1INTRODUCCION A LA BIOLOGIA

CELULAR Y MOLECULAR

Replicacin, reparacin y

recombinacin de ADN

Empaquetamiento del ADN

Cada molcula de ADN se empaqueta en un cromosoma

El total de informacin gentica contenida en los cromosomas de un organismoconstituye su genoma.

El genoma de E. Coli est formado por 4.7 x 106 pares de bases, en una nicamolcula de ADN de doble hlice (un cromosoma).

El genoma humano est formado por 3 x 109 pares de bases, en 24 cromosomas(22 autosomas y 2 cromosomas sexuales diferentes), es decir est formado por24 molculas de ADN distintas, cada una de las cuales contiene entre 50 x 106 y250 x 106 pares de bases.

En los organismos diploides, existen dos copias de cada tipo de cromosoma, unoheredado de la madre y otro del padre (con la excepcin de los cromosomassexuales en los machos, en los que el cromosoma Y procede del padre y el X dela madre). As una clula humana tpica presenta contiene 46 cromosomas y 6 x109 pares de bases.

2Divisin celular

3Cariotipo humano

Cada molcula de ADN que forma un cromosoma ha de contenerun centrmero, dos telmeros y varios orgenes de replicacin

4El ADN de todos los cromosomas se encuentra empaquetado en una estructuramuy compacta con la ayuda de protenas especficas.

Las protenas de los eucariotas que se unen al ADN se clasifican en dos grupos:las histonas y las protenas cromosmicas no-histonas.

El complejo formado por el ADN cromosmico y las dos clases de protenas sedenomina cromatina.

Las histonas son protenas relativamente pequeas, con una proporcin muyelevada de aminocidos cargados positivamente (Lisina y Arginina). La cargapositiva ayuda a las histonas a unirse firmemente al ADN, el cual est cargadonegativamente, independientemente de su secuencia de nucletidos. Es probableque las histonas no se disocien del ADN; influiran sobre cualquier reaccin queocurriese en los cromosomas.

Los cinco tipos de histonas de las clulas eucariotas se clasifican en dos gruposprincipales: las histonas nucleosmicas y las histonas H1. Las histonasnucleosmicas (H2A, H2B, H3 y H4) son pequeas protenas (102-135 aa)responsables del plegado del ADN en los nucleosomas. Las histonas H1 son demayor tamao (220 aa) y han sido menos conservadas evolutivamente que lashistonas nucleosmicas.

La asociacin de las histonas con el ADN conduce a laformacin de los nucleosomas, las partculas unitariasde la cromatina

5Cada nucleosoma est compuesto 8 histonas nucleosmicas (eloctmero de histonas). La partcula tiene una forma de disco, con undimetro de alrededor de 11 nm y contiene dos copias de cada una delas cuatro histonas nucleosmicas (H2A, H2B, H3 y H4). Este octmerode histonas forma un ncleo proteico alrededor del cual la hlice de ADNde doble cadena da dos vueltas.

El nucleosoma est formado por dos vueltascompletas de ADN (83 pb por vuelta)alrededor de un ncleo octamrico dehistonas ms el ADN separador adyacente.La parte del nucleosoma que se denominacuenta contiene alrededor de 146 pb(alrededor de 1.8 vueltas) luego de serdigerido por una DNAasa.

Existen zonas del ADN que se encuentranlibres de nucleosomas por accin deprotenas de regulacin gnica.

6Generalmente los nucleosomasse empaquetan con la histonaH1 formando estructurasregulares de orden superior

Las molculas de histona H1 son responsables del empaquetamiento de losnucleosomas formando la estructura de la fibra de 30 nm. En la molcula de lahistona H1 se puede diferenciar una regin globular central, muy conservadaevolutivamente, unida a los brazos amino y carboxilo terminales, menosconservados.

Cada molcula de H1 se une a travs de su regin globular a un lugar nico delnucleosoma, mientras que los brazos entran en contacto con otros lugares de lashistonas del ncleo o de los nucleosomas adyacentes, permitiendo que seempaqueten de forma repetida regularmente.

7Desde el eje del cromosoma seextienden grandes bucles decromatina descondensada.

Los cromosomas plumuladosson un buen ejemplo de unacaracterstica recurrente de lacromatina: cuando lacromatina se transcribeactivamente se encuentra enuna estructura extendida,cuando est condensada esinactiva.

8Algunos experimentos indican que la cromatina activa es bioqumicamentediferente:

1- La histona H1 se une con menor fuerza a la cromatina activa.

2- Las histonas de la cromatina activa presentan mayor grado de acetilacin

3- La histona H2B parece estar menos fosforilada en la cromatina inactiva

4- La cromatina activa se encuentra enriquecida en una forma variante menor dela histona H2A

5- Los nucleosomas de la cromatina activa se unen selectivamente a dospequeas protenas cromosmicas similares, denominadas HMG 14 y HMG 17.

Heterocromatina: altamentecondensada, 10% del genomase encuentra empaquetado bajoesta forma

Cromatina

Eucromatina:

Eucromatina activa:10% del genoma, es laforma de cromatinamenos condensada

Eucromatina inactiva:80% del genoma, seencuentra mscondensada que laeucromatina activapero menos que laheterocromatina

9Los cromosomas mitticos estnformados por cromatina en suforma ms condensada

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El conjunto de los 46 cromosomas humanos enmitosis se denomina cariotipo. Tincin deGiemsa para bandas G (A-T).

cidos nucleicos

Una cadena de ADN es un largopolmero no ramificado, compuestonicamente por cuatro tipos desubunidades. Estas subunidades sonlos desoxirribonucletidos quecontienen las bases adenina (A),citosina (C), guanina (G) y timina (T).

Los nucletidos est unidos porenlaces covalentes fosfodister entre elcarbono 5 de un grupo desoxirribosay el carbono 3 del siguiente.

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La molcula de ADN es un polmero helicoidalformado por dos hebras.

Todas las bases nitrogenadas de la molcula deADN se hallan en el interior de la doble hlice,mientras que la regin azucar fosfato se disponeen el exterior de la misma.

Las bases nitrogenadas se aparean entre A y T porun lado y entre C y G por otro.

Cada nucletiido, A, T, C, o G, puede serconsiderado como una letra de un alfabetosencillo de cuatro letras que es utilizadopara escribir los mensajes biolgicos enforma lineal. Los organismos se diferencianentre s porque sus respectivas molculasde ADN poseen diferentes secuencias denucletidos, y por consiguiente, diferentesmensajes biolgicos.

Como consecuencia directa delmecanismo de apreamiento de bases,resulta evidente que el ADN contieneinformacin gracias a la secuencia linealde sus nucletidos.

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El nmero de posibles secuenciasdiferentes en una cadena de DNA de nnucletidos es de 4n. La variedad biolgicaque se puede generar utilizando unamodesta longitud de ADN es enorme. Unaclula animal tpica contiene un metro deADN (3 x 109 nucletidos).

La informacin gentica existente en unaclula humana permitira llenar un libro dems de 500.000 pginas.

La enzima DNA polimerasa cataliza laadicin de un desoxirribonucletido alextremo 3 de una cadena de ADN. Cadanucletido aadido a la cadena es, enrealidad, un desoxirribonuclesidotrifosfato, la liberacin del pirofosfato deeste nucletido activado y su hidrlisisposterior proporcionan la energa para lareaccin de replicacin del ADN,convirtindola de forma efectiva en unareaccin irreversible.

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La replicacin semiconservativa delADN. En cada ciclo de replicacin, cada unade las dos hebras de ADN son utilizadascomo patrn para la formacin de una hebracomplementaria de ADN. Por lo tanto, lashebras originales permanecen inalteradas a lolargo de muchas generaciones celulares.

Mecanismos de replicacin del ADN

La replicacin del ADN supone unasvelocidades de polimerizacin deaproximadamente 500 nucletidos porsegundo en las bacterias y de unos 50nucletidos por segundo en los mamferos.Las enzimas de replicacin son exactas yrpidas para cumplir con este proceso.

La rapidez y la exactitud se consiguenmediante un complejo multienzimtico devarias protenas que dirige el proceso yconstituye una complicada mquina dereplicacin.

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En la horquilla de replicacin se sintetiza el ADN de las dos hliceshijas mediante un complejo multienzimtico que contiene la DNApolimerasa.

Nunca se ha encontrado una DNA polimerasa que acteen direccin 3a 5.

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Las horquillas de replicacin se inician en el origen dela replicacin. En las bacterias, levaduras y en variostipos de virus, las burbujas de replicacin se generanen secuencias especiales del ADN que reciben elnombre de orgenes de replicacin. Estos puedentener una longitud de 300 nucletidos.

Una horquilla de replicacin tiene una estructura asimtrica.La cadena hija de ADN que se sintetiza de manera continua recibe elnombre de cadena conductora y se sintetiza antes que la cadenahija que se sintetiza en forma discontinua y recibe el nombre decadena retrasada.

La sntesis de la cadena retrasada es ms lenta debido a que debeesperar a que la cadena conductora exponga la cadena patrn sobrela que se sintetizar cada uno de los fragmentos de Okazaki.

La sntesis de la cadena conductora mediante un mecanismodiscontinuo de punto hacia atrs significa que para la replicacindel ADN nicamente se necesite la DNA polimerasa.

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En la horquilla retrasada la DNA primasautiliza ribonuclesidos trifosfato para sintetizarcebadores de aproximadamente 10nucletidos de longitud en eucariotes.

La sntesis de cada fragmento de Okasakiacaba cuando la DNA polimerasa se encuentracon el RNA cebador unido al extremo 5 delfragmento anterior de DNA.

Un sistema especial de reparacin del ADNacta para eliminar el ARN cebador y losubstituye por ADN. Posteriormente la ligasaune el extremo 3 de cada fragmento de ADNcon el extremo 5 del fragmento anterior.

Reaccin catalizada por la DNA ligasa. Esta enzima suelda un enlacefosfodister roto. La DNA ligasa utiliza una molcula de ATP para activar elextremo 5 de la muesca (paso 1) antes de formar el nuevo enlace (paso 2). Deesta forma, la reaccin energticamente desfavorable de soldadura de lamuesca est desplazada por el proceso energticamente favorable de lahidrlisis de ATP.

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Mltiples copias de unasprotenas iniciadoras se unen alugares especficos del origen dereplicacin enrollando el ADN asu alrededor y formando un grancomplejo ADN-protena. Luego,este complejo une la DNAhelicasa y la coloca sobre unazona de ADN de una sola cadenaen una regin adyacente a lahlice.

Para la replicacin de E. Coli , laprotena de iniciacin es laprotena dnaA y el primosomaest compuesto por lasprotenas dnaB (DNA helicasa) ydnaG (RNA primasa)

Para abrir la doble hlice y poner al descubierto lacadena patrn del ADN que ser copiada por laDNA polimerasa, son necesarias protenasadicionales. Dos tipos de protenas de replicacincontribuyen con este proceso: las DNA helicasas ylas protenas de unin al DNA monocatenario(SSB).

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Las protena SSB se unen a cadenas abiertas, sin recubrir las basesde la cadena. Colaboran con las helicasas estabilizando laconformacin desenrollada de las cadenas sencillas.

Su unin cooperativa recubre completamente las regiones de ADN decadena sencilla de la cadena retrasada previniendo as la formacinde cortas hlices en forma de horquilla que impediran la funcin dela DNA polimerasa.

La molcula de DNA polimerasa se mantiene unida al DNA medianteun anillo deslizante. Esta protena forma una amplio anillo alrededorde la hlice de ADN. Un lado del anillo se une a la DNA polimerasa, yel anilllo completo se desliza libremente a medida que la polimerasase desplaza a lo largo de la cadena de ADN. El ensamblaje de laabrazadera alrededor del ADN requiere hidrlisis de ATP por protenasaccesorias que se unen a la abrazadera y al ADN.

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Protenas de la horquilla de replicacin

La molculas de primasa se une directamente a la DNA helicasa,formando una unidad denominada primosoma.

Las protenas de replicacin se mantienen unidas entre s formando unagran unidad (masa total > 106 daltons) que se desplaza rpidamente a lolargo del ADN, permitiendo la sntesis de ADN en las dos direcciones de lahorquilla de una forma coordinada y eficiente.

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Las DNA topoisomerasa evitan que el ADN se enrede durante la replicacin

Cada 10 pares de bases replicadas en lahorquilla corresponden a una vuelta completadel ADN que se replica alrededor del eje de ladoble hlice. Por consiguiente, para que lahorquilla de replicacin pueda desplazarse, todoel cromosoma que se halla por delante de lahorquilla tendra que girar rpidamente.

Durante la replicacin del ADN se utiliza unaestrategia alternativa que utiliza unas protenasconocidas como DNA topoisomerasas queforman un eslabn giratorio en la hlice de ADN.

La DNA topoisomerasa es una especie de nucleasareversible que se une covalentemente a un fosfatodel ADN rompiendo un enlace fosfodister de unacadena de ADN.

La topoisomera 1 genera una rotura en una solacadena (nick) que permite a las dos secciones de lahlice del ADN a cada lado de la muesca girarlibremente una respecto a otra utilizando como lugarde giro el enlace fosfodister de la cadena opuesta ala que se ha producido la muesca.

Cualquier tensin que se genere en la hlice de ADNdirigir la rotacin en la direccin en la que estatensin se disipe.

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La topoisomerasa II forma una unin covalentecon ambas cadenas de la hlice de ADN al mismotiempo, generando transitoriamente una rotura enlas cadenas de ADN.

Estas enzimas se activan por determinadas zonasdel cromosoma en la que dos hlices se cruzanentre s.

La reaccin de la Topo II evita que se generen losgraves problemas de embrollamiento, que de otraforma, apareceran durante la replicacin delADN.

El fsico Erwin Schroedinger seal en 1945 que, fuese cual fuesela naturaleza qumica del material hereditario (desconocida enaquel momento), un gen tena que ser extremadamente pequeo yestar formado de pocos tomos. En caso contrario, el elevadonmero de genes necesarios para generar un organismo no cabraen el ncleo celular. Por otro lado, y debido a su reducido tamao,caba esperar que un gen sufriera importantes cambios comoconsecuencia de reacciones espontneas inducidas por colisionestrmicas aleatorias con molculas del disolvente.

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Mecanismos de reparacin del ADN

El ADN sufre importantes cambios debido a fluctuaciones trmicas. Cadada se pierden unas 5000 bases pricas (adenina y guanina) debido a ladestruccin trmica de enlaces N-glucosdicos entre estas bases y ladesoxirribosa (despurinacin). Anlogamente, se estima que ladesaminacin de citosina a uracilo en el ADN se produce a una velocidadde 100 cambios por genoma/da.

Desaminacin de nucletidos deADN. En el ADN de vertebrados unescaso porcentaje de losnucletidos C estn metilados, locual contribuye al control de laexpresin gnica. Cuando estos 5-metil nucletidos C se desaminanaccidentalmente, forman T. Esta Tse aparear con una G de lacadena opuesta, formando un parde bases equivocado.

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Resumen de las alteraciones espontneas que requierenreparacin del ADN. Se indican los lugares de cadanucletido que se sabe se modifican por oxidacinespontnea (flechas rojas), ataque hidroltico (flechasazules), o metilacin descontrolada por el dador degrupos metilo S-adenosil metionina (flechas verdes), lafrecuencia de cada proceso se indica por el grosor de cadaflecha.

Detalle de la estructura de un dmero de timina, untipo de alteracin generado por la exposicin a laradiacin ultravioleta (como la luz solar). Se puedeformar un dmero similar entre dos bases depirimidina vecinas cualesquiera (residuos C o T) delADN.

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MELANINA

Sntesis de melanina

240 400 nm

290 320

UV-AUV-BUV-C

Estructura de la melanina

Melanina

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Radiacin UV-B (290-320 nm)

Noviembre Diciembre Enero

La exposicin de ratas a la radiacin UV-B genera la aparicin de tumores slidosAngel H Roffo 1934.

Cancer et. Soleil. Carcinomes et sarcomes provoqu par lction du soleil in toto Bull Assoc Fra tude Cancer

Angel H. Roffo

El primer trabajo que puso el acento sobre la correlacin entre la exposicin solar y la mortalidad a causa de melanoma fue publicado por Lancaster et al. en 1956.

Some geographical aspects of the mortality from melanoma in Europeans. Med J Aust

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ADN y UV

Reparacin del ADN

Uno de cada mil cambios accidentales de las basesdel ADN provocan una mutacin. Para conservar estefenmeno, existe una amplia variedad demecanismos de reparacin del ADN, cada uno deellos catalizados por un conjunto de enzimasdiferentes.

El proceso bsico consta de tres etapas:

1-La porcin alterada de la cadena es reconocida yeliminada por nucleasas de reparacin del ADN, quehidrolizan los enlaces fosfodister alterados. Estoproduce un hueco en la regin de la hlice de ADN.

2-La DNA polimerasa se une al extremo 3-OH de lacadena cortada de ADN y coloca nucletidosutilizando la informacin correcta de la cadenapatrn.

3- La DNA ligasa suelda la cadena completando elproceso.

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Las alteraciones del ADN son eliminadas por ms de una va

Las enzimas involucradas en el proceso de reparacin del ADN dependen del tipo dealteracin que se trate.

-La despurinacin, la lesin ms frecuente de las que tienen lugar en el DNA, produceuna azucar desoxirribosa que ha perdido su base. Este azcar es rpidamentereconocido por la enzima AP endonucleasa, la cual corta el enlace fosfodister dellado 5del lugar alterado. Luego de la escisin de una residuo azcar-fosfato por unaenzima fosfodiesterasa, se recupera la secuencia de DNA inalterada mediante la accinde una DNA polimerasa y una DNA ligasa.

-Una ruta de reparacin relacionada, denominada reparacin por eliminacin de bases,implica la actuacin de una batera de enzimas diferentes llamadas DNA glucosilasas.Cada DNA glucosilasa reconoce a un tipo de base de ADN alterada y cataliza laeliminacin hidroltica de la base. Posteriormente el sistema AP reconoce el azucar-fosfato y lo elimina por el sistema antes mencionado.

Existen como mnimo seis tipos de estas enzimas, entre las que se encuentran las queeliminan C desaminadas, A desaminadas, diferentes tipo de bases alquiladas u oxidadas,bases con anillos abiertos, y bases en las que un enlace doble carbono-carbono se haconvertido un enlace simple carbono-carbono

La DNA polimerasa acta como una enzima autocorrectora que elimina sus propios errores de polimerizacin a medida que avanza por el ADN.

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El elevado grado de fidelidad del mecanismo de replicacin delADN requiere la existencia de un mecanismo de correccin degaleradas o verificacin de lectura.

A diferencia de las RNA polimerasas, las DNA polimerasas no inicianuna nueva cadena de nucletidos uniendo entre s dos nucletidostrifosfato: necesitan de forma absoluta la presencia de un extremo3-OH de una cadena cebadora sobre la que aadir los nucletidossiguientes.

Las molculas de ADN que presentan errores de apareamiento (ocon la falta de algn apareamiento), de nucletidos en el extremo3-OH de la cadena cebadora no son efectivas como cadenapatrn.

Las molculas de DNA polimerasa son capaces de trabajar concadenas de ADN defectuosas de este tipo mediante la utilizacin deuna subunidad o dominio cataltico que corta cualquier residuodesapareado del final de la cadena cebadora.

El proceso de corte mediante esta actividad correctoraexonucleasa 3a 5 contina hasta que se ha eliminado elnmero de nucletidos necesarios del extremo 3 como pararegenerar un extremo con bases apareadas que pueda cebar lasntesis de ADN.

Comparacin entre los dos principales sistemas de reparacin del ADN

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Recombinacin gentica

Una propiedad importante del ADN en las clulas,es su capacidad de experimentar reordenacionesque pueden hacer variar tanto las combinacionesparticulares de genes que se hallan presentes enel genoma de cualquier individuo como elprograma y el nivel de expresin de estos genes.Estas reordenaciones de ADN estn generadasmediante la recombinacin gentica.

Se conocen dos grandes tipos de procesos derecombinacin gentica: la recombinacin generaly la recombinacin especfica.

En la recombinacin general, el intercambiognico se produce entre secuencias homlogasdel ADN, generalmente localizadas sobre doscopias del mismo cromosoma.

Unin heteroduplex. Esta estructura junta dosmolculas de ADN en el lugar donde se hanentrecruzado. Este tipo de unin presentageneralmente varios cientos de nucletidos delongitud.

En el lugar de intercambio no se altera lasecuencia de nucletidos, el proceso de roturay unin ocurre de una forma tan precisa, queni se pierde ni se gana un solo nucletido.

A pesar de esta precisin, la recombinacingeneral crea molculas de ADN cuyasecuencia es nueva. El mecanismo derecombinacin general asegura que slo seproduzcan intercambios entre dos regiones dedoble hlice de ADN que presenten secuenciasnotablemente homlogas.

El proceso de reconocimiento ocurre medianteinteracciones directas de apareamiento debases.

A pesar de la precisin del proceso, se generanporciones de ADN cuya secuencia es nueva: launin heterodplex puede contener unpequeo nmero de errores en elapareamiento de bases, y lo que es msimportante, habitualmente los dos DNA que seentrecruzan no son exactamente el mismo acada lado de la unin.

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La recombinacin especfica de lugar no se produce nicamente entre ADNhomlogo. Por el contrario, el intercambio se produce entre cortassecuencias de nucletidos (sobre una o ambas molculas de ADN queparticipan) reconocidas especficamente por una enzima de recombinacinespecfica de lugar. La recombinacin especfica de lugar altera las posicionesrelativas de las secuencias de nucletidos en los genomas.

En la recombinacin conservativa especfica de lugar, enzimas derecombinacin especfica de lugar ponen y quitan del genomasecuencias especiales de ADN

-La recombinacin gentica especfica delugar est guiada por una enzima derecombinacin que reconoce secuenciasespecficas de nucletidos presentes en unao en ambas molculas de ADN que serecombinan.

-Separando y volviendo a unir molculas deADN de doble hebra en lugaresdeterminados, este tipo de recombinacinpermite que varios tipos de secuencias deADN se desplacen dentro y entrecromosomas. Se forma una pequea reginheteroduplex de 6-7 pares de bases.

-El mismo sistema enzimtico que une dosmolculas de ADN tambin puede separarlasde nuevo, recuperando de forma precisa lasecuencia de ambas molculas originales deADN. No se modifica la secuencianucleotdica.

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Recombinacin transposicional especfica de lugar. La recombinacintransposicional pude insertar un elemento gentico mvil en cualquiersecuencia de ADN

Muchas secuenciasmviles de ADN,incluyendo virus yelementostransponibles, codificanintegrasas que insertansu ADN en uncromosoma a travs deun mecanismodiferente del que utilizael bacterifago lambda.

Estas integrasas no requieren secuencias especficas en el ADN y no forman ninguna uninheteroduplex.

Introducen cortes en ambos extremos de la secuencia lineal del ADN del elemento genticomvil y catalizan un ataque directo de estos extremos de ADN sobre la molcula de ADNdiana, rompiendo dos enlaces fosfodister cercanos de la molcula diana.

Debido a la forma de estos cortes quedan huecos a ambos lados que son rellenados por laDNA polimerasa generndose una corta duplicacin de la secuencia del ADN diana adyacente

Representatividad en el genoma humano de los distintos elementos gnicos

Tipos de transposones

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