UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA EQUINOCCIAL
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA INGENIERÍA E
INDUSTRIAS
CARRERA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS
Evaluación de la Capacidad Antioxidante por el Método
DPPH de Nuevas Cromonas Haloalquil Sustituidas.
TRABAJO PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO
DE INGENIERA DE ALIMENTOS
ZAIDA PAULINA DUFFEY CASTILLO
DIRECTOR: Dr. CRISTIAN ALCIVAR LEÓN
Quito, Marzo 2018
DERECHOS DE AUTOR
© Universidad Tecnológica Equinoccial. 2018
Reservados todos los derechos de reproducción
FORMULARIO DE REGISTRO BIBLIOGRÁFICO
PROYECTO DE TITULACIÓN
DATOS DE CONTACTO
CÉDULA DE IDENTIDAD: 0201937059
APELLIDO Y NOMBRES: DUFFEY CASTILLO ZAIDA PAULINA
DIRECCIÓN: MACHALA Y RÍO TULIPE
EMAIL: [email protected]
TELÉFONO FIJO: 022491712
TELÉFONO MOVIL: 0984651460
DATOS DE LA OBRA
TITULO: Evaluación de la Capacidad Antioxidante por el Método DPPH de Nuevas Cromonas
Haloalquil Sustituidas.
AUTOR O AUTORES: ZAIDA PAULINA DUFFEY CASTILLO
FECHA DE ENTREGA DEL PROYECTO DE
TITULACIÓN:
Marzo de 2018
DIRECTOR DEL PROYECTO DE TITULACIÓN: Dr. CRISTIAN ALCIVAR LEÓN
PROGRAMA PREGRADO POSGRADO
TITULO POR EL QUE OPTA: INGENIERA EN ALIMENTOS
RESUMEN: Mínimo 250 palabras
Las cromonas son compuestos heterocícliclos, distribuidos en plantas y pigmentos. Los compuestos derivados de cromona con sustituyentes haloaquilo obtenidos por síntesis, muestran mejores propiedades de liposolubilidad. Asimismo, diversas actividades biológicas, como actividad antiinflamatoria, antimicótica, antimicrobiana, antiviral, antitumoral y anticancerígena. El presente trabajo evaluó la capacidad antioxidante de 13 nuevas cromonas haloalquil sustituidas, correlacionando los resultados experimentales con la entalpía de disociación de enlace (EDE). El
X
estudio teórico de la EDE permite inferir en la capacidad de molécula antioxidante de donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable. La actividad antioxidante se determinó mediante el radical estable DPPH y los resultados se expresaron como EC50 utilizando el estándar Trolox como referencia. De las 13 moléculas analizadas, 2 actuaron como anti radicales efectivos correspondientes a las estructuras de 3-nitrometil-2-triflurometilcromona (A) y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (B). Se determinó un EC50 de 0.00185; 0.00093 y 0.000043 g para A, B y Trolox, respectivamente. En cuanto al poder anti radical (P.A.) expresado como 1/EC50 se obtuvo valores de 541.23; 1080.5 y 23081.8 A, B y Trolox respectivamente. Los resultados muestran una relación directamente proporcional entre el poder anti radical y la capacidad antioxidante. Por otro lado, los valores de EDE fueron 331.4 kJ/mol (A) y 280.7 kJ/mol (B) y evidencian una mayor facilidad para escindir el enlace C-H, en el compuesto B con el grupo azido (N3), donde el grupo funcional N3 que presenta características electro-atractoras favorece la deslocalización del radical a lo largo del anillo cromona. Asimismo, la densidad spin mostró la deslocalización del electrón en ambos compuestos y la capacidad del nitrógeno en el grupo azida de favorecer la potencia antioxidante. Finalmente, se observó que cuanto menor es el EDE, mayor es la capacidad de donar un átomo H de un grupo
hidroxilo, dando lugar a un radical más estable. Debido a la actividad biológica de las cromonas, al contener actividad antioxidante nos permite abrir una puerta hacia la creación de novedosos compuestos útiles para la industria alimentaria y la industria farmacológica.
PALABRAS CLAVES: 2-Trifluorometilcromonas-3-metilsustituidas, DPPH, entalpía de disociación de enlace (EDE).
ABSTRACT:
Chromones are heterocyclic compounds, distributed in plants and pigments. Compounds derived from chromone with haloacyl substituents obtained by synthesis, show better liposolubility properties. furthermore, various biological activities, such as anti-inflammatory, antifungal, antimicrobial, antiviral, antitumor and anticancer activity. The present work evaluated the antioxidant capacity of 13 new haloalkyl substituted chromones, correlating the experimental results with enthalpy of bond dissociation (BDE). The theoretical study of BDE allows to infer the capacity of antioxidant molecule to donate an atom of H, to form an stable radical. The antioxidant activity was determined by the stable DPPH radical and the results were expressed as EC50 using Trolox as reference. Of the 13 molecules analyzed, 2 acted as effective anti-radicals corresponding to the structures of 3-nitromethyl-2-trifluoromethylchromone (A) and 3-azidomethyl-2-trifluoromethyl-chromone (B). An EC50 of 0.00185 was determined; 0.00093 and 0.000043 g for A, B and Trolox, respectively. Regarding
DEDICATORIA
Este trabajo va dedicado a mi familia que siempre me ha apoyado y de
una u otra manera han estado presentes en cada paso de mi vida.
A mi madre porque gracias a ella soy la mujer que soy, por su fortaleza,
porque nunca dejó de creer en mí, ha sabido mantenerse de pie ante
cualquier adversidad y me ayudó a llegar a este punto de mi vida, con sus
palabras siempre acertadas y su ejemplo de vida. ¡Te amo!
A mi padre por su paciencia, amor, ejemplo y tolerancia, me ayudó a
formar mi carácter y a saber que quiero en la vida.
A Doris por ser ejemplo de fuerza y de superación, nada es capaz de
derrotarte.
A Sofía porque siempre has sido amiga y hermana.
A Amanda por ser mi luz, cada vez que me abrazas el mundo se detiene,
eres parte de mi fuerza.
Andrea porque la vida nos hizo hermanas, siempre tuviste las palabras
justas para levantarme cuando sentía que el mundo se venía abajo.
¡Con amor para todos ustedes!
AGRADECIMIENTOS
Agradezco en primer lugar a mi Director el Dr. Cristian David Alcivar León
por su tiempo, paciencia y dedicación a este trabajo, por impartirme sus
conocimientos, experiencia y sus palabras de apoyo en todo este
proceso, por su amistad, Muchas Gracias.
Al personal del CIAL especialmente a la Bioq. María José Andrade y la
Ing. Michelle Guijarro quienes en su momento supieron guiarme y
ayudarme para el desarrollo del presente trabajo.
A mis padres por estar siempre presentes con su apoyo incondicional, por
no dudar de mí.
A mi tía Ana Alicia que siempre está apoyándome y fue parte importante
en el desarrollo de mi carrera, fue luz al final del túnel, millón Gracias.
A mi primo César Vega, sin tu ayuda esto no hubiese sido posible, estoy
agradecida eternamente contigo.
A mis amigas Andre, Gise, Pame, Edu, Taty, Dany que siempre me
hicieron barras y me ayudaron cuando necesité.
A mis amigos anónimos que con llamadas o mensajes siempre me
animaron a continuar.
¡A todos ustedes Gracias!
i
ÍNDICE DE CONTENIDOS
PÁGINA
RESUMEN ………………………………………………………………………1
ABSTRACT ……………………………………………………………………..2
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................3
1.1. EL PROCESO DE GENERACIÓN DE RADICALES LIBRES .......3
1.2. EL NÚCLEO ESTRUCTURAL CROMONA Y LA ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE ......................................................................................5
2. METODOLOGÍA .................................................................................9
2.1. PRODUCTOS QUÍMICOS Y SOLVENTES ..................................9
2.2. ACTIVIDAD SECUESTRANTE DE RADICALES LIBRES ...........9
2.3. CÁLCULO DE LAS ENTALPÍAS DE DISOCIACIÓN DE ENLACES Y
DISTRIBUCIÓN DE LA DENSIDAD ESPÍN. ..........................................10
2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ...........................................................12
2.4.1. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR
TRATAMIENTOS DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA .. 12
2.4.2. PRUEBA TUKEY PARA 3-NITROMETIL-2-
TRIFLUROMETILCROMONA.................................................................. 13
2.4.3. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS
DE 3-AZIDOMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA. ........................... 14
2.4.4. PRUEBA TUKEY DE 3-AZIDOMETIL-2
TRIFLUOROMETILCROMONA ............................................................... 15
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..........................................................17
3.1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE ....................................................17
3.1.1. CURVAS DOSIS-RESPUESTA PARA LA CAPACIDAD DE
CAPTACIÓN DPPH DE 3-NITROMETIL-2-
TRIFLUOROMETILCROMONA. .............................................................. 21
3.2. ENTALPIA DE DISOCIACIÓN DE ENLACE ...............................22
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ....................................27
4.1. CONCLUSIONES .......................................................................27
4.2. RECOMENDACIONES ...............................................................28
ii
5. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................29
6. ANEXOS ...........................................................................................31
iii
ÍNDICE DE TABLAS
PÁGINA
Tabla 1. ANOVA 3-nitrometil-2-triflurometilcromona .............................12
Tabla 2. Prueba TUKEY 3-nitrometil-2-triflurometilcromona ..................13
Tabla 3. Diferencia significativa 3-nitrometil-2-triflurometilcromona .......13
Tabla 4. ANOVA 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ..........................14
Tabla 5. Prueba TUKEY 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ...............15
Tabla 6. Diferencia significativa 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ....15
Tabla 7. Resumen de resultados de la capacidad antioxidante .............17
Tabla 8. Concentración Efectiva EC50 ...................................................18
Tabla 9. Energía de disociación de enlace………………………………...22
Tabla 10. Energía de disociación de enlace. ...........................................23
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
PÁGINA
Figura.1 Generación de radicales libres ...............................................33
Figura.2 Radical libre y molécula normal ...............................................4
Figura 3. Estructura de flavonoides y sus anillos A, B y C. ......................5
Figura 4. Nuevas Moléculas ....................................................................7
Figura 5. Reacción química entre especie antioxidante y el radical. .......8
Figura 6. Capacidad Antioxidante DPPH .............................................19
Figura 7. Cinética de estabilización de la molécula A ............................19
Figura 8. Cinética de estabilización de la molécula B ............................19
Figura 9. Curva dosis-respuesta 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona ....20
Figura 10. Curva dosis-respuesta 3-azidometil-2-trifluorometilcromona ..21
Figura 11. Curva dosis-respuesta trolox ..................................................22
Figura 12. Especies Radicalarias ...........................................................22
v
ÍNDICE DE ANEXOS
PÁGINA
ANEXO 1 Cálculo de UPM6 ..............................................................31
ANEXO 2 Imágenes del trabajo experimental ....................................32
1
RESUMEN
Las cromonas son compuestos heterocícliclos, distribuidos en plantas y
pigmentos. Los compuestos derivados de cromona con sustituyentes
haloaquilo obtenidos por síntesis, muestran mejores propiedades de
liposolubilidad. Asimismo, diversas actividades biológicas, como actividad
antiinflamatoria, antimicótica, antimicrobiana, antiviral, antitumoral y
anticancerígena. El presente trabajo evaluó la capacidad antioxidante de 13
nuevas cromonas haloalquil sustituidas, correlacionando los resultados
experimentales con la entalpía de disociación de enlace (EDE). El estudio
teórico de la EDE permite inferir en la capacidad de molécula antioxidante de
donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable. La
actividad antioxidante se determinó mediante el radical estable DPPH y los
resultados se expresaron como EC50 utilizando el estándar Trolox como
referencia. De las 13 moléculas analizadas, 2 actuaron como anti radicales
efectivos correspondientes a las estructuras de 3-nitrometil-2-
triflurometilcromona (A) y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (B). Se
determinó un EC50 de 0.00185; 0.00093 y 0.000043 g para A, B y Trolox,
respectivamente. En cuanto al poder anti radical (P.A.) expresado como
1/EC50 se obtuvo valores de 541.23; 1080.5 y 23081.8 A, B y Trolox
respectivamente. Los resultados muestran una relación directamente
proporcional entre el poder anti radical y la capacidad antioxidante. Por otro
lado, los valores de EDE fueron 331.4 kJ/mol (A) y 280.7 kJ/mol (B) y
evidencian una mayor facilidad para escindir el enlace C-H, en el compuesto
B con el grupo azido (N3), donde el grupo funcional N3 que presenta
características electro-atractoras favorece la deslocalización del radical a lo
largo del anillo cromona. Asimismo, la densidad spin mostró la
deslocalización del electrón en ambos compuestos y la capacidad del
nitrógeno en el grupo azida de favorecer la potencia antioxidante.
Finalmente, se observó que cuanto menor es el EDE, mayor es la capacidad
de donar un átomo H de un grupo hidroxilo, dando lugar a un radical más
estable. Debido a la actividad biológica de las cromonas, al contener
actividad antioxidante nos permite abrir una puerta hacia la creación de
novedosos compuestos útiles para la industria alimentaria y la industria
farmacológica.
Palabras clave: 2-Trifluorometilcromonas-3-metilsustituidas, ensayo de DPPH, entalpía de disociación de enlace (EDE), densidad de spin
2
ABSTRACT
Chromones are heterocyclic compounds, distributed in plants and pigments.
Compounds derived from chromone with haloacyl substituents obtained by
synthesis, show better liposolubility properties. furthermore, various biological
activities, such as anti-inflammatory, antifungal, antimicrobial, antiviral,
antitumor and anticancer activity. The present work evaluated the antioxidant
capacity of 13 new haloalkyl substituted chromones, correlating the
experimental results with enthalpy of bond dissociation (BDE). The
theoretical study of BDE allows to infer the capacity of antioxidant molecule
to donate an atom of H, to form an stable radical. The antioxidant activity
was determined by the stable DPPH radical and the results were expressed
as EC50 using Trolox as reference. Of the 13 molecules analyzed, 2 acted
as effective anti-radicals corresponding to the structures of 3-nitromethyl-2-
trifluoromethylchromone (A) and 3-azidomethyl-2-trifluoromethyl-chromone
(B). An EC50 of 0.00185 was determined; 0.00093 and 0.000043 g for A, B
and Trolox, respectively. Regarding the anti-radical power (P.A.) expressed
as 1 / EC50, values of 541.23 were obtained; 1080.5 and 23081.8 A, B and
Trolox respectively. The results show a directly proportional relationship
between anti-radical power and antioxidant capacity. On the other hand, the
BDE values were 331.4 kJ / mol (A) and 280.7 kJ / mol (B) and show a
greater facility to cleave the CH bond, in compound B with the azido group
(N3), where the functional group N3 that presents electro-actractor
characteristics favors the delocalization of the radical along the chromone
ring. Likewise, the spin density showed the delocalization of the electron in
both compounds and the nitrogen capacity in the azide group to favor the
antioxidant potency. Finally, it was observed that the smaller the BDE, the
greater the capacity to donate an H atom of a hydroxyl group, giving rise to a
more stable radical. Due to the biological activity of chromones, since it
contains antioxidant activity, it allows us to open a door towards the creation
of novel compounds useful for the food industry and the pharmaceutical
industry.
Keywords: 2-Trifluoromethyl-chromonas-3-methylsubstituted, DPPH, Bond
dissociation enthalpy (BDE), spin density.
1. INTRODUCCIÓN
3
1. INTRODUCCIÓN
1.1. EL PROCESO DE GENERACIÓN DE RADICALES
LIBRES
Los procesos de oxidación provocan deterioro en la composición de algunos
productos, por ende daños en la función nutricional y sensorial (Figura 1).
Estos procesos son causados por la acción de los radicales libres (Figura 2),
que son moléculas o intermediarios muy reactivos, que en su estructura
química presenta un electrón desapareado o libre, por lo tanto tienden a
captar un electrón de moléculas estables con el fin de alcanzar su propia
estabilidad. Actualmente, se busca retardar este tipo de reacciones con el
uso de bajas temperaturas, reducción de presión y oxígeno, enzimas que
catalizan la oxidación y material de empaque adecuado (J. Pokorny,
Yanishlieva, Alonso, & Gordon, 2004).
Una vía para detener el proceso oxidativo es la utilización de compuestos
inhibidores de la oxidación que eviten la iniciación y/o propagación de
reacciones en cadena de los radicales libres, que son causantes de
problemas a la salud por una exposición prolongada a diversos
contaminantes responsables de producir distintos tipos de radicales libres
(Avello & Suwalsky, 2006).
Figura 1. Generación de radicales libres (Cataño 2001)
4
Los procesos oxidativos provocan diferentes patologías como trastornos
cardiovasculares, procesos neurodegenerativos e incluso cáncer (Machado
& Marques, 2010). Como una alternativa para contrarrestar los efectos
nocivos de formación de radicales libres en la última década se ha
investigado una variedad importante de antioxidantes naturales que
muestran diversas actividades biológicas como, agentes antibacteriales,
antivirales, antiinflamatorios, antialergénicos, antitrombóticos y
vasodilatadores (Valenzuela & Pérez, 2016). La variada actividad biológica
muestra una estrecha relación con las propiedades curativas de una gran
cantidad de plantas medicinales (García Bacallao, Vicente García Gómez,
Rojo Domínguez, & Sánchez García, 2001)
Por otra parte, las condiciones de estrés oxidativo, son reconocidas por estar
directamente relacionados al daño de varios procesos bioquímicos en
células, afectando a lípidos, ADN y proteinas (Halliwell, 2007; Riboli & Norat,
2003; von Zglinicki, 2002). El análisis de evidencia epidemiológica muestra la
capacidad de reducir el riesgo de enfermedades como el cáncer,
promoviendo una dieta rica en frutas y vegetales, que promueven un balance
oxidativo homeostático para el organismo (Riboli & Norat, 2003).
Figura 2. Radical libre y molécula normal (Libre de Derechos (S.F.)
5
1.2. EL NÚCLEO ESTRUCTURAL CROMONA Y LA
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE
La relación estructura-actividad anti-radicalaria u antioxidante, depende de la
estructura química y se encuentra fuertemente influenciada por los
sustituyentes, que son determinantes en la eficiencia de la actividad
antioxidante. En moléculas con el anillo estructural cromona, como los
flavonoides tres porciones estructurales determinan la potencia antioxidante
o actividad secuestrante de radicales libres.
(a) La estructura de catecol en el anillo B,
(b) Los dobles enlaces en posición 2 y 3 en conjugación con el grupo
carbonilo en el anillo C,
(c) La presencia de grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 5.
La Figura 3, muestra la relación estructura actividad antioxidante de los
flavonoides, que presentan el anillo estructural cromona.
Particularmente, es conocido el efecto antioxidante y nutracéutico de
diversas cromonas, (Balasundram, Sundram, & Samman, 2006) ubicuas en
el reino vegetal (K Sharma et al., 2011) representando una característica
relevante, la capacidad antioxidante de estos compuestos, que promueven la
disminución de radicales libres (Phosrithong, Samee, Nunthanavanit, &
Ungwitayatorn, 2012). Por lo tanto, la evaluación de la capacidad
antioxidante de cromonas y análogos estructurales (Dias, Machado, &
Marques, 2011) (por ejemplo: flavoniodes, isoflavonoides) sugieren un rol
importante en procesos oxidativos (Li & Yang, 2010). En recientes años este
tipo de compuestos han suscitado gran interés, debido a que son altamente
reactivos como donadores de hidrógeno o electrones y por lo tanto
Figura 3. Estructura de flavonoides y sus anillos A, B y C. El recuadro de color gris señala la porción estructural del anillo responsable de la estructura – actividad antioxidante.
6
presentan facilidad para interaccionar en la disminución y bloquear la
formación de radicales libre (Seyoum, Asres, & El-Fiky, 2006). Esta
evidencia motiva el interés y busqueda de nuevos compuestos antioxidantes,
consistentes con la relación estructura-actividad de un nucleo estructural
cromona y sustituyentes que presenten átomos de halógeno.
Por otra parte, la industria de alimentos tiene entre sus retos más
importantes la conservación de productos. Evitar la descomposición por
microorganismos, proteger la salud de los consumidores y evitar pérdidas
económicas, se encuentran entre las metas comunes de toda empresa (Jan
Pokorny, Yanishlieva, & Gordon, 2005). Es aquí, donde los antioxidantes son
elementos relevantes, debido a su capacidad para controlar el daño
oxidativo, presente de forma natural en lípidos y proteínas, componentes
mayoritarios de algunos alimentos (Valenzuela & Pérez, 2016). En la
actualidad variados antioxidantes naturales son empleados por la industria
de alimentos, estos son provenientes de frutas y vegetales. Sin embargo, su
aplicación a veces no resulta viable o efectiva ya que modifican el aroma,
sabor y valor nutricional. Es así, que el estudio de nuevas moléculas, que
presenten el núcleo cromona y sustituyentes que favorezcan la capacidad
antioxidante suscita un interés constante (De la Vega, Cañarejo, & Pinto,
2017).
Las nombres de las moléculas estudiadas son: 2-difluorometil-3-
metilcromona (1); 2- diclorometil-3-metilcromona (2); 3-metil-2-
pentafluoroetilcromona (3); 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona (4); 3-
azidometil-2-trifluorometilcromona (5); 3-ftalimidoilmetil-2-
trifluorometilcromona (6); 2-clorodifluorometil-3-metilcromona (7); 6-cloro-3-
metil-2-trifluorometilcromona (8); 3-bromometil-2-trifluoroometilcromona (9);
3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona (10); 3-nitrometil-2-
trifluorometilcromona (11); 3-bromometil-2-clorodifluorometilcromona (12); 3-
cianometil-2-trifluorometilcromona (13), estos se presentan en la Figura 4.
7
De los diversos métodos para evaluar la capacidad antioxidante, uno muy
utilizado se basa en la estabilidad del radical 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
(DPPH) el cual se controla mediante la reducción de la absorbancia a una
longitud de onda. El DPPH presenta una coloración violeta cuando está
presente como radical libre, y absorbe alrededor de 520 nm produciendo una
disminución de la absorbancia que cambia a color amarillo (Figura 5).
Cuando una disolución de DPPH entra en contacto con una sustancia que
puede donar una átomo de hidrógeno o con otra especie radical, se produce
la forma reducida DPPH-H ó DPPH-R (Muñoz Juárez & Gutiérrez, 2009).
Figura 4. Nuevas Moléculas (Alcivar 2016)
8
Figura 5. Reacción química entre la especie antioxidante y el radical DPPH.
N
N
NO2
O2N
O2N Antioxidante
DPPH (color: violeta)
NH
N
NO2
O2N
O2N
DPPH--H (color: amarillo)
Antioxidante: cromona
Respecto a la relación estructura – actividad observada en compuestos que
presentan el anillo cromona, se ha observado que el número y posición de
los grupos hidroxilos, influencia en la actividad frente a radicales, debido a
que determinan el carácter de la actividad secuestrante (Muñoz Jauregui &
Ramos Escudero, 2007). En este trabajo se estudiará la capacidad
antioxidante experimental de nuevos derivados que presentan el núcleo
cromona y sustituyentes perhaloalquilo en posiciones 2 y 3. Evaluando la
energía de disociación de enlace (EDE) por métodos teóricos y la densidad
espín de las de los nuevos compuestos. Las correlaciones observadas de
relación estructura – actividad, permitirá inferir en la influencia de grupos
funcionales y su efecto en la tendencia a reaccionar con moléculas
radicalarias (Vakarelska-Popovska & Velkov, 2016)
Por otra parte, la energía de disociación de enlace (EDE) se define como la
cantidad de energía necesaria para romper o formar un enlace. Esta
característica específica del enlace , varía en su valor entre enlace fuertes y
enlaces débiles (Morrison & Boyd, 1998). Otra propiedad teórica evaluada, la
densidad espín pone en evidencia la deslocalización del electrón a lo largo
del sistema conjugado π de la molécula (Bort, 2001).
El presente estudio tuvo como objetivo evaluar la capacidad antioxidante de
una serie de nuevas cromonas haloalquil sustituidas con diversos grupos
funcionales por el método DPPH. Se asistió la interpretación de los
resultados experimentales por estudios téoricos ab initio, que permitieron la
predicción de entalpías de formación de enlace (EDE), debido a su conocida
influencia en la disminución de radicales libres y su capacidad para eliminar
los mismos.
2. METODOLOGÍA
9
2. METODOLOGÍA
2.1. PRODUCTOS QUÍMICOS Y SOLVENTES
Los 13 compuestos estudiados en la presente tesis, fueron provistos por el
Dr. Cristian Alcivar León (Facultad de Ciencias de la Ingeniería. CIAL. UTE,
Quito, Ecuador), los mismos fueron sintetizados y estudiados en la tesis
doctoral de tema ¨Estudio de nuevos benzopiranos haloalquilsustituidos¨
(Alcívar León, 2016).
A continuación, se describen los nombres químicos: 2-difluorometil-3-
metilcromona (1); 2- diclorometil-3-metilcromona (2); 3-metil-2-
pentafluoroetilcromona (3); 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona (4); 3-
azidometil-2-trifluorometilcromon (5); 3-ftalimidoilmetil-2 trifluorometilcromona
(6); 2-clorodifluorometil-3-metilcromona (7); 6-cloro-3-metil-2-
trifluorometilcromona (8); 3-bromometil-2-trifluoroometilcromona (9); 3-
hidroximetil-2-trifluorometilcromona (10); 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona
(11); 3-bromometil-2 clorodifluorometilcromona (12); 3-cianometil-2-
trifluorometilcromona (13).
2.2. ACTIVIDAD SECUESTRANTE DE RADICALES LIBRES
Se evaluó la actividad secuestrante de radicales libres para los 13 derivados
haloalquil sustituidos, a través del ensayo DPPH, utilizando TroloxTM (6-
hidroxi- 2,5,7,8 - tetrametilcromona - 2 - carboxílico) como estándar (Dias et
al., 2011). El método consiste en la reducción de una solución metanólica
de DPPH en presencia de un antioxidante donador de hidrógeno. Tras la
reacción, el DPPH de color violeta (máximo de absorción a 515 nm) produce
una solución amarilla de DPPH2. El cambio de color de violeta a naranja
nos indica que el compuesto analizado presenta capacidad antioxidante,
esta variación de color es determinada utilizando un espectrofotómetro que
mide la absorbancia.
La capacidad antioxidante de los nuevos compuestos se determinó al
agregar soluciones metanolicas (250 µL) de concentración conocida (3 a 4
mM) a 1000 µL de una solución metanólica de DPPH (preparada a partir de
20 mg de DPPH en 500 ml de metanol), la cual se diluyó para obtener un
valor de absorbancia a 515 nm en el rango entre 0.9-1.0 unidades de
10
absorbancia. El porcentaje de DPPH en la solución se determinó, mediante
la ecuación 1
%DPPH en solución
[1]
El porcentaje de DPPH en solución se representó frente a la concentración
de los compuestos ensayados, con el fin de obtener los correspondientes
valores de EC50 que muestran la concentración efectiva que conduce a una
pérdida del 50 % de la actividad de DPPH (Dias, Machado, & Marques,
2011).
Los valores de EC50 (mM) obtenidos con su respectiva desviación estándar
son: 460 ± 0,015 C-NO2; 59 ± 0,036 C-N3; 8,3 ± 0,0977 Trolox.
Para todos los compuestos analizados se utilizó metanol como disolvente.
Se utilizó una solución DPPH_metanólica como control negativo y Trolox
como control positivo. Las medidas fueron realizadas por triplicado con la
finalidad de estimar el coeficiente de variación experimental en cada medida.
2.3. CÁLCULO DE LAS ENTALPÍAS DE DISOCIACIÓN DE
ENLACES Y DISTRIBUCIÓN DE LA DENSIDAD ESPÍN.
Para predecir las entalpías de disociación de enlace (EDE) y distribución de
la densidad de spin en especies radicalarias. Se utilizó cálculos téoricos ab
initio, mediante el software Gaussian 09.
Para las moléculas neutras se realizó un cálculo de optimización de energía
con el nivel de teoría PM6.
Asimismo, de cada molécula neutra optimizada, se generaron radicales por
la eliminación de un átomo de hidrógeno. Se realizó de cada posible radical
un calculó de optimización de geometría, utilizando multiplicidad de spin 2, al
nivel de teoría de capa abierta uPM6. Se tomó en cuenta las estructuras
radicalarias que presentaron menor energía de disociación del enlace C-H
(BDE), asociadas con la formación de radicales, se calculó de acuerdo a la
ecuación 2:
[2] 𝐸𝐷𝐸 𝐻𝑓 𝑀 + 𝐻𝑓 𝐻 − 𝐻𝑓 𝑀 − 𝐻
11
Donde Hf (M.), Hf (H) y Hf (M-H) representan, las entalpías de formación de la
especie radical, hidrógeno y neutra formado por la eliminación de un enlace
C-H. El átomo de hidrógeno presentó un valor de energía de 0.0830298
Hartrees, calculado al mismo nivel de teoría (uPM6) mostrados en el Anexo
1.
Por otra parte, los valores de densidad de espín (DE) corresponden a la
probabilidad de localización del electrón desapareado en la molécula. De los
radicales que presentaron actividad antioxidante por el ensayo experimental
de DPPH se generó los orbitales que muestran la distribución de densidad
de espín, los mismos que ponen en evidencia los átomos de la estructura
radicalaria donde se produce la deslocalización electrónica.
Finalmente, se correlacionó los valores EC50 (µM) y la entalpía de
disociación de enlace EDE (kJ mol -1) de los compuestos que presentaron
actividad antioxidante, respecto a Trolox.
A continuación se detalla el cálculo de la EDE para los compuestos que
presentaron actividad antioxidante.
[4]
𝑬𝑫𝑬𝑵𝟑 𝑯𝒇 𝑴 +𝑯𝒇 𝑯 −𝑯𝒇 𝑴− 𝑯
𝐸𝐷𝐸𝑁3 − 36,5924443 + − ,5 2257 − − 37.228855 2 = 0,134154
EDE N3 = 0,134154 Hartree EDE N3 = 352,221 kJ/mol
𝑬𝑫𝑬𝑵𝑶𝟐 𝑯𝒇 𝑴 +𝑯𝒇 𝑯 −𝑯𝒇 𝑴−𝑯
𝐸𝐷𝐸𝑁𝑂2 − 77.5 66 235 + − ,5 2257 − − 78. 67 75 4 = 0,158216
EDE NO2 = 0,158216 EDE NO2 = 415,396 kJ/mol
12
2.4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los valores experimentales se ajustaron con funciones de regresión no
lineal, y los resultados se compararon con los determinados utilizando el
agente antioxidante de referencia Trolox. Todas las mediciones se realizaron
por triplicado.
2.4.1. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA
La Tabla 1 muestra los resultados del análisis de varianza de un factor para
los datos experimentales de absorbancia. Se compararon los valores
medios de absorbancias para los 4 diferentes niveles de concentraciones.
La prueba-F en la tabla ANOVA permite determinar, si hay diferencias
significativas entre las medias.
Fuente Suma de Cuadrados
Gl*
Cuadrado Medio
Razón-F Valor-p
Entre grupos
0.00237 3 0.00079 15.88 0.010
Intra grupos 0.000398 8 0.00004975
Total (Corr.) 0.002768 11
*Gl: grados de libertad
En vista que el valor-p de la prueba-F es menor que 0.05, existe una
diferencia estadísticamente significativa entre la media de absorbancias, con
un nivel del 95.0 % de confianza. Para determinar cuáles son las
concentraciones significativamente diferentes, se realizó una prueba de
significación de Tukey, se seleccionó esta prueba debido a que el proceso
aún no es estandarizado y se lo realizó a baja escala.
Donde el valor F es una estrategia para poner a prueba la hipótesis de
igualdad de medias, refleja el grado de parecido entre las medias que se
están comparando. Si la hipótesis nula es verdadera, la relación será
alrededor de 1 (Pérez López, 2005).
Tabla 1. Tabla ANOVA para absorbancias por Tratamientos de 3-nitrometil-2-
triflurometilcromona
13
El ―valor de p‖ representa una seguridad del 95% que la asociación que
estamos estudiando no sea por el azar. Por conceso se ha aceptado un
0.05% de arbitrariedad, es decir, de error (MANTEROLA & PINEDA, 2008)
Los grados de libertad Gl nos describe al espacio e hiperespacios de libertad
a través de los cuales una medida de resumen puede moverse y tomar
diferentes valores (La Cruz-Oré & Luis, 2013)
2.4.2. PRUEBA TUKEY PARA 3-NITROMETIL-2-TRIFLUROMETILCROMONA
En la Tabla 2 se muestra los resultados de la prueba de Tukey para la 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.
Método: 95.0 porcentaje Tukey HSD
Se han identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X's en
columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre
aquellos niveles que compartan una misma columna de X's.
La Tabla 3 aplica un procedimiento de comparación múltiple para determinar
cuáles medias son significativamente diferentes de otras. La mitad inferior
de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El
asterisco que se encuentra al lado de los 4 pares indica que estos pares
muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0%
de confianza.
Concentraciones Casos Media Grupos Homogéneos
1 3 0.2583 X
2 3 0.2663 X
3 3 0.2873 X
4 3 0.2920 X
Contraste Diferencia +/- Límites
1 – 2 -0.008 0.0184359
1 – 3 * -0.029 0.0184359
1 – 4 * -0.0336667 0.0184359
Tabla 2. Tabla prueba TUKEY para la para 3-nitrometil-2-triflurometilcromona
Tabla 3. Tabla prueba TUKEY para la 3-nitrometil-2-triflurometilcromona - diferencia significativa.
14
* indica una diferencia significativa.
El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el
procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey.
Con este método hay un riesgo del 5.0% al decir que uno o más pares son
significativamente diferentes, cuando la diferencia real es igual a 0.
Este análisis estadístico ayuda a identificar cuál es la concentración
adecuada para que la cromona presente actividad antioxidante. En este caso
la concentración que presenta una mejor respuesta en capacidad
antioxidante es la solución con mayor concentración.
2.4.3. TABLA ANOVA PARA ABSORBANCIAS POR TRATAMIENTOS DE 3-AZIDOMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA.
En la Tabla 4 se realizó un análisis de varianza de un factor para los
resultados de absorbancia. Se compararon los valores medios de
absorbancias para los 4 diferentes niveles de concentraciones. La prueba-F
en la tabla ANOVA determina si hay diferencias significativas entre las
medias
Fuente Suma de
Cuadrados Gl Cuadrado
Medio Razón-F Valor-p
Entre grupos
0.0124476 3 0.00414919 13.04 0.0019
Intra grupos 0.00254533 8 0.000318167 Total (Corr.) 0.0149929 11
Gl: grados de libertad
En vista que el valor-p de la prueba-F es menor que 0.05, existe una
diferencia estadísticamente significativa entre la media de absorbancias, con
un nivel del 95.0 % de confianza. Para determinar cuáles son las
2 – 3 * -0.021 0.0184359
2 – 4 * -0.0256667 0.0184359
3 – 4 -0.00466667 0.0184359
Tabla 4. Tabla ANOVA para absorbancias por Tratamientos 3-azidometil-2-trifluorometilcromona
15
concentraciones significativamente diferentes, se realizó una prueba de
significación de Tukey, se seleccionó esta prueba debido a que el proceso
aún no es estandarizado y se lo realizó a baja escala.
2.4.4. PRUEBA TUKEY DE 3-AZIDOMETIL-2 TRIFLUOROMETILCROMONA
En la Tabla 5 indican los resultados de la prueba de Tukey, se han
identificado 2 grupos homogéneos según la alineación de las X's en
columnas. No existen diferencias estadísticamente significativas entre
aquellos niveles que compartan una misma columna de X's.
Tabla 5. Tabla prueba TUKEY para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona
Método: 95.0 porcentaje Tukey HSD La Tabla 6 muestra los resultados de aplicar un procedimiento de comparación múltiple para determinar cuáles medias son significativamente diferentes. La mitad inferior de la salida muestra las diferencias estimadas entre cada par de medias. El asterisco que se encuentra al lado de los 3 pares indica que estos pares de contraste, muestran diferencias estadísticamente significativas con un nivel del 95.0% de confianza.
Tabla 6. Tabla prueba TUKEY para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona- diferencia significativa
* indica una diferencia significativa.
El método empleado actualmente para discriminar entre las medias es el
procedimiento de diferencia honestamente significativa (HSD) de Tukey.
Tratamientos Casos Media Grupos Homogéneos
A1 3 0.4050 X A2 3 0.4173 X A3 3 0.4200 X
A4 3 0.4873 X
Contraste Diferencia +/- Límites
A1 - A2 -0.01233 0.0466225 A1 - A3 -0.01500 0.0466225
A1 - A4 * -0.08233 0.0466225 A2 - A3 -0.00267 0.0466225
A2 - A4 * -0.07000 0.0466225 A3 - A4 * -0.06733 0.0466225
16
Con este método hay un riesgo del 5.0 % al decir que uno o más pares son
significativamente diferentes, cuando la diferencia real es igual a 0.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
17
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3.1. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
En la Tabla 7 se muestra un resumen de todos los datos calculados para la
determinación de la capacidad antioxidante.
La Ecuación 3 nos indica el cálculo para determinar la concentración molar
[3]
, 7
25 ,24 , ,67
2 2 ,67 ,8 2 25 2 , 42
MTRA
Vfinal
bco
DPPH (l
mtra/...) Absorbancia (515 nm) %
DPPH mM y=a+bx desviación 1/2 Abs EC50 1/EC50
gr cromona (abs) (l) (ml)
(/ml DPPH) 1 2 3 prom cons.
x µM
(l mtra/mlDPPH)
(g cromonaj)
1/g cromona
C-NO2
10 0,0107 0,963 220 1 220 0,262 0,260 0,253 0,2583 73,17 0,63 460 0,01586305 1726,761453 1,85E-03 541,2325
10 0,0107 0,963 200 1 200 0,273 0,274 0,252 0,2663 72,34 0,578
10 0,0107 0,963 180 1 180 0,290 0,290 0,282 0,2873 70,16 0,515
10 0,0107 0,963 160 1 160 0,293 0,291 0,292 0,2920 69,68 0,458
C-N3
10 0,0085 0,963 120 1 120 0,404 0,376 0,435 0,4050 57,94 0,3811 59 0,036918727 1088,826135 9,26E-04 1080,494
10 0,0085 0,963 80 1 80 0,414 0,413 0,425 0,4173 56,66 0,2540
10 0,0085 0,963 60 1 60 0,421 0,418 0,421 0,4200 56,39 0,1905
10 0,0085 0,963 40 1 40 0,509 0,475 0,478 0,4873 49,39 0,1270
Trolox
10 0,0017 0,969 80 1 80 0,103 0,104 0,104 0,1037 89,30 0,042 8,3 0,097707665 254,847764 4,33E-05 23081,83
10 0,0017 0,969 60 1 60 0,167 0,161 0,169 0,1657 82,90 0,032
10 0,0017 0,969 40 1 40 0,217 0,218 0,226 0,2203 77,26 0,0214
10 0,0017 0,969 20 1 20 0,357 0,357 0,357 0,3570 63,16 0,0107
Tabla 7. Resumen de resultados de la capacidad antioxidante
18
Se evaluó una serie de cromonas con diferentes sustituyentes, se evaluó su
capacidad para capturar el 2,2-difenil-1-picrilhidracil (DPPH), y determinar
su actividad para secuestrar radicales libres. La actividad antiradicalaria para
los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-
trifluorometilcromona, con sustituyentes nitro y azida en posición del anillo
cromona presentaron los valores de EC50 mostrados en la Tabla 8.
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE
1/EC50
Nombre Molécula 1/g cromona
3-nitrometil-2-triflurometilcromona NO2 541.2325
3-azidometil-2-trifluorometilcromona N3 1.080.494
Trolox Trolox 23081.83
Los valores medios de la concentración efectiva y de la desviación estándar
se representan para cada molécula con una concentración conocida
obtenida a partir de experimentos independientes llevados a cabo por
triplicado.
Los valores EC50 se calcularon a partir de cada curva como la concentración
efectiva capaz de reducir 50 % de DPPH. La Figura 6, muestra los
resultados obtenidos para los compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona
y 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, con sustituyentes NO2 y N3 en
contraste con trolox. En el caso de Días (2011) se realizó un procedimiento
similar, con un tiempo de estabilización de 20 minutos, determinando el
porcentaje de DPPH para cada compuesto y cada concentración, los
compuestos reaccionaron de diferente forma y algunos no presentaron
reducción de radicales DPPH, lo que indica que el centro de cromona es
importante pero no es el único responsable de la capacidad secuestrante de
radicales libres (Dias et al., 2011).
Según el estudio realizado por Sharma (2011), se comparó la actividad
antioxidante de un grupo de cromonas con medicamentos estándar
utilizados en el tratamiento de hongos. Los resultados arrojan resultados
más prometedores para el grupo de cromonas, incluso mejor que los
fármacos, este ensayo se lo realizó por el ensayo de DPPH, mostrando
capacidad antioxidante a una concentración de 1mg/ml.
Por otra parte, se calculó el porcentaje de DPPH (Tabla 7) utilizado en la
soluciones para la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona y la 3-nitrometil-2-
Tabla 8. Concentración Efectiva EC50
19
trifluorometilcromona. La actividad antioxidante mostró un perfil dependiente
del tiempo y de cada nivel de concentración de cromona.
El
DPP
H
mue
stra
un
máxi
mo
de
absorción típico a
515 nm, que desaparece tras la reducción a la correspondiente hidrazina
(DPPH2). Este ensayo colorimétrico se utiliza comúnmente para establecer
relaciones estructura-actividad.
En primer lugar se determinó el tiempo de estabilización para la reducción
del DPPH, las Figuras 7 y 8 muestran la cinética de estabilización de los
compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-
trifluorometilcromona. La decoloración de la mezcla de DPPH con la solución
de cromona se realizó en estado estacionario y se comprobó que el tiempo
para que se estabilice el DPPH era de 8 horas para los dos moléculas que
mostraron actividad antioxidante, de las 13 cromonas estudiadas.
Figura 6. Capacidad Antioxidante DPPH
0
500
1000
1500
2000
2500
3-nitrometil-2-triflurometilcromona
3-azidometil-2-trifluorometilcromona
TROLOX
1/E
C 5
0
Móleculas
Capacidad Antioxidante (DPPH)
20
0,4
0,5
0,6
0,7
9:36 12:00 14:24 16:48
Ab
sorb
anci
as
Tiempo
Cinética de estabilización de C-NO2
Figura 7. Cinética de estabilización de 3-nitrometil-2-triflurometilcromona.
Figura 8. Cinética de estabilización de 3-azidometil-2-trifluorometilcromona.
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
9:36 10:48 12:00 13:12 14:24 15:36 16:48
Ab
sorb
anci
as
Tiempo
Cinética de estabilización de C-N3
21
Figura 9. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante del compuesto 3-
nitrometil-2-trifluorometilcromona.
y = 0,0633x + 59,304 R² = 0,942
68
69
70
71
72
73
74
75
160 170 180 190 200 210 220
% D
PP
H
µl cromona
Compuesto C-NO2
3.1.1. CURVAS DOSIS-RESPUESTA PARA LA CAPACIDAD DE CAPTACIÓN DPPH DE 3-NITROMETIL-2-TRIFLUOROMETILCROMONA.
Las curvas dosis-respuesta correspondientes para los compuestos
antiradicales más eficaces se muestran en las Figuras 9 y 10 junto con trolox
(Figura 11) como control. Muestran una relación de proporción directa entre
los microlitros de cromona agregada y el porcentaje de DPPH cosumido.
Figura 10. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante del compuesto 3-azidometil-2-trifluorometilcromona
y = 0,0903x + 48,321 R² = 0,6385
48
50
52
54
56
58
60
30 50 70 90 110
% D
PP
H
µl cromona
COMPUESTO C-N3
22
Figura 11. Curva dosis-respuesta de la capacidad antioxidante de trolox
y = 0,4204x + 57,138 R² = 0,9487
60,00
65,00
70,00
75,00
80,00
85,00
90,00
95,00
20 30 40 50 60 70 80 90
% D
PP
H
µl de cromona
TROLOX
La Figura 10 una curva de calibración para el compuesto 3-azidometil-2-
trifluorometilcromona con un bajo valor del coeficiente de determinación (R2
= 0.639). Por lo tanto, los datos no se ajustarían a la respuesta directamente
proporcional de una ecuación lineal. Sin embargo, el aumento de niveles de
microlitros de cromona (µl) incrementaría el tamaño de la muestra
corregiendo la repuesta lineal (Restrepo & González, 2007).
Los dos compuestos que mostraron actividad antioxidante (Figura 4)
presentaron como caracteristica en común al grupo CF3 en la posición 2 del
anillo cromona y sustituyentes electroatrayentes específicos como el grupo
funcional nitro y azido, que favorecen la actividad antioxidante.
El procedimiento experimental realizado asegura un análisis reproducible y
fiable de los datos, ya que las condiciones se mantienen constantes para
cada evaluación de barrido de radicales y los resultados se interpretan de
acuerdo a parámetros calculados relevantes para la capacidad antioxidante.
3.2. ENTALPIA DE DISOCIACIÓN DE ENLACE
La Tabla 9, presenta los valores de la entalpia de disociación de enlace
(EDE) de todos los compuestos estudiados y de color gris se señala los
nombres de las estructuras y los valores de EDE de los compuestos que
presentaron actividad antioxidante.
23
Compuesto Método uPM6*
(EDE/kJ mol-1
)
3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona 246.5
3-azidometil-2-trifluorometilcromona 280.7
3-ftalimidoilmetil-2-trifluorometilcromona 297.5
3-cianometil-2-trifluorometilcromona 313.1
3-bromometil-2-clorodifluorometilcromona 316.3
3-metil-2-pentafluoroetilcromona 316.7
2-clorodifluorometil-3-metilcromona 317.3
6-cloro-3-metil-2-trifluorometilcromona 317.9
2- diclorometil-3-metilcromona 318.2
3-bromometil-2-trifluoroometilcromona 319.8
3-nitrometil-2-trifluorometilcromona 331.4
2-difluorometil-3-metilcromona 345.4
3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona 570.7
Trolox 131.1
* Método de capa cerrada uPM6.
Los valores de EDE de todas las moléculas estudiadas se obtuvieron
utilizando modelos de capa abierta con el nivel de teoría semi-empírico PM6
(Stewart, 2007). Cuanto menor es la EDE, mayor es la capacidad de donar
un átomo H de un grupo, dando lugar a un radical estable, que deslocaliza el
electrón desapareado alrededor del sistema conjugado que posea la
molécula, favoreciendo el proceso de actividad anti-radicalario (Dias et al.,
2011). El detalle del cálculo de la energía de disociación de enlace C-H,
determinado por el método de capa abierta uPM6 se detalla en el Anexo 1.
Por otra parte, la Tabla 10 muestra los resultados de la EDE y potencial de
ionización (PI) calculados para los compuestos que presentaron actividad
antioxidante.
La aplicabilidad de métodos PM6 implementados en el modelado de la
actividad antioxidante o anti-radicalaria de flavonoides, muestra que la
entalpía de disociación de enlace (EDE) de los grupos -OH podría calcularse
mucho más rápido con el método semiempírico PM6 y con una calidad
similar a los métodos de la Teoría del Funcional de la Densidad (DFT) (Amić
& Lučić, 2010). Por lo tanto, los cálculos de la EDE mostrados en la Tabla 9,
presentan un buen grado de confiabilidad, que permite inferir tendencias
generales y correlaciones entre los resultados de capacidad antioxidante
determinados por el ensayo DPPH y valores teóricos de la EDE.
Sin embargo, con la finalidad de verificar la tendencia determinada con el
método semiempírico uPM6, se desarrolló para los compuestos 5 (C-N3) y
11 (C-NO2) que mostraron actividad antioxidante, un cálculo de la EDE con
Tabla 9. Entalpia de disociación de enlace, calculada (uPM6) C-H, correspondientes a la formación de especies radicalarias para los derivados de cromona bajo estudio.
24
un nivel de teoría más sofisticado uB3LYP/6-311++ g (d,p). La Tabla 10
muestra los resultados de la EDE (kJ/mol) y presentan una tendencia similar
entre los métodos estudiados.
Compuesto
Método uB3LYP/6-311++ g (d,p)
P. I.* (kcal/mol)
(EDE/kJ mol-1
)
3-nitrometil-2-trifluorometilcromona
352,221 175,7
3-azidometil-2-trifluorometilcromona
415,396 165,9
* P.I.: Potencial de ionización determinado con el método uB3LYP/6-311++ g (d,p).
La EDE permite inferir en la capacidad de la potencial molécula antioxidante
de donar un átomo H, para dar lugar a la formación de un radical estable, el
cual dependiendo de sus características estructurales podría deslocalizar la
carga, favoreciendo procesos de actividad secuestrante de radicales libres,
por lo tanto de acuerdo a los resultados obtenidos se puede observar que el
valor de EDE del compuesto 11 con el sustituyente nitro es menor que el
compuesto 5 con el sustituyente azida. Los resultados de EDE son
respectivamente 352,2 y 415,4 kJ/mol respectivamente. Este resultado
sugiere una mayor facilidad de la3-azidometil-2-trifluorometilcromona para
donar un átomo de hidrógeno que la 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.
En cuanto al valor del potencial de ionización (P.I.) se define de manera
general como la energía necesaria para sustraer un electrón de un sistema
en equilibrio. Por tanto, el P.I. presenta relación con la energía del orbital
HOMO, siendo el orbital HOMO el orbital molecular ocupado de más alta
energía. Por lo tanto, una eficiente atracción de carga requiere que el P.I
presente un valor bajo de energía, resultando concordante el valor menor de
175,7 kcal/mol de la 3-azidometil-2-trifluorometilcromona, respecto al valor
de P.I. de 165,9 kcal/mol de 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona.
La Figura 12 a – b, muestran las especies radicalarias más estables
calculadas, de los compuestos que presentaron actividad antioxidante. Se
observa deslocalización electrónica desde el enlace doble C2-C3 del anillo
4-pirano hacia los grupos electroatractores, azida (-C-N3) y nitro (-C-NO2).
Asimismo, la densidad de espín mostrada en las figuras 12 c – d, de los
compuestos 3-nitrometil-2-triflurometilcromona y 3-azidometil-2-
trifluorometilcromona, localiza orbitales sobre los átomos en los cuales se
deslocaliza el electrón desapareado del radical. Se puede inferir que la
coplanaridad observada entre el sustituyente –CH-N3 y el anillo cromona en
Tabla 10. Energía de disociación de enlace, correspondientes a la formación de
especies radicalarias para los derivados de cromona bajo estudio.
25
el radical formado del compuesto 3-azidometil-2-trifluorometilcromona
favorece el eficiente traslape de orbitales p, que contribuyen a una mejor
deslocalización del electrón a lo largo de los enlaces conjugados.
Se sugiere que la planaridad del sustituyente –CH-N3 favorece una mayor
eficiencia para deslocalizar el electrón en la especie radicalaria, estando
correlacionada la relación de estructura con el comportamiento antioxidante.
Como puede notarse el radical del compuesto 3-nitrometil-2-
trifluorometilcromona, no muestra el grupo CH-NO2 en el mismo plano del
núcleo estructural cromona.
Criterios estructurales para la actividad antioxidante de flavonoides que
presentan una cercanía estructural con los compuestos estudiados en la
presente tesis, muestran una alta dependencia con su estructura química,
donde planaridad y conjugación extendida π, a lo largo de los anillos muestra
una marcada influencia en la capacidad antioxidante (Amic et al., 2007).
La distribución de la densidad de espín en las especies de radicales, se
correlacionan con los valores calculados de energía de disociación de enlace
EDE. Los zonas de color azul y verde muestran los orbitales donde se
deslocaliza el electrón del radical, el compuesto con el sustituyente azida
(N3) presenta mayor conjugación alternada π, respecto al grupo nitro (NO2)
Figura 12. Especies radicalarias de 3-azidometil-2-trifluorometilcromona (a) y 3-nitrometil-2-trifluorometilcromona (b).
(a) (b)
(c) (d)
26
para deslocalizar el electrón. Esta observación se condice con la mejor
capacidad antioxidante y un valor de EDE menor para la cromona con el
sustituyente electro-atractor metilazida (-CH2N3) en posición 3 del heterociclo
cromona.
De las 13 cromonas estudiadas, el radical de 3-hidroximetil-2-
trifluorometilcromona, es el que presenta menor valor de EDE mientras que
el radical de 3-tiocianometil-2-trifluorometilcromona es el que presenta mayor
valor de EDE.
Las cromonas se comportan de una manera especial debido a que su radical
más estable no corresponde necesariamente a la conformación favorecida
de la molécula que presenta mayor capacidad antioxidante.
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
27
4. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
4.1. CONCLUSIONES
Se evaluó las propiedades antioxidantes de 13 cromonas haloalquil
sustituidas, de las cuales dos mostraron actividad antioxidante, 3-
azidometil-2-trifluorometilcromona y 3-nitrometil-2-
trifluorometilcromona.
Se realizó cálculos teóricos químico cuánticos, utilizando modelos
semi-empíricos PM6 para determinar la energía de disociación de
enlace (EDE) de las especies radicalarias. Sin embargo del conjunto
de moléculas estudiadas (1 - 13), el estudio teórico de EDE con el
método semiempírico uPM6 no permite inferir que a menor valor de
EDE existiría una mayor capacidad antioxidante.
Las cromonas que presentaron actividad antioxidante, presentan
sustituyentes nitrometil (-CH2NO2) y azidometil (-CH2N3) en posición
3 y el grupo trifluorometilo (-CF3) en posición 2. Estos rasgos
estructurales relevantes evidencian la influencia de los sustituyentes
electroatractores mencionados, en el comportamiento químico y
actividad antioxidante observada. Se mostró los sitios de
deslocalización a lo largo del anillo cromona y sustituyentes utilizando
los mapas de distribución de densidad de espín.
Los resultados del presente trabajo permiten inferir una relación
estructura-actividad diferente a los observados en diversos derivados
de flavonoides. La capacidad antioxidante observada en este grupo
de compuestos muestra una marcada influencia de los sustituyentes
electroatractores nitro y azida en posición 3 del anillo cromona y se
infiere que la coplanaridad y conjugación π, del sustituyente en el
radical favorece en gran medida la deslocalización del electrón a lo
largo del sistema conjugado.
Los valores de EDE analizados para todas las estructuras estudiadas
nos indican que el radical de 3-hidroximetil-2-trifluorometilcromona es
la estructura que menor energía necesita para donar un átomo de
hidrogeno por los tanto es el radical más estable del grupo estudiado.
28
4.2. RECOMENDACIONES
Para continuar con el estudio de actividades biológicas de los
compuestos analizados, se recomienda realizar un posterior ensayo
de toxicidad de los compuestos que presentaron capacidad
antioxidante, con el objetivo de poder utilizar este tipo de cromonas en
la industria de alimentos.
Según la bibliografía analizada el nivel de teoría PM6 modela de
manera fiable los resultados de EDE y permite correlacionarlos con la
capacidad antioxidante. Sin embargo, se sugiere realizar un estudio
con niveles de teoría más sofisticados en los 13 compuestos para
minimizar los errores intrínsecos del nivel de cálculo semiempírico
PM6. Esto permitiría predecir otras propiedades electrónicas con
mayor fiabilidad para continuar un estudio de relación estructura-
actividad, utilizando descriptores mecánico cuánticos.
5. BIBLIOGRAFÍA
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5. BIBLIOGRAFÍA
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6. ANEXOS
32
ANEXO 1
Cálculo de uPM6
𝐸𝐷𝐸𝑁3 − . 577948 + . 83 298 − − . 8 6722 = 0,1069072
EDE N3 = 0,1069072 Hartree EDE N3 = 280,7 kJ/mol
𝑬𝑫𝑬𝑵𝑶𝟐 𝑯𝒇 𝑴 +𝑯𝒇 𝑯 −𝑯𝒇 𝑴−𝑯
𝐸𝐷𝐸𝑁𝑂2 − .266857 + . 83 298 − − .3 427 = 0,1262154
EDE NO2 = 0,1262154 EDE NO2 = 331,3785 kJ/mol
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ANEXO 2
Imágenes del trabajo experimental realizado en el
laboratorio
Medición de absorbancias de las
nuevas cromonas
Segundo grupo de soluciones de
cromonas
Preparación de material Primer grupo de soluciones de cromonas