Post on 05-Jul-2022
Biología molecular aplicada al diagnóstico médico
Curso
2021
Lic. Ezequiel Zubillaga ezubillaga@cibic.com.ar
Herramientas y tecnologías de la biología molecular, aplicadas al diagnóstico y al tratamiento en medicina.
Herramientas y tecnologías
¿ Por qué se han desarrollado tantas herramientas para realizar diagnósticos utilizando la biología molecular?
Eficacia + Eficiencia = Efectividad
• Eficacia: Todo aquello que nos sirve para cumplir el objetivo que se ha planificado.
• Eficiencia: Consiste en utilizar los recursos adecuadamente.
• Efectividad: Cumplir con los objetivos planteados utilizando la menor cantidad de recursos posibles.
¿ Cómo?
¿ Cómo?
¿ Cómo?
¡Entonces!...¿ Por qué se han desarrollado tantas herramientas para realizar diagnósticos utilizando la biología molecular?
Porque introducen un cambio positivo en la vida de los pacientes.
Tecnologías aplicadas al estudio de biomarcadores moleculares
1. Aspectos Pre-analíticos
2. Aspectos Técnicos:1. Extracción de Ácidos nucleicos2. PCR / RT-PCR / NESTED PCR3. Real time PCR4. Secuenciación Sanger5. NGS
3. Aspectos analíticos:1. Controles de calidad2. Validación técnica3. Validación clínica
4. Aspectos Post- analíticos:1. Modelo de informe2. Interpretación del resultado
1. Aspectos Pre-análiticos:
Entre un 40 % y un 70 % de los errores cometidos en un laboratorio clínico seoriginan en esta etapa.
Los errores que pueden generarse son de significancia distinta y su medidaes difícil ya que algunos de ellos se ponen de manifiesto en la fase analítica yotros no se evidenciarán.
Debe tenerse en cuenta que muchas veces, en la evolución de un pacienteo en el monitoreo de la eficacia terapéutica, son muestras irrepetibles, esdecir, que no pueden volver a tomarse.
En Biología Molecular, los
ácidos nucleicos son el analito.
(ADN – ARN)
Extracción manual de Ácidos Nucleicos:
Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación mediante un procedimiento químico son:
1.Lisis de las células.
2.Degradación de la fracción proteica asociada al ADN.
3.Purificación. Consta de 3 fases:
a. Precipitación.
a. Lavado del pellet
a. Recuperación.
Aspectos técnicos: Extracción de ácidos nucleicos.
1953
Extracción semi-automatizada de Ácidos Nucleicos:
El procedimiento puede realizarse por separación física con la ayuda de minicolumnas Equipadas con una membrana de sílica que retiene específicamente los ácidos nucleicos.
Kits comerciales: High Pure Template (Roche), Stool Mini Kit (Quiagen)
Aspectos técnicos: Extracción de ácidos nucleicos.
sistema de extracción basado en el uso de partículas magnéticas que permite el aislamiento rápido y automatizado de ácidos nucleicos.
El ácido nucleico obtenido es altamente puro y puede ser usado en múltiples aplicaciones, tales como PCR convencional o cuantitativa, secuenciación, análisis mediante arrays, etc.
Ej: MagNA Pure (Roche)
Extracción automatizada de Ácidos nucleicos:
Aspectos técnicos: Extracción de ácidos nucleicos.
Kary Mullis
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
Una PCR ideal debería ser altamente específica, sensible y de gran rendimiento.
Fases de la PCR
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
35 – 60 Ciclos
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
Amplicon = producto de la amplificación por Métodos Moleculares de un fragmento de ADN o ARN.
TAMAÑO: TEMPERATURA DE MELTING: SECUENCIA:
PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
1990 - 2003RT - PCR – Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa:
Se aumenta la sensibilidad y la especificidad de la PCR.
Nested PCR – Reacción en cadena de la polimerasa:
Electroforesis en gel de agarosa (PCR punto final) :
Fases de la PCR
Los procesos de amplificación y detecciónocurren desfasados.
PCR Multiplex punto final :
MIX A MIX B MIX C
1 2 3 4 P N M 1 2 3 4 P N M 1 2 3 4 P N
Real time PCR:
La real time PCR es cinética: Los procesos de amplificación y detección ocurren dentro del mismo vial cerrado.
Fases de la PCR
Existen dos métodos para la detección: 1- Métodos No Específicos.2- Métodos Específicos.
Real time PCR:
Los métodos no específicos se basan en el uso de moléculas intercalantes que tienen afinidad por el ADN de doble cadena y que al ser oxidados generan una señal fluorescente (SYBR).
PCR Multiplex Real Time No Especifico :
Real time PCR:
Los métodos específicos siguen el principio conocido como FRET para generar la señal. Utilizan sondas de secuencia conocida para realizar la detección.
Real time PCR: métodos específicos - TaqMan
PCR Multiplex Real Time Especifico :
Real time PCR: métodos específicos - Probes
Análisis de mutaciones y polimorfismos utilizando Curvas de Disociación:
1- Se realizan curvas de Fluorescencia vs. Temperatura luego de finalizada la reacción
2- De estas curvas se determina el Tm (temperatura de fusión de cada producto generado, que es directamente dependiente de la secuencia del mismo)
3- Tan solo la diferencia en una base entre dos secuencias genera una diferencia en la Tm, lo cual Nos permite diferenciarlos
¿Como se cuantifica en la PCR Tiempo Real?
A través de STD o por medio de un gen de expresión constitutiva.
Cuantificación Absoluta
vs
Cuantificación Relativa
Secuenciación por método enzimático:
El método de Sanger (1977) se basa en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con unaterminación específica.
Secuenciación por método enzimático automatizado:
Secuenciación en electroforesis capilar: En la actualidad la reacción de secuenciación se basa en una modificación de la PCR con dideoxinucleótidos marcados con fluoróforos y se resuelve mediante una electroforesis capilar.
Secuenciación:
Secuenciación NGS (Next Generation Sequencing):
Secuenciación NGS:
¿Para informar - liberar un resultado debemos conocer algo más?
Valorverdadero Variabilidad Biológica
Imprecisión analítica (CV%)
Resultado de la
muestra
VARIABILIDAD TOTAL /ERROR TOTAL
Bias Analítico(SESGO)
Variabilidad Pre-analítica
Debemos conocer la composición de un dato de Laboratorio…
Validación Técnica:
El control interno debe haber amplificado.
El control positivo debe haber amplificado. Su desempeño se debe ajustar a los parámetros establecidos.
El control negativo no debe presentar amplificación.
Validación Clínica:
En este punto vuelven a ser importantes los aspectos Pre-analíticos, la información aportada por el medico en la orden es fundamental para la validación clínica.
Es necesario conocer el estado fisiológico del paciente, sexo, edad, medicación y adherencia a la misma y el diagnostico. Además de útil contar con los test realizados sobre la misma muestra (ej: serología, citogenética, etc.).
El resultado obtenido debe concordar el estado del paciente al momento del realizar el estudio y para eso es necesario cruzar toda la información disponible.
En caso de no tener información previa se deben realizar test reflejos para confirmar la validez de nuestro resultado.
La validación clínica es el paso mas importante en la generación de resultados, ya que engloba los aspectos pre-analíticos y analíticos, establecer criterios y el uso de test reflejos para la misma es indispensable para conseguir buenas practicas en el laboratorio de análisis clínicos.
Modelo de informe:
El modelo de informe debe tener las siguientes características:
a.Test realizado:b.Tipo de muestra:c.Resultado:d.Observaciones:
Se debe dar información sobre el método utilizado para la obtención del resultado, y de ser necesario una aclaración de que los resultados obtenidos deben ser interpretados enfunción del estado fisiológico del paciente.
Ej: Tamizaje de HPV:
a.Tipo de muestra: (Hisopo, cepillo, semen)b.HPV 16: (Detectable / No Detectable)c.HPV 18: (Detectable / No Detectable)d.Otros genotipos de alto riesgo: (Detectable / No Detectable)e.Observaciones:
Interpretación del resultado:
Detección cualitativa del ADN del virus del papiloma humano.
El estudio es realizado por medio de la plataforma Cobas 4800 (Roche) – Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real.
Se amplifica la región L1 del genoma de HPV.
El ensayo detecta los siguientes genotipos (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 66)
Aclaración: “Otros genotipos de alto riesgo” implica la detección de uno o mas de lossiguientes genotipos 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 66.
Nota: Los resultados obtenidos en este estudio deben interpretarse en conjunto con la información clinico-ginecologica, histológica, anatomopatológica y colposcopica delpaciente.
¡Muchas gracias!
ezubillaga@cibic.com.ar