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Diferentes roles de Susceptibilidad Mejorada a la
Enfermedad 1 (EDS1) unido y disociado a Deciente en
Fitoalexinas 4 (PD4) en la inmunidad de rabidopsis
!esumen
- EDS1 es un regulador importante de la inmunidad basal y activada
por receptores. La EDS1 de Arabidopsis interacta con dos
protenas relacionadas, PAD y !en Asociado a la Senescencia1"1
#SA!1"1$, cuyas actividades combinadas son esenciales para la
se%ali&aci'n de de(ensa. Los di(erentes tama%os y distribuciones
intracelulares de los comple)os EDS1-PAD y EDS1-SA!1"1 en
te)idos de las *o)as en Arabidopsis sugieren +ue cumplen
(unciones no redundantes.
- La naturale&a y relevancia biol'gica de las interacciones de EDS1con PAD y SA!1"1 (ueron eploradas utili&ando ensayos de
levaduras tri-*bridas, anlisis invitrode protenas recombinantes
puricadas de Escherichia coli, y caracteri&aci'n de plantas
transg/nicas de Arabidopsis epresando una protenas mutante de
eds1 +ue no logra unirse a PAD pero retiene la interacci'n con
SA!1"1.- EDS1 (orma comple)os molecularmente distintos con PAD o
SA!1"1 sin (actores adicionales. La p/rdida de interacci'n con
EDS1 reduce la acumulaci'n post-transcripcional de PAD,consistente con la asociaci'n (sica de EDS1 +ue estabili&a PAD.
Las (ormas disociadas de EDS1 y PAD son completamente
competentes en la muerte celular gatillada por receptores en el
(oco de in(ecci'n. Por otra parte, el comple)o EDS1-PAD es
necesario para la resistencia basal involucrando la movili&aci'n de
las de(ensas de cido saliclico.- 0onguraciones moleculares di(erentes de EDS1 y PAD tienen
(unciones distintas en la inmunidad innata de la planta.
"ntroducci#n
$ Para sobrevivir, las plantas necesitan ser capaces de responder a
numerosos tipos de estr/s del ambiente y reprogramar su
metabolismo y crecimiento de manera correcta. EDS1 de
Arabidopsis *a emergido como un regulador de estr/s bi'tico
importante. Estudios mutacionales identicaron EDS1 como un
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componente esencial de la inmunidad basal en respuesta a
pat'genos biotr'cos virulentos y de la inmunidad gatillada por
e(ectores #E2$ condicionada por receptores 23-45-L33 +ue
reconocen e(ectores especcos de pat'genos. En la respuesta
inmune basal, EDS1 coopera cercanamente con el gen PAD4en la
estimulaci'n de la producci'n de la *ormona de de(ensa6 cido
saliclico #SA$ y otros procesos +ue limiten el crecimiento del
pat'geno. La acumulaci'n de SA es re+uerida para la inmunidad
sist/mica #SA3$, inducida en te)idos distantes mediante se%ales
emitidas por las c/lulas locales a(ectadas por el estr/s. El rol del
SA en el re(or&amiento de la resistencia alrededor del (oco de
in(ecci'n parece ser mediado en parte por la restricci'n de la
iniciaci'n de la muerte celular programada por parte del *u/sped.$ Anlisis ms a (ondo de mutantes de Arabidopsis revelaron +ue
EDS1 y PAD4 tambi/n contribuyen a la resistencia condicionadapor otros tipos de receptores intracelulares o protenas sensoriales
+ue reconocen pat'genos. Adems, EDS1y PAD4traducen se%ales
de estr/s (oto-oidativas llevando a la muerte celular y la
disminuci'n de la tasa de crecimiento de la planta. Estas
caracterstica sugieren +ue la protena EDS1, generalmente en
con)unto con PAD, sirven como un 7nodo8 regulatorio para la
coordinaci'n de respuestas a mltiples estmulos de estr/s
ambiental. odava no est claro si di(erentes estmulos reclutan
comple)os EDS1 particulares.
$ EDS1 puede (ormar dmeros *omom/ricos e interactuar con PADy otra protena relacionada, SA!1"1, en levaduras y etractos de
te)idos (oliares de Arabidopsis. 9untos, EDS1, PAD y SA!1"1
constituyen una (amilia de protenas especcas de pantas +ue
tienen *omologa con las lipasas eucari'ticas en sus terminales 4
y un dominio nico en sus terminales 0. Anlisis de mutantes
dobles pad4sag101mostraron +ue las (unciones combinadas de
PAD y SA!1"1 son esenciales para la se%ali&aci'n de EDS1 en la
resistencia mediada por 23-45-L33. La cooperaci'n ms +ue la
redundancia entre PAD4 ySAG101es apoyada gen/ticamente porla susceptibilidad etrema del (enotipo de pad4 sag101
comparadas con eds1y, a nivel molecular, por los patrones de
distribuci'n intracelular de los comple)os EDS1-PAD y EDS1-
SA!1"1 en Arabidopsis. :ientras +ue los dmeros EDS1 son
mayoritariamente citoplasmticos, los comple)os *eterom/ricos
EDS1-PAD se acumulan en el ncleo y citoplasma y los comple)os
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EDS1-SA!1"1 se encuentran connados en el ncleo. La
coordinaci'n entre las piscinas de EDS1 citoplasmtico y nuclear
va la ma+uinaria de trco a trav/s de poros nucleares es
necesaria para permitir la resistencia completa de la planta.$ A+u se reporta el anlisis de la ar+uitectura molecular de
comple)os individuales de EDS1 en levadura, Escherichia coli yte)idos vegetales, adems de la caracteri&aci'n de un mutante
eds1 +ue es incapa& de interactuar con PAD pero retiene la
*abilidad de (ormar dmeros *omom/ricos y asociarse a PAD. Se
provee evidencia de +ue EDS1 utili&a distintos determinantes
estructurales para interactuar con PAD y SA!1"1 y +ue las
asociaciones de EDS1 por separado con cada protena en ve& de
un comple)o ternario pueden eplicar la cooperaci'n entre PAD y
SA!1"1 en la se%ali&aci'n de EDS1. De improviso, se identic' un
rol para EDS1 no asociado a PAD en la muerte celular gatilladapor 23-45-L33 +ue no se compensa con SA!1"1. A su ve&, el
comple)o EDS1-PAD es necesario para impulsar la inmunidad
basal y la SA3 completa. Se concluye +ue conguraciones
di(erentes de EDS1 y PAD tienen (unciones distintas en la
se%ali&aci'n inmune de la planta.
Materiales y M%todos
- Esto te lo de)o a ti )a)a)a ;;
!esultados
EDS1 se asocia exclusi&amente con PD4 o S'11
$ PAD y SA!1"1 interactan con EDS1 en levadura. Se investig' la
naturale&a de la asociaci'n de EDS1 con sus dos protenas y si las
tres protenas podran coeistir en un comple)o ternario, ya +ue
esto podra eplicar su cooperaci'n. Previamente, se encontr' +ue
porciones individuales de EDS1 y un mutante con p/rdida de(unci'n eds1perdan su interacci'n con PAD en un ensayo de
doble *brido en levadura. Los mismos constructos de EDS1
tambi/n (allaron al interactuar con SA!1"1 en levadura, lo +ue
sugiere +ue la asociaci'n de EDS1 con cual+uier protena no puede
ser llevada a cabo por un solo dominio de EDS1. En un ensayo
tri*brido de levadura, di(erentes combinaciones de EDS1, SA!1"1
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y PAD (ueron epresadas como (usiones con un dominio de uni'n
al AD4 #carnada$ o un dominio de activaci'n #presa$ y la provisi'n
de la tercera protena como un componente libre ba)o en control
de un promotor condicional de metionina. Al no aplicar :et al
medio, se induce la epresi'n de la protena libre. La interacci'n
entre carnada y presa (ue cuanticada mediante la actividad de la
-galactosidasa del reportero #
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os complejos EDS1$PD4 y EDS1$S'11 tienen
este*uiometrias diferentes
$ Se consider' si el peso molecular aparentemente superior de los
comple)os EDS1-PAD en etractos celulares de plantas se podran
atribuir a di(erentes protenas o a una conguraci'n molecular
intrnseca distinta del comple)o entre EDS1-PAD comparada a la
de EDS1-SA!1"1. Se investig' mediante cromatogra(a de
eclusi'n por tama%o la este+uiometria de las asociaciones EDS1-
PAD y EDS1-SA!1"1 en protena recombinantes puricadas de E.
coli. :ientras +ue EDS1 y SA!1"1 pudieron ser puricadas en
cantidades relativamente altas #
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- De los datos obtenidos arriba, se *ipoteti&a +ue los comple)os
EDS1-PAD y EDS1-SA!1"1 tienen distintas (unciones en la
resistencia. Para calcular la importancia de la interacci'n entre
EDS1-PAD, se eamin' para variantes de ED1 +ue no lograban
unirse a PAD en un ensayo di*brido de levadura. El cD4A de
EDS1 (ue aleatoriamente mutageni&ado por P03 propenso a
errores y las secuencias amplicadas de EDS1 (ueron (usionadas al
dominio de activaci'n 5@ #Pb@AD$ y trans(ormadas a levaduras
epresando PAD (usionada al dominio de uni'n al AD4 LeA
#pLeA$. Las interacciones entre las protenas de (usi'n LeA?PAD
y 5@?EDS1 (ueron monitoreadas por la actividad del reportero de
-galactosidasa, como (ue descrito previamente #A. :uc*as de las protenas EDS1 +ue no
interactuaban con PAD presentaban mltiples mutaciones. res
clones independientes con cambios en un aminocido (ueron
seleccionados y epresados en E. coli para una caracteri&aci'n
ms detallada. De los tres mutantes, eds1EHI@! y eds10H3 solo
pudieron ser puricados desde E. coli en cantidades ba)as
comparadas con la EDS1 nativa #is y eds1L@F@P?>is #
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+na disrupci#n en la interacci#n EDS1$PD4 reduce la
acumulaci#n de PD4 en ,ojas
- Para medir las consecuencias de la interrupci'n de la asociaci'n
EDS1-PAD en la planta, se trans(orm' de manera estable el
mutante nulo eds1-1de Arabidopsis con la variante eds1L@F@Pba)o
control del promotor nativo de EDS1 y se (usion' a una marca en
el terminal 4 =>A #>A?eds1L@F@P$. 0omo re(erencia, eds1-1
tambi/n (ue trans(ormada con una EDS1 G ba)o el promotor
EDS1 y con la misma marca en el terminal 4 #>A?EDS1$. Jna lnea
de >A?EDS1 epresando niveles similares a la G de la protena
EDS1 se utili&' como control en eperimentos subsecuentes
#A?eds1L@F@P y se eamin' la epresi'n de las protenas EDS1 y
PAD en etractos totales de *o)as de plantas sanas. Las lneas 1-=acumularon cantidades similares de eds1L@F@P, aun+ue a niveles un
poco ms reducidos en comparaci'n con la G y con la lnea de
control >A?EDS1, mientras +ue la lnea de >A?eds1L@F@P
present' cantidades muc*o ms ba)as de eds1L@F@P #ubo una se%al d/bil de PAD en los etractos, probablemente
debido a los niveles de e+uilibrio de PAD. PAD no se detect' en
la G y no se observ' una se%al clara de PAD en las lneas
transg/nicas #
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o PAD. 0antidades de >A?EDS1 inmunopuricada #A?EDS1 pero no
co-puric' con ninguna de las protenas >A?eds1L@F@P#A?EDS1, se concluyen +ue la protena mutante eds1L@F@P tambi/n
(alla al interactuar con PAD en te)idos de plantas y +ue la p/rdida
de la interacci'n EDS1-PAD reduce la acumulaci'n de la protena
PAD en *o)as in(ectadas. Se ra&on' +ue las cantidades
disminuidas de PAD en las lneas >A?eds1L@F@P se atribuye
probablemente a la p/rdida de un e(ecto estabili&ante directo de
EDS1, ya +ue la acumulaci'n de PAD recombinante tambi/n
re+uiere de la co-epresi'n de EDS1 en E. coli #