Tinción de la muestra
• Aumenta la resolución• Acentúa las características morfológicas
• Conserva la muestra
ColorantesHacen más visibles las estructuras internas y externas aumentando el contraste con el fondo
–2 características fundamentales :• Grupos cromóforos
–Con dobles enlaces conjugados–Dan al colorante su color
• Afinidad por los componentes celulares–Por enlaces iónicos (más comunes) , covalentes o hidrófobos
Colorantes• Ácidos:
– afinidad por las estructuras alcalina hemoglobina
– Eosina.
• Básicos: – afinidad por las estructuras ácidas ácidos nucleicos.
– Azul de metileno.
Colorantes• Neutros:
– Sales de un ácido y de una base coloreados. – Tiñen el núcleo de un color y el citoplasma de
otro. – Eosinato de azul de metileno.
• Indiferentes: – Insolubles en el agua y tiñen
a aquellas sustancias que tienen un poder de disolución superior al del líquido empleado para preparar la solución colorante.
– Sudán III para teñir las grasas.
Fijación– Por calor
•Preserva la morfología general pero no las estructuras internas
– Química•Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño
Fijación química• Aldehídicos
• Ácido ósmico• Tetróxido de osmio
• Compuestos mercúricos y crómicos,
• Alcoholes, la acetona, el dietil-pirocarbonato.
Tipos de tinción• Tinción simple
– Un solo colorante. –Colorantes básicos
• Mas usados• Tienen cargas positivas
–Ej.: Cristal violeta, fucsina básica, safranina, verde malaquita
–Colorantes ácidos • Menos usados• Tienen cargas negativas
–Ej.: Eosina, Fucsina ácida
Safranina
Tipos de tinc ión
•Tinción diferencial
– 2 ó más colorantes– Divide a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades de tinción:
•Tinción de Gram•Tinción ácido alcohol resistente
• Tinción de Gram
Procedimiento Técnico
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Gram positiva
Gram negativa
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-Tinc ión Ácido alcohol res is tente
– Elevado contenido en lípidos de las paredes de estas células
– Se tiñen calentando una mezcla de fucsina básica y fenol
Mycobacterium lepraeColorante de contraste: azul de metileno
-Método de Ziehl Nee ls en
• Frotis fijación x calor teñir con fucsina fenicada Calentar suavemente con el mechero hasta la emisión de vapores.
– El colorante no debe secarse ni hervir, añadir más si es necesario.
– Mantener la emisión de vapores durante 5 minutos. • Lavar con agua decolorar con alcohol ácido
Lavar con agua teñir con azul de metileno• un minuto.
• Lavar con agua escurrir dejar secar al aire microscopio
*Rojo Positivo *Azul Negativo
TINCIÓN DE KINYOUN• Ziehl-Neelsen modificado Método frío
– Extensión Desecación Fijación Dejar enfriar Coloración
• Fucsina de Kinyoun • 5-7 minutos-min., sin calentar.
– Lavar con agua/escurrir el colorante Decolorar con alcohol-HCl Lavar con agua Coloración de contraste
• Azul de metileno • 2-3 min.
– Lavar secar microscopio.
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Tinc ión de es tructuras es pec íficas
Tinción negativa– Para capsulas – Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden sobre un porta
– Las capsulas se observan sin color sobre un fondo oscuro
Cryptococcus neoformans – tinción negativa con tinta china
– Doble tinción– Las esporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita
– Se contratiñe con safranina quedando las células vegetativas y las endosporas con colores diferentes
Bacillus cereus
Tinción de esporas (Método de Schaeffer-Fulton)
Tinc ión de flage los– Los flagelos deben ser recubiertos con suficiente colorante como para ser observados
– Se aplica mordiente (como ácido tánico y alumbre de potasio) para aumentar el grosor de los flagelos y se tiñen con pararosanilina (Método de Leifson) o fucsina básica (Método de Gray)
Vibrio cholerae O1
Tinc iones policrómicas• Tipo Romanowsky
– un colorante ácido (eosina) – Colorantes básicos (tiacinas).
• Azul de metileno y sus derivados (colorantes tipo azur).
• Diagnóstico hematológico– Wright – Giemsa
• sola o en combinación con la de May-Grünwald
TINCIÓN GIEMSA• Frotis sanguíneo • Fijación con metanol x 3 minutos Escurrir
secar al aire • Diluir en un tubo de ensayo 0,2 ml de azur-
eosina-azul de metileno según Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2.
• Cubrir el frotis con la dilución de colorante– dejándolo actuar durante 25 minutos.
• Escurrir lavar con agua del grifo. • Lavar con tampón pH 7,2 hasta eliminar los
restos del colorante. • Escurrir y secar en posición vertical
TINCIÓN GIEMSA• Eritrocitos color rosa asalmonado
• Plaquetas color violeta.
• Neutrófilos núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la granulación de un color violeta rojizo
TINCIÓN DE WRIGHT• Frotis sanguíneo muy fino secar al aire. • Verter 1 ml de eosina-azul de metileno
– por un minuto
• Lavar con solución tampón pH 7,2 escurrir y secar en posición horizontal
• Diluir 0,5 ml. de eosina-azul de metileno con 0,5 ml de solución tampón pH 7,2. Mezclar bien y cubrir la extensión. – durante 3-5 minutos
• Lavar con agua del grifo con solución tampón pH 7,2 escurrir y secar en posición vertical.
Tinción de es tructurases pec íficas
Sistemas de marcaje inmunocitoquímico
• Métodos directos – primer anticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo de marcador fluorocromo
Tinción de es tructurases pec íficas
• Métodos indirectos– El anticuerpo primario aplicado sobre las células es reconocido por un segundo anticuerpo, secundario, unido a un marcador
– El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso.
– Mas sensible
Tinción de es tructurases pec íficas
• Métodos del anticuerpo no marcado o de puente
anticuerpo primario anti-anticuerpo, secundario anticuerpo anti-peroxidasa peroxidasa.
Otras tinc iones
• Para protozoos• Para Trichomonas vaginalis• Para amibas de vida libre• Para helmintos
Conclus ión
Materiales
Técnica
Observacion
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