UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA

Biomoléculas

Grupo: 2207

Actividad experimental I:Purificación de la enzima BADH de P. aeruginosa por cromatografía

de intercambio iónico y ensayo de su actividad.

Equipo 5:

Monter Castro Luis AlbertoMoreno Pérez Luis Fernando

Ortega Olguin Diana GuadalupePedroza Quevedo Gerardo

Pérez Cortes Florencia FernandaRamírez Flores Miguel Angel

Fecha de entrega: 10-Marzo-2015OBJETIVO

Purificar a homogeneidad y en un solo paso cromatográfico la enzima betaína aldehído deshidrogenasa (BADH) de P. aeruginosa.

INTRODUCCIÓNPara fines científicos es importante purificar un preparado de proteínas para poder

llegar a extraer las enzimas indeseables. Cada tipo de enzima y tejido requieren un tipo

de tratamiento distinto. Algunos métodos que se utilizan son la precipitación

fraccionada, la diálisis y la precipitación mediante el calentamiento moderado, con

algún ácido o con concentraciones de alcohol o acetona.

Para la realización de la pureza de una enzima es necesario realizar la técnica de

purificación de una proteína algunas de estas son: el análisis por ultracentrífuga, el

electroforético, cromatografía de intercambio iónico (La cromatografía de intercambio

iónico es un método que permite la separación de moléculas basada en sus

propiedades de carga eléctrica. Se compone de dos fases: la fase estacionaria o

intercambiador iónico, y la fase móvil. La fase estacionaria insoluble lleva en la

superficie cargas electrostáticas fijas, que retienen contra iones móviles que pueden

intercambiarse por iones de la fase móvil, la cual suele ser una disolución acuosa con

cantidades moderadas de metanol u otro disolvente orgánico miscible con agua que

contiene especies iónicas generalmente en forma de buffer. Los iones de ésta compiten

con los analitos por los sitios activos de la fase estacionaria) entre otros pero se debe

tomar en cuenta que durante este transcurso se llegan a perder gran parte de ella.

También este se puede realizar mediante el sometimiento de la enzima a

fraccionamientos sensitivos como en el caso de la electroforesis en gel de almidón o de

acrilamida y así demostrar que la enzima como tal está compuesta por varias

proteínas, y que algunas presentan la misma actividad enzimática pero a causa de la

sus estructuras y propiedades distintas se les consideran iso enzimas. La purificación de las enzimas se realiza a una baja temperatura para así disminuir la pérdida por desnaturalización en algunos casos esta puede ser calentada durante unos minutos más sin embargo este no tendrá ningún pérdida de su actividad enzimática.Para saber exactamente si en se da la pureza absoluta existen otros procesos que pueden obtenerse por medios físicos como los son la electroforesis, sedimentación en ultra fuga, la cromatografía y la determinaciones de solubilidad.Aun sabiendo que las propiedades de las enzimas pueden llegar a ser muy diferentes es necesario tener preparaciones puras para poder hacer el estudio completo de su actividad. Hoy en día se ha llegado a cristalizar o purificar de una manera correcta, cerca de unas 200 enzimas, y es posible que en unos años más, esto llegue a aumentar considerablemente.

MATERIALES Y MÉTODOS:

Retiramos de la columna los tapones inferior y superior. Depositamos con la jeringa 1 mL del Amortiguador I sobre la resina Q-Fast Sefarosa. Colocamos el tapón superior sobre la columna e insertamos en él la jeringa conteniendo 9 mL del mismo amortiguador. Se equilibró la resina haciendo pasar el líquido a una velocidad aproximada de 1 gota/2 seg (~ 10 mL/10 min). Nos aseguramos que todo el amortiguador permee a través de la resina. Para ello se retiró la jeringa, se llénelo de aire,se insertó nuevamente y empujo lentamente el émbolo hasta que el líquido desapareció de la superficie. Justo cuando el amortiguador termine de ingresar, separe inmediatamente el tapón junto con la jeringa y tape la columna por la parte inferior.

Agregamos con una micropipeta 2 mL del extracto celular (ExP) sobre la resina. Retiramos el tapón inferior, permitiendo que el líquido drene por sí solo y recolectamos en un frasco limpio etiquetado con las letras “FT” el líquido que drena (FT, de “flow-through”, que contiene las proteínas que no se unen a la resina). El “pegado” de la proteína es más eficiente si se realiza lentamente (10-15 min).

Cuando toda la muestra ingreso a la resina, se vertió un poco de Amortiguador I sobre ésta y se lávelo haciendo pasar 10 mL de este amortiguador con ayuda de la jeringa utilizamos una velocidad de ~1 gota/seg. Guardamos el líquido de lavado en un frasco etiquetado.

Inmediatamente después de lavar pasamos con la jeringa 6 mL del Amortiguador II a través de la resina (~1 gota/seg). Recolectamos 10 fracciones de 0.5 mL en tubos eppendorf de 1.5 mL, debidamente etiquetados. una vez Colectada la última fracción, colocamos el tapón en la parte inferior de la columna para después pasar a Medir en el espectrofotómetro, a una λ=280 nm, la absorbancia de las 10 fracciones colectadas, utilizando como blanco al amortiguador II.Reunimos las dos fracciones que tienen la mayor absorbancia y etiquetamos el tubo con las letras ENZ.

SE guardó la fracción (ENZ) en alícuotas de 200 µL, para posteriormente descongelar sólo la enzima que se utilizó. Agregamos a una de estas alícuotas 1 µL de NADP+ 100 mM (marcándose como ENZ-N) para estabilizar su conformación activa y utilizarla en los posteriores ensayos de actividad.

ANÁLISIS Y RESULTADOS

Fracción A 280nm

PE1 0.027

PE2 0.19

PE3 0.222

PE4 0.248

PE5 0.194

PE6 0.170

PE7 0.155

PE8 0.118

Tabla 1. Muestra los valores de absorción obtenidos en cada fracción medida

Se juntaron las fracciones PE4 y PE3 obteniendo 1 mL de Fracción ENZ

Gráfico 1. Se muestra el perfil de elución de las fracciones medidas.

En las fracciones PE se encontró que las PE 3 y 4 obtuvieron una mayor absorbancia, esto se debe a que las primeras PE que salieron de la elución de la proteína de la columna fueron lo sobrante de amortiguador, los siguientes fueron la proteína. Al no ser tanta la cantidad de la proteína sólo hubo dos fracciones con una gran absorción

siendo estas PE 3 y 4. Las siguientes fracciones descendieron en su absorbancia porque lo saliente era solamente amortiguador II.

EL ensayo de la actividad enzimática de nuestra fracción ENZ no se llevó a cabo, a causa de que el espectrofotómetro no marcaba la actividad por fallas en el mismo. Pero al haber una correcta lectura en las fracciones PE se estima que hubo una correcta purificación de la enzima BADH

DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓNSe logró conseguir la proteína, pero no se registro actividad enzimática en el espectrofotómetro como dijo Wiseman, A. (1985) “En particular se puede subestimar la actividad conseguida en columnas cuando se produce la inhibición por el sustrato o la activación por el producto, y se puede sobreestimar dicha actividad cuando tiene lugar la activación por el sustrato o la inhibición por el producto.”

CUESTIONARIO

1. ¿Por qué se une la proteína BADH a la resina? Con el fundamento de que la cromatografía de intercambio iónico es a base de hacer pasar una solución por una matriz la cual por medio iónico polar, se creará una unión que no afecte las propiedades de la solución en este caso de la solución que contenía la BADH para que esta pueda ser retenida por la matriz de características porosas que en este caso fue una resina o matriz conocida como “Resina Sefarosa”; esta reacción es subdividida como cromatografía de columna que se caracteriza por tener una fase estacionaria empaquetada por la cual pasa la sustancia reteniendola y aislandola obteniendo de esa manera la BADH (Lehninger, 2007). 2. Explique por qué al cambiar de amortiguador la enzima BADH se despega de la resina y eluye de la columna. Se dice que la columna debe ser lavada, esto se hace para que la columna quede al mismo pH que la proteína a aislar, en este caso la enzima y conforme aumenta el pH los enlaces creados se romperán y podrán dejar resbalar a diferentes niveles la sustancia agregada (Fuentealba et al, 2010). 3. ¿Por qué se mide a una longitud de onda de 280 nm la absorbancia de las fracciones obtenidas?

Se utiliza ya que cada aminoácido tiene una absorbancia máxima debido a que las cadenas radicales aromáticas de los residuos: histidina, fenilalanina, triptófano y tirosina absorben esa longitud de onda (Flores et al, 2004).

4. Escriba la reacción que cataliza la BADH y explique por qué cuando se mide su actividad se registra el cambio de absorbancia en una longitud de onda de 340 nm. La enzima betaína aldehído deshidrogenasa (BADH) cataliza la oxidación irreversible de las aldehído deshidrogenasas a sus correspondientes ácidos carboxílicos con la reducción del NAD+ o NADP+.La enzima BADH utiliza las coenzimas NAD+ y NADP+ , cuando estas se oxidan presentan una absorción máxima de 340nm (medición de la actividad enzimática) (Flores et al, op cit).

REFERENCIAS

● Flores, H. O. Riveros, R. H. Sosa P. A. y Vázquez C. E. 2004. Mensaje Bioquímico. Vol XXVIII. Depto Bioquímica. Facultad de Medicina, Universidad Nacional Autónoma de México. Cd Universitaria, México, DF. 203-223 pp.

● Fuentealba, U.F. Fuentes, C. V. Lobo, B. M. y Mora, V. C. 2010. Técnicas Bioquímicas: Cromatografía de intercambio Iónico. Facultad de medicina. Escuela de Medicina Dpto. de Bioquímica. 13 pp.

● Lehninger. 2007. Principios de Bioquímica. Edit. Omega. Edición 5ta. Pags 1296.