionando excelentes cualidades organolépticas al producto
terminado, que permitirán la inclusión al comercio. La industrialización de la fermentación del
cacao colombiano proporcionaría un mayor control sobre la calidad de los granos y el chocolate
derivado de ellos. (Batista et al., 2016). A partir de este proceso se pretende que durante la
fermentación los cultivos iniciadores se basen en levaduras ya que estos microorganismos son
necesarios para obtener una transformación exitosa de la almendra. (Ho, et al 2015).
Esta investigación hace parte de un macro proyecto que pretende establecer cultivos
iniciadores en la fermentación del cacao en Santander asociando las cepas a la producción de
compuestos volátiles de interés. En este trabajo, se presenta la identificación molecular de las
levaduras aisladas, mediante la amplificación de regiones informativas del ribosoma 26S y 5.8S
de las levaduras, como lo son el espaciador transcrito interno (ITS) y NL, usando reacción en
cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas inglés), y comparando con las secuencias
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 23
consignadas en el repositorio del Centro Nacional para la información biotecnológica (NCBI),
además de realizar análisis filogenético para poder observar las relaciones entre las levaduras
aisladas que serán el insumo para el contraste posterior con la producción de compuestos
volátiles.
Considerado este panorama, se plantea la siguiente pregunta de investigación:
¿Qué especies de levaduras cultivables con producción de compuestos volátiles de
interés, predominan en la fermentación espontánea del cacao?
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 24
3. Objetivos
3.1 Objetivo General
Realizar la caracterización molecular de levaduras cultivables asociadas a la fermentación
espontánea del cacao, amplificando el gen 26S y la región ITS1-5.8S.
3.2 Objetivos Específicos
Establecer los parámetros de reacción y amplificación para el gen 26S y la región ITS1-
5.8S
Identificar las levaduras aisladas asociadas a la fermentación espontánea del cacao.
Establecer la relación filogenética entre las levaduras identificadas y otras especies
reportadas.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 25
4. Marco Referencial
4.1 Estado del Arte
La fermentación de la pulpa de los granos de cacao por microorganismos es esencial para
desarrollar los precursores del sabor a chocolate. Actualmente, la fermentación del cacao todavía
se realiza mediante un proceso tradicional no controlado a través de un consorcio de especies
nativas de levaduras, bacterias del ácido láctico y ácido acético.
Estudios como el de (Zhao, & Fleet, 2014) utilizaron un enfoque novedoso para
determinar el papel de las levaduras y su contribución a la calidad del chocolate, empleando 2
tipos de cajas de fermentación: a la primera le agregaron natamicina (aditivo alimenticio
inhibidor de levaduras) mientras que la segunda se manejó una fermentación normal (control).
Demostraron que levaduras como Hanseniaspora guilliermondii, Pichia kudriavzevii y
Kluyveromyces marxianus fueron las especies principales encontradas en la fermentación. Su
identificación se llevó a cabo mediante extracción y amplificación de PCR empleando cebadores
específicos para la región de ADNr 5.8S-ITS como ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)
e ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′). Posteriormente los datos obtenidos se
sometieron a la base de datos GenBank donde se identificaron comparando la homología de
secuencia con los datos disponibles.
Los análisis fisicoquímicos realizados mostraron que los granos fermentados sin
levaduras tenían un mayor contenido de cáscara, y menor producción de etanol, además de
mayor cantidad de ésteres durante la fermentación y una menor presencia de pirazinas en el
producto tostado, además de esto, los granos eran de color violeta violáceo más no
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 26
completamente marrones; el chocolate preparado a partir de estos granos sabía más ácido y
carecía del sabor característico del chocolate. Los granos fermentados con crecimiento de
levadura fueron completamente de color marrón y dieron chocolate con caracteres típicos que
fueron claramente preferidos por los paneles sensoriales. Estos hallazgos demuestran que el
crecimiento y la actividad de la levadura fueron esenciales para la fermentación del grano de
cacao y el desarrollo de las características del chocolate.
Otro estudio realizado por (Jespersen et, al 2015) donde identificaron 496 cepas de
levadura a través de análisis microbiológicos convencionales y mediante la amplificación de sus
regiones ITS1-5.8S rDNAITS2 y secuenciación del dominio D1/D2 del ADN ribosómico de
subunidad grande (26S); empleando el uso de primers ITS1 (5’ -TCC GTA GGT GAA CCT
GCG G-3’ ) e ITS4 (5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ) para la primera región y NL-1
(5’ -GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) y NL-4 (5’ -GGT CCG TGT TTC AAG
ACG G-3’) fueron utilizados para la amplificación del dominio D1/D2. El estudio menciona que
tomaron muestras de granos de cacao en dos ocasiones distintas durante las fermentaciones en
pila y en bandeja en Ghana, África Occidental. Encontraron que Candida krusei era la especie
dominante durante la fermentación en pilas, seguida por P. membranifaciens, P. kluyveri,
Hanseniaspora guilliermondii y Trichosporon asahii, mientras que Saccharomyces cerevisiae y
P. membranifaciens fueron las especies dominantes durante la fermentación en bandeja, seguida
de números bajos. de C. krusei, P. kluyveri, H. guilliermondii.
Probablemente las sucesiones microbiológicas observadas durante la fermentación del
cacao tanto en las pilas y las bandejas se deban a cambios en el microambiente, es decir, cambios
en la disponibilidad de nutrientes, pH, temperatura, presencia y concentración de ácidos
orgánicos, así como en la concentración de oxígeno. Es por esto que el aumento relativo de P.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 27
membranifaciens durante la fermentación del cacao podría estar relacionado con su tolerancia
hacia un pH bajo y una alta concentración de ácidos orgánicos, incluido el ácido acético. Se ha
informado que P. membranifaciens adicional inhibe el crecimiento de Hanseniaspora spp. en
frutos, seguramente debido a la competencia del sustrato o la producción de sustancias
inhibidoras, como Hanseniaspora spp. son bastante sensibles al etanol y otros metabolitos
secundarios. También se ha informado que las cepas de P. membranifaciens y P. kluyveri
producen micocinas que inhiben otras levaduras como S. cerevisiae y Candida spp. Las cepas de
C. krusei aisladas de la masa de maíz fermentado autóctono en Ghana han demostrado
previamente ser más tolerantes a la presencia de ácidos orgánicos que S. cerevisiae
Arana et al, (2015) mencionan que en México el proceso de fermentación del cacao es un
paso muy importante para la generación de compuestos aromáticos, que son atribuibles al
metabolismo de los microorganismos involucrados. Existen algunos reportes sobre este proceso
y la identificación de microorganismos; sin embargo, no hay informes que identifiquen las
levaduras involucradas en un proceso de fermentación de cacao mexicano utilizando técnicas de
biología molecular, incluido el polimorfismo de longitud de fragmento restringido (RFLP) y la
electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE). Su principal enfoque en este estudio
fue identificar las principales especies de levaduras asociadas con las fermentaciones de cacao
mexicano empleando técnicas dependientes e independientes del cultivo logrando dos muestreos
con una diferencia de tiempo de 1 año en el mismo sitio.
Con la aplicación de métodos moleculares, la técnica independiente del cultivo (PCR-
DGGE), se vertió 1 µL de ADN microbiano total extraído de los granos de cacao en cada tiempo
de fermentación en un tubo que contenía un PureTaq Ready-To-Go PCR Beads junto con el
NL1GC (5’-CGC -CCG-CCG-CGC-GCG-GCG-GGC-GGGGCG-GGG-GCA-TAT-CAA-TAA-
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 28
GCG-GAG-GAA-AAG3’) y LS2 (5’-ATT-CCC-AAA-CAA-CTC-GAC- TC-3’), posterior a
esto se realizó la secuenciación del dominio D1 / D2 del gen 26S rRNA empleando los primers
NL1 (5’ -GCA-TAT-CAATAA-GCG-GAG-GAA-AAG-3’ ) y NL4 (5’ -ATTCCC-AAA-CAA-
CTC-GAC-TC-3’ ) mediante parámetros guiados por otros autores. Los resultados arrojaron que
la levadura predominante con la técnica en DGGE corresponde a Hanseniaspora sp, seguida de
P. kudriavzevii y P kluyveri sin embargo Saccharomyces cerevisiae fue la principal especie
aislada en ambas ténicas. Los autores mencionan que la diferencia en ambas técnicas con
respecto a las levaduras encontradas se debe a la sensibilidad de DGGE, lo que indica que si una
especie se encuentra en una relación de 10:1 a 100:1, la intensidad de la banda podría ser muy
débil o incluso desaparecer.
Koné et, al (2016) refiere que el sabor del cacao es la propiedad organoléptica más
importante para los consumidores de chocolate. Los granos de cacao crudo de Costa de Marfil no
son conocidos por su excelente calidad de aroma. En búsqueda de la mejora de la calidad del
cacao crudo, este estudio abordó la determinación y control de las condiciones de formación del
compuesto aromático teniendo en cuenta determinar la contribución potencial de la levadura
asociada a la fermentación a la formación de perfiles sensoriales para los granos de cacao. Se
Utilizó métodos moleculares como PCR, se amplificó un fragmento de la región D1 / D2 del gen
de ADNr 26S utilizando cebadores universales tales como NL1 GC (5'-CGC CCG CCG CGC
GCG GCG GGC GGGGCG GGG GCC ATA TCA ATA AGC GGA GGA AAA G-3 '; Sigma);
LS2 (5'-ATT CCC AAA CAA CTC GAC TC-3 '; Sigma), y algunos métodos sensoriales para
determinar el potencial de contribución de sabor de algunas levaduras predominantes aisladas de
ensayos de fermentación de cacao realizados alrededor de Abidjan.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 29
Se encontró que durante el proceso de identificación un total de diez especies de levadura
involucradas en la fermentación del cacao, pero entre ellas, seis cepas fueron identificadas como
Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Pichia kudriavzevii, Pichia
galeiforms, Galactomyces geotrichum y Wickerhamomyces anomalus. Estas levaduras
identificadas produjeron un total de 33 compuestos aromáticos agrupados en cuatro familias
como ésteres, alcoholes, ácidos y otros. Entre todas las levaduras involucradas en la
fermentación realizada en Abidjan, P. kudriavzevii, S. cerevisiae, G. geotrichum y W.
anomaluspodrían se consideran como los contribuyentes más importantes a la formación de
compuestos aromáticos específicos del cacao. Estas capacidades de producción de aroma de
cacao de los aislados de levadura podrían usarse para mejorar el perfil sensorial de granos de
cacao crudos u otros alimentos fermentados. Además, algunos aislados de levadura específicos
pueden usarse como marcadores biológicos para predecir la determinación de las características
sensoriales del chocolate e indicar el origen geográfico o la historia de procesamiento de los lotes
de granos de cacao.
Un estudio reciente realizado en Colombia por (Delgado et, al 2020) donde explica que
las levaduras juegan un papel importante en el proceso de fermentación del cacao. Aunque la
función más relevante es la degradación de los azúcares y la producción de etanol, hay poca
comprensión de las actividades y atributos de las enzimas que les permiten sobrevivir incluso
después del secado. Exploraron la biodiversidad funcional de levaduras asociadas con granos
fermentados de cacao criollo colombiano, capaces de sobrevivir después del secado.
Se aislaron e identificaron 12 especies pertenecientes a 10 géneros de levaduras tolerantes
a osmo, ácido, termo y desecación a partir de granos de cacao fermentados y secos, mediante
técnicas moleculares como el uso de PCR, el ADN de todos los aislamientos se sometió a
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 30
polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) de la región ITS1-5.8S rRNA-
ITS2 (ITS). La región ITS se amplificó con los cebadores ITS1 (5'-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3') y la
identificación a nivel de especie se confirmó mediante la secuenciación del bucle D1-D2 del gen
que codifica el rRNA 26S, después de la amplificación con los cebadores NL1 / NL4 para
obtener un producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), las levaduras destacadas
fueron Pichia kudriavzevii y S. cerevisiae como las más frecuentes. Por primera
vez reportamos la presencia de Zygosaccharomyces bisporus en granos de cacao fermentados. Se
encontró que la resistencia a la desecación está relacionada con las diferentes capacidades de
degradación de los sustratos de fermentación, lo que sugiere que pueden existir relaciones
asociativas entre las diferentes especies de levaduras y sus productos de degradación. Además, el
aumento de la termo tolerancia de algunas especies se relacionó con la presencia de polifenoles
en el medio, que podrían jugar un papel fundamental en la conformación de la composición de la
comunidad microbiana.
4.2 Marco Teórico
4.2.1 Proceso de Fermentación del Cacao
Los granos de cacao pertenecientes al árbol (Theobroma cacao) son la principal materia
prima para la producción de chocolate; están cubiertos por una mazorca o vaina que tiene entre
30 y 40 granos cubiertos con una capa mucilaginosa de aspecto viscoso y adherente. Como parte
del proceso de la fabricación del chocolate, se realiza una serie de trabajos que comprenden
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 31
desde la recolección, tostado, y conchado que se encargan de potencializar el sabor característico
del chocolate. (Afoakwa et al., 2011; Lima et al., 2011; Schwan y Wheals, 2014).
Cuando la transformación inicia, el cacao crudo mantiene un sabor astringente y
desagradable es por esto que la fermentación es un paso esencial para eliminar la capa de pulpa
que los cubre y al mismo tiempo desarrollar precursores de sabor que destacan al chocolate
(Fowler, 2011; Thompson et al., 2013). Para llevar a cabo una fermentación antes de obtener el
producto terminado, puede realizarse en dos sistemas de fermentación como las pilas y charolas,
en el primer sistema se hacen pilas de estos granos rompiendo las vainas acumulándolos para ser
volteados cada 24-72 horas respectivamente para asegurar que el aire circule entre ellos. El
segundo sistema consiste en usar charolas posicionando los granos de cacao en capas delgadas y
luego acomodar las charolas una encima de otra, de tal manera que el aire pase a través de ellas y
que al mismo tiempo no sea necesario mover los frijoles cada cierto tiempo.
La ecología microbiana y el rol que llevan a cabo este proceso natural o espontáneo
surgen en la pulpa como sustrato de fermentación que tiene las condiciones adecuadas para el
crecimiento microbiano como diversas levaduras, bacterias del ácido láctico (BAL) y bacterias
del ácido acético (BAA) que se desarrollan entre sí. Dentro de las levaduras aparecen entre 5 y
6 especies diferentes como Dedaryomyces, Hansenulaa, Kloeckera, Rhodotorula, y Torulopsis
que luego desaparecen dejando su lugar a Hanseniaspora que es la predominante durante las
primeras 24 horas, Saccharomyces y Pichia priman durante las 36-38 horas y Cándida suele
encontrarse al final o en todo el proceso de la fermentación, Las especies encontradas con mayor
frecuencia son S. cerevisae, C. krusei, K. apiculata, H. anomala Pichia fermentans, y
Schizosaccharomyces pombe (Ardhana y Fleet, 2013; Maura et al., 2016; Jespersen et al., 2015;
Nielsen et al., 2010).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 32
Dentro de las bacterias del ácido láctico (BAL) se encuentran Lactobacillus plantarum y
Lactobacillus fermentum crecen con mayor frecuencia, aunque a veces se informan
contribuciones de las especies Pediococcus y Leuconostoc (Camu et al., 2010b; Kostinek et al.,
2014; Nielsen et al., 2010). Y más tarde bacterias del ácido acético (BAA) como Acetobacter
pasteurianus es con frecuencia el principal contribuyente, pero otras especies también están
involucradas, incluidas Gluconobacter oxydans, Acetobacter tropicalis, Acetobacter lovaniensis
y Acetobacter syzygii (Ardhana y Fleet, 2013; Camu et al., 2010b; Lefeber et al., 2011; Nielsen
et al., 2010).
4.2.2 Roles de los Microorganismos Involucrados en la Fermentación
4.2.2.1 Levaduras. Las levaduras son hongos unicelulares constituidas en su mayor parte
por células aisladas suelen ser esféricas, elipsoidales/ovoides, cilíndricas con terminaciones
esféricas, apiculadas, ojivales, triangulares, encorvadas, filamentosas. Las dimensiones pueden
oscilar entre 1-3 μM hasta los20-50 μM de longitud según la especie, nutrición, edad y otros
factores que tenga previsto durante su desarrollo. Es posible encontrar levaduras formadoras de
pigmentos que comprende la gama de colores entre los que destacan crema, blanco, negro, rosa,
rojo, naranja y amarillo (Kurtzman, Fell y Boekhout, 2011).
Su reproducción puede realizarse de forma sexual mediante esporulación formando
esporas haploides que luego podrán conjugarse para producir células diploides y seguir con el
ciclo de reproducción, mientras que la reproducción asexual ocurre gemación, fisión y por la
producción de blastoconidias en tallos conocidos como esterigmas (Cabej, 2012).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 33
Relacionado a su forma morfológica las levaduras pueden clasificarse en dos grupos
filogenéticos: “Levaduras ascomicetes y Basidiomicetes”. La primera clase forman ascas libres
establecidas entre 1 a 8 ascosporas haploides producidas como resultado de cariogamia y meiosis
haciéndolas más resistentes al calor y a la desecación manteniendo la viabilidad de la especie
durante los cambios adversos del medio ambiente. Las levaduras basidiomicéticas forman un
basidio cilíndrico y alargado en cuyo extremo se originan las basidiosporas, aunque también
suelen presentar pseudohifas y clamidosporas cuya reproducción se da de forma asexual
mediante gemación (Cabej, 2012).
Dentro de las características fisiológicas, La mayoría de las levaduras crecen a una
temperatura entre 5° y 37°C obteniendo un valor óptimo situado hasta los 28°C. Sin embargo, en
ambientes naturales su temperatura óptima puede variar rigurosamente. Por lo general las
levaduras que habitan en la superficie, se encuentran expuestas a temperaturas máximas que van
desde los 40°C a 55°C bajo condiciones de luz intensa o a temperaturas mínimas osciladas entre
los 5°C a 10°C durante la noche. En cuanto al pH, el crecimiento óptimo para las levaduras
oscila entre4,5 a 6,5 aunque existen especies que toleran grandes variaciones del pH entre 2,8-3 a
2-8,5 (Kurtzman et, al 2011).
La ecología unicelular de las levaduras las adapta mejor a sustratos líquidos o húmedos y
algunas superficies irregulares por lo que estas se hallan típicamente en estos ambientes donde
prevalezcan nutrientes simples, solubles como azúcares y aminoácidos ricos en fuentes de
carbono. Algunas levaduras son osmotolerantes y soportan una actividad de agua (Aw) del orden
de 0.65 dependiendo de las propiedades nutritivas del sustrato, disponibilidad de oxígeno, pH y
temperatura; mientras que el efecto de la presión osmótica varia de una cepa a otra (Kurtzman et,
al 2011).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 34
Cuando el oxígeno está presente, todas las levaduras son aeróbicas ya que éstas crecen
eficientemente gracias a la presencia de carbohidratos del medio para la producción de biomasa y
CO2. Sin embargo, sin la presencia de oxígeno o su disminución, las levaduras cambian su
metabolismo anaerobio o fermentativo, y también así una menor cantidad de biomasa y
producción de alcohol (Sarmiento 2013).
Las levaduras inician la fermentación alcohólica a partir de los azúcares de la pulpa
generando etanol y ácido acético. El proceso comienza desde el ingreso al frijol para matar al
embrión y desencadenar reacciones bioquímicas endógenas que producen los precursores del
sabor a chocolate. Se cree que el ácido acético se produce por bacterias ácido-acéticas a través de
la oxidación de parte del etanol producido por las levaduras. Esta última reacción genera calor
que provoca la fermentación. La temperatura de granos aumenta a 45-50 ° C, también
considerada esencial para una fermentación exitosa y el desarrollo del sabor a chocolate (Zhao et
al, 2014).
Algunas levaduras, como Candida spp. y Pichia spp., metabolizan el ácido cítrico
haciendo que el valor del pH aumente en la pulpa, permitiendo el crecimiento de bacterias
presentes. La pérdida de ácido cítrico por el metabolismo microbiano provoca una deriva alcalina
en el pH. Esto, junto con los niveles crecientes de alcohol y aireación, inhibe las levaduras y su
actividad disminuye. Además, algunos de los aislados de levaduras producen ácidos orgánicos,
incluidos los ácidos acético, oxálico, fosfórico, succínico y málico. Estos ácidos orgánicos
débiles tendrán una capacidad de amortiguación y tenderán a reducir las fluctuaciones en el pH
(Maura et al, 2016).
Estos microrganismos tienen potencial de producción de una gran variedad de
compuestos aromáticos, principalmente, ácidos grasos, ésteres de ácidos grasos y algunas
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 35
especies producen aromas diferentes. Se sabe que los compuestos volátiles son importantes en el
desarrollo del sabor a chocolate completo (López, 2013). Se han identificado cinco levaduras
principales que producen estos compuestos volátiles: Kloeckera apiculata, S. cerevisiae, S.
cerevisiae var. chevalieri, Candida sp. y Kluyveromyces marxianus las cuales han sido
estudiadas particularmente. Por su parte cepas como Kloeckera apiculata y S. cerevisiae son las
principales productoras de volátiles como el acetato de isopropilo, acetato de etilo, metanol, 1-
propanol, alcohol isoamílico, 2,3-butanodiol, succinato de dietilo y 2-feniletanol (Lima et al,
2011).
Por otro lado, existen cepas productoras de enzimas pectinolíticas como K. marxianus, S.
cerevisiae, Candida rugopelliculosa y K. thermotolerans que descomponen el cemento entre las
paredes de las células pulpares y el jugo resultante (o "miel de cacao") se drena como "sudor".
Esta actividad enzimática es crucial durante las primeras 24 horas porque descompone la pulpa y
permite la penetración de oxígeno en la masa de cacao en fermentación, lo que permite que
crezcan bacterias aeróbicas de ácido acético (Lima et al, 2011).
4.2.2.2 Bacterias. La gran mayoría de las bacterias de ácido láctico aisladas durante la
fermentación del cacao utilizan glucosa a través de la vía de Embden-Meyerhof produciendo más
del 85% de ácido láctico. Sin embargo, algunas especies emplean glucosa a través de la ruta de
hexosa monofosfato que produce 50% de ácido láctico y etanol, ácido acético, glicerol, manitol y
CO2. Su proporción relativa cambiará así la composición del sustrato de la pulpa y, en
consecuencia, puede cambiar la sucesión microbiana (Soto et al, 2011).
Además, contribuyen primero a un aumento de la acidez al producir ácido cítrico y luego
reducen el pH al metabolizarlo y liberar subproductos no ácidos La disimilación de estos ácidos
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 36
conduce a una caída general de la acidez y un aumento del valor del pH para dar lugar al proceso
a las bacterias del ácido acético (Madigan et al, 2010).
Las bacterias del ácido acético son responsables de la oxidación del etanol en ácido
acético y de la oxidación posterior de este último en dióxido de carbono y agua. Las reacciones
exotérmicas de las bacterias del ácido acético elevan la temperatura de la masa fermentada, a
veces a 50 ° C o más. La acidez de los granos de cacao, la alta temperatura en la masa de
fermentación y la difusión e hidrólisis de proteínas en los cotiledones se han atribuido al
metabolismo de estos microorganismos. El etanol, los ácidos y el agua que se difunden en el
cotiledón actúan como solventes para que los componentes celulares se transporten a los sitios de
actividad enzimática y viceversa. (Drake, 2012).
4.2.3 Métodos de Identificación Molecular
La identificación molecular de levaduras, posee valor práctico para el desarrollo de
métodos y herramientas para la identificación rápida y precisa los métodos moleculares de
identificación de levaduras y microorganismos en general, se basan en el estudio de las
moléculas de DNA y RNA. En levaduras estos estudios se iniciaron con complementariedad del
DNA nuclear, determinándose la existencia de relaciones coespecíficas entre cepas cuyos
caracteres fisiológicos y morfológicos que se consideran determinantes para discernir entre
especies que son diferentes
A continuación, se describen todos estos métodos, los cuales han permitido el desarrollo
de herramientas de identificación de aplicación biotecnológica para el esclarecimiento de
relaciones filogenéticas entre especies y géneros de levaduras de interés.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 37
4.2.3.1 Métodos Basados en el Análisis de Regiones Ribosómicas. Las subunidades
(5.8S, 18S, y 26S) que codifican los genes ribosomales están dispuestas en tándem formando así
unidades de transcripción que se repiten en el genoma de las levaduras alrededor de 100 y 200
veces (figura 1).
Existen 2 regiones de transcripción como los espaciadores internos (ITS) y los externos
(ETS), que son divisiones procesadas que no forman parte de la molécula de ARNr final, pero se
transcriben constantemente.
A su vez estas unidades codificantes están separadas por espaciadores intergénicos (IGS)
que son llamados NTS.
Cuando se trata de identificación de levaduras las regiones ribosomales que se tienen en
cuenta son el dominio D1/D2 de la subunidad grande ribosomal (gen 26S) que se emplea para
cepas levaduriformes de taxomia ascomiceta (Kurtzman & Robnett, 2011) y la región que
comprende los espaciadores transcritos internos y el gen ribosomal 5.8S (ITS1-5.8S rADN-ITS2)
se emplea para levaduras ascomicetas como basidiomicetas.
Se ha tenido en cuenta que la región ITS ha sido catalogada como una de las principales
para la identificación de levaduras puesto que su sistema de identificación llega hasta nivel de
especie ofreciendo un mayor porcentaje de confianza, cuando se encuentra una identidad igual o
superior al 99% con secuencias depositadas en bases de datos como Genbank o Mycobank, una
levadura es identificada a nivel taxonómico de especie (Kurtzman et al., 2011)
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 38
Figura 1
Estructura del ADN Ribosómico Nuclear
Nota: en la figura se puede observar el Claster de genes del ADN ribosomal, se encuentran las unidades 18S, 5.8S y 26S. 2020.
4.2.3.1.1 Secuenciación de Regiones Ribosómicas. Este método es bajo la
determinación y comparación de secuencias nucleotídicas de estas regiones. Como se ha
mencionado anteriormente; las dos regiones más utilizadas son las correspondientes a los
dominios D1 y D2 ubicados en el extremo 5’ del gen 26S (Kurtzman y Robnett, 1998) y el gen
18S (James y col., 1997). La disponibilidad de las secuencias en bases de datos, sobre todo en el
caso de la región D1/D2 del gen 26S, hacen que esta técnica sea muy útil para asignar o
identificar una levadura desconocida a una especie concreta cuando el porcentaje de homología
de sus secuencias es superior o igual a 99% (Kurtzman y Robnett, 1998). Además, el desarrollo
de la PCR, que permite la secuenciación directa de las regiones de interés, junto con las
modernas tecnologías de secuenciación automática, hacen que la aplicación de esta técnica sea
relativamente rápida. (Li et al 2012).
4.2.3.1.2 Polimorfismo de Longitud en los Fragmentos de Restricción del rDNA/rRNA
(RFLPs). La técnica de RFLP de las regiones ITS-5.8S, se desarrolló como una alternativa de
identificación de levaduras de manera rápida para su utilización, su determinación del
polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción se basa en la diferenciación de los
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 39
organismos mediante el análisis de los patrones de ruptura que se generan en el sitio específico
del genoma cuando este es cortado empleando enzimas de restricción. Luego en un gel de
electroforesis se muestra el patrón de bandas polimórficas correspondientes a los fragmentos de
distintos tamaños, que se generan con el corte de cada endonucleasa. La similitud de los patrones
que son generados después de este proceso permite establecer relaciones entre especies y cepas
cuya existencia de patrones son únicos permitiendo la identificación (Henrick, 2010).
4.2.3.1.3 PCR-DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis). La técnica de PCR
seguida de una electroforesis en gradiente de desnaturalización se ha introducido recientemente
Mediante PCR-DGGE, los fragmentos de DNA con distintos tamaños, pero diferente secuencia
puede ser divididos en geles de poliacrilamida que tiene un gradiente linear de agentes
desnaturalizantes de DNA (es una mezcla de urea y formamida). En dicho gel de DGGE, la
doble hebra que tiene el ADN se va desnaturalizando poco a poco puesto que contiene regiones
discretas llamadas dominios de fusión que es específica para la secuencia. Cuando el fragmento
aparece parcialmente desnaturalizado, su movilidad se reduce en el gel de poliacrilamida. Así,
fragmentos del mismo tamaño, pero distinta secuencia mostrará distinto comportamiento en el
gradiente de desnaturalización (Ercolini, 2014).
4.2.3.1.4 PCR en Tiempo Real. La técnica se basa en la detección y cuantificación de una
sonda fluorescente cuya señal aumenta en proporción directa a la cantidad de producto de PCR
en la reacción. El proceso, se lleva a cabo en un termociclador que tiene un sistema de detección
capaz de capturar y cuantificar la señal emitida por el donante (ADN con sonda) al final de cada
ciclo para cada muestra. La información obtenida se representa como una curva de amplificación
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 40
que proporciona información de la cantidad de ADN que se amplifica. Este número de ciclo se
denomina ciclo umbral (Ct) y es inversamente proporcional al número de copias de la muestra
(cantidad de ADN). Por lo tanto, se puede utilizar para evaluar la cantidad inicial de la muestra
numéricamente (ADN o células) con gran precisión, dentro de una amplia gama de
concentraciones (Fernández-Espinar et al., 2016).
4.3 Marco Legal
Para este proyecto los experimentos se realizaron solamente a nivel de laboratorio con
fines de investigación, los materiales y sustancias que se generaron como efecto de este trabajo
fueron contenidos y destruidos de acuerdo con las medidas de bioseguridad implementadas por
el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología de la UDES, por lo que las actividades del
proyecto no generaron impacto ambiental. Con el fin de garantizar la trazabilidad de los
resultados, la seguridad del experimentador y demás individuos durante la ejecución de los
procedimientos y el análisis de las muestras, se tomaron en cuenta las Buenas Prácticas de
Laboratorio (BPL) establecidas por el Laboratorio de Biología Molecular y Biotecnología. Esta
investigación no involucró seres humanos o derivados.
De acuerdo con la Resolución Nº 008430 de 1993 del Ministerio de Salud de la
República de Colombia del 4 de octubre de 1993, por la cual se establecen las normas científicas,
técnicas y administrativas para la investigación en salud, esta investigación tuvo en cuenta el
Título IV de la bioseguridad de las investigaciones, Capítulo I de la investigación con
microorganismos patógenos o material biológico que pueda contenerlos. Principalmente, en sus
artículos 63-66, 68 y 71 en donde se dispone la normatividad para el manejo de estos
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 41
microorganismos. Las levaduras que se usaron en este estudio hacen parte del grupo de riesgo I y
II (nulo o bajo riesgo al individuo o la comunidad y riesgo individual moderado) En cuanto a la
manipulación de estas cepas, el artículo 68 dispone que deben procesarse en laboratorios básicos
de microbiología empleando gabinetes de seguridad cuando se considere necesario.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 42
5. Hipótesis
5.1 Hipótesis Nula
El resultado de la amplificación de las regiones del ADN ribosomal seleccionadas
permitirá la clasificación de las levaduras aisladas del proceso de fermentación espontánea del
cacao hasta el nivel de especie.
5.2 Hipótesis Alternativa
El mayor número de especies de levaduras identificadas corresponderá a los géneros de
Cándida y Saccharomyces.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 43
6. Método
6.1 Diseño del Estudio
Investigación tipo experimental
6.2 Metodología
Figura 2
Esquema General de la Metodología
Nota: en la figura se puede observar el resumen general de la metodología empleada en este estudio. 2020.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 44
6.3 Materiales y Métodos
6.3.1 Cultivo de Levaduras de Interés
Las levaduras de interés se cultivaron por agotamiento en los agares YCG y Sabouraud
(proceso realizado en el laboratorio CICTA de la Universidad Industrial de Santander, sede
Guatiguará) con un periodo de incubación de 48h a 30°C. Una vez cumplido este lapso se tomó
un inoculo para siembra en medio líquido (Caldo Sabouraud 2%) incubándolas a 30°C por 24h,
posteriormente, se transportaron a la universidad de Santander UDES, para su posterior
procesamiento.
6.3.2 Extracción y Cuantificación de ADN Genómico
Se empleó el kit de extracción de ADN genómico Wizard®, (Promega) (Epicentre®
Biotechnologies, Madison, Wisconsin, USA) según instrucciones del fabricante y las
modificaciones sugeridas por Serrano Blanco (2017). El proceso de extracción se basó en tres
momentos: a partir de 1 ml de caldo de cultivo Sabouraud se llevó a centrifugación a 7,000 rpm
× 20 minutos para sedimentar las células y eliminar el sobrenadante. Se transfirió la muestra a un
tubo de 1.5ml de micro centrífuga y se realizó la precipitación de células agregando 293µl de
EDTA (50mM), el pretratamiento de lisis de pared celular con 125µl de Proteinasa K y se llevó
una incubación a 37°C por 1 hora luego se empleó vórtex por 2 minutos, finalmente se
centrifugó 11,000 g × durante 4 minutos y se removió el sobrenadante.
La segunda etapa corresponde a la lisis celular y la precipitación de detritos, se adicionó
de 300µl de Solución nuclear de lisis y 100µl de Solución de precipitación de proteínas; se llevó
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 45
vigorosamente a vórtex por 20 segundos. Durante 5 minutos se dejó la muestra a -20°C y se
centrifugó a 11,000 g × por 3 minutos.
Finalmente, en la tercera etapa que corresponde a la precipitación y lavados del ADN; se
transfirió el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5ml de micro centrífuga y se añadieron 300µl de
isopropanol mezclando por inversión hasta encontrar la visibilidad de hebras de ADN genómico,
se centrifugó a 11,000 × g por 4 minutos se descartó el sobrenadante y se añadieron 300µl de
etanol al 70% para lavar el pellet de ADN y centrifugarlo a 11,000 × g por 2 minutos.
Posteriormente se descartó el sobrenadante y se dejó secar el etanol durante 10-15 minutos.
Se añadieron 30µl de Solución de Rehidratación de ADN y 1,5µl de solución de RNasa a
la muestra de ADN purificada; se agitó en vórtex durante 1 segundo y se centrifugó brevemente
a 4,000 rpm × 20 segundos para colectar el líquido e incubar a 37 ° C durante 15 minutos. Se
rehidrató el ADN incubándolo a 65°C durante 1 hora y añadió posteriormente 25µl de Solución
de Rehidratación de ADN y se almacenó toda la noche a 4°C para su posterior uso.
Por otro lado, la cuantificación del ADN genómico se realizó mediante el uso de
espectrofotometría con una (OD260) tomando alrededor de 1,5 a 2 µL de cada muestra en el
Nanodrop 2000. La cantidad de ADN se expresó en concentraciones de ng/µl.
6.3.2.1Amplificación por PCR. El ADN extraído se utilizó para realizar PCR y
amplificar las subunidades del ribosoma específicamente los genes 26S del dominio D1/D2 y
5.8S que comprenden las regiones ITS y NL. El mix de reacción de 2x contiene: Buffer Green
1x, MgCl2 a 1,8mM; dNTPs a 0.2 mM; primers ITS1 a 100μM (5’-TCC GTA GGT GAA CCT
GCG G-3’) e ITS4 a 100μM (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´); primers NL-1F (5’-GCA
TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-3’) a 100μM y NL-4R (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 46
G-3’) a 100μM; 25 U de Taq DNA polimerasa, entre 1 hasta 5μl de ADN dependiendo de la
levadura en estudio y completado con agua estéril.
Atendiendo los parámetros de PCR en una reacción de 50 μl según (Bornemann y Hartin,
2000) para la amplificación de las levaduras con los sets de primers ITS1 (5’-
TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’) e ITS4 (5´-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3´), fueron
utilizados para la amplificación de la región ITS1-5.8S rDNA-ITS2. Las reacciones se realizaron
en un termociclador automático (SimpliAmp Applied Biosystems A24811) En las siguientes
condiciones: desnaturalización inicial a 94 ºC durante 3 min; 30 ciclos de desnaturalización a
94ºC durante 2 minutos, anillaje a 60ºC durante 1 minuto, extensión a 72ºC durante 2,5 minutos;
elongación final a 72ºC durante 7 min; conservación a 4ºC.
Posteriormente la segunda amplificación se realizó básicamente según lo descrito por
(Crafack et al. 2013) con los primers NL-1F (5’-GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG-
3’) y NL-4R (5’-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3’) en las siguientes condiciones
desnaturalización inicial de 5 min a 94 ° C, 30 ciclos a 94 ° C durante 90 s, anillaje a 53 ° C
durante 30 s y alargamiento a 72 ° C durante 90 s, seguido de una elongación final paso a 72 ° C
durante 10 min conservación a 4ºC
6.3.2.2 Electroforesis. El producto fue verificado por electroforesis utilizando un gel de
agarosa al 0.8% corrido a 80 V durante 70 minutos. Este se cargó con aproximadamente 10 µl de
muestra y se incluyó 6 µl de marcador de peso molecular de 1 kb (GeneRulerTM DNA ladder
ready to used, Thermo Fisher Scientific) en cada gel. Las bandas fueron evidenciadas mediante
el Sistema de documentación en gel GEL DOC, de BioRad
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 47
6.3.2.3 Purificación de PCR. Según instrucciones del fabricante; la purificación de PCR
se llevó a cabo mediante el kit Sigma Aldrich (GenElute Gel Extraction Kit Sufficient For 70
Purifications). La confirmación del ADN genómico purificado se realizaba en gel de agarosa al
0.8% corrido a 80 V durante 30 minutos. Este paso se realiza con el fin de obtener amplicones de
buena calidad eliminando los contaminantes como remanentes de Buffers, dNTPs, polimerasa,
mediante un simple centrifugado y obtener una recuperación de ADN hasta de un 80% según
indicaciones del kit empleado.
6.3.2.4 Secuencia y Filogenia. A partir de 20 µl de la reacción purificada se envió a
Corpogen (Bogotá, Colombia) realizando el método de secuenciación Sanger dichas secuencias
se recibieron en archivos tipo raw, fasta y electroferogramas de calidad del proceso para su
análisis bioinformático. Las secuencias se analizaron mediante la plataforma Quality Check de
Thermo Fisher con el fin de establecer su calidad. Posteriormente, utilizando el software
BioEdit, con la herramienta Contig Assembly program, se obtuvo la secuencia del amplicón
(Contig), estas son el insumo para el análisis de bases de datos y filogenia.
Posteriormente se tomó los “contigs” obtenidos para cada una de las secuencias, se
contrastaron con la base de datos del NCBI
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch#), de las coincidencias
identificadas se tomaron las secuencias con las identidades más altas (>85%), aleatoriamente se
seleccionaron entre dos o tres para poder realizar el set de datos. Los análisis filogenéticos se
realizaron de forma individual para cada uno de los aislados, y un árbol filogenético que reúne
todos los aislamientos identificados. Los parámetros para este ensayo se definieron: árboles
individuales, método de Neighbor Joining, bootstrap de 500 repeticiones. Para el set de datos de
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 48
los aislados identificados, se realizó análisis del conjunto de secuencias en MegaX (Kumar, et al,
2018) para identificar el modelo que soporta el árbol, el bootstrap se definió en 500.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 49
7. Resultados
7.1 Extracción, Cuantificación y Purificación de ADN Genómico
Se aislaron y purificaron 70 cepas de levaduras obteniendo en promedio 337,51 ng/μl, la
relación de 260/280 determina la pureza del ADN, el rango óptimo está entre 1,8-2 para estas
muestras, la relación en promedio estuvo en 2,08 lo que denota que en la extracción no se
encuentran proteínas, lípidos o remanentes de alcoholes utilizados durante la extracción, sin
embargo, señala que pudo haber ARN en las muestras extraídas; a su vez, la relación 260/230
<1,5 mostrando contaminación con sales, el promedio de las extracciones fue de 1,58 lo que
significa presencia de sales en ciertas muestras, el detallado se describe en la (tabla 1)
Tabla 1
Concentración de ADN Levaduras Analizadas
Levadura Concentración
ADN (ng/µl) 260/280 260/230 Levadura
Concentración
ADN (ng/µl) 260/280 260/230
0 1 678 2,29 2,48 137 182,9 2,04 1,65
0 4 98,0 2,16 1,86 139 62,43 2,42 0,88
12 1102,7 1,99 2,11 140 65,63 2,25 0,86
17 103 1,61 1,06 141 54,06 1,74 0,78 19 495,6 2,17 2,1 143 1165,2 2,01 1,44
30 721,2 2,03 1,76 154 394,1 2,06 1,74
31 114,3 1,43 1,09 158 562,7 2,1 1,76
33 527,2 2,16 2,34 163 735,26 2,18 1,94
35 134 1,6 0,62 187 57,43 1,84 0,68
43 51,5 2,37 0,78 188 1145,6 2,13 2,26
44 173,1 2,08 1,73 195 114,96 2,33 1,21
45 105 1,26 0,64 200 90,26 1,69 0,75
52 43,1 1,25 0,57 211 53,4 2,36 0,65
70 289,4 2,13 1,73 218 922,26 2,23 2,31
71 259,36 2,23 2,04 219 243,2 1,82 1,14 73 242,4 2,01 1,5 227 63,5 2,26 0,71
74 618 1,99 1,85 231 465,76 1,98 1,24
81 891,1 2,18 2,39 232 348,8 2,02 1,53
85 476,2 2,15 2,14 233 291,53 2,04 1,98
87 269,4 2,1 1,89 236 25,96 2,77 0,53
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 50
Tabla 1 (Continuación).
Levadura Concentración
ADN (ng/µl) 260/280 260/230 Levadura
Concentración
ADN (ng/µl) 260/280 260/230
91 43,73 2,13 1,17 239 342,2 1,57 1,13
93 221,4 2,19 1,51 242 374,83 2,2 2,06
96 148,06 2,17 1,29 244 258,6 2,06 1,75
97 442 1,92 1,17 245 204,3 2,13 2,15
103 65,36 1,46 0,39 246 133,03 1,96 1,05 105 586,3 1,9 1,51 11C 544,5 2,06 2,09
107 107,46 1,79 0,75 13A 351,4 2,16 1,92
111 1252,5 2,28 2,36 29A 66,7 1,89 2,01
115 188,6 2,07 1,68 92A 21,6 2,36 0,92
117 300,8 2,17 2,28 99C 470,4 1,93 1,44
120 277,9 2,11 1,89 109SBA 54,7 1,83 0,88
131 936,6 2,04 1,94 110MRS 1859 2,24 2,37
132 75,56 1,89 0,56 112B 362,23 2,14 1,7
133 32,6 2,31 0,44 117A 128 2,19 1,84
134 298,6 2,3 1,8 173MRS 169,13 1,81 0,71
135 486,6 2,05 2,13 241B 40,56 1,85 0,49 136 229,4 2,12 1,84
Nota: en la tabla se observar la concentración ADN obtenido (ng/µL) de cada uno de los ensayos de extracción con
las relaciones 260nm y 280nm.2020.
7.2 Amplificación por PCR
La región que incluye el gen 5,8S y las regiones intergénicas ITS1 e ITS2 se amplificaron
utilizando los oligonucleótidos ITS-1 e ITS-4, los pesos moleculares de estas regiones se basan
en bandas entre 400 y 750pb.
Por otro lado, la amplificación del gen 26S se utilizaron los cebadores NL-1 y NL-4
cuyos pesos moleculares se mantienen entre los 600pb respectivamente
A continuación, se evidencian los resultados de amplificación mediante electroforesis en
gel de agarosa con los cebadores ITS1; ITS4 y NL-1; NL-4 para el primer y segundo set de
levaduras (figuras 3 y 4) en total se realizaron 8 sets de amplificaciones (ver apéndice A).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 51
Figura 3
Electroforesis Gel de Agarosa Primer Set de Levaduras
Nota: (A) Primers ITS carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 99C, carril 3 lev 110 MRS, carril 4 lev 74,
carril 5 lev 232, carril 6 lev 11C, carril 7 lev 19, carril 8 lev 12, carril 9 control positivo lev 4, carril 10 control
negativo. (B) Primers NL carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 99C, carril 3 lev 110 MRS, carril 4 lev
74, carril 5 lev 232, carril 6 lev 11C, carril 7 lev 19, carril 8 lev 12, carril 9 control positivo lev 4, carril 10 control
negativo. 2019.
Figura 4
Electroforesis Gel de Agarosa Segundo Set de Levaduras
Nota: Electroforesis gel de agarosa (A) primers ITS carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 45, carril 3 lev
52, carril 4 lev 97, carril 5 lev 103, carril 6 lev 107, carril 7 lev 133, carril 8 lev 163, carril 9 lev 211, carril 10 lev
231. (B) primers NL, carril 1 Marcador de peso molecular, carril 2 Lev 45, carril 3 lev 52, carril 4 lev 97, carril 5 lev
103, carril 6 lev 107, carril 7 lev 133, carril 8 lev 163, carril 9 lev 211, carril 10 lev 231. 2019.
500 250
750
A
I
m
a
g
e
n
S
E
Q
B
I
m
a
g
e
n
S
E
Q
I
250
750 500
500 750
750 500 250
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 52
7.3 Análisis de Secuencia y Filogenia para cada Aislado
Una vez se obtuvo las secuencias para cada uno de los amplicones, se realizó la
verificación de la calidad de estas, la figura 5 describe detalladamente el proceso, ejemplificando
el análisis para el aislado 29A.
Esta herramienta se encarga de tomar las secuencias examinando los picos del
electroferograma realizando así una comparación entre los más adecuados y al finalizar propone
una secuencia corregida.
Según resultados obtenidos en la (Tabla 1) y las (Figuras 3 y 4) más (Apéndice A), se
lograron aislar, extraer y amplificar mediante PCR 70 cepas de levadura, en el momento de
realizar la secuenciación a través del método de Sanger junto con su respectivo análisis
evidenciado en la figura 5, la identificación completa se realizó solo para 40 cepas de levadura,
las 30 cepas restantes no se lograron identificar, pues las secuencias de los primers reversos no
tenían buena calidad, al hacer el ensamblado, la no especificidad de la secuencia arrojaba
resultados variables.
Para este grupo de secuencias se requiere, re secuenciar, y realizar nuevamente el
análisis.
En general el porcentaje de las secuencias obtenidas fueron de excelente calidad, para los
40 aislados identificados presentes en la tabla 2.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 53
Figura 5
Análisis de Control de Calidad (Qualitycheck) para la Secuencia Obtenida de 29A NL-1F
Nota: en la figura se observa el control de calidad de la levadura 29A obtenidos con los primers NL, se muestra el
paso a paso en detalle. 2020.
Brevemente con cada uno de los cebadores se realizaron observaciones verificando su
calidad y una vez obtenidas las secuencias de las regiones amplificadas se procedió a hacer una
revisión de estas con las reportadas en las bases de datos internacionales GenBank utilizando
BLASTn (herramienta básica de búsqueda de alineación local).
La secuencia señalada en este paso B de la figura 5, es el inicio para la verificación de
afiliación parcial de cada una de las lecturas, porque se obtiene una secuencia “Forward”
corregida. Este mismo proceso se debe realizar para las lecturas “Reversas” de cada uno de los
primers utilizados. Con el fin de hacer el empalme de la secuencia completa Forward+Reverse
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 54
se debe obtener la complementaria de la reversa, este proceso se realizó en el software Bioedit
(http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) (Hall, et al 2011).
Finalmente, utilizando BioEdit, con la aplicación CAP (Contig assembly Program) se
obtiene la secuencia ensamblada. Con esta secuencia se realiza el análisis de identidad y
similitud en la base de datos del National Center for Biological Information (NCBI) utilizando la
herramienta Blast Nucleotide (Blastn)
(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch)
Las lecturas con índice >200, se aceptaron, señalando que los alineamientos se acoplaron
exitosamente con secuencias consignadas en la base de datos, las identidades consideradas en la
identificación deben ser >98 y coberturas >98 los valores de E deben ser de 0. En general se
obtuvo 140 secuencias para el set de primers ITS y 140 secuencias para el set de primers NL,
posterior a este análisis se obtuvo una excelente lectura para 40 aislados (Tabla 2), los 30
aislados restantes, presentaron baja calidad en las secuencias, lo que requiere una nueva PCR y
re-amplificación para poder realizar un análisis preciso de cada una de ellas.
Para la afiliación filogenética de los aislados identificados se utilizó el software Mega,
versión X para la construcción de los árboles, las secuencias analizadas se alinearon utilizando la
herramienta ClustalW con secuencias conocidas, utilizando el método de Neighbor Joining con
el modelo de Kimura de dos componentes, para la confiabilidad estadística se realizó un
“bootstrap” de 500 para cada árbol filogenético obtenido.
Los pasos descritos se realizaron según se detalló en la metodología y se obtuvieron las
secuencias consenso para las levaduras de interés, la tabla 2 señala el resumen en la
identificación de las secuencias de interés.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 55
Tabla 2
Resumen Identificación Levaduras de Interés
Identificación Según Blast
Levaduras Denominación
17 Candida parapsilopsis
158 Candida sobosivorans
43 Criptococcus sp*
112B, 13A, 01, 12,105, 154, 188 Hanseniaspora opuntiae
143 Hanseniospora meyeri
74, 111, 131, 132, 218, 245, 99C 110MRS Pichia kluyverii
227, 239 Pichia kudriavzevii
117, 232 Pichia mashurica
246 Pichia occidentalis
45 Rhodotorula acuta
31 Rhodotorula mucilaginosa
19, 30, 33, 81, 85, 29A Saccharomyces cerevisiae
70, 96, 139, 140, 195, 109SBA Torulaspora delbrueckii
11C, 04 Wickerhamomyces anomalus
Nota: en la tabla se observa la identificación de levaduras según la base de datos GenBank, empleando Blast-n. 2020.
Según la tabla anterior, se obtuvo un 57,14% de identificación de levaduras con excelente
calidad en el momento de realizar el contig del set de primers ITS y NL sin sobrelapamientos en
las secuencias y picos bien definidos, mientras que el porcentaje restante, es decir, el 42,85% de
las secuencias con la finalidad de obtener su género y especie no se logró debido a la baja calidad
de los primers reversos en el momento de adquirir la secuencia consenso y dar finalidad al
proceso los picos mostrados en el electroferograma no eran bien definidos presentando quizá
contaminación de otra secuencia de ADN lo que interrumpían la identificación.
Para contrastar los resultados obtenidos con el NCBI se realizó un análisis filogenético
para cada uno de los aislados de interés, presentados en la tabla 2. Para el aislado 246,
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 56
identificado como Pichia occidentalis, en la región ITS se obtuvo lecturas en BLASTn con
índice >200, lo que muestra que los alineamientos se acoplaron exitosamente con secuencias
consignadas en la base de datos, con identidades de 99,76%, cobertura del 100% y valores E de
0, lo que señala que estos resultados son confiables y se puede estimar la identificación para este
aislado, para este fragmento se encontró una relación con Pichia kudriavzevii, al contrastar la
secuencia consenso para la región NL los índices, valores E y cobertura fueron idénticos a los
descritos para ITS, afiliando el aislado con Pichia kudriavzevii, Pichia occidentalis e
Issatchenkia occidentalis con un 99,82% de identidad.
Para definir esto se realizó un análisis para una única secuencia que reuniera la región
ITS y NL encontrándose que este aislado corresponde a Pichia occidentalis con 101 hits de 125
coincidencias halladas en el blast. La tabla 3 muestra la descripción taxonómica para los aislados
correspondientes a este género y especie.
A continuación, se evidencia la identificación a nivel filogenético de uno de los géneros
encontrados de las levaduras presentadas en la tabla 2 (ver apéndice B) para la identificación
completa de los demás géneros hallados.
Tabla 3
Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 246 en la Región ITS-NL del ADNr
Descripción Taxonómica Levadura 246 ITS/NL
Taxonomía Número de Hits Número de organismos
Fungi 125 15
Sacharomycetales 124 14
Pichiae 122 12
Pichia 121 11
Pichia occidentalis 101 1
Nota: en la tabla se observa el empalme de la levadura 246 con ambos primers. 2020.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 57
Para el análisis filogenético se realizó el árbol con la secuencia completa de la región
amplificada con los primers ITS y NL, se obtuvo el árbol consenso, donde el aislado se afilia con
la cepa A2 de Pichia occidentalis (número de acceso MK4019682.1), como lo muestra la figura
6.
Figura 6
Relaciones Evolutivas de Taxones para el aislado 246 primers ITS y NL
Nota: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining (Saitou, et al, 1987). El árbol de
consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones, se toma para representar la historia evolutiva de los taxones
analizados. Las ramas correspondientes a particiones reproducidas en menos del 50% de réplicas de bootstrap se
colapsan. El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque
(500 repeticiones) se muestran junto a las ramas. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de
kimura de dos componentes. Este análisis involucró 11 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas
fueron 1º + 2º + 3º + Sin codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción de eliminación por pares). Hubo un total de 1303 posiciones en el conjunto de datos final. Los análisis
evolutivos se realizaron en MEGA X. (Kumar, et al. 2018). 2020.
El árbol de consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones, se toma para representar la
historia evolutiva de los taxones analizados.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 58
Las ramas correspondientes a particiones reproducidas en menos del 50% de réplicas de
bootstrap se colapsan.
El porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la
prueba de arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas.
Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de kimura de dos
componentes. Este análisis involucró 11 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón
incluidas fueron 1º + 2º + 3º + Sin codificación.
Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción de
eliminación por pares). Hubo un total de 1303 posiciones en el conjunto de datos final. Los
análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (Kumar, et al, 2018).
En general, los amplicones obtenidos para la región ITS como para la región NL
arrojaron resultados comparables en el BLAST, es decir: lecturas con índice >200, las
identidades >98 y coberturas >98 con valores de E de 0, en el caso de los aislados que no
pudieron definir especie con los contigs NL o ITS se realizó empalme de toda la secuencia.
Para el análisis filogenético se creó un set de datos en formato FASTA para los contigs
NL, ITS y para NL e ITS. Para el set NL se obtuvo 763 regiones conservadas, 852 regiones
variables, 452 sitios informativos parsimoniosos.
Se analizó el set de datos para establecer el mejor modelo obteniendo que la filogenia se
realiza con Maximum Likelihood, y el modelo de sustitución de Kimura de dos componentes, se
obtuvo el árbol filogenético descrito en la figura 7.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 59
Figura 7
Árbol Filogenético
Nota: La historia evolutiva se infirió mediante el método de unión de vecinos. Se muestra el árbol óptimo. El
porcentaje de réplicas de árboles en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba bootstrap (500 réplicas)
se muestra junto a las ramas. El árbol está dibujado a escala, con la longitud de las ramas en las mismas unidades
que las distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon
utilizando el método de 2 parámetros de Kimura (Kimura,1980) y están en las unidades del número de sustituciones
de bases por sitio. Este análisis involucró 79 secuencias de nucleótidos. Se eliminaron todas las posiciones con
menos del 95% de cobertura del sitio, es decir, se permitieron menos del 5% de huecos de alineación, datos faltantes
y bases ambiguas en cualquier posición (opción de eliminación parcial). Hubo un total de 427 posiciones en el
conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (Kumar, et al 2018).2020.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 60
Se muestra el árbol óptimo. El porcentaje de réplicas de árboles en los que los taxones
asociados se agruparon en la prueba bootstrap (500 réplicas) se muestra junto a las ramas. El
árbol está dibujado a escala, con la longitud de las ramas en las mismas unidades que las
distancias evolutivas utilizadas para inferir el árbol filogenético. Las distancias evolutivas se
calcularon utilizando el método de 2 parámetros de Kimura (Kimura,1980) y están en las
unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este análisis involucró 79 secuencias de
nucleótidos. Se eliminaron todas las posiciones con menos del 95% de cobertura del sitio, es
decir, se permitieron menos del 5% de huecos de alineación, datos faltantes y bases ambiguas en
cualquier posición (opción de eliminación parcial). Hubo un total de 427 posiciones en el
conjunto de datos final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X (Kumar, et al 2018)
Del árbol filogenético se resaltan las afiliaciones monofiléticas para los clados de
Saccharomyces, Torulaspora y Hanseniospora donde se identifica el ancestro común en el nodo
interno con un soporte de rama del 96%, por su parte el clado de Wickerhamomyces y Candida
son monofiléticos con un soporte de rama del 87%. El clado del Género Pichia se encuentra
definido para las especies kudriavzevii y occidentalis conectadas por un ancestro a Pichia
kluyveri. Finalmente, los géneros Candida, Rhodotorula y Criptococcus se afilian en el último
clado filogenéticamente distantes de los anteriores señalados. Para cada uno de los aislados
identificados, se confirma lo señalado en la tabla 2.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 61
8. Discusión
Actualmente se están desarrollando enfoques moleculares para proporcionar una
identificación más rápida y objetiva de levaduras en comparación con los métodos fenotípicos
tradicionales. Las dianas ribosómicas, especialmente los dominios ITS1, ITS2 y D1-D2 del
operón de ADN, se han mostrado particularmente prometedoras para la identificación
molecular. (Fell, et al, 2010).
El primer apartado de Figura 3 y 4 secciones A se encuentran los fragmentos de PCR
amplificados con primers universales ITS-1 e ITS-4 enfocándose en la región ITS-5,8S. Se
encuentran bandas de excelente calidad, claridad e intensidad manejando pesos variables entre
los 500 y 800 pb. Kabir et al., 2015, explica que el espaciador interno transcrito o ITS del ADN
ribosómico, es ampliamente utilizado en estudios filogenéticos porque constituye una fuente de
información sobre varias especies fúngicas. Entre las ventajas de la utilización de la región ITS
es el requerimiento de una cantidad baja de material genético para la amplificación y las
secuencias disponibles para la comparación facilitan en gran medida la identificación de
especies.
Además, que Schoch et al, 2012, mencionan que la región ITS es considera como el
código universal para el estudio de microorganismos del reino Fungi ya que al presentar una
longitud comprendida entre los 500 y 800 pb son sitios diana empleados para la detección
molecular y realización de estudios filogenéticos de interés puesto que estas secuencias son
cortadas y posteriormente degradas durante la maduración del ADNr. Esta región junto con el
gen 5.8S también presentan una alta probabilidad y exactitud de identificación muy definida al
momento de codificar la subunidad pequeña del ADNr.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 62
El segundo apartado de Figuras 3 y 4 secciones B y (C empleada en el apéndice A) se
evidencian los fragmentos amplificados realizados con primers universales NL-1F y NL-4R
específicamente para región 26S dominio D1/D2 de las levaduras aisladas. Se observa una gran
homogeneidad entre las bandas visualizándose a la altura de los 600 pb, además de una alta
calidad e intensidad; aunque algunas bandas se encuentran ligeramente por encima o por debajo
del rango, se debe al tamaño de los fragmentos varían de especie a especie, por ejemplo, algunos
estudios han reportado que levaduras como Metschnikowia pulcherrima amplifican alrededor de
390 pb, mientras que Hanseniaspora uvarum amplifican 760 pb o Saccharomyces cerevisiae 880
pb. (Guillamón et al., 1998).
Se conoce que el dominio D1/D2 constituye una región altamente variable de la
subunidad grande (26S) del ADN ribosómico, con diferencias entre especies de hasta una sola
base. Específicamente hablando en el caso de levaduras se ha determinado que existe una
variación superior al 1% en esta región indicando diferencia de especies. Por lo tanto, se conoce
que el tamaño promedio de esta región cercana a los 600 pb. La mayoría de levaduras pueden ser
identificadas analizando el dominio D1/D2, sin embargo, la región ITS es utilizada para
distinguir especies que son muy cercanas. (Fell, et al., 2010).
Este dominio (D1/D2) ha sido secuenciado en la mayoría de hongos ascomicetos y es
común a todas las especies de levaduras, lo que permite un reconocimiento intraespecífico entre
ellos, es decir, permite diferenciar cepas de una misma especie, por ser una región altamente
variable ayuda a mejorar la identificación de las especies. (Segura et al., 2010).
En la tabla 2 se observa el nombre de las especies de levaduras identificadas según datos
arrojados por Blastn. Se identificaron alrededor de 14 especies, las cepas identificadas con los
códigos 112B, 13A, 01, 12,105, 154, 188 corresponden a Hanseniaspora opuntiae y los códigos
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 63
74, 111, 131, 132, 218, 245, 99C 110MRS a Pichia kluyverii dos de las especies más abundantes
en este estudio.
Algunas cepas en la producción de etanol, como Pichia spp y Candida spp., metabolizan
el ácido cítrico haciendo que el valor del pH aumente en la pulpa lo que permite el crecimiento
de bacterias. La pérdida de ácido cítrico tanto en los “sudores” como por el metabolismo
microbiano provoca una deriva alcalina en el pH. Esto, junto con los niveles crecientes de
alcohol y aireación, inhibe las levaduras y su actividad disminuye
Se ha descubierto en estudios anteriores que Pichia kluyveri tienen un potencial
aromático muy alto en otros productos fermentados como el vino, en adición, se ha propuesto el
uso de cultivo iniciador para fermentaciones de cacao, donde su influencia en el sabor del cacao
es positiva para el perfil organoléptico del chocolate. (Crafack et al., 2013).
Por otro lado, cepas con codificación 19, 30, 33, 81, 85, 29A correspondieron al género
de Saccharomyces cerevisiae, este microorganismo se ha considerado como una especie ejemplo
en el aporte de características sensoriales en distintos tipos de cacao, en el estudio realizado por
(Menezez et al, 2016), mencionaron que la inoculación de S cerevisiae en granos de cacao
contribuye atributos organolépticos basándose desde un perceptible sabor a caramelo,
característico (chocolate) y hasta una sensación astringente o amargosa. Además de ser la especie
dominante en las fermentaciones de cacao en diferentes países, incluidos Brasil, Ghana,
Indonesia y Malasia. (Ardhana et al, 2013).
En adición, S cerevisiae es una levadura con alto poder fermentativo al producir grandes
cantidades de compuestos aromáticos, lo que sugiere que esta cepas podría estar colaborando en
la elaboración de características de aroma y sabor se encuentra, además de que se encuentra entre
las principales levaduras que producen compuestos volátiles como acetato de isopropilo, acetato
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 64
de etilo, metanol, 1-propanol, alcohol isoamílico, 2,3-butanodiol, succinato de dietilo y 2-
feniletanol seguidas de Kloeckera apiculata, Candida sp. y Kluyveromyces marxianus. (Schwan
et al, 2014).
En general, el género de Rhodotorula sp correspondiente a los aislados 45 y 31 se ha
descrito como una levadura productora de carotenoides naturales, en la industria alimentaria,
farmacéutica e incluso en el uso de aguas residuales; dicha característica se ha tenido en cuenta
debido a su alta eficiencia y fácil manipulación en los esquemas de procesamiento, la utilización
comercial de microorganismos con potencial biotecnológico para producir carotenoides naturales
está actualmente limitada por el alto costo de producción, su participación en fermentaciones de
cacao se encuentra en la su producción en gran escala debido a su alta tasa de crecimiento y
naturaleza unicelular a partir de etanol, ácido acético, lípidos y acetaldehído. (Rodríguez, et al,
2012).
Una única cepa aislada en este estudio de identificación de levaduras fermentadoras con
código 43 se identificó como parte del género Cryptococcus. A pesar de que este
microorganismo, es considerado como una levadura causante de enfermedades infeccionas como
la neumonía y otras a nivel respiratorio, en el proceso de fermentación de cacao esta cepa se
caracteriza por la producción de lípidos y otros ácidos grasos que aportan nutrientes a la manteca
de cacao que es un ingrediente esencial del chocolate que se obtiene a partir de granos maduros
del planta (Theohroma cacao) el estudio realizado por Hassan et al, 2010 donde emplea una
mutante de Cryptococcus curvutus (UfaM3) para la producción de este subproducto del
chocolate, su rendimiento en la conversión de nutrientes a partir de los granos a lípidos como
ácido oleico se encuentra entre un 44 y 49% factor que es importante para la industria alimenticia
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 65
ya que puede alcanzar. uno de los precios más altos entre todas las grasas y aceites comerciales y
puede fluctuar ampliamente.
La figura 5 menciona la excelente calidad y los picos definidos del estudio, este tipo de
comparaciones permite que la identificación de las especies fúngicas se pueda tipificar cepas de
una misma especie. (Webster et al, 2012). Se hallaron en algunas cepas de levaduras su alta
calidad correspondiente al 57,14 % de identificación completa con ambos primers, el porcentaje
no resultante del 42, 85%se debía a esa baja calidad en la secuencia, se tiene que tener en cuenta
que para obtenerlas los primers Forward como Reverse deben mantener una intensidad en sus
bases nitrogenadas aptas para la lectura y empalme considerando un contig competente para
análisis, Valdelamar et, al 2011, menciona que para obtener la secuencia consenso al comparar
el sentido Forward (5’-3’) y el sentido Reverse (3’-5’), es de suma importancia porque en este
proceso las polimerasas tienen diferentes porcentajes de fidelidad o en ocasiones pueden existir
problemas en la electroforesis de secuenciación y esto a su vez puede generar falsos
polimorfismos. Como también es útil el consenso cuando el fragmento que se está analizando es
mayor a 700 pb debido a que permite obtener un tamaño mayor de secuencia al complementar
ambas cadenas.
En cuanto al análisis filogenético, el modelo permitió obtener la clasificación de las
levaduras en las divisiones Ascomycota: Clados Saccharomyces, Torulaspora, Hanseniaspora,
Wickerhamomyces, Candida y Pichia y las divisiones Basidiomycota: Clados Rhodotorula y
Cryptococcus, además permite observar la diversidad en cuanto a las levaduras fermentadoras y
las relaciones evolutivas que las conectan. Este tipo de clasificación, en el caso de
microorganismos de interés biotecnológico puede servir como una herramienta predictiva de las
aplicaciones biotecnológicas. (Kurtzman, et al, 2015).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 66
En el contexto de este estudio, este árbol filogenético es fundamental para contrastar la
producción de los compuestos volátiles y pode establecer si las afiliaciones filogenéticas se
relacionan con la producción de metabolitos de interés. Ya se ha establecido que muchas vías
metabólicas se comparten ampliamente entre las especies, especialmente la fermentación de la
glucosa, identificada entre las especies de Saccharomycotina, Taphrinomycotina y
Basidiomycota, sin embargo, se resaltan otras vías, como, por ejemplo, la fermentación de la D-
Xilosa, restringida a linajes filogenéticos específicos. (Kurtzman, et al, 2015).
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 67
9. Conclusiones
La identificación molecular de las levaduras de interés, apoyada por la amplificación de
regiones del ADN ribosomal informativas en términos evolutivos como la ITS y D1/D2 son de
gran ayuda en procesos biotecnológicos como la determinación de cultivos iniciadores, que
potencian las propiedades organolépticas de los granos de cacao producidos en el departamento
de Santander. De los aislamientos analizados, se encontró predominancia de Hanseniaspora
opuntiae y Pichia kluyveri cepas con alto potencial para la producción de compuestos volátiles y
mayor permanencia en el momento de la realización del proceso por las condiciones ambientales
que los granos le generan.
Cabe mencionar que la identificación molecular, es un procedimiento de meticuloso
desarrollo altamente susceptible a contaminación (durante la PCR) o lecturas erróneas durante la
secuenciación, especialmente el tipo Sánger, lo que deriva en procesos de identificación
truncados que requieren de la incorporación de otras herramientas o técnicas de análisis.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 68
10. Recomendaciones
Dado que este trabajo es una parte de un macro proyecto, se recomienda tomar la
identificación molecular generada y contrastarla con las clasificaciones bioquímicas realizadas
previamente. Además de analizar si los compuestos volátiles que producen estos aislados se
asocian con las afiliaciones filogenéticas obtenidas.
Finalmente, se recomienda revisar detalladamente los electroferogramas de las secuencias
reversas de los aislados que no se lograron identificar en el contexto de este trabajo de grado.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 69
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IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 77
Apéndices
Apéndice 1. Electroforesis
Figura 1
Electroforesis Gel de Agarosa Tercer Set de Levaduras
Figura 2
Electroforesis Gel de Agarosa Cuarto Set de Levaduras
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 78
Figura 3
Electroforesis Gel de Agarosa Sexto Set de Levaduras
Figura 4
Electroforesis Gel de Agarosa Séptimo Set de Levaduras
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 79
Figura 5
Electroforesis Gel de Agarosa Octavo Set de Levaduras
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 80
Apéndice 2. Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Torulaspora
Delbrueckii Levadura 195
El análisis Blast de la secuencia consenso para el amplicón de la región NL arrojó lecturas con
índice >200, lo que muestra que los alineamientos se acoplaron exitosamente con secuencias
consignadas en la base de datos, con identidades de 100%, cobertura del 100% y valores E de 0,
124 se asociaron con Sacharomycetes, de estos 120 coincidieron con el género Torulaspora y
112 con la especie delbrueckii, la tabla 5 muestra esta clasificación.
Tabla 1
Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 195 en la Región NL del ADN
Descripción Taxonómica Levadura 195 NL
Taxonomía Número de Hits Número de organismos
Sacharomycetes 124 8
Sacharomycetales 122 6
Sacharomycetaceae 121 5
Torulaspora 120 4
Torulaspora delbrueckii 112 1
Estos resultados se confirmaron con lo hallado en el análisis filogenético descrito en la figura 3.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 81
Figura 1
Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 195
Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor-Joining
Se muestra el árbol óptimo con la suma de la longitud de la rama = 0.02477882. El
porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de
arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas El árbol está dibujado a escala, con
longitudes de rama en las mismas unidades que las distancias evolutivas utilizadas para inferir el
árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de Kimura y
están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este análisis involucró 12
secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º + 3º + Sin
codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción
de eliminación por pares). Hubo un total de 919 posiciones en el conjunto de datos final. Los
análisis evolutivos se realizaron en MEGA X
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 82
Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Saccharomyces
cerevisiae Levadura 29A. Para este aislamiento se encontró una afiliación con Saccharomyces
cerevisiae, como se describe en la tabla 2 y en la figura 2
Tabla 2
Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 29A en la Región ITS/NL del ADNr.
Descripción Taxonómica Levadura 29A ITS/NL
Taxonomía Número de Hits Número de organismos
Sacharomycetales 99 9
Sacharomycetaceae 98 8
Sacharomyces 97 7
S. cerevisiae 69 6
S. cerevisiae/paradoxus 20 1
Figura 2
Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 29A
Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining
El árbol de consenso bootstrap inferido de 500repeticiones se toma para representar la
historia evolutiva de los taxones analizados. Las ramas correspondientes a particiones
reproducidas en menos del 50% de réplicas de bootstrap se colapsan. El porcentaje de árboles
replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque (500
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 83
repeticiones) se muestran junto a las ramas Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el
método de Kimura y están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este
análisis involucró 6 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º
+ 3º + Sin codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias
(opción de eliminación por pares). Hubo un total de 920 posiciones en el conjunto de datos final.
Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.
Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Hanseniospora
opuntiae Levadura 01: El análisis Blast de la secuencia consenso para el amplicón de la región
NL arrojó 132 hits asociados con hongos, de estos 126 se afiliaron con el orden
Sacharomycetales y 123 pertenecieron al género Hanseniospora, para la especie la mayoría de
hits (77) se afiliaron con la especie opuntiae, los demás se afiliaron con especies guillermondii
(19), meyeri (7), aquellos hits que se afiliaron con hanseniospora sp (20) no se consideraron, la
tabla 3 muestra esta clasificación
Tabla 3
Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 01 en la Región NL del ADNr
Descripción Taxonómica Levadura 01 NL
Taxonomía Número de Hits Número de organismos
Fungi 131 23
Sacharomycetales 126 22
Hanseniaspora 123 19
Hanseniospora opuntiae 77 1
Hanseniospora guilliermondii 19 1
Hanseniospora meyeri 7 1
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 84
En cuanto a los eventos evolutivos, se encontró que el aislado 01, se afilia con el
Hanseniospora opuntiae aislado P13 (Número de acceso: MF979601.1 en el NCBI), la
disposición del árbol obtenido sugiere que la levadura 01 pertenece a este género y especie, pues
su relación filogenética se aleja de la especie guillermondi, la figura 15 muestra el árbol
filogenético obtenido.
Figura 3
Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 01
Nota: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor-Joining
Se muestra el árbol óptimo con la suma de la longitud de la rama = 0.01496019. El
porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de
arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas El árbol está dibujado a escala, con
longitudes de rama en las mismas unidades que las distancias evolutivas utilizadas para inferir el
árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de Kimura y
están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este análisis involucró 12
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 85
secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º + 3º + Sin
codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción
de eliminación por pares). Hubo un total de 3097 posiciones en el conjunto de datos final. Los
análisis evolutivos se realizaron en MEGA X
Levadura 112B: Según los datos obtenidos y observando los alineamientos se presume
que el aislamiento denominado “112B” es Hanseniospora opuntiae para la región D1/D2 del gen
26 S que codifican los primers NL, las especies guillermondi y meyeri se encontraron en los
análisis blast afiliadas en menor número con la secuencia de interés, esto se presenta cuando hay
cercanía filogenética descrita para este género esta denominación surge de la cercanía
filogenética entre las dos especies, como se presenta en la tabla 4 y la figura 4.
Tabla 4
Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 112B en la Región D1/D2 del Gen
26S
Descripción Taxonómica Levadura 112B-NL
Taxonomía Número de Hits Número de organismos
Sacharomycetales 126 25
Hanseniaspora 124 23
Hanseniospora opuntiae 75 1
Hanseniospora guilliermondii 16 1
Hanseniospora meyeri 7 1
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 86
Figura 4
Relaciones Evolutivas de Taxones Levadura 112B
Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining.
El árbol de consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones se toma para representar la
historia evolutiva de los taxones analizados. Las ramas correspondientes a particiones
reproducidas en menos del 50% de réplicas de bootstrap se colapsan. El porcentaje de árboles
replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque (500
repeticiones) se muestran junto a las ramas. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el
método de Kimura y están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este
análisis involucró 11 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º
+ 3º + Sin codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias
(opción de eliminación por pares). Hubo un total de 3107 posiciones en el conjunto de datos
final. Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.
Identificación de Cepas de Levaduras Correspondientes al Género Pichia kluyverii
Levadura 110 MRS: Según los datos obtenidos y observando los alineamientos se presume que
el aislamiento denominado “110MRS” presumiblemente es Pichia kluyverii para la región
D1/D2 del gen 26S que codifican los primers NL.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 87
La tabla 5 describe la clasificación taxonómica, y la figura 5 señala las relaciones
filogenéticas con los aislados identificados en el análisis blast.
Tabla 5
Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 110MRS en la Región D1/D2 del
Gen 26S.
Descripción Taxonómica Levadura 110MRS-NL
Taxonomía Número de Hits Número de organismos
Sacharomycetales 119 9
Pichia 117 7
P. kluyverii 109 1
Pichia sin clasificar 3 3
Figura 5
Relaciones Evolituvas de Taxones Levadura 110MRS
Nota: Relaciones evolutivas de taxones: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor Joining.
El árbol de consenso bootstrap inferido de 500 repeticiones se toma para representar la
historia evolutiva de los taxones analizados. Las ramas correspondientes a particiones
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 88
reproducidas en menos del 50% de réplicas de bootstrap se colapsan. El porcentaje de árboles
replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de arranque (500
repeticiones) se muestran junto a las ramas. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el
método de Kimura y están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este
análisis involucró 11 secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º
+ 3º + Sin codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias
(opción de eliminación por pares). Hubo un total de 911 posiciones en el conjunto de datos final.
Los análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.
Levadura 218: Según los datos obtenidos y observando los alineamientos se presume que
el aislamiento denominado “112B” presumiblemente es Pichia kluyverii para la región D1/D2
del gen 26 S que codifican los primers NL, esto se describe en la tabla 6.
Tabla 6
Descripción Taxonómica para la Identificación de Levadura 112B en la Región D1/D2 del Gen
26S
Descripción Taxonómica Levadura 218-NL
Taxonomía Número de Hits Número de organismos
Sacharomycetales 120 9
Pichia 118 7
Pichia kluyverii 110 1
Pichia sin clasificar 3 3
Nota: La descripción filogenética mostrada en la imagen 10 señala una afiliación directa con el clado de Pichia kluyverii
reafirmando la identificación señalada por el blast.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE LEVADURAS 89
Figura 6
Relaciones Evolutivas de Taxones Levadiura 112B
Nota: La historia evolutiva se infirió utilizando el método de Neighbor-Joining.
Se muestra el árbol óptimo con la suma de la longitud de la rama = 0.01676919. El
porcentaje de árboles replicados en los que los taxones asociados se agruparon en la prueba de
arranque (500 repeticiones) se muestran junto a las ramas . El árbol está dibujado a escala, con
longitudes de rama en las mismas unidades que las distancias evolutivas utilizadas para inferir el
árbol filogenético. Las distancias evolutivas se calcularon utilizando el método de Kimura y
están en las unidades del número de sustituciones de bases por sitio. Este análisis involucró 12
secuencias de nucleótidos. Las posiciones de codón incluidas fueron 1º + 2º + 3º + Sin
codificación. Se eliminaron todas las posiciones ambiguas para cada par de secuencias (opción
de eliminación por pares). Hubo un total de 2786 posiciones en el conjunto de datos final. Los
análisis evolutivos se realizaron en MEGA X.
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