Post on 23-Jan-2016
1
Estudio teórico del mecanismo de transferencia de hidruro entreFerredoxina-NADP reductasa (FNR) de Anabaena y NADP+
ISAIAS LANS VARGAS
2
Citosol
Lumen tilacoidal
La Cianobacteria Anabaena PCC 7119
FNR2Fldox + NADPH2Fldrd + NADP+ + H+
3
Mecanismo de reacción de la FNR
4
isoaloxazina
FMN
FAD
Riboflavina
Derivados del anillo de isoaloxazina
5
Estados de oxidación de la flavina
6
Mecanismo de transferencia de hidruro
N
N
N-
NH
O
O
C
CHO
C
C
CH2
HO
HO
H
H
H
O
P
O
P
O
O
-O
-O O CH2O
HO OH
N
N
N
N
NH2
N+
NH2
O
O
OHHOPO2
-
O
PO2-
CH2O
HO OPO2H-
N
N
N N
NH2
1 2
34aC
O
4
10a
5
10
5a
9a
6
98
7
1' HH
H H 12
34
5
6
7
5'
H
HN5
FADH- NADP+
Se propone la transferencia neta de hidruro desde el átomo N5 del anillo de Flavina, hacia el átomo C4 del anillo de Nicotinamida
7
La Tyr303 impide una interacción directa entre el anillo de Flavina y el anillo de nicotinamida, de tal forma que debe producirse el desplazamiento de la Tyr303 para que la transferencia de hidruro pueda ocurrir
A B
FAD
Y303
NADP+
NADP+
FAD
FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)
Mecanismo de transferencia de hidruro
8
Obtener un conocimiento más amplio del mecanismo de transferencia de hidruro al NADP+ catalizado por la FNR(Tyr303Ser). Lo cual podría darnos una indicación del papel de la Tyr303 en la FNR nativa
Objetivos
Por medio de un estudio Teórico-experimental
Estudio Experimental
Determinar las constantes cinéticas del proceso de transferencia de
hidruro y efecto Isotópico
Estudio Teórico
Obtener detalles estructurales del proceso de transferencia de hidruro en
FNR(Tyr303Ser)
Determinar las Constantes de reacción y efecto
isotópico del proceso de transferencia de hidruro en
FNR(Tyr303Ser)
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Resultados Experimentales
FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH
kB C
[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]
Tiempo muerto
CTC-2 CTC-1
WT FNR
kHT
kHT-1
Tiempo muerto
FNRrd + NADP+ FNRox + NADPH
kB C
[FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH]CTC-2 CTC-1
Tyr303Ser FNR
kHT
Tiempo muerto
Tiempo muerto
El equilibrio es desplazado hacia la producción de NADPH
El remplazo de Tyr303 por Ser elimina la capacidad de reducción de NADP+
10
La Disposición estructural entre la Flavina y la nicotinamida en el mutante, parece ser adecuada para que se de la
transferencia de hidruro en ambas direcciones
Anabaena Tyr303Ser FNR:NADP+ complex 2BSA
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Dinámica molecular
Términos de Campos de Fuerza más comunes:
12
QMH-
Métodos mecánico cuánticos (QM)-Pueden tratar reacciones químicas-No pueden tratar sistemas muy grandes
Métodos de mecánica molecular (MM)-No pueden tratar reacciones químicas-Pueden tratar sistemas muy grandes
QM/MM
Parte del sistema más involucrada en la
reacción
Resto del sistemaParte más alejada del
sitio de reacción
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Programas Usados
CHARMM GAUSSIANCHARMMRATE
14
A B
FAD
Y303
NADP+
NADP+
FAD
FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)
Estructura cristalográfica de FNR
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Dinámica Molecular QM/MM del complejo Y303S FNR:NADP
QM H-
N
N
N-
NH
O
O
C
CHO
C
C
CH2
HO
HO
H
H
H
O
P
O
P
O
O
-O
-O O CH2O
HO OH
N
N
N
N
NH2
N+
NH2
O
O
OHHOPO2
-
O
PO2-
CH2O
HO OPO2H-
N
N
N N
NH2
1 2
34aC
O
4
10a
5
10
5a
9a
6
98
7
1' HH
H H 12
34
5
6
7
5'
H
HN5
FADH- NADP+
Centro de reacción en la FNRModelo del Sistema Biológico Cordenadas Cartesianas de PDB 2BSA.
Estado de protonación: PROPKA. Adición de átomos de H:HBUILD/CHARMM.Neutralización con 7 Na+
Solvataciión TPI3Ptotal número de átomos: 41896(4800 protein atoms)
Equilibrado Campo de fuerza C15HARMM22 Dinámica Molecular NPT (270 K, 1 atm) Condicioniones de límite periódico Particle Mesh Ewald method.
58 átomos QM; 2 Átomos frontera (GHO); 41838 Átomos MM
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RD RA
Coordenada de reacción (z) = RD- RA
Definición de la coordenada de reacción
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Potencial de Fuerza Media (PMF)
Muestreo sesgado: umbrella samplingObligo al sistema a muestrear zonas de alta energía
V´(x) = V(x ) + W(x) Wi(x) = 1/2k(x - xo)2
Para la eliminación de sesgado se hace uso del método WHAM
Wi
x
Nº
Con
form
acio
nes
))(ln()( xPTkxW B
18
sims
sims
N
jBjbiasjj
N
iii
TkxwFn
xPxnxP
1,
1
'
/]exp([
)()(
Weighted Histogra Analysis Method (WHAM)
dx)(exexp /)(/xPp TkxwTkF
Bibi
))(ln()( xPTkxW B
19
-2 -1 0 1-5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
PM
F(k
cal/m
ol)
z(Å)
Proceso endoérgico, con barrera de energía potencial de ~35 kcal/mol
Potencial de fuerza media (AM1)
20
Evaluación del método QM usado
PES de Y303SFNR:NADPAM1 describe mal la contribución de la energía de dispersión al apilamiento y favorece la formación de puentes de hidrógeno
Usando MPWB1K/6-31+G(d,p)level la lumiflavina y 1-metilnicotinamida presentan interacción de apilamiento.
MPWB1K/6-31+G(d,p) Describe mejor las interacciones de apilamiento que B3LYP (6 kcal/mol de diferencia en energía de formación del complejo)
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Corrección a doble nivel del PMF
RPAM
AMcQM
RPAM
KMPWBcQM
CMAMCMDL zVzVzWzW 11
111
AM1 MPWB1K/631g(d,p) Corrección a doble nivel
FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH
FNRrd + NADP+ [FNRrd-NADP+] [FNRox-NADPH] FNRox + NADPH
NT FNR
Y303S FNR
34.9 kcal/mol 35.8 kcal/mol
3.6 kcal/mol
14.9 kcal/mol
AM1
•La corrección de energía con MPWB1K cambia la endoergícidad de la reacción
•La localización del Estado de transición de mueve levemente hacia los productos.
22
Interacción del Centro de reacción con la proteína
23
Atom1 Atom2 X-ray R TS P
N-Arg100 O2-FAD/H- 3.0 2.99 ±0.01 3.14 ±0.02 3.19 ±0.02
OH-Tyr79 O4’-FAD/H- 2.9 2.89 ±0.01 2.84 ±0.02 2.85 ±0.01
Oγ-Ser80 N5-FAD/H- 3.3 3.55 ±0.00 3.60 ±0.03 3.80 ±0.04
N-Ser80 O4-FAD/H- 3.3 3.66 ±0.01 3.43 ±0.01 3.70 ±0.01
O-Cys98 N3-FAD/H- 2.9 3.05 ±0.00 3.03 ±0.01 3.02 ±0.02
O-Glu301 N7N-NADP+/H 4.3 3.78 ±0.03 3.70 ±0.06 3.42 ±0.03
Sγ-Cys261 N7N-NADP+/H 5.0 3.71 ±0.01 3.52 ±0.04 3.66 ±0.01
Sγ-Cys261 C4N-NADP+/H 3.3 3.71 ±0.01 3.95 ±0.02 4.28 ±0.02
Oγ-Ser303 O7N-NADP+/H 3.0 4.13 ±0.01 4.23 ±0.03 4.14 ±0.04
O-Tyr79 N-Ile60 3.1 2.92 ±0.01 2.97 ±0.01 2.91 ±0.01
N-Tyr79 O-Ile60 3.0 2.88 ±0.00 2.89 ±0.02 2.89 ±0.02
Interacción del Centro de reacción con la proteína
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Variación del ángulo entre los anillos de flavina y nicotinamida en la reacción
•El ángulo N5 – hidruro – C4N se aproxima a 180 y el átomo aceptor y donador se aproximan entre si.
• Deformación del par iónico FNRrd-NADP+, y perdida parcial de la interacción π stacking
•La penalización energética incrementa el costo energético del estado de transición
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CMFTRR
CMCMCMact GzWzWzG ,,
zWzWzW vibCMQC
RvibCM
FTRRCMQCQC
act WGzWzWzG ,,,
Corrección vibracional
26
Corrección Vibracional
-4 -2 0 2
-4
-2
0
2
B
A
B Gauss Fit of B
-4 -2 0 2-3
-2
-1
0
1
C
A
C Gauss Fit of C
Corrección vibracional H Corrección vibracional D
Ajuste a una curva gaussiana
z
E(k
cal/m
ol)
z
27
-2 -1 0 1-5
0
5
10
15
20
25
30
35
PM
F(k
cal/
mo
l)
z(Å)
PMF H/D
28
R SP PZ1
Z2
Aproximación a Zona secundaria-estatica(Frozen Bath)
Coeficiente de transmisión neto promedio γ
Por cada configuración de estado de transición vibracional Por cada configuración de estado de transición vibracional i i a a zz**
QCQC::
1) AM1/CHARMM22 SP localización 2) AM1/CHARMM22 MEP3) Corrección a doble nivel del MEP (interpolación usando ISPE).4) Factor de transmisión QuasiclasicoΓi5) Coeficiente de transmisión Semiclasicoκi
29
8 estructuras optimizadas
-2 -1 0 1-5
0
5
10
15
20
25
30
35
PM
F(k
cal/
mo
l)
z(Å)
R
P
TS
Cálculo Coeficiente de Transmisión: γ
T T T
i(T) = exp{-Gi}
PMF
Vi (s)Para cada configuración i.
Coordenada de reacción z
Gi
tunel
I(T)
30
Coeficiente de Transmisión
Coeficiente de Transmisión:
/
/
E kT
E kT
P E e dET
e dE
0
≠TE
2
1
1 EP E
e
P(E) : permeabilidad (o probabilidad de transmisión):
)exp( */
RT
zG
h
TkTk
QCQCactBMTVTSTEA
T T T
31
RT
zG
h
TkTk
QCQCactBMTVTSTEA */ exp(
)( *CMCM
actzG )( *zG QCQC
act i i k MTVTSTEA / G MTVTSTEA /
act
HT-1 35.04 31.87 0.998±0.003 335.70±142.79 334.82±142.44 2.24X10-10 28.64
HT 20.08 17.02 0.998±0.003 335.70±142.79 334.82±142.44 92.76 13.80
DT-1 35.00 32.67 0.999±0.00 56.37±22.90 56.29±22.84 8.87X10-12 30.43
DT 20.08 17.85 0.999±0.00 56.37±22.90 56.29±22.84 3.52 15.61
Cálculo de la constante de reacción
32
3.44 3.46 3.48 3.50 3.52 3.54 3.56 3.58 3.602.0
2.5
3.0
Ln
(KIE
)
103/T
3.44 3.46 3.48 3.50 3.52 3.54 3.56 3.58 3.602
3
4
5
6
Ln
(ko
bs)
A
B
Cálculo de la constante de reacción
RT
zG
h
TkTk
QCQCactBMTVTSTEA */ exp(
33
Comparación Teórico Experimental
Parametro Teórico Experimental
kHT (279k) 92.8 s-1 190 s-1
kDT (279 K) 3.5 s-1 16.3 s-1
KIE 26.3 11.6
AH/AD12.5
34
• La transferencia de hidruro en la dirección fisiológica desde Tyr303Ser FNRrd hacia NADP+ no es posible. La reacción inversa, la transferencia de hidruro de NADPH hacia Tyr303Ser FNRox, ocurre.
• Las constantes de reacción teórica y experimental están en concordancia.
• En la zona de reactivos la distancia N5-C4N es compatible con la transferencia de hidruro, pero el ángulo N5-hidruro-C4N no es coolineal, y por lo tanto, la transferencia de hidruro es ineficiente. Al ir de la zona de reactivo hacia estado de transición el ángulo N5-hidruro-C4N se aproxima a 180º haciendo la transferencia de hidruro viable, y la distancia entre átomo donador y aceptor mas pequeña.
• Dado que la anchura del camino de reacción para la transferencia de hidruro es pequeña, la transferencia de hidruro involucra un importante cantidad de quantum mechanical tunneling.
• El KIE H/Des independiente de la temperatura.
• Las deformaciones geométricas que incluyen perdida parcial de interacción π stacking, involucra una gran penalización de energía libre para poder alcanzar el estado de transición. La barrera de energía de la reacción de transferencia hidruro desde Tyr303Ser FNRrd hacia NADP+ es 15 kcal/mol más baja que la barrera de energía para la reacción inversa, esta diferencia energética podría ser debido a una importante estabilización de la interacción del par iónico FADH-:NADP+ en los reactivo, mientras que en los productos, después de la transferencia de hidruro los dos especies (FAD y NADP) son neutras.
Conclusions
35
WT FNR
Posible role de Tyr303 en WT FNR?
Cualquier factor capaz de romper la interacción entre el par iónico FADH-:NADP+ podría desestabilizar los reactivos, incrementando la constante de reacción. La afinidad por el NADP+ en WT FNR (Kd = 5.7 μM), es mucho mas baja que en el mutante Tyr303Ser FNR (Kd < 0.01 μM) ¿Podría ser atribuida la baja afinidad por NADP+ en WT FNR podría ser atribuida a la presencia de la Tyr303 la cual eliminaría de alguna forma la interacción del par iónico FADH-:NADP+, el cual es muy estable en el mutante Tyr303Ser FNR
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A B
FAD
Y303
NADP+
NADP+
FAD
E3E2E1
Hipótesis del mecanismo de reconocimiento del NADP+ en la FNR
FNR(1GJR) Y303S FNR(2BSA)
Simulación NT FNR:NADP
37
Modelo de partida para la simulación del complejo NT FNR:NADP+.
38
Equilibrado del Modelo
Dinámica Molecular con la restricción del movimiento de la Arg 264
Dinámica Molecular con restricción del movimiento de FADH- y NAD+
Simulación del complejo FNR:NADP+
39
R264
Fluctuación de residuos de FNR durante la dinámica molecular
40
PES partiendo del modelo de WT
Plantilla Y303SER
24kcal/mol
Z(Å)
V(k
cal/m
ol)
N1-C4N
N10 N1N
41
-2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
35
B
A
W(k
cal/m
ol)
Z(Å)
Corrección a doble nivel del PMF WT
-2 -1 0 1 2-50
-40
-30
-20
-10
0
10
Z(Å)
V(k
cal/m
ol)
pKa Glu301: 5.11 pKa Glu301: 8.04
42
PES con Glu301 protonado
-3 -2 -1 0 1 2 3-40
-30
-20
-10
0
10
20
30
40
50
-3 -2 -1 0 1 2 3
V(k
ca
l/m
ol)
Z(Å)
75kcal/mol
43
PES partiendo de reubicación de TYR
-3 -2 -1 0 1 2 3-10
-5
0
5
10
15
20
25
30
V(k
cal/
mo
l)
Z(Å)
35kcal/mol
44
Modelos de FNR WT obtenidos con el servidor Geno3D
Plantilla: estructura de FNR PDB (1qga)
45
-3 -2 -1 0 1 2
0
10
20
30
40
50
V(k
cal/
mo
l)
Z(Å)
PES partiendo de un modelo obtenido usando el servidor Geno3D
Plantilla: estructura de FNR de guisante
25kcal/mol
46
N
N
N
NH
R
O
O
N
N
N
NH
R
O
O
N
N
N
NH
R
O
O
-
+*
-
H H
e- + H+ e-
2
3
1
44a
10a
5
109a5a6
987
QN NEUTRA SQ NEUTRA HQ ANIÓNICA
Puntos a tener en cuenta para la simulación de la FNR WT
Glu301Ser80
47
Gracias por su atención