Concepción, 17 de abril 2015

JM Sayagués

Citogenética molecular en tumores sólidos:

Aplicación al estudio del cáncer colorrectal

esporádico

Citogenética molecular en tumores sólidos

1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los

tumores sólidos

2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de

biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.

3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de

recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH

Citogenética molecular en tumores sólidos

1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los

tumores sólidos

2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de

biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.

3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de

recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH

Cáncer de mama

Neoplasia más frecuente en la mujer (30%)

700.000 nuevos casos en Europa

1/20 mujeres contraerá cáncer de mama

Por cada 100 mujeres existe un hombre

Hereditario: 5-10% casos

Periodos máxima incidencia: Premenopausia: 45-49 años

Postmenopausia: 65 años (rango 35-80 años).

EPIDEMIOLOGÍA

Cáncer de mama: Factores pronósticos

• Afectación ganglionar• Estadio clínico según la clasificación TNM• Tipo histológico• Grado de diferenciación• Receptores hormonales (RE y RP)• Contenido de ADN (ploidía)• Índice de proliferación: fase S• Proto-oncogenes: Her-2/neu

Factores pronósticos

Ros JS, Fltcher JA, Linette GP, et al: The HER2/NEU/neu gene and protein in breastcancer. Biomarker and target therapy 2003, 8 :307-25.

Esperanza de vidaEtapa TNM Descripción Supervivencia

5 años

0 Tis N0 M0 Carcinoma in situ 99%

IIB T2 N1 M0T3 N0 M0

2 -5 cen + mts Gan>5 cen, no mts Gan 65%

IIIB T4NX M0TX N3 M0

>5 cen + mts gan>5 cen + mts gan mm 44%

IV >5 cen + mts gan >5 cen + mts gan +mts a distancia 14%

AIT0 N1 M0T1 N1 M0T2 N0 M0

No TP, mts gan<2 cm + mts gan,

2 -5 cm82%

Cáncer de mama: Factores pronósticos

• Afectación ganglionar• Estadio clínico según la clasificación TNM• Tipo histológico• Grado de diferenciación• Receptores hormonales (RE y RP)• Contenido de ADN (ploidía)• Índice de proliferación: fase S• ¿Ploidía de ADN? ó ¿alteraciones genéticas?: Her-2/neu

Factores pronósticos

Ros JS, Fltcher JA, Linette GP, et al: The HER2/NEU/neu gene and protein in breastcancer. Biomarker and target therapy 2003, 8 :307-25.

Cáncer de mama: Factores pronósticos

1 /4 pacientesHER2+ (25%)

HER2

75% vs. 25%

Cáncer de mama: Factores pronósticos

ReceptoresHER2

activados

Cáncer de mama: Estudio de HER2

AltaAmplificación

1+1+2+2+ Negative/0Negativo/0

NormalNormal

3+3+

BajaAmplificación

TÉCNICA FISH(n=108)

Cáncer de mama: Estudio de HER2

Trisomía + Tetrasomía: 18%

Normal: 25%

Ganancias: 40%

Trisomía: 16% Tetrasomía: 6%

PATRONES FISH (n=108)Her-2/neu/CEP17

Am J Clin Pathol 2003;120:917-927

Cáncer de mama: Estudio de HER2

Amplificación: 29%

Amplificación media: 6%Baja Amplificación : 11% Amplificación alta: 12%

PATRONES FISH (n=108)Her-2/neu/CEP17

Her-2/neu/CEP17> 2.2

Cáncer de mama: Estudio de HER2

Am J Clin Pathol 2003;120:917-927

ANTECEDENTES FAMILARES

P= 0.01

Normal Pérdidas Ganancias Amplificación

Noantecedentesfamiliares

16/68 (23%) 4/68 (6%) 34/68 (50%) 14/68 (21%)

7/28 (25%) 3/28 (11%) 5/28 (18%) 13/28 (46%)Antecedentesfamiliares

Cáncer de mama: Estudio de HER2

Am J Clin Pathol 2003;120:917-927

Aneuploidía

P<.001

amplificación

pérdidas

ganancias

normal

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

0DIPLOIDE

15

15

12

59

ANEUPLOIDE

37

50

10

3

Índice ADN

amplificaciónpérdidasgananciasnormal

Med

ia d

el I

DNA

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

,8

676291

10730

516

P<.001

Fase S

amplificaciónpérdidasgananciasnormal

Med

ia d

e la f

ase

S

60

50

40

30

20

10

0

-10

17

80

51

72591

P=.001

ESTUDIO DEL ADN

P<.001

Am J Clin Pathol 2003;120:917-927

Cáncer de mama: Estudio de HER2

Espinosa A et al, Am J Clin Pathol 2003;120:917-927

Cáncer de mama: Estudio de HER2

La amplificación de HER2 en cáncer de mama marcan un tratamiento muyespecifico con el uso de terapias dirigidas, trastuzumab.

Algoritmo para la evaluación de HER2

*ASCO/CAP HER2 Testing Update: Wolff AC, et al. J Clin Oncol. 2013 Nov 1;31(31):3997-4013

Carcinoma de mama con componente infiltrante

IHQ

Negativo (0,1+) Boderline (2+) Positivo (3+)

FISH

No AmplificadoHER2/CEP17 < 2*

HER2 < 4 señales/núcleo

– Se evalúa sólo el componente infiltrante.– Se evalúan al menos 50 células en al menos dos áreas tumorales distintas.

* doble sonda: HER2/CEP17 Sonda única: HER2

BoderlineHER2/CEP17 < 2*

HER2 ≥ 4 y < 6 señales/núcleo

AmplificadoHER2/CEP17 ≥ 2*

HER2 ≥ 6 señales/núcleo

Melanoma vs Nevus

160.000 casos nuevos de melanoma el en mundo (↑4,1%)

Histopatología técnica “gold estándar”

158 melanomas invasivos 22 lesiones benignas

513 melanomas invasivos 85 nevus benignonevus dísplasicomelanoma in situ

Veenhuizen KCW, et al. Quality assessment by expert opinion in melanomapathology: experience of the pathology panel of the Dutch Melanoma WorkingParty. J Pathol 2005;182:266-72.

Melanoma

Actas Dermosifiliogr. 2009;100:Supl. 1:52-65

BRAFPTENCDKN2A CCND1 E-caderina

TRPM1 TRPM1

Uso de Zelboraf en pacientes con MM metastásico irresecablecon mutación en BRAF identificada con plataforma Cobas®

Nevus displásico vs. Melanoma maligno

>38%

>29%

>40%

Melanoma

>19%

>16%

>42%

U. Chicago NeoGenomics

Sensibilidad: 86%Especificidad: 95%

Abbot

≥2.5*

31%

≥2.5*

*Media de señales por núcleo

Am J Surg Pathol 2012;36:808–817

Spitz benigno vs. Melanoma Spitzoide

Am J Surg Pathol 2012;36:808–817

Sensibilidad: 86%Especificidad: 95%

11q13 (CCND1)

6q23 (MYB) 8q24 (CMYC)

Sensibilidad: 94%Especificidad: 98%

9p21 (P16)

N=27 LESIONES AMBIGUAS(5 años de seguimiento)

6 casos MTS: 6+ (100%)

21 casos NO-MTS: 5+ (24%)

Oligodendrogliomas

• Deleción de 19q en un 50-80% de los casos

• Deleción 1p en 70% casos

• Coexistencia de deleción 1p/19q

• Polisomía y deleciones otros cromosomas

• Progresión relacionada con amplificación de EGFR

• Progresión relacionada con pérdida de PTEN

• Falta de correlación entre la histología y los marcadores

moleculares

Aplicación:

Detección de deleciones 1p36 y 19q13 importantes en elestablecimiento del pronóstico en oligodendrogliomas.

1p36/1q25 and 19q13/19p13 FISH Probe Kit

Oligodendrogliomas

Oligodendrogliomas: Subtipos moleculares

▫ 1) Pérdida de 1p/19q Más probable en frontal, parietal Respuesta cercana al 100% Supervivencia mayor a 10 años

▫ 2) Pérdida de 1p sin pérdida de 19q Respuesta cercana al 100% Supervivencia aproximada de 6 años

▫ 3) Sin deleción de 1p/19q con mutación TP53 Más probable temporal, insular 33% de respuesta Supervivencia menor a 6 años

▫ 4) Sin deleción de 1p/19q, sin mutación TP53 18% de respuesta Supervivencia generalmente inferior a 18 meses

Hamalat et al. Oligodendroglioma: clinical study and survival analysiscorrelated with chromosomal anomalies. Neurosurg Focus. 2005 Nov15;19(5):E15.

Deleción 1p-19q

No del. 1p-19q

Polisomías

Gliomas

Aplicación:

La amplificación es un marcador de mal pronóstico, deprogresión

Excluyente con deleción 1p/19q

Diagnóstico diferencial entre glioblastomas de célulaspequeñas y oligodendrogliomas anaplásicos

EGFR / CEP 7 FISH Probe Kit

Cáncer de pulmón NSCLS

• La translocación del gen ALK es unevento poco frecuente en NSCLC(3-5% de los casos)

• Frecuente en pacientes jóvenes,no fumadores y mujeres

• Los pacientes con translocaciónALK responden al tratamiento conCrizotinib con una reducción muysignificativa del tamaño tumoral,aumento de la esperanza de vida ycalidad de vida

• Al igual que las mutaciones EGFRdeben realizarse medianteplataforma Cobas®: tratamientoanti-EGFR Kwak EL, et al. 2010. NEJM. 363 :1693-703.

Translocación ALK

Antes Después

Paciente con cancer de pulmón NSCLSALK+ tratado con Crizotinib.

Cáncer de pulmón NSCLS

• FISH:- El tratamiento con Crizotinib establece la selección de pacientes

utilizando la sonda LSI ALK Break Apart (Abbott, Santa Clara, Ca)

• IHC:– La detección por inmunohistoquímica que ha dado una correlación

excelente en linfoma anaplásico y tumores miofibroblásticosinflamatorios no ha funcionado igual en NSCLC y no se ha podidoestablecer correlación

• RT-PCR para cDNA– Tienen grandes dificultadas debido a los diferentes puntos de ruptura

identificados.– Muy malos resultados en tejido FFPE debido al gran tamaño del

amplicón con muchos casos falsos negativos

Citogenética molecular en tumores sólidos

1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los

tumores sólidos

2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de

biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.

3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de

recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH

HETEROGENEIDAD INTRATUMORAL EN CÁNCER DECOLON Y SU RELACIÓN CON METASTASIS HEPÁTICAS

Mucosa normal

Pólipo

Cr 5qMutaciones de APC

Adenoma

Cr. 12p,Ganancia del cr. 7 y 20q

Mutaciones de KRAS

CarcinomaMetástasis

Hepática

TP53, DCCGanancias de: 5q, 8q, 13q, XPérdidas de: 4, 8p, 15, 17q, 18q

¿Cariotipos complejos?

Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, et al. Genetic alterations duringcolorectal-tumor development. N Engl J Med 319 (9): 525-32, 1988.

11q+++

34%

8p-,17p-,18q-

8q+, 20q+8%

17p- , 18q-

12%

1p- 8p-17p-18q-

8q+13q+20q+

17%17%

1p-,17p- ,18q-

13q+, 20q+

4%

8p-

7q+, 13q+

8%

1p- , 18q-

20q+

17%

17p-

4%

1p-

8%

8p-

20q++

Tumor

primar

ioM

etás

tasis

hepá

tica

8%8%

13q++

8%

13q+++

4%

7q+

4%8q+, 11q+

4%

11q+

4%7q+11q+13q+

12%

4%

17p-

7q+11q++

4%8q+,13q+

8%

17%

11q+, 13q+

17%

8q++, 20q++

12%

8q+++

8%

7q+

11q+13q++

1p-, 8p- ,18q-

8q+

12%7q+13q+20q+

4%11q+

8%

8q++

8%

13q+

4%20q++

8%

8%

8q++

8q+++, 11q+

4%11q+

8%

7q+

8q++20q++

8%

1st aneuploid tumor cell clone 2nd aneuploid tumor cell clone 3th aneuploid tumor cell clone

24 2, 3, 6, 11 5, 14 8, 9, 12, 13, 15,18, 20, 22 10, 1617, 19, 231, 4, 7, 21Cases:

HETEROGENEIDAD INTRATUMORAL EN CÁNCER DECOLON Y SU RELACIÓN CON METASTASIS HEPÁTICAS

TUMOR PRIMARIO METASTASIS HEPÁTICA

HETEROGENEIDAD INTRATUMORAL EN CÁNCER DECOLON Y SU RELACIÓN CON METASTASIS HEPÁTICAS

0

20 Mb

40 Mb

60 Mb

80 Mb

0 0.5 1 1.5-0.5-1-1.5

17p11.2

Genotipado masivo: Cáncer de colon metastásico

0

20 Mb

40 Mb

60 Mb

80 Mb

0 0.5 1 1.5-0.5-1-1.5

17p11.2

20,156,497 bp

22,975,771 bp

A B

C

TEL

Clon B

20156497 22975771

17q11.217p11.2 17p11.117q11.1

25280000

Clon A

CEN

Genotipado masivo: Cáncer de colon metastásico

PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683

All patients(n=58)

Metastatic tumors(n=27)

Non-metastatic tumors(n=31)

Univariateanalysis

Chromosome 1Normaldel(p)Polysomy

21 (36%)26 (45%)11 (19%)

7 (26%)13 (48%)7 (26%)

14 (45%)13 (42%)4 (13%)

NS

Chromosome 7Normaldel(q)q+Polysomy

19 (33%)6 (10%)3 (5%)

30 (52%)

5 (19%)5 (19%)1 (3%)

16 (59%)

14 (45%)1 (3%)2 (7%)

14 (45%)

NS

Chromosome 13NormalPolysomy

20 (35%)38 (65%)

7 (26%)20 (74%)

13 (42%)18 (58%)

NS

Chromosome 17Normaldel(17p13)Polysomy

25 (43%)26 (45%)7 (12%)

5 (19%)20 (74%)

2 (7%)

20 (65%)6 (19%)5 (16%)

p 0.001

Breakpoints at 17p11.2 21 (36%) 18 (67%) 3 (10%) p 0.001Chromosome 22

Normaldel(q)Polysomy

38 (66%)6 (10%)

14 (24%)

15 (56%)6 (22%)6 (22%)

23 (74%)0 (0%)8 (26%)

p=0.021

Cáncer de colon metastásico vs. no metastásico:Características genéticas

PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683

All patients(n=58)

Metastatic tumors(n=27)

Non-metastatic tumors(n=31)

Univariateanalysis

Age (years) 72 (38-83) 73 (48-80) 72 (38-83) NSGender

FM

20 (34%)38 (66%)

11 (41%)16 (59%)

9 (29%)22 (71%)

NS

LocationRLRe

16 (28%)28 (52%)14 (20%)

5 (19%)13 (48%)9 (33%)

11 (36%)15 (48%)5 (16%)

NS

Histological gradeWellModeratePoor

39 (67%)15 (26%)4 (7%)

16 (59%)8 (30%)3 (11%)

23 (74%)7 (22%)1 (4%)

NS

HistopathologypN0pN1pN2

38 (66%)12 (21%)8 (13%)

7 (26%)12 (44%)8 (30%)

31 (100%)0 (0%)0 (0%)

p ≤ 0.001

Size (cm) 5 (2.5-14) 5 (2.5-9) 5 (2.5-14) NSALP (mg/dl) 101 (1-495) 94 (1-330) 108 (55-495) NSCEA (ng/ml) 7.2 (0.6-4598) 45.4 (0.8-4598) 3.2 (0.6-84) p ≤ 0.001Exitus 23 (40%) 20 (74%) 3 (10%) p ≤ 0.001

Cáncer de colon metastásico vs. no metastasico:Características clinico-biologicas

PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683

120100806040200

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Chromosome 22 p0.001

Time from surgery (months)

Polysomy

Normal

del (22q11.2)

120100806040200

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

del (17p13)

Polysomy

Normal

Chromosome 17 p=0.041

120100806040200

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0

< 7.5 ng/ml

Cum

surv

ival

CEA p0.001

>7.5 ng/ml

120100806040200

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

No

Yes

Breakpoints at 17p11.2 p0.001

Cum

surv

ival

Time from surgery (months)

Time from surgery (months) Time from surgery (months)

A B

C D

Cáncer de colon: clasificación pronóstica

Cum

surv

ival

Time from surgery (months)

120100806040200

1

0.8

0.6

0.4

0.2

0

Score 0 (n=14)

Score 1 (n=36)

Score 2 (n=5)

Factores pronósticos:1. CEA2. del(17p11)3. del(22q11)

Cáncer de colon: clasificación pronóstica

P<.001

0%

60%

100%

PLoS ONE 7(8): e42683. doi:10.1371/journal.pone.0042683

Citogenética molecular en tumores sólidos

1. Implicaciones clínicas de las alteraciones genéticas en los

tumores sólidos

2. Aplicaciones de las técnicas moleculares para la identificación de

biomarcadores en cáncer colorrectal esporádico.

3. Predicción de la respuesta a la RQT preoperatoria en cáncer de

recto localmente avanzado mediante técnicas de FISH

• Biopsia• Análisis histopatológico• Colonoscopia• Rectoscopia rígida• RMN• Niveles séricos CEA• ECO endo-rectal

Métodos diagnósticosT1-2, N0

T3, N0 oTx N1-2

T4 localmenteirresecable

T o Nx M1Metástasis resecables

T o Nx M1Metástasis irresecables

NCCN. Practice guidlines in Oncology.

Abordaje terapéutico cáncer de recto

• Biopsia• Análisis histopatológico• Colonoscopia• Rectoscopia rígida• RMN• Niveles séricos CEA• ECO endo-rectal

Métodos diagnósticosT1-2, N0

T3, N0 oTx N1-2

T4 localmenteirresecable

T o Nx M1Metástasis resecables

T o Nx M1Metástasis irresecables

NCCN. Practice guidlines in Oncology.

Abordaje terapéutico cáncer de recto

T3, N0 óTx N1-2

T3, N0 oTx N1-2

TratamientoNeoadyuvante

QuimioterapiaRadioterapia

CIRUGIA

Amputaciónabdominoperineal

Resecciónanterior

Protocolectomía Hartmann Laparotomía

Abordaje terapéutico cáncer de recto

20-30% no responden

40-60% respuesta parcial

5-25% respuesta completa

G0: Ausencia de regresión

Sistema de regresión tumoral de Dworak

G4: Respuesta completa.

G3: Células tumorales aisladas

G2: Dominio de cambios fibróticos (fibrosis)

G1: Dominio de masa tumoral

Respuesta al tratamiento neoadyuvante

A) PACIENTES: 45 pacientes- 45 muestras pre-tratamiento (biopsias)- 31 muestras post-tratamiento (pieza tumoral)

– 30 Varones y 15 mujeres (2:1)– Edad media: 67 años (rango: 39-85)– Diagnóstico –Criterios de la OMS- (Jass JR & Sobin L. WHO. 2nd edition, New York, NY.

Springer-Verlag NY Inc. 1989)

B) LOCALIZACIÓN TUMORAL:

- 4% recto bajo- 51% recto medio- 40% recto alto

Materiales y métodos

C) Clasificación -American Joint Committee on Cancer- (TNM):

D) Estadio tumoral (Pre/post-tratamiento; NS):

- 0: 0%/11%- I: 2%/38%- II: 11%/18%- III: 87%/29%- IV: 0%/4%

E) CEA (Pre/post-tratamiento; p .002):- ≤5ng/mL: 59%/88%- ≥5ng/mL: 41%/12%

Materiales y métodos

Recurrencia local

T0 T1 T2 T3 T4 N0 N1 N2 M0 M1 G0 G1 G2 G3 G4 APR AR Hartmann R0 R1 R2

0% 0% 2% 65% 33% 16% 84% 0% 100% 0% NA

13% 9% 36% 42% 0% 67% 22% 11% 96% 4% 13% 25% 40% 9% 13% 29% 69% 2% 91% 7% 2% 4%POST-TRATAMIENTO

PRE-TRATAMIETNO

Resección tumoral

NA

M CirugíaT N Regresión Dworak

NA NA

(p .009) (p .005) (NS)

• uTNM estadio

• Determinación CEA

tiempo(semanas)

5Semanas

CT

CT

45 biopsias tumorales

Cirugía

Estadio histopatológico(ypTNM y evaluación de la

respuesta)

Terapia neoadyuvanteRadioterapia: 45 Gy ( )Quimioterapia:Capecitabina (CT)

0

20

Materiales y métodos

Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.

iFISH: Regiones cromosómicas analizadas (N=51)

-100

-80

-60

-40

-20

020

4060

80100

YX

22q

21q

20q

20p

19q

19p

18q

18p

17q

17p

16p

15q

15p

14q

13q

12q

12p

11q

11p

10q

10p9q9p8q8p7q7p6q6p5q5p4q4p3q2q2p1q1p

Frecuencia de alteraciones cromosómicas:Pre-tratamiento vs. Post-tratamiento

% d

e ca

sos

Cromosomas

Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.

8p

8q 13q 20q

1p 17p

Pre-tratamientoPost-tratamiento

Gana

ncia

s

Pérdidas

Frecuencia de alteraciones cromosómicas:Pre-tratamiento vs. Post-tratamiento

Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.

PRE-TRATAMIENTO POST-TRATAMIENTO

Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.

Adquisición de número copias de 20q entre lamuestra pre-tratamiento y post-tratamiento

Perfiles genéticos en función de la respuestaal tratamiento neoadyuvante

Medicine (Baltimore). 2014 Nov;93(26):e153.

P: .0002

CONCLUSIONES

La contribución de la genética molecular ha mejoradosignificativamente la precisión en el diagnóstico de diferentes tipos deneoplasias

Los estudios citogenéticos son fundamentales para el tratamiento dealgunos subtipos de leucemias, linfomas y tumores sólidos.

Las alteraciones citogenéticas predicen el pronóstico de lospacientes con leucemias, linfomas y tumores sólidos.

Agradecimientos

Servicio de Citometría

Alberto Orfao

Laboratorio de FISH

ML Gutiérrez

María González

Servicio de Bioinformatica

Javier de las Rivas

Celia Fontanillo

Servicio de Oncología

Emilio Fonseca

Servicio de Cirugía

Luís Muñoz

Jacinto García

José Antonio Alcázar

Servicio de Patología

Mar Abad

Oscar Bengoechea

Gracias

Por

Vuestra Atención