DOCENTE: QF.MINAYA GALARRETA ANGELICA

INTEGRANTES:ASTETE CALDERON MYRIAMBRAVO RUIZ PILARFIESTAS ISABELGALVEZ OSPINAL JENNIFEROREJON GOMEZ DENISSEPAZ OJEDA NESTORVALDIVIA CASTILLO EDGARWONG CARRERA CECILIA

FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS Y BIOQUIMICA

EXTRACCIÓN DE ADN, ARN Y PROTEÍNAS

Los ácidos nucleicos almacenan la información genética de los organismos vivos y son los responsables de la transmisión hereditaria. 

Gran parte del desarrollo físico de un organismo a lo largo de su vida.

Las proteínas que elaboraran sus células y las funciones que realizaran están todas registradas en esta cinta molecular.

Existen dos tipos: el ADN y el ARN.

Ácidos Nucleicos

Es una macromolécula muy larga , filamentosa y formada por desoxirribonucleótidos, cada uno de ellos compuesto por una base nitrogenada, un azúcar desoxirribosa y un grupo fosfato.

EL ADN

El ARN tiene una sola hebra.

La pentosa de los nucleótidos constituyentes es ribosa.

Sus cuatro bases son: A, G, C, U.

Es la molécula que dirige las etapas intermedias de la síntesis proteica.

EL ARN

ARNr: Recibe la información genética. Traduce las proteínas. Se ubica en el

ribosoma, organela donde se sintetiza las proteínas.

Tipos de ARN

La extracción de ADN, ARN y proteínas, es el método más fundamental utilizado en la biología molecular.

Pueden ser aislados de cualquier material biológico, tales como tejidos vivos o conservados, células, partículas de virus u otras muestras.

Actualmente existen muchos métodos especializados que pueden ser utilizados para extraer biomoléculas puras.Estos métodos permiten un alto rendimiento de la muestra y la velocidad, exactitud y fiabilidad de la prueba; y reduce la contaminación cruzada.

Introducción

1869

• Dr Friedrich Miescher realizó la primera extracción de ADN.

• Esperaba solucionar los principios fundamentales de la vida, para determinar la composición química de las células.

• Utilizó los leucocitos obtenidos de la pus recogidos en vendajes quirúrgicos y obtuvo mediante sus pruebas precipitado crudo de ADN.

Historia:

MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS

MÉTODOSCONVENCIONALES

Tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo

Extracción alcalina

Método de Extracción CTAB

Centrifugación en gradiente de bromuro de etidio-cloruro de

cesio.

Purificación de ARN Poli (A) por cromatografía de celulosa de oligo

(dT).

Extracción de Ácidos Nucleicos por Métodos

Convencionales:

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN

Cantidad de material de partida Número de copias de las moléculas de AN Cantidad de tejido

Condiciones en las que se encuentra el material de inicio (fresco, congelado, fijado)

Contaminantes e interferentes en el material biológico

Extracción de ADN La extracción tiene como objetivo obtener la mayor cantidad de ADN de alto

peso molecular, libre de proteínas, carbohidratos y otros inhibidores de enzima.

La extracción de ADN se puede dividir en 5 pasos:

1. Ruptura de las células:

2. Eliminación de proteínas:

3. Eliminación de ARN

4. Extracción de proteínas

5. Precipitación de ADN

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS POR MÉTODOS

CONVENCIONALES

Fundamento del método: También conocido como método TRIZOL.Método común para la extracción de ácidos nucleicos. Se basa en la separación de fases, posterior a la centrifugación. Se usa una mezcla de fenol con agua, cloroformo y un agente caotrópico desnaturalizante (guanidin-tiocianato) en una fase acuosa y una orgánica (fenol).Posteriormente al uso de solventes orgánicos fenol- cloroformo que permiten su separación de restos de proteínas, lípidos y la posterior precipitación de los ácidos nucléicos usando etanol o isopropanol.

1. EXTRACCIÓN CON TIOCIANATO DE GUANIDINO – FENOL – CLOROFORMO (MÉTODO DE CHOMCZYNSKI)

EXTRACCIÓN DE ADN PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA

Fundamento del método: Se basa en las diferencias de la

desnaturalización y renaturalización entre el ADN plasmídico y el ADN cromosómico.

La alcalinización con NaOH en presencia de un detergente fuertemente aniónico como el Dodesilsulfato de Sodio, provoca la lisis celular, la desnaturalización del ADN cromosómico y de las proteínas, y la liberación de los plásmidos. La neutralización del medio con acetato potásico, provoca precipitación de proteínas y del ADN cromosómico.

LISIS ALCALINA

PURIFICACION

PURIFICACION

3. MÉTODO DE EXTRACCIÓN CTAB (Bromuro de Cetiltrimetilamonio)Fundamento del método:

Es un método mas largo, pero se obtiene un ADN de mayor pureza.El CTAB es un detergente cationico que solubiliza las membranas celulares, dependiendo de la concentración de NaCl en la solución.Las células pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en medio hipo salino. De ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado.

Adecuado para extraer y purificar ADN de vegetales y especialmente indicado para eliminar los polisacáridos y los compuestos polifenólicos que dañarían al ADN

Elaborado por Murray y Thompson

en 1980.

LISIS MEMBRANA CELULAR

SOLUBILIZACION DE LOS LIPIDOS

LISIS DE LA MEMBRANA

4.- CENTRIFUGACIÓN EN GRADIENTE DE BrEt - CsCl

Fundamento del método:

El BrEt ingresa y se intercala en la cadena de ADN disminuyendo su densidad, pero lo hace en mayor cantidad en el ADN plasmídico en estado relajado que en el ADN plasmídico superenrrollado.

pudiéndose separar por centrifugación en el gradiente de densidad de CsCl.

DNA SuperenrroladoCovalentemente cerrado y muy empacado.

DNA circular. DNA que no se ha empacado.

EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS

NUCLEICOS POR FASE SÓLIDA

EXTRACCIÓN DE ÁCIDO NUCLEICO EN FASE SÓLIDA

Los sistemas de Fase Solida absorberán los ácidos nucleídos en el proceso de extracción dependiente del pH y contenido de sales de buffer.

Basado en los siguientes principios.

• La interacción de los puentes de hidrogeno con una matriz hidrofilia bajo condiciones caotrópicas

• Intercambio iónico bajo condiciones acuosas por medio de un intercambio aniónico• Mecanismos de exclusión por afinidad y tamaño.

Tipos

Matrices de sílica

Partículas de

vidrio

Tierra de diatomea

s

Trasportadores de

intercambio aniónico

La Purificación en Fase Solida

PASOS PARA LA EXTRACCIÓN EN FASE SÓLIDA.

7. Finalmente, se reconstituye el ADN de elevada pureza en un tampón de baja salinidad para su posterior utilización o almacenamiento.

1. Se acondiciona la columna para la absorción de la muestra.

2. Luego, convierte la superficie o grupos funcionales en el sólido es decir en una forma particular de química.

3. El ácido nucleído deseado se absorberá a la columna con la ayuda de un alto pH y concentraciones de sal de la solución enlazadora.

4. La muestra que fue degradada mediante el uso de soluciones amortiguadora se aplica a la columna.

5. Luego los ácidos nucleídos se eluyen con un tampón de máxima salinidad.

6. Se precipita con isopropanol para lavar y eliminar todos los restos de impurezas.

LAS MATRICES DE SÍLICA

La matriz de silica hidratante preparada por reflujo de óxido de silicio en hidróxido de sodio o hidróxido de

potasio

El ADN se enlaza a la matriz inorgánica y es liberada en agua caliente.

.

PURIFICACIÓN

TIERRA DE DIATOMEAS (DIATOMITA)

La diatomita tiene contenido de sílice hasta en un 94% ha sido usado para

filtración y en cromatografías, quitan el ADN trenzada doble pero no el ARN o las

proteínas.

La diatomita resultante enlazada con el ADN es luego lavado con un tampón que contiene alcohol, este es luego dejado de lado y el ADN es eluído en un tampón bajo

en sal o en agua destilada.

PURIFICACIÓN

EXTRACCION DE PROTEINAS

Las proteínas que tienen una fuerte afinidad hacia los grupos químicos específicos como los ligandos, se unirán y enlazaran covalentemente a la columna matriz mientras las otras proteínas atravesarán la columna.

El enlace entre el ligando y las moléculas de proteínas debe ser reversible para permitir que las proteínas sean removidas de forma activa. Después del lavado de los contaminantes, el ligando asociado debe retener su enlace de afinidad específico hacia las proteínas fijadas.

CROMATOGRAFIA POR AFINIDAD

CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO

CROMATOGRAFÍA DE FILTRACIÓN EN GEL

La separación de moléculas puede ser dividida en tres tipos principales:

exclusión total, las moléculas grandes no pueden entrar sus poros y eluír de manera rápida.

permeación selectiva, moléculas de tamaño intermedio pueden entrar en los poros y, tal vez, tengan una duración promedio dependiendo de su tamaño y forma.

límite total de permeación, moléculas pequeñas tienen la mayor duración en ella una vez que entran en los poros de la columna.

¿Para qué se utiliza una electroforesis?

Electroforesis es una técnica para la separación de moléculas (proteínas o ácidos nucleícos) según la movilidad de estas en un campo eléctrico a través de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaños moleculares y carga eléctrica, dependiendo de la técnica que se use.

La electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida puede llevarse a cabo en condiciones nativas (ND-PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). Las diferencias entre uno y otro son :

ND-PAGE las proteínas mantienen su estructura tridimensional y las diferentes cadenas polipeptídicas pueden permanecer unidas, separándose no sólo en función de su carga eléctrica, sino también según su tamaño y forma

SDS-PAGEcuando las proteínas se solubilizan en presencia del detergente aniónico SDS , éste se une a las proteínas, rompiendo interacciones hidrofóbicas y desnaturalizándolas. Las proteínas desnaturalizadas de la muestra adoptarán una estructura en forma de bastoncillo con una serie de moléculas de SDS cargadas negativamente a lo largo de la cadena polipeptídica. Las proteínas se separan en base a su masa molecular

ELECTROFORESIS EN GEL

ELECTROFORESIS EN GELEs uno de los métodos más

utilizados para la purificación,

análisis y caracterización de proteínas según su relación tamaño a carga eléctrica en el que se utiliza una corriente

eléctrica controlada.

Usándose como base una matriz

gelatinosa, ya sea de agarosa o

poliacrilamida

SISTEMA DE EXTRACCIÓN AUTOMÁTICA

Northern blot Es una técnica de detección

de moléculas de ácido

ribonucleico (ARN).

Para ello, se toma la mezcla de

ARN y se somete a

una electroforesis en gel a fin

de separar los fragmentos en

base a su tamaño.

Western blot o inmunoblot

Es una técnica analítica usada para detectar proteínas. Mediante

una electroforesis en gel se separan las proteínas atendiendo al criterio que se

desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc.

Southern blotEs un proceso que se utiliza

para el análisis del ADN.

Para ello, emplea la

 electroforesis en

gel de agarosa con el fin de

separar los fragmentos de

acuerdo a su longitud y,

después, una transferencia a

una membrana en la cual se

efectúa la hibridación de

la sonda

Las técnicas generales de

purificación y extracción de ácidos

nucleicos; tanto los métodos

convencionales como los métodos

modernizados gracias al desarrollo

de la tecnología; como es el sistema

automatizado; permiten a los

investigadores y científicos a

adquirir mejores resultados y es

esencial en una gran cantidad de

aplicaciones bioquímicas como son:

relaciones de parentesco, para

detectar enfermedades hereditarias,

para conocer los genes de una

persona, clonación, etc.

CONCLUSIONES