Utilitat de la meta genòmica per NGS per la caracterització d’un brot de enterovirusDr C Launes
Grup de recerca en malalties infeccioses pediàtriques. CIBER Epidemiologia i Salut Pública (CIBERESP). CB15/00067Institut de recerca pediátrica Sant Joan de Déu, Barcelona.
• Generalitats dels EVs.
• El brot de 2016. Interrogants i respostes amb la
microbiologia convencional.
• La metagenòmica ens dona més respostes?
Pico-RNA-viridae
• Aphthovirus• Aquamavirus• Avihepatovirus• Avisivirus• Cardiovirus• Cosavirus• Dicipivirus
• Enterovirus• Erbovirus• Gallivirus
• Hepatovirus• Hunnivirus• Kobuvirus• Kunsagivirus• Megrivirus• Mischivirus• Mosavirus• Oscivirus
• Parechovirus• Pasivirus
• Passerivirus• Rosavirus• Sakobuvirus• Salivirus• Sapelovirus• Senecavirus• Sicinivirus• Teschovirus• Tremovirus
Familia
ENTERO-viridiae
• Coxsackie A
• Coxsackie B
• Polioviruses
• Echoviruses
Genus
Clasificación más reciente
• Enterovirus A• Enterovirus B• Enterovirus C• Enterovirus D• Enterovirus E• Enterovirus F• Enterovirus G• Enterovirus H• Enterovirus J
• Rhinovirus A• Rhinovirus B• Rhinovirus C
Genus
Àcid-sensibleTermosensible
Millor replicació en tracte respiratori
Transmisión
• Fecal-oral. Aguas contaminadas.• Incubación: 3-10 d.• Excreción sostenida en orofaringe (15 d) y, especialmente
heces (de 6 semanas hasta 3 meses) • J Microbiol Immunol Infect 2001; 34: 167–70.
• Resistente a alcohol, clorhexidina. • Agua y jabón. Fricción más efectiva que emulsificación
Med Microbiol Immunol. 1985;174(5):221-36.
• Sensible a derivados del Cloro.
EV-A EV-B EV-C EV-D
Cutánea Diversos Asociados a EBMP (CV-A6)Rash
Exantema Conjuntivitishemorrágica
Conjuntivitishemorràgica
Respiratoria víasaltas
HerpanginaC catarral
Faringoamigdalitis(exudados) CV-B
C catarral
Respiratoria víasbajas
- - - BronquiolitisBroncoespasmo
Neurológica MeningitisConvulsiones febrilesEncefalitis
Meningitis MeningitisPFA
-PFA
Cardíaca - Sepsis-likeMiocarditisSèpsia neonatal
-
Tiposdestacables
CV-A6CV-A16EV-71
E6 E-B5CV-A9CV-B4
CV-A24Poliovirus 1-3
EV-68EV-94
Clínica (50% asint; 95% benigna; < 6 a)
Brotes Elevada tasa de mutación
Errores en la polimerasa (J Virol. 1988; 62: 558–562). Recombinación (PLoS One. 2014; 9: e96051; Nucleic Acids Res. 2016;44:6883-95)
Aparición nuevos genotipos: Nuevos genotipos (A71 año 1969 en USA; C-117 en 2012,…) Nuevos subgenotipos (A71: C1, C2, C4…; D68…) Pequeños cambios o recombinaciones dentro de subgenotipos.
Comportamientos clínicos distintos Mayor tropismo SNC en determinadas mutaciones (J Virol. 2007;81:9386–9395)
Pérdida de tropismo cutáneo en A71 (N Engl J Med 1999;341:929–35).
Según nuevas mutaciones, escapan a sistema immune (Emerg Infect Dis. 2016; 22: 1562–1569) . Diversidad circulación tipos/subtipos según zona geográfica. Reto diagnóstico ante primeros casos de manifestaciones atípicas o
casos esporádicos!
• 1969. California (origen del virus Holanda en 1963)
• 1975. Bulgaria 705 casos (149 PFA, 44 muertes)
• 1978. Hungria.
• 1997-8. Malasia, Taiwan, Japón
• 1998, 2000-1. China.
• 1999-2000. Austràlia. Singapur.
• 2005. Vietnam.
• 2007-2012 China. 7 millones de HFMD. 500-900 èxitus.
• 2010-2011. Singapur. Vietnam.
• 2011. Notificación de casos en Marsella.
• 2012-13. Rusia.
• 2013. Australia.
Brotes
• 1962. California
• 2010. Holanda/Alemania.
Respiratorios graves.
• 2012-14. USA. Respiratorios graves.
D68. PFA (?).
EV71 D68
Rodà D, et al . Clinical characteristics and molecular epidemiologyof Enterovirus infection in infants < 3 months in a referral paediatric hospital of Barcelona. Eur J Pediatr. 2015;174:1549-53.
• Mayoritarios: E5 y E11. Primavera / verano. Buena evolución.
Laura Valero-Martín, et al. La estacionalidad en la circulación de tipos de EV condicionó una diferente expresión clínica en lactantes menores de 3 meses. doi:10.13140/RG.2.1.1089.2403
• > 60% infecciones por E5 y E9 van con meningitis.
• 2012 circula E-5 mayoritariamente Brote meningitis aséptica.
• 5 casos EV71 (2010, 2011, 3 2012). C clínico benigno, buena evolución.
Cabrerizo M, et al. Molecular epidemiology of enterovirus 71, coxsackievirus A16 and A6 associated with hand, foot and mouth disease in Spain. Clin Microbiol Infect. 2014;20:O150-6• EV-A71, muy minoritario < 2%. Todos del mismo subgenogrupo (C2).
Epidemiología molecular en nuestro entorno
D68: You don't see what you don't look for
Launes C, et al. Molecular epidemiology of severe respiratory disease by human rhinoviruses andenteroviruses at a tertiary paediatric hospital in Barcelona, Spain. Clin Microbiol Infect.2015;21:799.e5-7
2010-2012. 38 Severe LRTI with rhinovirus detection.
3 enterovirus D68 in 2010. (Simultaneous outbreak in the
Netherlands and Germany). J Clin Virol. 2011;52:103-6. Viruses. 2015;7:6043-50).
HRV and EV-D68, shared clinical manifestations (respiratory).
Asthmatic children.
¿ Qué pasó en 2016?
- Febrero, 1 PFA asociada a EV en HVH. Posteriormente, EV-D68- Marzo-Abril (informe AEPED-SEIP):
- Camp de Tarragona. Encefalitis “característica”. Detección EV en aspirado o en heces. NO EN MUESTRA LCR.
- 1 éxitus Reus con encefalitis de tronco por necropsia y edema pulmonar.
- 1a semana mayo: 1er caso encefalitis tronco en nuestro centro. Finales de semana, notificación “CLUSTER DE CASOS DE MALALTIA NEUROLÒGICA AGUDA” HVH (11 casos) CatSalut. Orientacions.
- 19 mayo. Anuncio Público del brote por el Conseller de Salut
24-48hMioclonías del sueño
ExageradasSOMNOLENCIA MARCADA
48-36hTemblor
generalizadoreposo
24-72hRombencefalitisAtaxia cordones posteriores y/o
Cerebelosa
Cuadro vírico(2-5 días)
(Fiebre, vómitos +/-exantema b-m-p)
Alta 3-11 días Asintomáticos
Leve Ataxia
ENFERMO TIPO
• Entorno a 2 años de vida.
• Por depression nivel de consciencia hasta 10-15% ingresaron en UCIP.
• 4 % con afectación disautonómica grave.
• 5 % con afectación motora (parálisis).
• Filiar correctamente etiología• Detectar EV en muestra no invasiva no es sinónimo de causalidad• EV: 0-5% dels casos detectados en literatura en LCR.
• Conocimiento de la enfermedad. • Problema: ausencia de manifestaciones dermatológicas en hasta el
80%.
• Organización respuesta assistencial. • Más de 100 afectados en 12 semanas.
RETOS
AGENTE ETIOLÓGICO
• Estudio EV muestras LCR, SANG, ANF/frotis, heces
• Niños con LCR negativo para PAN-EV. Estudio Filmarray ® Meningitis-encefalitis.
Launes C, Casas-Alba D, Fortuny C, Valero-Rello A, Cabrerizo M, Muñoz-Almagro C. Utility of FilmArray Meningitis/Encephalitis Panel during Outbreak of Brainstem Encephalitis Caused by Enterovirus in Catalonia in 2016. J Clin Microbiol. 2016;55:336-338.
Virological findings: • EV detection: stools 32/40 patients, nasopharyngeal aspirate 31/43 patients,
CSF 0/40 patients, plasma 0/31 patients.
44 patients with BE or EM and EV
detection
40 EV-A71(no other types)
38 subgenotyped35 C1
(recombinant strainGermany 2015)
ResultsClin Microbiol Infect. 2017. pii: S1198-743X(17)30185-4.
0-24 h 1 mes 3 meses
Seqüenciació massiva mNGS
Què ens ofereix la seqüenciació?
1ª generació
2ª generació
3a generació
Dirigit PrecisióSeqüències llargues
No dirigitPrecís Seqüències curtesRàpida seqüenciació
No dirigitSeqüències llarguesRàpid
Dirigit…Lent
Gran treballbioinformàtic al darrere…
ErrorsTreball bioinformàtic
Punt fort Punt feble
Fins fa 1-2 anys: - Validació tècnica/concordància resultats.- Ús en casos excepcionals i en mostres amb poca “contaminació”.
Ens plantegem
Utilitat en el maneig d’un brot d’etiologia incerta
• Detectem noves co-infeccions inadvertides?
• Concordància amb diagnòstic p complementàries d’ús clinic
habitual?
• Concordància amb tècniques de tipatge mitjançant amplificació-
seqüenciació VP1?
• Rendiment diagnòstic en LCR? Sensibilitat / limit inf c viral.
• Estudi del virus complert
10 casos: encefalitis de tronc i encefalomielitis (definicions OMS).10 controls: meningitis asèptica.
• Tests convencionals.• NGS.• Totes les mostres disponibles: LCR/plasma/ANF/femtes.
Disseny
Resultats
- En totes les mostres on es detecta EV per PAN-EV RT-PCR, també es detecta per NGS.
- En 10 de 35 mostres negatives per PAN-EV PCR, es detecta patogen per NGS. Permet la detecció en 4 mostres ANF, 1 de femtes i 5 LCR!.
- LCR: Teníem patogen en 5 pacients amb tècniques microbiològiques convencionals (tots EV). NGS suma 5 casos més:
- 4 casos en LCR de EV-A71 (3/4 en meningitis asèptica)
- 1 cas en LCR de HHV-7 (?)
No falsos negatius
Incrementa detecció en tottipus de mostra:
Discrepància concordantamb clínica = Veritables
positius.
HHV-7: Virus amb latència a SNC? El cas no té capcaracterística especial…
Tipatge:
- Tipatge concordant amb tècniques de seq VP1.
- Permet tipar 10 casos més (no detectats per PCR convencional).
- Afegeix 5 co-deteccions de diferents genotips de EV. De A-71 en
ANF en 1 cas de meningitis per Echo-30 i viceversa.
Per què uns van fer afectació més lleu i altres més greu?
• No coinfecció... • Anàlisi d’SNVs:
55 inter-host SNVs únicament detectats als EV-A71s associats als encefalitis de tronc:- Només 2 dels SNVs eren compartits entre aquests EV-A71s neuroinvasors.- … però eren mutacions sinònimes.
• Concordància, però increment de sensibilitat, especialment
relevant en LCR (liquid normalment estèril).
• Demostra neuroinvasivitat (detecció en LCR) de EV-A71.
• Les dades generades per mNGS permeten una millor filiació
de l’origen dels brots –filogenètic i geogràfic - (especialment,
per soques recombinants).
Conclusions
Ombres
• Validació insuficient. Metodologia diversa.
• Dificultat per distingir colonitzador/contaminant de patògen.
• Software bioinformàtic no dirigit a interpretació clínica, dubtessobre la qualitat i exhasutivitat de les BBDD.
• Sensibilitat baixa en abundància de material genètic humà (inh).
• Diferents sensibilitats en CV baixes descrites.
NGS: Futur? Present?
Llums
• Casos “repte” (avantatge d’un test no dirigit).
• Estudis de validació clínica, per a la filiació etiològica
sindròmica. P ex. Infeccions LCR: DETECCIONS DE
PATÒGENS EN EL 80-90% (actualment 40%, especialment
encefalitis). Genome Res. 2019; 29: 831–842.
• Filiació de brots d’encefalitis/meningitis. Saha et al. 2019
Take-home message:
Nova tècnica amb grans avantatges i “limitacions”, nou
aprenentatge.
NGS segurament haurà de conviure amb tècniques convencionals
(inclosa la serologia,…)
Interpretació de resultats en “sessions” p laboratori -clínics.
Top Related