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Diferentes roles de Susceptibilidad Mejorada a la

Enfermedad 1 (EDS1) unido y disociado a Deciente en

Fitoalexinas 4 (PD4) en la inmunidad de rabidopsis

!esumen

- EDS1 es un regulador importante de la inmunidad basal y activada

por receptores. La EDS1 de Arabidopsis interacta con dos

protenas relacionadas, PAD y !en Asociado a la Senescencia1"1

#SA!1"1$, cuyas actividades combinadas son esenciales para la

se%ali&aci'n de de(ensa. Los di(erentes tama%os y distribuciones

intracelulares de los comple)os EDS1-PAD y EDS1-SA!1"1 en

te)idos de las *o)as en Arabidopsis sugieren +ue cumplen

(unciones no redundantes.

- La naturale&a y relevancia biol'gica de las interacciones de EDS1con PAD y SA!1"1 (ueron eploradas utili&ando ensayos de

levaduras tri-*bridas, anlisis invitrode protenas recombinantes

puricadas de Escherichia coli, y caracteri&aci'n de plantas

transg/nicas de Arabidopsis epresando una protenas mutante de

eds1 +ue no logra unirse a PAD pero retiene la interacci'n con

SA!1"1.- EDS1 (orma comple)os molecularmente distintos con PAD o

SA!1"1 sin (actores adicionales. La p/rdida de interacci'n con

EDS1 reduce la acumulaci'n post-transcripcional de PAD,consistente con la asociaci'n (sica de EDS1 +ue estabili&a PAD.

Las (ormas disociadas de EDS1 y PAD son completamente

competentes en la muerte celular gatillada por receptores en el

(oco de in(ecci'n. Por otra parte, el comple)o EDS1-PAD es

necesario para la resistencia basal involucrando la movili&aci'n de

las de(ensas de cido saliclico.- 0onguraciones moleculares di(erentes de EDS1 y PAD tienen

(unciones distintas en la inmunidad innata de la planta.

"ntroducci#n

$ Para sobrevivir, las plantas necesitan ser capaces de responder a

numerosos tipos de estr/s del ambiente y reprogramar su

metabolismo y crecimiento de manera correcta. EDS1 de

Arabidopsis *a emergido como un regulador de estr/s bi'tico

importante. Estudios mutacionales identicaron EDS1 como un

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componente esencial de la inmunidad basal en respuesta a

pat'genos biotr'cos virulentos y de la inmunidad gatillada por

e(ectores #E2$ condicionada por receptores 23-45-L33 +ue

reconocen e(ectores especcos de pat'genos. En la respuesta

inmune basal, EDS1 coopera cercanamente con el gen PAD4en la

estimulaci'n de la producci'n de la *ormona de de(ensa6 cido

saliclico #SA$ y otros procesos +ue limiten el crecimiento del

pat'geno. La acumulaci'n de SA es re+uerida para la inmunidad

sist/mica #SA3$, inducida en te)idos distantes mediante se%ales

emitidas por las c/lulas locales a(ectadas por el estr/s. El rol del

SA en el re(or&amiento de la resistencia alrededor del (oco de

in(ecci'n parece ser mediado en parte por la restricci'n de la

iniciaci'n de la muerte celular programada por parte del *u/sped.$ Anlisis ms a (ondo de mutantes de Arabidopsis revelaron +ue

EDS1 y PAD4 tambi/n contribuyen a la resistencia condicionadapor otros tipos de receptores intracelulares o protenas sensoriales

+ue reconocen pat'genos. Adems, EDS1y PAD4traducen se%ales

de estr/s (oto-oidativas llevando a la muerte celular y la

disminuci'n de la tasa de crecimiento de la planta. Estas

caracterstica sugieren +ue la protena EDS1, generalmente en

con)unto con PAD, sirven como un 7nodo8 regulatorio para la

coordinaci'n de respuestas a mltiples estmulos de estr/s

ambiental. odava no est claro si di(erentes estmulos reclutan

comple)os EDS1 particulares.

$ EDS1 puede (ormar dmeros *omom/ricos e interactuar con PADy otra protena relacionada, SA!1"1, en levaduras y etractos de

te)idos (oliares de Arabidopsis. 9untos, EDS1, PAD y SA!1"1

constituyen una (amilia de protenas especcas de pantas +ue

tienen *omologa con las lipasas eucari'ticas en sus terminales 4

y un dominio nico en sus terminales 0. Anlisis de mutantes

dobles pad4sag101mostraron +ue las (unciones combinadas de

PAD y SA!1"1 son esenciales para la se%ali&aci'n de EDS1 en la

resistencia mediada por 23-45-L33. La cooperaci'n ms +ue la

redundancia entre PAD4 ySAG101es apoyada gen/ticamente porla susceptibilidad etrema del (enotipo de pad4 sag101

comparadas con eds1y, a nivel molecular, por los patrones de

distribuci'n intracelular de los comple)os EDS1-PAD y EDS1-

SA!1"1 en Arabidopsis. :ientras +ue los dmeros EDS1 son

mayoritariamente citoplasmticos, los comple)os *eterom/ricos

EDS1-PAD se acumulan en el ncleo y citoplasma y los comple)os

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EDS1-SA!1"1 se encuentran connados en el ncleo. La

coordinaci'n entre las piscinas de EDS1 citoplasmtico y nuclear

va la ma+uinaria de trco a trav/s de poros nucleares es

necesaria para permitir la resistencia completa de la planta.$ A+u se reporta el anlisis de la ar+uitectura molecular de

comple)os individuales de EDS1 en levadura, Escherichia coli yte)idos vegetales, adems de la caracteri&aci'n de un mutante

eds1 +ue es incapa& de interactuar con PAD pero retiene la

*abilidad de (ormar dmeros *omom/ricos y asociarse a PAD. Se

provee evidencia de +ue EDS1 utili&a distintos determinantes

estructurales para interactuar con PAD y SA!1"1 y +ue las

asociaciones de EDS1 por separado con cada protena en ve& de

un comple)o ternario pueden eplicar la cooperaci'n entre PAD y

SA!1"1 en la se%ali&aci'n de EDS1. De improviso, se identic' un

rol para EDS1 no asociado a PAD en la muerte celular gatilladapor 23-45-L33 +ue no se compensa con SA!1"1. A su ve&, el

comple)o EDS1-PAD es necesario para impulsar la inmunidad

basal y la SA3 completa. Se concluye +ue conguraciones

di(erentes de EDS1 y PAD tienen (unciones distintas en la

se%ali&aci'n inmune de la planta.

Materiales y M%todos

- Esto te lo de)o a ti )a)a)a ;;

!esultados

EDS1 se asocia exclusi&amente con PD4 o S'11

$ PAD y SA!1"1 interactan con EDS1 en levadura. Se investig' la

naturale&a de la asociaci'n de EDS1 con sus dos protenas y si las

tres protenas podran coeistir en un comple)o ternario, ya +ue

esto podra eplicar su cooperaci'n. Previamente, se encontr' +ue

porciones individuales de EDS1 y un mutante con p/rdida de(unci'n eds1perdan su interacci'n con PAD en un ensayo de

doble *brido en levadura. Los mismos constructos de EDS1

tambi/n (allaron al interactuar con SA!1"1 en levadura, lo +ue

sugiere +ue la asociaci'n de EDS1 con cual+uier protena no puede

ser llevada a cabo por un solo dominio de EDS1. En un ensayo

tri*brido de levadura, di(erentes combinaciones de EDS1, SA!1"1

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y PAD (ueron epresadas como (usiones con un dominio de uni'n

al AD4 #carnada$ o un dominio de activaci'n #presa$ y la provisi'n

de la tercera protena como un componente libre ba)o en control

de un promotor condicional de metionina. Al no aplicar :et al

medio, se induce la epresi'n de la protena libre. La interacci'n

entre carnada y presa (ue cuanticada mediante la actividad de la

-galactosidasa del reportero #

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os complejos EDS1$PD4 y EDS1$S'11 tienen

este*uiometrias diferentes

$ Se consider' si el peso molecular aparentemente superior de los

comple)os EDS1-PAD en etractos celulares de plantas se podran

atribuir a di(erentes protenas o a una conguraci'n molecular

intrnseca distinta del comple)o entre EDS1-PAD comparada a la

de EDS1-SA!1"1. Se investig' mediante cromatogra(a de

eclusi'n por tama%o la este+uiometria de las asociaciones EDS1-

PAD y EDS1-SA!1"1 en protena recombinantes puricadas de E.

coli. :ientras +ue EDS1 y SA!1"1 pudieron ser puricadas en

cantidades relativamente altas #

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- De los datos obtenidos arriba, se *ipoteti&a +ue los comple)os

EDS1-PAD y EDS1-SA!1"1 tienen distintas (unciones en la

resistencia. Para calcular la importancia de la interacci'n entre

EDS1-PAD, se eamin' para variantes de ED1 +ue no lograban

unirse a PAD en un ensayo di*brido de levadura. El cD4A de

EDS1 (ue aleatoriamente mutageni&ado por P03 propenso a

errores y las secuencias amplicadas de EDS1 (ueron (usionadas al

dominio de activaci'n 5@ #Pb@AD$ y trans(ormadas a levaduras

epresando PAD (usionada al dominio de uni'n al AD4 LeA

#pLeA$. Las interacciones entre las protenas de (usi'n LeA?PAD

y 5@?EDS1 (ueron monitoreadas por la actividad del reportero de

-galactosidasa, como (ue descrito previamente #A. :uc*as de las protenas EDS1 +ue no

interactuaban con PAD presentaban mltiples mutaciones. res

clones independientes con cambios en un aminocido (ueron

seleccionados y epresados en E. coli para una caracteri&aci'n

ms detallada. De los tres mutantes, eds1EHI@! y eds10H3 solo

pudieron ser puricados desde E. coli en cantidades ba)as

comparadas con la EDS1 nativa #is y eds1L@F@P?>is #

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+na disrupci#n en la interacci#n EDS1$PD4 reduce la

acumulaci#n de PD4 en ,ojas

- Para medir las consecuencias de la interrupci'n de la asociaci'n

EDS1-PAD en la planta, se trans(orm' de manera estable el

mutante nulo eds1-1de Arabidopsis con la variante eds1L@F@Pba)o

control del promotor nativo de EDS1 y se (usion' a una marca en

el terminal 4 =>A #>A?eds1L@F@P$. 0omo re(erencia, eds1-1

tambi/n (ue trans(ormada con una EDS1 G ba)o el promotor

EDS1 y con la misma marca en el terminal 4 #>A?EDS1$. Jna lnea

de >A?EDS1 epresando niveles similares a la G de la protena

EDS1 se utili&' como control en eperimentos subsecuentes

#A?eds1L@F@P y se eamin' la epresi'n de las protenas EDS1 y

PAD en etractos totales de *o)as de plantas sanas. Las lneas 1-=acumularon cantidades similares de eds1L@F@P, aun+ue a niveles un

poco ms reducidos en comparaci'n con la G y con la lnea de

control >A?EDS1, mientras +ue la lnea de >A?eds1L@F@P

present' cantidades muc*o ms ba)as de eds1L@F@P #ubo una se%al d/bil de PAD en los etractos, probablemente

debido a los niveles de e+uilibrio de PAD. PAD no se detect' en

la G y no se observ' una se%al clara de PAD en las lneas

transg/nicas #

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o PAD. 0antidades de >A?EDS1 inmunopuricada #A?EDS1 pero no

co-puric' con ninguna de las protenas >A?eds1L@F@P#A?EDS1, se concluyen +ue la protena mutante eds1L@F@P tambi/n

(alla al interactuar con PAD en te)idos de plantas y +ue la p/rdida

de la interacci'n EDS1-PAD reduce la acumulaci'n de la protena

PAD en *o)as in(ectadas. Se ra&on' +ue las cantidades

disminuidas de PAD en las lneas >A?eds1L@F@P se atribuye

probablemente a la p/rdida de un e(ecto estabili&ante directo de

EDS1, ya +ue la acumulaci'n de PAD recombinante tambi/n

re+uiere de la co-epresi'n de EDS1 en E. coli #