Replicación del DNA

Replicacion del DNA

Es un proceso complejo, mediante el cual a partir de una molecula de DNA progenitora o parental se sintetiza una nueva, originandose dos moleculas de DNA hijas, de secuencia identica a la del DNA original

Relación :

Estado Replicación Progresión del ciclo

• Inicia Replicación DNA Célula inicia división celular

• Cuando inicia debe No hay división celular hasta

terminar que se complete la replicación

• El final de la replicación Posible señal División

La replicacion de los cromosomas eucarioticosocurre una vez por ciclo celular

Caracteristicas principales del proceso:

Caracter semiconservador

Realizacion simultanea (en ambas hebras)

De forma secuencial

Con caracter bidireccional

Origen monofocal (procariotas) o multifocal (eucariotas)

La replicacion se produce de forma coordinada con la la division celular, en fase “S”, previas a la mitosis y Meiosis I.

Es el mecanismo por el cual se copia la información codificada en una molécula de ADN

ATATTAGCTACGATCG

AATGTCAC

TTACAGTG

ATATTAGCTACGATCG

ATATTAGCTACGATCG

Mol original Separación Mol. Nuevas (vieja-nueva)

Replicación del DNA

Mecanismos de Replicación:

Replicación del DNA

Experimento de Meselson y Stahl

Replicación del DNA

Experimento de Meselson y Stahl

CARACTERÍSTICAS REPLICACIÓN:

b) Síntesis simultánea

en ambas hebrasSíntesis no comienza al azar:

• “Orígenes de replicación”

• c/u apertura local de la doble hélice

• Comienza síntesis simultánea de 2 nuevas hebras

• Simultáneo ≠ contínuo

c) Secuencial 2 hebras nuevas se van alargando progresivamente

Adición secuencial de Nucleótidos

d) Bidireccional Separación 2 hebras progenitoras (comienza en cada origen)

Progresa en ambas direcciones

P P P P PP P

PP

P

OH

PP

P

PP

P

PP

OH

PP + H2OP P P P

PP

P P

OH

PP

P

PP

PPP

P

OH

P

PP

5’ 3’

1. Desenrollar la doble hélice y Liberar la tensión de torsión

2. Separar las dos hebras

3. Mantener la hebras desenrolladas

4. Sintetizar las nuevas cadenas

1. Topoisomerasas

2. Helicasas

3. RPA-ReplicationProtein A

4. Primasas y Polimerasas

Tipo I – nick o muesca en una cadena

Tipo II – ruptura de doble banda

La misma enzima une los extremos rotos de ADN (ligación)

Macrofotografía electrónica del ADN viral de SV40

De acuerdo al análisis de secuencias las DNA polimerasas se clasifican en 7 Familias (Hogg et al 2005) : ◦ A, B, C, D, X, Y, RT ◦ Tres subdominios: Fingers: interactúa con la hebra molde

Palm: Sitio de catálisis y de unión con metales

Thumb: contacto con dsADN

Tipos de DNA polimersas

Se añade un nucleótido a la vez en la parte 3’-0H de la cadena

El sentido de la nueva cadena es 5’-3’◦ Alta fidelidad: ~ 10-8/ 10-10 .

◦ Tipo de polimerasa y secuencia

Tipos de Cebadores

RNA◦ retrovirus

ADN ◦ parvovirus

Proteína-nucleótidos◦ Adenovirus

Primasa: Sintetiza fragmentos cortos de 40-400 nt de RNA

La DNA polimerasa también tiene corrección de prueba

La DNA polimerasas se encuentran en todos los

organismos

Characteristic Polymerase I Polymerase II Polymerase III

gene polA polB polC

MW 103,000 90,000 130,000

Number/cell 400 100 10

5’-3’ elogation yes yes yes

3‘-5’ exonuclease yes yes yes*

5‘-3’ exonuclease yes no no

biological functionDNA repair, RNA primer excision

SOS DNA repair (?)

replicative chain growth

*3' exonuclease function carried out by the DnaQ protein, a subunit of the core enzyme

E. Coli tiene tres DNA polimerasas

Polymerase LocationSize of Catalytic Subunit

Enzimatic Activity3’-5’ exonuclease

Biological Function

Alpha (I) nucleus160-185 kD

NOlagging strand replication

beta nucleus 40 kD No DNA repair

gamma mitochondrion 125 kD Yesmitochondrial DNA replication

Delta (III) nucleus 125 kD Yesleading strand replication

epsilon (II) nucleus210-230 or 125-140 kD

Yesreplication (?)

Eucariotes tiene cinco DNA polimerasas

Todas tienen actividad 5’-3’ de elongación

Otras Enzimas

• Helicasas

Separan lashebras de ADN– Proteina SSB

DNA Helicasa: Proteínas hexaméricas en forma de anillo, que catalizan la separación de las dos cadenas de DNA.Se mueve a lo largo del DNA en una dirección

fija (POLARIDAD). Requiere la energía suministrada por la hidrólisis del ATP.

Proteínas SSBs

- Estabilizan las cadenas separadas.

- Interacciones electrostáticas con la columna de fosfato.

- Interacciones de apilamiento con las bases del DNA.

- Presentan unión cooperativa.

• Ligasas

Unen dos fragmentos de ADN

Ligasas

Enzimas de replicacionProteina SSB = single strand binding protein

DNA girasa

Primasa

El replisoma: una maquinaria de replicación extraordinaria

1963 François Jacobs, Sydney Brenner y Jacques Cuzin→ Modelo que explica proceso de replicación en bacterias:

Origen de replicación → Replicón Uno en procariotes (monofocal):Comienza siempre en un punto determinado ORIGENProgresa formando 2 horquillas de replicación

Múltiples en Eucariotes (multifocal):C/crs existen múltiples orígenes de replicación (centenares –

miles)Progresan dando lugar a un número doble de horquillas

Componentes que controlan la iniciación de la replicación

◦ Replicador → grupo de secuencias suficientes para dirigir la

iniciación de la replicación del DNA ≠ Origen de replicación

Proteína Iniciadora → Reconoce específicamente una secuencia de

DNA (iniciador) → activa la iniciación de la replicación

Modelo del replicón del inicio de la replicación

Las secuencias replicadoras, presentan dos características comunes◦ Sitios de unión → Maquinaria de replicación

◦ Regiones ricas en AT → Fácil desenrollamiento

245 pb

13 13 13 9 9 9 9

OriC (E. coli)

SV40

EP EP P P P P

65 pb

Múltiples origenes de replicación en

eucariotes

+

Proteína Iniciadora:◦ Unión a sitio especifico don el Iniciador

◦ Desenrrollamiento del sitio adyacente al sitio de unión.

◦ Interacción con otras proteínas → Reclutamiento

Eucariotes → Iniciador → Complejo proteico → Complejo de reconocimiento del origen (ORC)

Iniciador unido a Replicador → Inicio de la replicacion → Interacciones proteina-proteina y proteina-DNA → Esamble de dos orquillas de replicacion (Burbuja de replicacion)

REQUERIMIENTOS DE LA REACCIÓN DE SÍNTESIS:

Cebador: Fragmento de ADN

Sustratos: dNTPS

Cofactores: Mg2+

Molde o plantilla

Mecanismo de la reacción

Dirección de la síntesis

Enzimas

FASES:

Iniciación: topoisomerasa, helicasa, proteínas unidas

a hebra sencilla, primasa y cebador

Elongación: DNA polimerasa, horquilla de replicación

Terminación, maduración y unión de los fragmentos

de Okazaki

A partir de los puntos de iniciación se originan las denominadas burbujas de

replicación, las cuales presentan dos zonas con forma de Y llamadas

horquillas de replicación que se van abriendo gradualmente a medida que se

sintetiza nuevas hebras complementarias de ADN

FASE DE INICIACIÓN

5´

3´5´

3´

Burbujas de

replicación

Horquillas de

replicación

-CADENA CONTINUA: Se sintetiza de forma continua.

-CADENA RESAGADA: Se sintetiza por medio de

fragmentos de OKAZAKI

CADENA RESAGADA

CADENA ADELANTADA

Fragmentos de Okazaki

3`

5`

Aumentan la procesividad de la DNA polimerasa.

Compuesta por múltiples subunidades idénticas que se

ensamblan en forma de dona, y contiene moléculas de

agua entre el DNA y la proteína.

Para iniciar la replicación se requieren primers de RNA, que son sintetizados por una RNA polimerasa PRIMASA.

-Cadena continua:

Necesita un solo primer.

- Cadena rezagada:

Necesita varios primers.

Los primers RNA son removidos por la RNAasa H, que remueve todo el primer excepto el último ribonucleótido unido directamente al extremo terminal del DNA.

Cataliza la abertura y ubicación de la

abrazadera deslizante sobre el DNA.

El proceso es acoplado a la unión de ATP y a

la hidrólisis.

Procariotes Complejo

Eucariotes Factor de replicación (RFC).

FASE DE ELONGACIÓN

• Es la fase en la que tiene lugar la síntesis de nuevas hebras de

ADN complementarias a cada una de las dos hebras de ADN

originales.

• En esta fase intervienen varios tipos de ADN polimerasas que se

nombran como I, II y III.

• La actividad de estos enzimas es por una parte polimerasa, es

decir que seleccionan y unen entre sí los nucleótidos que

corresponden a los complementarios de la hebra molde a medida

que la van recorriendo.

• Actividad exonucleasa, por la cual se eliminan nucleótidos

erróneos o mal apareados y fragmentos de ARN colocados

provisionalmente.

En la horquilla de replicación se sintetizan a lavez las cadenas adelantada y retrazada.

Procariotes Complejo multimérico =Holoenzima DNA Pol III

Terminacion

Final de elongacion

Replicacion de los telomeros

Acortami-ento de 50 – 200 pb porcadadivision celular

Están localizados en los extremos de los cromosomas

Sin los telómeros, los cromosomas son inestables y pueden combinarse con otros cromosomas para formar cr. dicéntricos o anillos

Protegen al cromosoma de la degradación Permiten la replicación completa de cada

cromosoma Posicionan a los cromosomas dentro del núcleo Sus secuencias tienen estructura y función

propias Tienen unas 6-10 kilobases, y consisten de

unas 250 – 1500 repeticiones de una secuencia rica en G, en los vertebrados es TTAGGG

Replicacion en procariotes

Mecanismos de replicación es mas simple:

Hay una sola unidad de replicación

Genoma bacteriano es un replicón circular unico de 4200 kb

La velocidad de replicación es aproximadamente = 50,000 pb/mn

Tamaño de los fragmentos de Okasaki = 1 a 2 kb

Concierna un unico origen de replicación, a partir de la cual progresan dos orquillas de replicación en direcciones opuestas.

... Replicacion en procariotes

•Intervienen las topoisomerasas :

Topoisomerasa I que produce una roturatransitoria a nivel de una de las dos hebras deDNA, a una pequeña distancia de la horquilla, loque permite el relajamiento de la molecula.

Toposisomerasa II provoca una roturatransitoria en los dos cadenas de DNA de una delas dos moléculas hijas, liberando asi lasmoleculas, de una del otro.

There are two types of plasmid integration into a host bacteria: Non-integrating plasmids replicate as with the top instance; whereas episomes, the lower example, integrate into the host chromosome.

Replicacion de genoma bacteriano

Replicacion de genoma mitocondrial

Modelo circulo rodante

Replicacion en Eucariotes

•Origen de replicación en :

levadura : 500 replicones

Plantas superiores: 35,000 replicones

Mamiferos: 100,000 replicones

•Longitud de los replicones: varia entre 40 a 300 kb

•Velocidad de replicación en eucariotes es más lento que en procariotes:

Sapo: 500 pb/mn

Drosophila: 2600 pb/mn

Levadura: 3600 pb/mn

1 L de cultivo = 4.1010 células 400 000 km de DNA sintetizado (distancia Tierra - Luna)

Levaduras 14 Mbp (1 cm) 3 kb/min 20 min 330 S duraría 80 horas con 1 ori

2.1013 km de DNA sintetizado ( 2 años luz ) durante el tiempo de vida ( 1016 divisiones celulares )

Humanos 3 Gbp (2 m) 3 kb/min 7 h >10 000 ? S duraría 1 año con 1 ori

GenomaVelocidad de

la horquillaFase S Origenes Comentario

E. coli 4.6 Mbp 30 kb/min 40 min 1 S mayor al doubling time

Velocidad de síntesis de DNA (múltiples orígenes)

Organismo

... Replicacion en Eucariotes

•Los fragmentos de okasaki (FO) son más chiquitos que en los procariotes, son aproximadamente de 100 a 200 bases

•La replicación de secuencias de DNA localizadas en los terminales de los cromosomas, trae mecanismos particulares.

Otros mecanismos de replicación

a.DNA de mitocondrias

La replicación en mitocondrias es diferente a lo de DNA circular bacteriana.

Al inicio una sola hebra de las dos hebras parentales, llamado la hebra “H” es utilizado como matriz para la sintesis de nuevo hebra. La hebra que no sirve de matriz, llamada la hebra “L”, forma una orquilla, conocido como orquilla de desplazamiento, orquilla “D”. La hebra “L” es igualmente desplazada.

... Mitocondrias

Hay dos origenes de replicación en el DNA mitocondrial de los mamiferos; uno sobre la hebra “H” y la otra sobre la hebra “L”.

Sin embargo ciertos DNA mitocondrial pueden tener varios orquillas de desplazamiento, lo que atestigua tantos números de origen de replicacion.

DNA de cloroplastos

El DNA de cloroplastos de plantas superiores, se describe el mismo mecanismo que para las mitocondrias, con la presencia de dos orquillas de desplazamiento.

Las mutaciones pueden ser el resultado de:

• Una incorporación incorrecta de bases durante la replicación

• Producto de cambios químicos espontáneos

• Exposición de agentes químicos y/o radiaciones

REPARACIÓN DEL ADN

Daño

DNA

Replicación

Cáncer

Envejecimiento

celular

Mutación

Replicación errónea

Daño persistente DNA

Inestabilidad genómicaReparación

DNA

DNA

ReparadoDefecto

DNA no reparado

Daño DNA Daño DNA

Estabilidad

Genética

Inestabilidad

Genética

CA

Enfermedades

hereditarias

Divergencia

Genética

Se estima que la frecuencia de errores durante la replicación

corresponde a una base cada 109 a 1010 nucleótidos incorporados.

Este frecuencia es mucho más baja que la predecida en base a la

complementaridad de las bases.

Esto se debe a las propiedades de la DNA polimerasa.

La fidelidad en la replicación es crucial para la reproducción celular.

Tipos (nomenclatura) de mutaciones

Mutaciones puntuales: afectan a una sola base

Sustituciones: transiciones Purina por purina o pirimidina por pirimidina

transversiones Purina por pirimidina o viceversa

Inserciones o delecciones de una letra

Inserciones o deleciones de mayor tamaño

En secuencias codificantes

silenciosa

No produce cambio de aminoácido

missense

Produce un cambio sinónimo

Produce un cambio significativo

Nonsense

Produce un codon de stop

Frameshift

Cambia la fase de lectura (Inserción o delección no múltiplo de 3)

Ocurren mutaciones en condiciones

naturales por:

Errores de las polimerasas (proofreading, slippage)

Reacciones espontáneas del DNA

(tautomería, despurinización (10000/ciclo), desaminación de C o

5-meC)

Exposición a mutágenos naturales, estrés oxidativo

Exposición a radiación

Inserciones de trasposones/virus

Traslocacíones/recombinación

Etc.La mayoría se reparan, por suerte.

Tipos de Daño

Deaminación de Bases

● Remoción del grupo amino (citosina-uracilo) (adenina- hipoxantina)

(guanina-xantina)

● Problema de mal apareamiento, transmisión de una mutación

● Agentes que causan deaminación

• Calor (37ºC)

• Hidroxilamina (in vitro, citosina)

• Bisulfito (citosina simple cadena)

• Ácido Nitroso (aditivos alimenticios; adenina y guanina)

Can basepair with Thymine

Can base pair with Cytosine

Most frequent deamination

AGENTE ACCION EFECTO

Analogos de bases 5’ bromouracilo

se incorpora como T :

a veces aparea con G

A-T G-C

G-C A-T 2’ aminopurina se incorpora como A :

a veces aparea con C A-T G-C

G-C A-T

Reaccion con DNA acido nitroso

deamina A, C

A-T G-C

G-C A-T hidroxilamina reacciona con C G-C A-T

Agentes alquilantes etilmetanosulfonato

inserta metilo en G, induce

error de apareamiento

G-C A-T

mostazas nitrogenadas, NTG

entrecruzamiento de hebras, regiones de escicion

mutaciones puntuales y deleciones

acridinas, bromuro de

etidio

colorantes intercalantes cambio del marco de lectura

Radiaciones

u.v

formacion de dimeros de pirimidinas

reparacion c /s error o delecion

radiaciones ionizantes formacion de radicales libres

con ruptura de DNA

reparacion c /s error o delecion

MUTÁGENOS QUÍMICOS

La mayoría causan modificaciones de bases

Sustancias reactivasÉsteres de alquilo, agentes alquilantes) Etilmetanosulfonato

Agentes desaminantes, Ácido nitroso

Reaccionan con las bases y producen derivados con apareamiento anormal

Radicales libres, hidroxilamina

Análogos de bases5-Bromouracilo

2-Aminopurina

Se incorporan al DNA y producen apareamiento anormal

Agentes intercalantesSe insertan entre las bases, producen inserciones o delecciones

Análogos de bases

5-Bromouracilo, se incorpora como T

Produce transiciones T > C

Análogos de bases

2-Aminopurina, se incorpora como A

Produce transiciones A > G

Reparación Pre-replicativa:Reparación por Foto reactivaciónReparación por Essicion

Reparación Post replicativa:Reparación por actividad de la desoxinucleotidiltransferasa terminalReparación Por Precombinación génicaRespuesta SOS.

REPARACION POR

RECOMBINACION