DNA
DNA ESTRUCTURALA ESTRUCTURA DEL ADN ESTA DEFINIDA POR LA SECUENCIA DE LAS BASES NITROGENADAS EN LA CADENA DE NUCLEOTIDOS
ESTRUCTURA DE BASES NITROGENADAS DEL DNA Y RNA
A G C T
Hombre, H.sapiens0.290.180.180.31
Bovino, Bos taurus0.260.240.230.27
Levadura, S.cerevisiae0.300.180.150.29
Mycobacterium sp.0.120.280.260.11Composicin en bases del DNA en algunas especies
1. La relacin purinas/pirimidinas es igual a 1 Es decir, A+G = C+T
2. En todos los DNA estudiados, la proporcin molar de A es igual a la de T, y la de G igual a la de C. Es decir, A = T y G = CReglas de Chargaff
1. El DNA es una doble hliceplectonmica y dextrgira, con un paso de rosca de 3.4 nm3.4 nmModelo de Watson - Crick, A
Modelo de Watson-Crick, B2. Cada una de las dos hlices es un polinucletido entrelazado conel otro de manera que su polaridad es opuesta (es decir, corren ensentido antiparalelo)5353
3. El eje ribosa-fosfato se sitahacia el exterior de la doble hlice,en contacto con el solvente4. Mientras que las bases nitrogenadas (anillos planares) se sitan, apiladas,hacia el interior de la estructura, en unentorno hidrofbicoModelo de Watson-Crick, C
5. Las bases estn situadas en planos aproximadamenteperpendiculares al eje mayor de la doble hlice. La distanciaentre planos es de 0.34 nmModelo de Watson-Crick, D0.34 nm
Modelo de Watson-Crick, E6. Cada base interaccionacon su opuesta a travs deenlaces de hidrgeno, y demanera que:
(a) Adenina (A) slo puede interaccionar con timina (T)(y viceversa), a travs de dos puentes de hidrgeno, y
(b) Guanina (G) slopuede interaccionar concitosina (C) (y viceversa),a travs de tres puentesde hidrgeno
321547. La base est situadaen posicin anti-8. La desoxirribosaen forma furansica9. El anillo furansico esten conformacin endo-2Modelo de Watson-Crick, F
10. El eje de la doble hliceno pasa por el centro geomtricodel par de bases. Esto determinaque la hlice presente un surcoancho y un surco estrechoSurco anchoSurcoestrechoModelo de Watson-Crick, G
Paso de rosca3.4 nm
Distancia entre 0.34 nmplanos de bases
Pares de bases/vuelta10
Anchura2.4 nmGeometra de la doble hlice (DNA-B)0.343.42.4
Interacciones dbiles que mantienen la estructura del DNA1. Enlaces de hidrgeno entre bases complementarias
2. Interacciones hidrofbicas entre planos de bases contiguos (int. de apilamiento, stacking)
3. Interacciones inicas del fosfato con molculas electropositivas (histonas, poliaminas, etc.)
1. Compatible con los datos cristalogrficos
2. El modelo predice una determinada densidad lineal que se cumple para todos los DNAs conocidos
3. El DNA rico en GC debe ser ms difcil de desnaturalizar que el rico en AT. Esta prediccin se cumple perfectamente.
4. El estudio de frecuencias de vecino ms prximo (A.Kornberg) slo es compatible con un modelo complementario y antiparalelo
p.e.: el par AG tiene la misma frecuencia que el par CT; AT tiene la misma frecuencia que TA, y as sucesivamente.Pruebas experimentales de la estructura del DNA
A B Z
Grosor2.62.41.8GiroDextroDextroLevoBases/vuelta1110.412P.de rosca2.53.44.5Inclinacin1919plano basesDistintas formas del DNA
DNA-A1.Doble hlice plectonmica y dextr- gira
2. Planos de bases oblicuos respecto al eje de la doble hlica
3. Propio de RNAs en doble hlice, o de hbridos DNA-RNA
4. Ms ancha y corta que DNA-B
DNA-Z1. Doble hlice plectonmica y levgira
2. Zonas de secuencia alternante -GCGC-
3. Conformacin de G es syn- en lugar de anti-
4. Ms estrecha y larga que DNA-B
Desnaturalizacin del DNAT, C% IncrementoAbsorbancia a260 nmLa desnaturalizacintrmica del DNA sigueuna curva sigmoide. Elpunto medio, Tm, est relacionado con el conte-nido en G+C. As, la muestraB tiene un mayor contenidoen G+C que A.
La temperatura de fusin (Tm) necesaria para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reaccin ADN doble hlice ADN hlice sencilla) esta directamente relacionada con el contenido en G+C, a mayor contenido en G+C mayor temperatura de fusin (Tm).
El estado fsico de los cidos nucleicos est relacionado con su capacidad de absorcin de la luz ultravioleta (UV) a 2.600 . El menor grado de absorcin se produce en estado de doble hlice, la absorcin aumenta cuando se produce la desnaturalizacin pasando a estado de hlice sencilla (efecto hipercrmico, aumento de la absorbancia) y, por ltimo, si degradamos este ADN de hlice sencilla a nivel de nucletidos libres, de nuevo aumenta la absorbancia.Efecto Hipo crmico del DNA
EFECTO HIPOCROMICO
Para qu purificar DNA?Aplicaciones
AplicacionesForenseDx enfermedades infecciosasDx enfermedades congnitasClonacin de GenesGenmicaControl de calidad microbiolgicoBiodiversidadIdentificacin de especies
Cmo purificar DNA?
Los 3 pasos bsicos para purificar DNALisis celular
Fraccionamiento de los cidos nucleicos
Concentracin de los cidos nucleicos
1.2.3.
1. Lisis celularLisis enzimtica de tejidos animalesTampn de lisis con detergente. Algunos protocolos Con proteinasa K.
Lisis de bacterias o levaduras.Lisozima (Bacterias Gram-positivas) liticasa (levaduras).Detergente y pH alcalino para plsmidos.
Homogenizadores mecnicosAgitador mecnico, a la muestra se adicionan esferas.
Congelacin descongelacinSe usa nitrgeno liquido.
2. Fraccionamiento de los cidos nucleicosPreparacin de lisados crudosNo se purifica
Salting-out methodsSe precipitan las proteinas y contaminantes con sales de acetato de amonio o potasio
Fraccionamiento con solventes orgnicosFenol/cloroformo/alcohol isoamlico
3. Concentracin de cidos nucleicosPrecipitacin con:Etanol IsopropanolEn presencia de sales
2. SEPARACION DE FRAGMENTOS DE DNAElectroforesis
Cmo hacer una electroforesis de DNA?
Electroforesis de DNA
Electroforesis de DNA
Cmo se ve una electroforesis de DNA en geles de Agarosa?
Electroforesis de DNA
1235467
Propiedades estructurales del DNA5pOH3Las hebras de una molecula de DNA son Antiparalelas y complementarias
Complementaridad del DNATACGTATACGTACGCGTA5pp 5OH33 OHPuentesHidrgeno
25CDesnaturalizacin/reasociacin del DNA
Desnaturalizacin/reasociacin del DNA
Reasociacin solo con cadenas complementarias
Hibridacin Es la unin de dos cadenas de cidos nucleicos complementarias para formar un duplex o molcula de cadena doble. Posibles hbridacionesDNA-DNADNA-RNA
DesnaturalizacinReasociacinRenaturalizacin
Molcula de DNAcs o RNA homloga a una secuencia de DNAcs o RNA con la que se hibrida de forma estable y especfica por asociacin de bases complementarias.
Sondas Una sonda es un fragmento de DNA que:Se puede marcar para ser identificado y medidoSe hibrida a un DNA gracias a su complementaridadTipo de marcajesRadioactivo (32P, 35S, 14C, 3H)FluorescenteBiotinilacin (avidina-streptavidina)
Hibridacin de DNA inmobilizado en soportes de hibridacion: Nitrocelulosa Membranas de nylon
Southern Blot
Nucleasas
Southern BlotEnzimas de retriccin
Southern (and Northern) blot: 1. electrophoresis
Southern (and Northern) blot: 2. transfer to a filter/membrane
Southern (and Northern) blot: 3. hybridization to a labeled unique probe
Gel de agarosaFiltro denitrocelulosatransferenciaELECTROFORESIS
Southern Blot
FILTRO DE NITROCELULOSACOLONIAS REPLICA ENPLACA CON FILTROFILTRO CON COLONIASCOLONIASADN DE LAS COLONIASEN EL FILTROAUTORADIOGRAFACOLONIA- Rplica en placa con filtro- Lisis- Secado- Hibridacin con sonda radioactiva
Hibridacion in situ por fluorescencia
Hibridacion in situ por fluorescencia
*******Human Genomic DNA
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