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UNIVERSIDAD DE CHILE Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas Departamento de Química Farmacológica y Toxicológica Laboratorio de Farmacoterapia Génica
DIFERENCIAS GENÉTICAS ENTRE RATAS ABSTEMIAS (UChA) Y BEBEDORAS DE ALCOHOL (UChB)
EN LOS GENES DE SIETE SUBUNIDADES DEL COMPLEJO I CODIFICADAS EN EL GENOMA MITOCONDRIAL
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE BIOQUÍMICO
GINEZ ANDRÉS GONZÁLEZ MARTÍNEZ
Patrocinante y Directora de Memoria Dra. Amalia Sapag Muñoz de la Peña
Santiago, Chile 2007
Esta memoria se realizó en el Laboratorio de Farmacoterapia Génica con fondos
provenientes del Proyecto FONDECYT 1050480 y, a la fecha (Agosto de 2007), ha
dado origen a las siguientes comunicaciones.
Sapag A, González-Martínez G, Encina L, Lobos-González L, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Four complex I proteins encoded in the mitochondrial genome are different in low drinker UChA and high drinker UChB rats” Panel 30th Annual Scientific Meeting of the Research Society on Alcoholism (RSA). Hyatt Regency Chicago, Chicago, Illinois, EE.UU. 7-12 de Julio, 2007 Alcoholism: Clinical and Experimental Research 31(6) Suppl.: 192A, 733 (2007)
González-Martínez G. “Beber o no beber alcohol: el poder de los genes” Oral XII Semana Nacional de la Ciencia y Tecnología. Colegio Teresiano Enrique de Ossó, Santiago, Chile. 5 de Octubre, 2006
Sapag A, González-Martínez G, Lobos-González L, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Maternal inheritance, mitochondrial complex I and alcohol consumption: differences between nondrinker (UChA) and drinker (UChB) rats in three mitochondrial genes” Panel 13th Congress of the International Society for Biomedical Research on Alcoholism (ISBRA). Wentworth Sydney, Sidney, Australia. 10-13 de Septiembre, 2006 Alcoholism: Clinical and Experimental Research 30(9) Suppl.: 155A, 810 (2006) González-Martínez G, Lobos-González L, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Herencia materna en alcoholismo: genes del complejo I mitocondrial. Diferencias entre ratas bebedoras de alcohol (UChB) y abstemias (UChA)” Oral XXIII Congreso de la Asociación Nacional de Estudiantes de Bioquímica (ANEB). Pontificia Universidad Católica de Valparaíso, Valparaíso, Chile. 2-4 de Agosto, 2006 Libro de resúmenes, página 31.
González-Martínez G, Lobos-González L, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Alcoholismo y herencia materna: diferencias en genes del complejo I mitocondrial entre ratas abstemias (UChA) y bebedoras de alcohol (UChB)” Panel XXVIII Reunión Anual de la Sociedad de Bioquímica y Biología Molecular de Chile. Centro de Convenciones Paso Pehuenches, Talca, Chile. 9-12 de Enero, 2006 Libro de resúmenes, página 43.
González-Martínez G, Sapag A, Quintanilla ME, Tampier L, Israel Y. “Búsqueda de factores genéticos mitocondriales que determinan aversión al alcohol: diferencias entre ratas UChA y UChB” Panel XLVIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Chile. Gran Hotel Pucón, Pucón, Chile. 13-16 de Octubre, 2005 Biological Research 38: R-88, 20 (2005)
“ El hecho de que tenga los pies en la tierra es sólo una casualidad ”
AGRADECIMIENTOS En primer lugar agradecer a mi madre y a mi hermano por la paciencia (que
probablemente yo no la hubiese tenido) y el apoyo durante toda la carrera, en especial,
durante el período de redacción de la tesis. También a mi padre, por su apoyo.
A mis profesores, en especial a mi directora de tesis Dra. Amalia Sapag, no sólo por su
gran dedicación y entrega en temas científicos sino también por sus consejos en el
ámbito profesional. Además, agradecer muy especialmente al director del laboratorio
Dr. Yedy Israel por su gran aporte a este trabajo. Gracias a ambos por la paciencia que
han tenido conmigo.
A mis compañeros de laboratorio, Gabriel, Gonzalo, Giuliana, Javier, Mario, Paula, y
Robel, por sus aportes en temas científicos, de diario vivir y por compartir momentos
recreacionales en el Santa Inés.
También, muy especialmente a mis compañeros y amigos de la generación que entró
el año 2000 a la carrera Bioquímica y a los que he ido conociendo durante el
transcurso de la tesis. Con todos ellos he compartido una etapa importante de mi vida y
que no se olvidará jamás.
Al final, pero no menos importante, a mis amigos del mundo exterior que hacen de
cable a tierra y ayudan a pensar en otras cosas. En especial a mi gran amigo del
colegio Jorge, a mis compañeros de baby-fútbol, y a los amigos de parranda.
ABREVIATURAS ALDH2: deshidrogenasa aldehídica mitocondrial DNA: ácido desoxirribonucleico EDTA: etilendiaminotetraacetato FAD: flavina adenina dinucleótido gDNA: ácido desoxirribonucleico genómico Km: constante de Michaelis-Menten mRNA: ácido ribonucleico mensajero NAD+: nicotinamida adenina dinucleótido nt: nucleótido pb: pares de bases PCR: reacción en cadena de la polimerasa RNA: ácido ribonucleico UV: ultravioleta
RESUMEN La predisposición al alcoholismo está en gran parte determinada por factores genéticos
que son difíciles de abordar en humanos, por lo que se han desarrollado en el mundo
líneas de ratas bebedoras y no bebedoras de alcohol para estudiar los factores
permisivos y protectores del alcoholismo. En Chile se encuentran la línea UChA
(Universidad de Chile, Abstemias) y la línea UChB (Universidad de Chile, Bebedoras)
que corresponden a ratas derivadas de la cepa Wistar. Las ratas UChA beben entre
0,1 y 1 g de etanol/kg/día, en cambio las ratas UChB beben entre 4 y 6 g/kg/día.
En la rata y el hombre la metabolización del etanol ocurre principalmente en el hígado,
donde la deshidrogenasa alcohólica (ADH) transforma el etanol en acetaldehído que es
transformado en acetato por la deshidrogenasa aldehídica mitocondrial (ALDH2). La
ADH y la ALDH2 utilizan NAD+ como cofactor en las reacciones de oxidación.
El linaje UChA se diferencia del linaje UChB en el gen Aldh2: el alelo Aldh22 se
encuentra exclusivamente en el linaje UChA y los alelos Aldh21 y Aldh23 se encuentran
en el linaje UChB, siendo el alelo Aldh23 exclusivo del linaje bebedor. Además, el linaje
UChA se diferencia del UChB en la capacidad de generación de NAD+ de las
mitocondrias: menor en las mitocondrias del linaje UChA que en las del linaje UChB.
En ratas, la variante ALDH23 es suficiente para generar un consumo elevado de
alcohol, independientemente de la mitocondria que posean. En cambio, la variante
ALDH22 es necesaria pero no suficiente para determinar un bajo consumo de alcohol,
fenotipo que sí se manifiesta cuando, además de la ALDH22, las ratas tienen
mitocondrias de menor capacidad de generar NAD+. Las diferencias en las
capacidades respiratorias mitocondriales se deben al complejo I (deshidrogenasa de
NADH) formado por 46 subunidades. Nueve de ellas son de herencia exclusivamente
materna, dos codificadas en el cromosoma X y siete en el genoma mitocondrial. En
esta memoria se estudiaron los genes mitocondriales que codifican subunidades del
complejo I de las ratas UChA y UChB con el propósito de identificar las bases
moleculares de las diferencias bioquímicas entre ambos linajes.
Se amplificaron, secuenciaron y analizaron, de cinco ratas UChA (Aldh22/Aldh22) y
cinco ratas UChB (Aldh23/Aldh23), siete genes mitocondriales que codifican sendas
subunidades del complejo I mitocondrial. No se encontró heteroplasmia puesto que hay
un sólo tipo de mitocondria por linaje, es decir, para cada gen, las cinco ratas UChA
son iguales entre sí y las cinco ratas UChB también son iguales entre sí.
Se encontró que las ratas UChA (no bebedoras) y UChB (bebedoras de alcohol) se
diferencian en los genes mitocondriales Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I.
No se encontraron diferencias nucleotídicas en el gen Nd4L. Los genes Nd1 y Nd3 sólo
tienen diferencias nucleotídicas silentes mientras que los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6
tienen además diferencias nucleotídicas conducentes a cambios aminoacídicos, por lo
que ambos linajes difieren en cuatro proteínas. Las subunidades ND2 se diferencian en
cuatro posiciones aminoacídicas, (UChA/UChB) posiciones 150 (Ser/Asn), 265
(Thr/Ala), 304 (Met/Thr) y una inserción de histidina en la posición 318 (His/---). Estas
variaciones aminoacídicas en la proteína ND2 determinan cambios estructurales que
se manifiestan de manera evidente en un modelo tridimensional y en el número de
segmentos de transmembrana: nueve en el linaje UChA y diez en el linaje UChB. Las
subunidades ND4 se diferencian en las posiciones 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu), las
subunidades ND5 se diferencian en la posición 37 (Val/Ile) y las subunidades ND6 en
la posición 139 (Val/Ile).
Siete de las catorce secuencias genéticas obtenidas en este trabajo son variantes
nuevas entre los roedores: los genes Nd1, Nd5 y Nd6 de ambos linajes y el gen Nd4
del linaje UChA. Las secuencias aminoacídicas deducidas de la subunidad ND5 de los
linajes UChA y UChB y la secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND4 del
linaje UChA corresponden a secuencias proteicas nuevas entre los roedores.
Concluyendo, los polimorfismos génicos aquí reportados en subunidades del
complejo I mitocondrial, en especial los responsables de variaciones aminoacídicas,
pueden establecer nuevos factores (permisivos o protectores) de herencia
exclusivamente materna que influyen en la capacidad mitocondrial de regenerar el
NAD+ y, por lo tanto, en el consumo de alcohol.
SUMMARY
“Genetic differences between alcohol nondrinker rats (UChA) and drinker rats (UChB) in the genes
for seven subunits of complex I encoded in the mitochondrial genome” The predisposition to alcoholism is determined mainly by genetic factors. Given the
complexity of unraveling these factors in humans several lines of alcohol drinker and
nondrinker rats have been bred around the world in order to study permissive and
protective factors in alcoholism. In Chile there are two Wistar derived lines of rats: the
UChA lineage (Universidad de Chile, Abstemious) and the UChB lineage (Universidad
de Chile, Bibulous). UChA rats drink between 0.1 and 1 g of ethanol/kg/day whereas
UChB rats drink between 4 and 6 g/kg/day.
In the rat and in man alcohol is metabolized mainly in the liver where alcohol
dehydrogenase (ADH) transforms ethanol into acetaldehyde which is then transformed
into acetate by mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2). Both ADH and ALDH2
use NAD+ as cofactor for the oxidation reactions.
The UChA and UChB lineages differ in the Aldh2 gene: the Aldh22 allele is found only in
the UChA line while alleles Aldh21 and Aldh23 are both common in the UChB line, the
latter being exclusively present in drinker rats. The UChA and UChB lineages also differ
in the capacity of their mitochondria to generate NAD+: the UChA line has a lower
capacity than the UChB line.
In rats, the ALDH23 variant determines a high alcohol consumption phenotype
independently of the type of mitochondria. In contrast, the ALDH22 variant is necessary,
but not sufficient, to determine a low alcohol consumption phenotype which develops
only when rats also carry mitochondria with a low capacity to generate NAD+. The
differences in the respiratory capacity of the mitochondria from both lineages has been
ascribed to complex I (NADH dehydrogenase), a macromolecular assembly of 46
subunits, nine of which are inherited exclusively through the maternal line; of these, two
are encoded in the X chromosome and seven in the mitochondrial genome. In this
work, the mitochondrial genes encoding complex I subunits from the UChA and UChB
rat lines were studied with the purpose of identifying the molecular basis for the
biochemical differences between both lineages.
The seven mitochondrial genes which encode subunits of mitochondrial complex I were
amplified from the genomic DNA of five UChA (Aldh22/Aldh22) rats and five UChB
(Aldh23/Aldh23) rats and were then sequenced and analysed. Heteroplasmy was not
apparent given that a single type of mitochondria for each lineage was found; the five
UChA rats were identical for each gene as were the five UChB rats amongst them.
It was found that the nondrinker UChA rats differ from the drinker UChB rats in six
mitochondrial genes of complex I, namely Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 and Nd6, while no
nucleotide differences were found in the Nd4L gene. There are only silent nucleotide
differences in the Nd1 and Nd3 genes whereas genes Nd2, Nd4, Nd5 and Nd6 have
both silent variations and nucleotide differences which lead to amino acid changes, thus
establishing that both lineages differ in four proteins. The ND2 subunits have four
variations found at positions (UChA/UChB) 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala), 304 (Met/Thr)
and 318 where a single amino acid insertion was detected (His/---). These amino acid
variations in the ND2 protein determine structural changes which are evident in a three
dimensional model and in the number of predicted transmembrane segments, nine in
the UChA protein and 10 in the UChB protein. The ND4 subunits differ in residues 23
(Thr/Ile) and 419 (Pro/Leu). The ND5 subunits differ only in residue 37 (Val/Ile) and the
ND6 subunits vary in residue 139 (Val/Ile).
Seven of the fourteen gene sequences obtained in this work are new variants for
rodents: the Nd1, Nd5 and Nd6 genes of both lineages and the Nd4 gene of the UChA
line. Likewise, the deduced amino acid sequences for the ND5 subunit of both lineages
and the ND4 subunit of the UChA line are new protein sequences amongst rodents.
Overall, the nucleotide polymorphisms reported herein for subunits of the mitochondrial
complex I, particularly those accounting for amino acid variations, may establish new
(permissive or protective) factors inherited through the maternal line that influence the
mitochondrial capacity to generate NAD+ and hence the alcohol drinking behavior.
1. INTRODUCCIÓN
Cerca de cinco millones de personas son consumidoras de alcohol en Chile según el
Sexto Estudio Nacional de Drogas en Población General de Chile realizado por el
Consejo Nacional para el Control de Estupefacientes (CONACE) en el año 2004. De la
población entre 12 y 64 años, uno de cada diez individuos presenta dependencia
alcohólica y serios trastornos en la vida familiar y social a causa del consumo excesivo
de bebidas alcohólicas que incluso puede llegar a un nivel de alcoholismo crónico
(CONACE, 2004).
Numerosos estudios demuestran que la predisposición al alcoholismo está en gran
parte determinada por factores genéticos (Radel y Goldman, 2001). A partir de
observaciones realizadas en gemelos y mellizos (Prescott y Kendler, 1999) se ha
determinado que el alcoholismo tiene una heredabilidad entre el 50 y el 60% y que la
predisposición a desarrollar alcoholismo es multigénica. El otro 40% está relacionado
con factores medioambientales que pueden predisponer o proteger contra el
alcoholismo. Así, la interacción de factores genéticos y medioambientales determina
qué tan protegida o expuesta está una persona al alcoholismo.
Debido a la gran complejidad que presenta el estudio de factores genéticos permisivos
y protectores en humanos, se han desarrollado modelos animales para el estudio del
alcoholismo. Entre ellos se encuentran líneas de ratas bebedoras y no bebedoras de
alcohol que han sido obtenidas en diversas partes del mundo. En Chile se encuentran
la línea UChA (Universidad de Chile, Abstemias) y la línea UChB (Universidad de
Chile, Bebedoras) que corresponden a ratas derivadas de la cepa Wistar. Estos
animales han sido obtenidos mediante cruzamientos dirigidos realizados durante más
de 50 años seleccionando las ratas según su consumo voluntario de bajas (UChA) y
altas (UChB) cantidades de alcohol (Mardones y Segovia-Riquelme, 1983; Quintanilla y
cols., 2006). Las ratas UChA beben entre 0,1 y 1 g/kg/día (g de alcohol por kg de peso
por día), en cambio las ratas UChB beben entre 4 y 6 g/kg/día (Quintanilla y cols.,
2006). Además, las ratas bebedoras de alcohol presentan fenómenos de tolerancia y
dependencia, por lo que constituyen buenos modelos para estudiar los determinantes
biológicos que predisponen al alcoholismo así como aquellos que son protectores.
Tanto en la rata como en el hombre la metabolización del etanol ocurre principalmente
en el hígado, donde la deshidrogenasa alcohólica (ADH), una enzima citosólica,
transforma el etanol en acetaldehído. Adicionalmente, otras dos enzimas son capaces
de realizar esta transformación: la citocromo P450 2E1 y la catalasa, pero en menor
grado que la transformación realizada por la ADH (Caballería, 2003). El acetaldehído,
metabolito aversivo que al acumularse genera efectos disfóricos asociados a una
ingesta alcohólica, es transformado en acetato por la deshidrogenasa aldehídica
mitocondrial (ALDH2). Tanto la ADH como la ALDH2 utilizan NAD+ como cofactor para
realizar las reacciones de oxidación.
En humanos existe una población que presenta deficiencias en la metabolización del
acetaldehído debido a una variante de la ALDH2: la población asiática oriental. Se ha
visto que entre 30 y 40% de esta población presenta una mutación puntual dominante
en el gen de la ALDH2 (alelo ALDH2∗2) que resulta en el cambio Glu487Lys,
produciendo una ALDH2 mitocondrial prácticamente sin actividad (Yoshida y cols.,
1984). Los individuos que tienen uno o ambos alelos de la ALDH2 mutados presentan
niveles de acetaldehído circulante entre 5 y 20 veces mayores que los de individuos
que poseen la versión silvestre de la ALDH2 (ALDH2∗1) (Peng y cols., 1999). Así, los
individuos heterocigotos para esta mutación están protegidos contra el alcoholismo
entre 66 y 95% y pueden beber sólo un tercio de lo que beben los individuos que no
portan la mutación. En cambio, los individuos homocigotos ALDH2∗2/ALDH2∗2 son
prácticamente abstemios (Tu e Israel, 1995).
En ratas también hay variantes alélicas de la ALDH2. En particular, al determinar las
propiedades cinéticas de la ALDH2 de las ratas desarrolladas en Chile se encontró que
las ratas UChA difieren de las ratas UChB en la actividad de esta enzima (ver más
abajo) y al estudiar el gen Aldh2 se encontraron tres variantes alélicas: Aldh21, Aldh22 y
Aldh23 (Sapag y cols., 2003). La variante Aldh22 se encuentra exclusivamente en las
ratas de bajo consumo de etanol (UChA) y los otros dos alelos (Aldh21 y Aldh23) se
encuentran en la línea de alto consumo de etanol (UChB), siendo el alelo Aldh23
exclusivo de ella. Estos alelos codifican proteínas que se diferencian sólo en dos
posiciones aminoacídicas (aminoácidos 67 y 479): el alelo Aldh21 tiene Gln67 y
Glu479, el alelo Aldh22 tiene Arg67 y Glu479 y el alelo Aldh23 tiene Arg67 y Lys479.
Además, estas tres proteínas se diferencian en su Km por el NAD+ de acuerdo a su
fenotipo de consumo de alcohol: la ALDH22 de las ratas UChA tiene una Km de 132 µM
y las enzimas asociadas a las ratas UChB (ALDH21 y ALDH23) tienen una Km de 43 y
41 µM respectivamente. En cambio, no se pudo establecer una relación entre el
fenotipo bebedor o abstemio y las diferentes Vmax (36, 27 y 28 nmol NADH/mg
proteína/min para las variantes ALDH21, ALDH22 y ALDH23 respectivamente) (Sapag y
cols., 2003) aunque sí hay una diferencia significativa entre el consumo de ratas UChB
homocigotas Aldh21/1 y el de ratas UChB homocigotas Aldh23/3, siendo menor el de
estas últimas (Quintanilla y cols., 2005a). De lo anterior se desprende que las variantes
de la ALDH2 deben sus diferencias entre linajes principalmente a su afinidad por el
cofactor NAD+, siendo la enzima ALDH2 de las ratas no bebedoras UChA menos
eficiente en la transformación de acetaldehído a acetato que la enzima ALDH2
proveniente de las ratas bebedoras UChB.
Si bien los cruzamientos selectivos permiten obtener animales con características
específicas de una condición, es posible que en ellos se seleccionen genes que no
necesariamente están relacionados con un determinado fenotipo debido a que se
encontraban en los individuos primordiales. Por ejemplo, es posible que los alelos
Aldh22 y Aldh23 de la ALDH2 se hayan encontrado en las parejas de ratas iniciales y
que estos alelos se hubieran segregado en los linajes no bebedor y bebedor de alcohol
por azar. Sin duda, el hecho de que sean alelos de un gen codificante de una enzima
del metabolismo del alcohol es muy sugerente pero para poner a prueba su efecto real,
se realizaron cruzamientos entre las líneas bebedora y no bebedora con el fin de
barajar los genomas y determinar si estos alelos de la ALDH2 (Aldh22 y Aldh23)
influyen en el fenotipo del consumo de alcohol al estar combinados con otros genes.
Se cruzaron entonces ratas hembras UChA (Aldh22/Aldh22) con ratas machos UChB
(Aldh23/Aldh23) y viceversa, empleando animales previamente fenotipificados según su
consumo de alcohol (Quintanilla y cols., 2005b) obteniéndose una F1 que tiene sólo
ratas hembras y machos heterocigotos para la ALDH2 (Aldh22/Aldh23). Luego se
cruzaron estas ratas entre ellas y se obtuvo una generación F2 que posee ratas
homocigotas (Aldh22/Aldh22 y Aldh23/Aldh23) y heterocigotas (Aldh22/Aldh23). Las ratas
se clasificaron en dos grupos según su origen materno: un grupo que provenía de ratas
F0 hembras UChA y otro grupo que provenía de ratas F0 hembras UChB. Además,
cada rata de la F2 se clasificó según la genotipificación del gen Aldh2 y su consumo de
alcohol. Se encontró que todas las ratas Aldh22/2 de la F2 bebían más alcohol que las
ratas UChA y que todas las ratas Aldh23/3 bebían menos que las UChB, ratificando que
son múltiples los genes que condicionan el beber alcohol. Además, las ratas de la F2
genotipificadas como Aldh23/3, independientemente del tipo de hembra F0 de la que
provenían (hembra bebedora o no bebedora), siempre tuvieron un elevado consumo de
alcohol. En cambio, de las ratas F2 genotipificadas como Aldh22/2, sólo las provenientes
de hembras de alto consumo de alcohol bebieron tanto como las ratas F2
genotipificadas como Aldh23/3, poniendo en evidencia un fenómeno de epistasis en el
cual la expresión de uno o varios genes, en este caso de herencia materna, anula el
fenotipo determinado por otro gen, el alelo Aldh22.
Considerando que i) la mitocondria es de herencia exclusivamente materna (Strachan y
Read, 1999), ii) en la cadena respiratoria mitocondrial se produce, entre otras cosas,
NAD+ a partir de NADH, y iii) el NAD+ es necesario como cofactor para las enzimas que
participan en el metabolismo del etanol (ADH y ALDH2) (Figura 1), se estudió la
capacidad de oxidación del NADH de las ratas F2 considerando su origen materno: de
hembras F0 bebedoras de alcohol (UChB) o de hembras F0 no bebedoras de alcohol
(UChA). En particular, se determinó la capacidad de las mitocondrias de ratas de la
generación F2 (descrita más arriba) de transportar electrones por los distintos
componentes de la cadena respiratoria mitocondrial, midiendo el consumo de oxígeno
en presencia de sustratos que aportan electrones en distintos puntos de la cadena, ya
sea como NADH o FADH2 (Quintanilla y cols., 2005b). No se encontraron diferencias
entre las ratas UChA y UChB de la F2 en la capacidad respiratoria de las mitocondrias
al agregar sustratos que aportan FADH2, en cambio, sí se encontraron diferencias en la
Figura 1. Metabolismo del alcohol y cadena respiratoria mitocondrial Arriba: reacción de transformación del alcohol en acetaldehído y acetato. Se indican las enzimas y los cofactores que participan. Abajo: cadena respiratoria mitocondrial. Se incluyen los cinco complejos y los cofactores accesorios (figura adaptada de Matthews y cols., 2003).
capacidad respiratoria mitocondrial cuando el sustrato aporta NADH, concluyendo que
las ratas que tienen mitocondrias provenientes de hembras de alto consumo de alcohol
tienen una mayor capacidad de regenerar el NAD+ que las ratas que tienen
mitocondrias que provienen de hembras de bajo consumo de etanol. Dichos estudios
indican que las mitocondrias de las dos líneas F0, UChA y UChB, son de distinto tipo, y
que hay diferencias funcionales en el complejo I de ambos linajes.
Los resultados de los cruzamientos sugieren que el origen del complejo I influye sobre
el consumo de alcohol, puesto que el fenotipo de bajo consumo, asociado al alelo
Aldh22, es revertido por la presencia del complejo I propio del linaje UChB proveniente
de una hembra de alto consumo de alcohol (Quintanilla y cols., 2005b). Este fenómeno
puede explicarse si el complejo I del linaje UChB es capaz de suministrar las
cantidades de NAD+ necesarias para que la ALDH2, aunque de alta Km (propia de las
ratas UChA), pueda transformar eficientemente el acetaldehído en acetato,
favoreciendo un mayor consumo de etanol. Entonces, un complejo I eficiente siempre
permite metabolizar el acetaldehído rápidamente (independientemente de la variante
de la ALDH2), en cambio, un complejo I deficiente en la generación de NAD+ se
manifiesta fenotípicamente sólo en presencia de la variante de Km alta de la ALDH2
(ALDH22) que contribuye a determinar un bajo consumo de etanol (Figura 2).
El complejo I mitocondrial de mamíferos está compuesto por alrededor de
46 subunidades polipeptídicas distintas, tiene una masa aproximada de 1 MDa y una
estructura conformada por dos partes: un brazo hidrofílico que se encuentra apuntando
hacia la matriz mitocondrial y un brazo hidrofóbico inserto en la membrana interna de la
mitocondria (Figura 3). El brazo hidrofílico es el responsable de sustraer los electrones
del NADH, para formar NAD+, y hacerlos pasar por los distintos transportadores que
posee el complejo I (grupo del mononucleótido de flavina y ocho centros de hierro-
azufre) hasta el aceptor lipídico ubiquinona (Lodish y cols., 1995). El brazo hidrofóbico
es el responsable de pasar los protones desde la matriz mitocondrial hacia el espacio
intermembrana, generando una gradiente de protones que lleva a la producción de
ATP mediante la acción de la ATPasa o complejo V.
Figura 2. Características bioquímicas y consumo de alcohol de ratas híbridas Se muestran las características del complejo I mitocondrial y de la ALDH2 de las ratas híbridas (homocigotas) estudiadas por Quintanilla y cols. (2005b); también se indica su consumo de alcohol. Las ratas híbridas son ratas de la F2 correspondiente al cruzamiento entre las líneas UChA (ratas no bebedoras de alcohol) y UChB (ratas bebedoras de alcohol).
Figura 3. Subunidades del complejo I de herencia materna Modelo del complejo I mitocondrial (adaptado de Yagi y cols., 2003) en el cual se muestra la ubicación de las nueve subunidades de herencia materna. La tabla indica la ubicación de los nueve genes, la estequiometría de las subunidades, su peso molecular y el número de segmentos de transmembrana. *Estequiometría, masa y número de segmentos de transmembrana determinados para las subunidades del complejo I bovino (Brandt, 2006 y Pocsfavi y cols., 2006).
En el brazo hidrofóbico es donde se ubican todas las subunidades del complejo I de
herencia materna que están codificadas en la mitocondria y en el cromosoma X,
además de otras subunidades.
De las 46 subunidades del complejo I, 39 se encuentran codificadas en el genoma
nuclear y siete en el genoma mitocondrial (ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6)
(Brandt, 2006). Los genes de dos de las subunidades codificadas en el núcleo, MWFE
(gen Ndufa1) (Zhuchenko y cols., 1996) y ESSS (gen Ndufb11) (Carroll y cols., 2002)
se encuentran en el cromosoma X y los genes de las otras 37 subunidades se
encuentran repartidos en los cromosomas autosómicos. El complejo I tiene, por lo
tanto, nueve subunidades que son de herencia materna, dos codificadas en el
cromosoma X y siete en el genoma mitocondrial.
Con el objeto de determinar las bases genéticas de las diferencias bioquímicas
descritas entre los complejos I de las ratas UChA y UChB, se amplificaron,
secuenciaron y analizaron los siete genes mitocondriales transmitidos por herencia
exclusivamente materna que codifican subunidades del complejo I de las ratas UChA y
UChB, y que corresponden a los genes Nd1, Nd2, Nd3, Nd4L, Nd4, Nd5 y Nd6.
HIPÓTESIS
Las ratas no bebedoras UChA y bebedoras de alcohol UChB, cuyas mitocondrias
difieren en la capacidad del complejo I de oxidar NADH a NAD+, tienen diferencias en
la secuencia de al menos uno de los siete genes mitocondriales codificantes de las
subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 del complejo I que son de
herencia exclusivamente materna y que pueden establecer la base molecular de
factores determinantes del consumo de alcohol.
Objetivo general
Identificar diferencias genéticas entre las ratas no bebedoras UChA y bebedoras de
alcohol UChB en las secuencias de los siete genes mitocondriales que codifican las
subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 del complejo I.
Objetivos específicos 1) Amplificar, de cinco ratas UChA homocigotas (Aldh22/2) y cinco ratas UChB
homocigotas (Aldh23/3), los siete genes mitocondriales que codifican las
subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 del complejo I.
2) Secuenciar, para cada una de las cinco ratas UChA y cinco ratas UChB, los
amplicones que contienen los siete genes mitocondriales del complejo I.
3) Analizar, de cinco ratas UChA y cinco ratas UChB, las secuencias de los siete
genes mitocondriales que codifican las subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4,
ND5 y ND6 del complejo I.
2. MATERIALES
2.1 Mitocondrias de hígado de rata Se utilizaron preparaciones de mitocondrias de hígado de una rata UChA y una rata
UChB obtenidas por María Elena Quintanilla y Lutske Tampier (Facultad de Medicina,
Universidad de Chile). Los animales corresponden a la rata UChA 866-4 de genotipo
Aldh22/2 y a la rata UChB 75S10-3 de genotipo Aldh23/3. De cada rata se tenían 3,6 mL
de suspensión mitocondrial obtenida de aproximadamente cinco gramos de hígado.
2.2 DNA genómico de rata Se trabajó con DNA genómico (gDNA) de hígado de rata disponible en el laboratorio
proveniente de cinco ratas UChA y cinco ratas UChB (Valle, 2003), específicamente de
las ratas A1 (80S11), A2 (80S14), A4 (80S15-7), A7 (81S16-2), A9 (81S5-6) y de las ratas B1
(71S7), B4 (71S12-4), B6 (72S8-9), B7 (72S8-10) y B8 (72S9-7). Estas diez ratas están
genotipificadas según el gen de la ALDH2 (Valle, 2003) y fenotipificadas según su
consumo de alcohol. Las ratas UChA son Aldh22/2 y tienen un consumo de alcohol
entre 0,1 y 0,5 g/kg de peso/día, en cambio las ratas UChB son Aldh23/3 y tienen un
consumo de alcohol entre 4 y 6 g/kg de peso/día.
2.3 Oligonucleótidos Se utilizaron 31 partidores para obtener y secuenciar los distintos amplicones que
contienen los genes del complejo I mitocondrial. Los partidores (Tabla 1) se diseñaron
en base a la secuencia mitocondrial de referencia para la rata Wistar (GenBank acceso
NC_001665.1) y a las lecturas obtenidas en las reacciones de secuenciación. Además,
se consideraron en el diseño su susceptibilidad de formar interacciones inter o intra
moleculares y su temperatura media de apareamiento (Tm, calculada mediante la
fórmula 4CG+2AT). Todos los partidores se sintetizaron en el Centro de Equipamiento
y Servicios de Apoyo Tecnológico (CESAT), Facultad de Medicina Norte, Universidad
de Chile.
Tabla 1. Partidores utilizados para la secuenciación y amplificación de los genes mitocondriales del complejo I Se indican las características de los oligonucleótidos: largo, posición en el genoma mitocondrial (según GenBank NC_001665.1), orientación (sentido > o antisentido <), secuencia y temperatura media de apareamiento (Tm, calculada en base a la fórmula 4CG+2AT). Los partidores están agrupados según el gen para el que fueron utilizados en secuenciación y ordenados según su cercanía al extremo 5’ del gen respectivo.
Gen Partidor Largo (nt) Posición >
< Secuencia (5’- 3’) Tm (°C)
TG-285 23 2673-2695 > GTA ATT GCG TAA GAC TTA AAA CC 64 TG-354 23 2918-2940 < AAT AGT GAT ATT GAG GTG GTT AG 62 TG-327 22 3335-3356 < CTG AGA CTA ATT CTG ATT CTC C 62
Nd-1
TG-286 24 3754-3727 < CCT AGA AAT AAG AGG ATT TAA AAC 64 TG-297 20 3852-3871 > CCC ATA CCC CGA AAA TGT TG 60 TG-355 21 4011-4031 < TTG TTG GCT AGA AGT GGG ATG 62 TG-340 22 4255-4276 > ATT CCC CTA CAC ATT GGA 60 TG-345 22 4458-4479 > AAT AAC AGC AAT CCT TCC ATA C 60
Nd-2
TG-298 22 4976-4955 < TGT TTT CTA AGG GCT TTG AAG G 62 TG-378 23 9343-9365 > GTT TCT ATC TAT TGA TGA GGA TC 62 TG-299 24 9377-9400 > GTA TAA ACA ATA CAA CTG ACT TCC 64 TG-379 22 9850-9871 < AGG AAA GCA GAT GTC ATT GTT G 62
Nd-3
TG-369 23 9885-9907 < CCT AGT AGA GAT AAT GTA AAG GC 64 Nd-4L TG-356 21 10218-10237 < GCT GTA GGA GGT GAC ATT GG 62
TG-301 24 10095-10118 > ATT TCA AAT ACT TAC GGA ACA GAC 64 TG-356 20 10218-10237 < GCT GTA GGA GGT GAC ATT GG 62 TG-346 23 10922-10943 < ATA ATG AGA GGA TGA TGA ATG G 60 TG-338 22 11275-11298 < GTT GCT ATA ACA ATG AAT AAC TCG 64
Nd-4
TG-302 25 11579-11555 < AAT TTG ATT TCC TGT TGT TAG ATT C 64 TG-303 22 11678-11689 > TAA TCC ATT GGT CTT AGG AAC C 62 TG-380 19 11844-11862 > TTC TCA TTC CTC CTT AGC C 56 TG-394 17 11846-11862 > GAG TAA GGA GGA ATC GG 52 TG-385 20 12121-12140 > CTA ACA ATC TAT TCC AAC TC 54 TG-381 20 12121-12140 < GAG TTG GAA TAG ATT GTT AG 54 TG-392 17 12302-12318 > CTC CTG AGA ACT CCA AC 52 TG-393 17 12366-12382 < GTG GCT GCA ATT AGT AG 50 TG-400 18 12768-12785 > CTC AAC GAT GAA CAA GAC 52 TG-304 22 13587-13608 < GCT ACT TGA ATG ATA GTG GTG G 64
Nd-5
TG-397 18 13597-13614 < AGT TGT GCT ACT TGA ATG 50 TG-305 25 13499-13475 < ACT ATA TTT CCT ATC ATT TCT ATC A 64
Nd-6 TG-306 25 14120-14096 > ATG TTT CTA TAG TTG AAT TAC AAC G 64
2.4 Soluciones para electroforesis Tampón TAE: Tris 40 mM, ácido acético 40 mM y EDTA 1 mM.
2.5 Enzima Se usó la DNA polimerasa Taq de Promega (Madison, WI, EE.UU.).
2.6 Reactivos y materiales generales Invitrogen Lifetechnologies (Carlsbad, CA, EE.UU.): agarosa ultra pura y DNAzol.
Merck (Darmstadt, Alemania): etanol absoluto (p.a.), ácido acético glacial (p.a).
Polaroid (St. Albans, Hertfordshire, Inglaterra): película 667.
Promega (Madison, WI, EE.UU.): sistema de purificación de DNA Wizard SV Gel and
PCR Clean-up System, marcador de peso molecular de 1 kb (1 kb ladder), marcador
de peso molecular de 100 pb (100 bp ladder), dATP, dCTP, dGTP y dTTP.
Sigma (St. Louis, MO, EE.UU.): Trizma base, acetato de sodio anhidro, azul de
bromofenol, bromuro de etidio, EDTA (sal sódica dihidratada).
Se usó agua destilada, desionizada en el laboratorio con un purificador Barnstead
NANOpure Infinity D8982 (18MΩ-cm) (Dubuque, IA, EE.UU.).
3. MÉTODOS
3.1 Extracción de DNA mitocondrial Se extrajo DNA mitocondrial del hígado de ratas UChA y UChB a partir de mitocondrias
correspondientes a 1,7 g de tejido contenidas en 1,2 mL de suspensión para cada
linaje (ver Materiales). Primero se concentraron las mitocondrias mediante
centrifugación a 15.777 x g (14.000 rpm) en una microfuga Eppendorf 5415C
(Hamburgo, Alemania) durante tres minutos a temperatura ambiente, se desechó el
sobrenadante y se resuspendieron las mitocondrias en 200 µL de agua. Se agregaron
200 µL de DNAzol y luego 1 mL de etanol 100%, mezclando mediante inversión
después de agregar cada uno de los reactivos; la mezcla se dejó un minuto a
temperatura ambiente. Se centrifugó a 4000 x g (7.000 rpm) durante dos minutos a
temperatura ambiente y se realizaron dos lavados con 1 mL de etanol 75%
centrifugando a 7.500 x g (~ 10.000 rpm); el DNA se secó al vacío durante cinco
minutos y se resuspendió en 200 µL de agua. El rendimiento se estimó en 33 ng de
DNA mitocondrial por cada 100 mg de hígado, determinado mediante cuantificación en
gel de agarosa y bromuro de etidio.
3.2 Amplificación de genes que codifican subunidades del complejo I a partir de DNA mitocondrial Se realizaron reacciones de PCR utilizando cantidades variables de molde, desde
0,35 pg (20.000 copias del genoma mitocondrial de rata de 16 kb) hasta 6 ng de DNA
mitocondrial, y las parejas de partidores correspondientes a los cinco amplicones que
contienen los siete genes mitocondriales, tanto para una rata UChA como para una
rata UChB. En las mezclas de reacción, además del DNA mitocondrial y las parejas de
partidores específicos (2 pmol/µL) (ver Tabla 2), se incluyeron MgCl2 1,6 a 2,4 mM, 2 U
de DNA polimerasa Taq en Tris-HCl 10 mM pH 9,0 (25°C), KCl 50 mM y Tritón X-100
0,1%, en un volumen final de 50 µL. Las mezclas de reacción se sometieron a una
etapa de desnaturación a 94°C durante 3 minutos y luego a 35 ciclos de amplificación;
la etapa de desnaturación se realizó a 94°C durante 1 minuto, la de apareamiento entre
60 y 64°C durante 2 minutos y la de polimerización a 72°C durante 2 minutos.
Finalmente, se realizó una etapa de elongación a 72°C durante 10 minutos. Se usó un
termociclador MJ Research Inc. modelo PTC 100 (Watertown, MA, EE.UU.). Los
productos, que corresponden a amplicones cuyos tamaños van desde 600 pb hasta
2400 pb (ver Tabla 2) se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa al
1% y bromuro de etidio (12 µg/mL) en tampón TAE y exposición a luz UV de 302 nm en
un transiluminador UVP TM20 (Upland, CA, EE.UU.). Para la electroforesis, se
utilizaron cámaras horizontales CBS Scientific (Del Mar, CA, EE.UU.) y dos fuentes de
poder, modelos VWR EC105 (Holbrook, NY, EE.UU.) y Bio-Rad PowerPac2000
(Hercules, CA, EE.UU.).
Tabla 2. Resumen de amplicones y condiciones utilizadas para la amplificación de genes mitocondriales del complejo I
Se indican los siete genes mitocondriales estudiados, así como los partidores con los que se obtuvieron, y el tamaño de los amplicones que los contienen. Además, se indican las principales condiciones de amplificación utilizadas: las temperaturas de apareamiento y las concentraciones de MgCl2. Se incluye el método para la purificación de amplicones.
Genes Partidores
(>) (<) Amplicón
(pb) T°
(°C) [MgCl2]
mM Método de
Purificación
Nd1 TG-285 TG-286 1082 60 2,0 Precipitación
Nd2 TG-297 TG-298 1125 60 2,0 Precipitación
Nd3-Nd4L TG-378 TG-356 897 62 2,0 Cortar banda de gel
Nd4 TG-301 TG-302 1475 60 2,0 Precipitación
Nd5-Nd6 TG-303 TG-306 2443 62 2,4 Cortar banda de gel
T°, se refiere a la temperatura de apareamiento utilizada en esa reacción de PCR
3.3 Amplificación de genes que codifican subunidades del complejo I a partir de DNA genómico Se realizaron reacciones de PCR utilizando 100 ng de gDNA como molde y las parejas
de partidores correspondientes a los seis amplicones que contienen los siete genes
mitocondriales (ver Tabla 2). Se amplificó el DNA de cinco ratas UChA y cinco ratas
UChB. En las mezclas de reacción se incluyeron, además del gDNA y las parejas de
partidores específicos (2 pmol/µL), MgCl2 1,6-2,4 mM, 2 U de DNA polimerasa Taq en
Tris-HCl 10 mM pH 9,0 (25°C), KCl 50 mM y Tritón X-100 0,1%, en un volumen final de
50 µL. Las mezclas de reacción se sometieron a un programa de termociclado similar
al empleado para amplificar DNA mitocondrial, pero acortando los tiempos de
desnaturación, apareamiento y polimeración de los ciclos de amplificación.
Desnaturación a 94°C durante 3 minutos y luego 35 ciclos de amplificación; la etapa de
desnaturación se realizó a 94°C durante 30 segundos, la de apareamiento entre 60 y
64°C durante 90 segundos y la de polimerización a 72°C durante 90 segundos.
Finalmente, se realizó una etapa de elongación a 72°C durante 10 minutos. Los
productos obtenidos se sometieron a electroforesis en geles de agarosa y bromuro de
etidio y se visualizaron por exposición a luz ultravioleta. En total se obtuvieron 50
amplicones: cinco para cada una de las diez ratas.
3.4 Purificación de amplicones Una vez obtenida la masa necesaria del amplicón para secuenciar, típicamente
alrededor de 200 ng, se purificaron los amplicones por dos métodos. La elección del
método dependió básicamente de los requisitos del servicio de secuenciación y de los
problemas en las reacciones de secuenciación (ver Resultados). Un método
corresponde a la precipitación con 0,1 volumen de acetato de sodio 3 M y 2 volúmenes
de etanol 100%, a temperatura ambiente. El otro, corresponde a la purificación del
amplicón mediante el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-up System a partir de la
banda del amplicón cortada del gel de agarosa o directamente a partir de la PCR a
temperatura ambiente. Posteriormente, el DNA precipitado se resuspendió en agua y
se cuantificó mediante visualización en geles de agarosa y bromuro de etidio.
3.5 Secuenciación Los amplicones se enviaron al servicio de secuenciación del Centro de Equipamiento y
Servicios de Apoyo Tecnológico (CESAT) de la Facultad de Medicina Norte de la
Universidad de Chile, al servicio de secuenciación del Departamento de Ecología de la
Pontificia Universidad Católica de Chile (PUC) o a la división en EE.UU. de Macrogen;
todos estos servicios utilizan el sistema de secuenciación por fluorescencia. El servicio
del CESAT utiliza un secuenciador ABI PRISM 377 (electroforesis en gel vertical) y el
sistema de marcación Dyenamic ET Terminator Cycle Sequencing Kit de Amersham
Biosciences (Little Chalfort, BU, Inglaterra), en cambio el servicio de la PUC utiliza un
secuenciador ABI PRISM 3100 (electroforesis capilar) y el sistema de marcación
BigDye Terminator v3.1 de Applied Biosystems (Foster City, CA, EE.UU.). En cuanto a
Macrogen, sólo se tiene información acerca de los equipos que utilizan que son los
secuenciadores ABI3730XL y ABI3700, que también corresponden a equipos que
emplean electroforesis capilar.
3.6 Análisis de secuencias Las secuencias obtenidas para cada gen se compararon entre ellas y con la secuencia
de referencia del genoma mitocondrial de la rata Wistar (acceso GenBank
NC_001665.1). Las comparaciones se realizaron manualmente y mediante el uso de
alineamientos simples y múltiples con los programas BLAST (basic local aligment
search tool) (variante BLAST two sequences, Altschul y cols., 1990) y ClustalW
(Thompson y cols., 1994) respectivamente. En ambos casos se utilizaron los
parámetros de comparación definidos por defecto. Los cambios nucleotídicos que
conducen a cambios aminoacídicos se analizaron considerando el código genético
alternativo de la mitocondria de mamífero (Osawa y cols.,1992), que además se
encuentra disponible en el sitio del National Center for Biotechnology Information
(NCBI) en Internet.
Además, se realizaron comparaciones utilizando las variantes blastn y blastx (Altschul
y cols., 1997) del programa BLAST para determinar cuáles de las secuencias
nucleotídicas o proteicas deducidas, de ambos linajes, corresponden a secuencias
nuevas que no han sido descritas en las bases de datos de GenBank. Se restringió en
ambos casos el universo de secuencias analizadas sólo a roedores entre las que se
encuentran las secuencias de rata y de ratón. La variante blastn hace una búsqueda
entre las secuencias nucleotídicas descritas para los roedores, en cambio, blastx
primero traduce la secuencia nucleotídica de interés a aminoacídica y luego la compara
con las proteínas descritas en la base de datos.
3.7 Predicción de la estructura tridimensional de la subunidad ND2 Se utilizó el programa Rosetta para predecir la estructura terciaria de la proteína ND2.
Este programa, que funciona en el servidor Robetta (Kim y cols., 2004) de la University
of Washington (Seattle, WA, EE.UU.), elabora estructuras tridimensionales de
proteínas a partir de secuencias aminoacídicas lineales sin la necesidad de disponer
de estructuras cristalográficas homólogas.
3.8 Predicción de segmentos de transmembrana de la subunidad ND2 Se utilizó el programa TMHMM 2.0 (Krogh y cols., 2001), para determinar cuáles de los
aminoácidos que están formando hélices alfa pueden estar formando segmentos de
transmembrana. Dicho programa predice qué hélices atraviesan la membrana y su
orientación en ella, definiendo así en qué lado de la misma se ubican los segmentos
conectores.
4. RESULTADOS
Con el objeto de encontrar diferencias genéticas en los genes de las siete subunidades
del complejo I de herencia exclusivamente materna que pudieran explicar las
diferencias bioquímicas del complejo I entre las ratas UChA y UChB descritas por
Quintanilla y cols. (2005) se amplificaron mediante PCR los siete genes codificados en
la mitocondria (Figura 4) a partir de cinco ratas de cada linaje y se secuenciaron.
El análisis de las secuencias reveló que cada uno de los siete genes es igual en las
cinco ratas de cada linaje, indicando que las secuencias encontradas son
representativas de las ratas UChA y de las ratas UChB. Se encontraron diferencias
nucleotídicas entre ambos linajes en seis de los siete genes (Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5
y Nd6) estudiados. Cuatro de ellos (Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6), determinan además
diferencias aminoacídicas entre ambos linajes, es decir, codifican proteínas distintas.
Hay dos genes que tienen diferencias nucleotídicas silentes (Nd1 y Nd3) y un gen
(Nd4L) que tiene la misma secuencia nucleotídica en ambos linajes.
4.1 Amplificación de genes mitocondriales
4.1.1 Amplificación a partir de mitocondrias En un principio se trabajó con DNA mitocondrial obtenido a partir de mitocondrias de
una rata UChA y una rata UChB. Sin embargo, los rendimientos de los amplicones que
contienen los genes mitocondriales siempre fueron pequeños a pesar de probar
diversas condiciones de magnesio y temperatura en la PCR, así como distintas
concentraciones de molde. En contraste, al trabajar en paralelo con el DNA genómico,
se obtuvieron buenos resultados de amplificación, por lo que no se continuó trabajando
con el DNA mitocondrial (mtDNA).
4.1.2 Amplificación a partir de DNA genómico Se obtuvieron cinco amplicones para cada rata, un amplicón para cada uno de los
genes Nd1, Nd2 y Nd4 y dos que contienen dos genes cada uno, Nd3-Nd4L y Nd5-Nd6
(Figura 5) (ver Tabla 2 en Métodos para detalles de los amplicones).
Figura 4. Representación del genoma mitocondrial de mamíferos Arriba: esquema del genoma mitocondrial completo; se indican los genes que lo conforman. En color se destacan los genes del complejo I que se secuenciaron en esta memoria (figura adaptada de Ruiz-Pesini y cols., 2007). Abajo: representación detallada del contexto de los genes del complejo I. Las flechas indican la orientación de los genes del complejo I así como el sobrelapamiento entre ellos. En achurado se indican las zonas en las que hay sobrelapamiento de dos genes.
Figura 5. Partidores utilizados para amplificar y secuenciar los siete genes del complejo I mitocondrial Se muestran los amplicones (barra gris oscura) y sobre ellos, la ubicación relativa de los partidores utilizados para la amplificación y secuenciación de los genes mitocondriales. La barra negra muestra el segmento del amplicón secuenciado, que incluye el gen de interés más secuencias adyacentes, las barras grises claras indican los límites del gen respectivo. Las zonas grises oscuras corresponden a zonas que no han sido secuenciadas. Los partidores con números en gris no dieron reacciones productivas de secuenciación. Las zonas de sobrelapamiento entre los genes Nd4L y Nd4 y entre los genes Nd5 y Nd6 están indicadas como dos segmentos, uno arriba del otro. Se muestra, a la derecha de los amplicones, su tamaño en pares de bases (pb).
Se realizaron barridos de concentración de magnesio y temperatura de apareamiento,
obteniéndose la mayoría de los amplicones en un rango de temperatura de 60 a 64°C y
entre 2,0 y 2,4 mM de magnesio, es decir, en condiciones no muy estrictas. Además,
los partidores para la amplificación se diseñaron largos y de Tm alta (ver Tabla 1), con
el objeto de darles suficiente especificidad a temperaturas elevadas, requeridas al usar
como molde el DNA total de la rata que contiene DNA mitocondrial y nuclear. Los
amplicones en general se obtuvieron sin productos secundarios y en mayor cuantía
que los obtenidos a partir de mtDNA al visualizarlos por tinción con bromuro de etidio
en geles de agarosa. Todos los genes se amplificaron a partir de gDNA, puesto que se
obtiene mayor cantidad de amplicón y porque se evita la preparación de mitocondrias.
Se realizaron entre tres y cinco reacciones de PCR para cada amplicón con el objeto
de obtener la masa suficiente para secuenciar. Si bien un volumen total de 50 µL
resultó, en general, en reacciones productivas, el amplicón de Nd5-Nd6 (2447 pb) sólo
se obtuvo a un volumen de 25 µL de reacción de PCR, por lo que en este caso fue
necesario realizar cinco reacciones de PCR para cada rata.
4.2 Secuenciación
4.2.1 Secuenciación de amplicones, aspectos generales Los partidores para la amplificación y secuenciación de los genes mitocondriales se
diseñaron pensando en la unión a secuencias que se ubican entre 20 y 45 nucleótidos
del comienzo o fin del gen de interés (Figura 5) dado que los primeros nucleótidos
incorporados durante la reacción de secuenciación están enmascarados por la gran
intensidad de la señal y no pueden ser identificados en el electroforetograma. La
extensión de esta región, que se conoce como “zona ciega”, depende del servicio de
secuenciación y, en definitiva, de la reacción en particular. El margen considerado para
la zona ciega fue insuficiente en varios casos, lo que impedía ver el comienzo o fin de
algunos genes (10 o 20 nucleótidos del extremo 5’ o 3’). En esos casos se sintetizaron
otros partidores en sentido contrario a la zona de interés para poder secuenciarla, por
lo que es recomendable considerar, si es que la situación lo permite, un segmento
holgado de nucleótidos, entre 40 y 50 nt, antes del comienzo o fin del gen de interés.
4.2.2 Secuenciación de amplicones, aspectos particulares En un principio, se logró obtener la mayor parte de la secuencia de los amplicones
correspondientes a los genes Nd1, Nd2 y Nd4 en el servicio de secuenciación del
CESAT sólo purificándolos por precipitación con acetato de sodio y etanol, teniendo la
consideración de diluir la reacción de PCR antes de precipitar, con el objeto de evitar la
coprecipitación de los partidores junto con el amplicón (ver Métodos). En cambio, el
amplicón de los genes Nd3-Nd4L dio repetidamente electroforetogramas con mucha
señal de fondo que no permitía la identificación de los nucleótidos, en especial el
segmento del gen Nd3, ya que el gen Nd4L se secuenció fácilmente. Este fenómeno se
repitió en ambos servicios nacionales (CESAT y PUC), aun cuando se probaron dos
formas distintas de purificación (precipitación y purificación directa por el sistema
Wizard SV Gel and PCR Clean-up System, ver Métodos), hasta que finalmente se
cortó la banda del amplicón de un gel preparativo de agarosa y se purificó luego
mediante cromatografía empleando el sistema Wizard SV Gel and PCR Clean-up
System. Se utilizó este último procedimiento puesto que la purificación directa de los
amplicones con el sistema comercial no logró eliminar del todo los partidores,
observándose, en geles analíticos de agarosa, bandas de intensidad importante
correspondientes a los partidores remanentes no utilizados en la reacción de PCR.
Estos partidores, ya sea uno o los dos de la reacción de PCR, también participan en
las reacciones de PCR del procedimiento de secuenciación, sustentando reacciones
paralelas que compiten con la de interés. Al extraer el amplicón del gel de agarosa, se
eliminó este efecto de los partidores remanentes lo que permitió mejores reacciones de
secuenciación. Sin embargo, en otros casos esto no fue suficiente y fue necesario
sintetizar nuevos partidores para los genes Nd3 y Nd5. Finalmente, los problemas que
surgieron con los genes Nd3 y Nd5 se resolvieron purificando los amplicones, mediante
electroforesis y cromatografía, y secuenciándolos en el servicio de Macrogen.
En general, las secuencias obtenidas en Macrogen (EE.UU.) fueron limpias y largas
(entre 400 y 600 nt), mayores que las obtenidas en cualquiera de los servicios
nacionales (200-500 nt). Además, el gen Nd6, que se encuentra en el mismo amplicón
que el gen Nd5, se secuenció sin problemas en Macrogen. La diferencia principal entre
los requisitos de los servicios nacionales y los de Macrogen es la cantidad de molde:
entre 100 y 300 ng (a una concentración entre 20 y 30 ng/µL) versus 500 ng (a
50 ng/µL) respectivamente.
4.3 Análisis de secuencias
4.3.1 Comparación del gen Nd1 entre ratas UChA y UChB Se encontraron siete diferencias nucleotídicas silentes entre las ratas UChA y UChB en
el gen Nd1 (Tabla 3). Estas diferencias se encuentran distribuidas casi uniformemente
a lo largo del gen (957 pb). Además, todas las diferencias son transiciones
pirimidínicas (C/T) (Figura 6) que corresponden a los cambios más comunes entre
nucleótidos debido a la desaminación de citosinas metiladas (Strachan y Read, 1999).
4.3.2 Comparación del gen Nd2 entre ratas UChA y UChB Se encontraron siete diferencias nucleotídicas entre las ratas UChA y UChB en el gen
Nd2. Una de ellas corresponde a una inserción de tres nucleótidos en las ratas UChA
(codón CCA entre las posiciones 4842 y 4843). Esta inserción lleva a la incorporación
de una histidina en la proteína después del aminoácido 317, lo cual quiere decir que la
subunidad ND2 de las ratas UChA tiene 346 aminoácidos, uno más que la de las ratas
UChB. De los seis cambios nucleotídicos restantes, hay tres que conducen a cambios
aminoacídicos entre ambos linajes (Tabla 3 y Figura 6). Éstos son en las posiciones
4340 (G/A), 4684 (A/G) y 4802 (T/C) (UChA/UChB), y llevan a cambios en los
aminoácidos 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala) y en la posición 304 (Met/Thr)
respectivamente (Figura 7). Dadas las características de los cambios aminoacídicos,
ninguno debiera representar alteraciones muy importantes en la estructura general de
la proteína.
4.3.3 Comparación del gen Nd3 entre las ratas UChA y UChB En el gen Nd3 se encontraron sólo diferencias nucleotídicas silentes, tres en total, y
todas corresponden a transiciones pirimidínicas. Las posiciones son 9519 (T/C), 9654
(C/T) y 9687 (T/C) (UChA/UChB) (Tabla 3 y Figura 6). Ambas proteínas son iguales.
Tabla 3. Variaciones polimórficas en seis de los siete genes mitocondriales del complejo I En la tabla de cada gen se indican las posiciones de cambio en el DNA mitocondrial (según GenBank acceso NC_001665.1) así como la identidad de los nucleótidos, los codones y los aminoácidos respectivos. En negrita, variaciones polimórficas conducentes a cambios aminoacídicos.
Gen Nd-1 (2729-3685) Nucleótido Codón Aminoácido Posición
variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 2825 C T CTA TTA Leu Leu 33 2917 C T CCC CCT Pro Pro 63 2944 C T ATC ATT Ile Ile 72 3367 T C GTT GTC Val Val 213 3418 T C AAT AAC Asn Asn 230 3424 C T ATC ATT Ile Ile 232 3433 T C AAT AAC Asn Asn 235
Gen Nd-2 (3892-4929) Nucleótido Codón Aminoácido Posición
variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 4340 G A AGC AAC Ser Asn 150 4434 T C TAT TAC Tyr Tyr 181 4542 C T ATC ATT Ile Ile 217 4684 A G ACA GCA Thr Ala 265 4773 A T ACA ACT Thr Thr 294 4802 T C ATA ACA Met Thr 304 ins
4842-4843 CAC ------ CAC-CAC
CAC-CAA His ------ 318
Gen Nd-3 (9436-9783) Nucleótido Codón Aminoácido Posición
variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 9519 T C AAT AAC Asn Asn 28 9654 C T CTC CTT Leu Leu 73 9687 T C ACT ACC Thr Thr 84
Tabla 3 (continuación).
Gen Nd-4 (10145-11522) Nucleótido Codón Aminoácido Posición
variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 10212 C T ACC ATC Thr Ile 23 10357 G A TGG TGA Trp Trp 71 10681 C T CTC CTT Leu Leu 179 10807 G A GTG GTA Val Val 221 11113 C A TCC TCA Ser Ser 323 11155 C T ATC ATT Ile Ile 337 11179 C T GCC GCT Ala Ala 345 11374 A G ATA ATG Met Met 410 11400 C T CCA CTA Pro Leu 419
Gen Nd-5 (11721-13555) Nucleótido Codón Aminoácido Posición
variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 11783 T C TTT TTC Phe Phe 21 11816 T C TTT TTC Phe Phe 32 11829 G A GTT ATT Val Ile 37 11903 T C TAT TAC Tyr Tyr 61 12053 T C GAT GAC Asp Asp 111 12257 T C GAT GAC Asp Asp 179 12335 T C AAT AAC Asn Asn 205 12456 T C TTA CTA Leu Leu 246 12482 A G GTA GTG Val Val 254 12563 C T GGC GGT Gly Gly 281 12623 T C ATT ATC Ile Ile 301 12806 G A ATG ATA Met Met 362 13466 G A GGG GGA Gly Gly 582
Gen Nd-6 (13531-14049) Nucleótido Codón Aminoácido Posición
variable UChA UChB UChA UChB UChA UChB Nº 13635 G A GTT ATT Val Ile 139 13681 G A TGG TGA Trp Trp 123
Figura 6. Variaciones nucleotídicas en los genes Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I mitocondrial en las ratas UChA y UChB Se indican las posiciones variables numeradas según GenBank NC_001665.1 y las identidades en ambos linajes (UChA/UChB). Arriba (rectángulo gris): genes que sólo tienen variaciones silentes. Abajo: genes que tienen variaciones nucleotídicas conducentes a cambios aminoacídicos resaltadas en gris oscuro.
Figura 7. Variaciones aminoacídicas en las subunidades ND2, ND4, ND5 y ND6 del complejo I mitocondrial de las ratas UChA y UChB Se indican las posiciones aminoacídicas variables deducidas a partir de los genes respectivos.
4.3.4 Comparación del gen Nd4L entre las ratas UChA y UChB El gen Nd4L, el más pequeño de los siete (297 pb), no tiene diferencias nucleotídicas
entre las ratas y por lo tanto las proteínas de ambos linajes son iguales.
4.3.5 Comparación del gen Nd4 entre ratas UChA y UChB El gen Nd4 tiene un tamaño de 1378 pb, es uno de los más grandes, y el análisis de su
secuencia arrojó que hay nueve diferencias nucleotídicas entre las ratas UChA y
UChB. Entre éstas hay transiciones pirimidínicas así como transversiones. Hay dos
diferencias nucleotídicas que conducen a sendos cambios aminoacídicos. Los
nucleótidos 10212 (C/T) y 11400 (C/T) (UChA/UChB) determinan variaciones en los
aminoácidos 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu) respectivamente (Tabla 3, Figuras 6 y 7). Esta
última variación es la que más llama la atención debido a los efectos que puede
provocar la prolina en la estructura secundaria de una proteína.
4.3.6 Comparación del gen Nd5 entre ratas UChA y UChB El gen Nd5 es el más grande de los siete analizados, tiene un tamaño de 1830 pb y
requirió el uso de diez partidores para su secuenciación. Se encontraron 13 diferencias
nucleotídicas, que corresponden al mayor número de diferencias entre las ratas UChA
y UChB (Tabla 3, Figura 6). De estas trece diferencias hay sólo una, situada en el
nucleótido 11829 (G/A) (UChA/UChB), que conduce a un cambio aminoacídico de tipo
conservado en la posición 37 (Val/Ile), siendo ambos aminoácidos de naturaleza
hidrofóbica.
4.3.7 Comparación del gen Nd6 entre ratas UChA y UChB El gen Nd6 se encuentra codificado en sentido inverso a los seis restantes en el
genoma mitocondrial (Figura 4). En él se encontraron tres diferencias nucleotídicas
entre los linajes (Figura 6), sólo una de las cuales, aquella detectada en el nucleótido
13635 (G/A) (UChA/UChB), conduce a un cambio aminoacídico en la posición
139 (Val/Ile), igual al cambio encontrado en el gen Nd5 (Tabla 3 y Figura 7).
4.4 Análisis estructural in silico de la proteína ND2 Se obtuvieron las estructuras tridimensionales de la subunidad ND2 de los linajes
UChA y UChB, y está en curso la determinación de las estructuras tridimensionales
correspondientes a las otras subunidades que también tienen diferencias
aminoacídicas entre ambos linajes (ND4, ND5 y ND6). Para ello se utilizó el programa
Rosetta, que genera estructuras tridimensionales a partir de una secuencia lineal
aminoacídica sin tener estructuras tridimensionales homólogas a la proteína en
cuestión. Este programa funciona en un servidor de la University of Washington
(Seattle, WA, EE.UU.) llamado Robetta (Kim y cols., 2004).
La predicción de la estructura tridimensional de la proteína ND2 de ambos linajes,
UChA y UChB, reveló diferencias estructurales evidentes entre ambas proteínas al
comparar las estructuras en diversos ángulos de rotación y empleando los aminoácidos
de interés como puntos de referencia (Figura 8). Al observar la distancia relativa entre
el aminoácido de la posición 150 y el de la posición 265, es evidente que éstos se
encuentran más separados en la subunidad ND2 del linaje UChA que en la del linaje
UChB. Estas diferencias de separación concuerdan con otras predicciones
estructurales.
Una de las limitaciones del programa Rosetta es que no determina qué segmentos son
de transmembrana, así es que se utilizó el programa TMHMM 2.0 (Krogh y cols., 2001)
para predecir qué aminoácidos estarán en los segmentos de transmembrana y cuáles
no, lo que permite determinar si los elementos conectores se encuentran orientados
hacia la matriz mitocondrial o hacia el espacio intermembrana. La predicción arrojó que
la subunidad ND2 del linaje UChA posee nueve segmentos de transmembrana, en
comparación con los diez que posee la subunidad del linaje UChB (Figura 9). Debido a
ello, y concordando con las diferencias estructurales sugeridas por la predicción de la
estructura tridimensional, el aminoácido 265 y los aminoácidos 304 y 318 se ubican en
lados opuestos de la membrana al comparar ambos linajes: en el linaje UChA la
treonina 265 está en la matriz mitocondrial y los aminoácidos metionina 304 e histidina
318 están en el espacio intermembrana, mientras que en el linaje UChB la alanina 265 Figura 8.
Figura 8. Modelamiento de la subunidad ND2 de los linajes UChA y UChB Las siguientes figuras corresponden a las estructuras tridimensionales de la subunidad ND2 generadas por el programa Rosetta, capaz de predecir estructuras tridimensionales a partir de una secuencia aminoacídica lineal. En la columna de la izquierda se muestran cuatro rotaciones de la subunidad ND2 de las ratas UChA. En la columna de la derecha, se muestran cuatro rotaciones de la subunidad ND2 de las ratas UChB. En amarillo se destacan la metionina amino terminal, la treonina carboxilo terminal y los aminoácidos 150 (Ser/Asn), 265 (Ala/Thr), 304 (Met/Thr), 316 (His/His), 317 (His/His) y 318 (His/---).
Figura 9. Predicción de segmentos de transmembrana de la subunidad ND2 de los linajes UChA y UChB Arriba se muestran dos rotaciones de las estructuras tridimensionales de la subunidad ND2 para ambos linajes; se señalan los extremos amino y carboxilo terminales y las estructuras alfa hélices. En una de las representaciones se indican con flechas los aminoácidos variables entre los linajes. Abajo se muestran dos figuras realizadas con los datos obtenidos del programa TMHMM 2.0. Los cilindros representan los segmentos de trasmembrana y las líneas los segmentos que los conectan. Además, se indican los aminoácidos variables, su posición en la proteína y su orientación con respecto a la membrana. En achurado se muestra el dominio de transmembrana presente en el linaje UChB y ausente en el UChA.
está situada en el espacio intermembrana y la treonina 304 se ubica en la matriz
mitocondrial.
Si bien (i) los tres cambios aminoacídicos encontrados en las posiciones 150, 265 y
304 no llaman la atención debido a que las variaciones no son muy radicales (Ser/Asn,
Thr/Ala y Met/Thr), y (ii) la inserción de un aminoácido (histidina 318) en una proteína
de 345 aminoácidos no representa un cambio muy importante, aparentemente dichas
sustituciones y la inserción son suficientes para producir cambios estructurales en la
proteína y por lo tanto permiten sospechar diferencias funcionales entre los linajes.
Además, la subunidad ND2 se encuentra representada ocho veces en el segmento
hidrofóbico del complejo I a diferencia de las otras subunidades que se encuentran
representadas sólo dos veces. Esto quiere decir que los cambios producidos en esta
subunidad pueden tener más impacto en la actividad general del complejo I.
Ambos análisis predictivos realizados in silico, es decir, el de la estructura
tridimensional de la proteína ND2 y el de los segmentos de transmembrana,
concuerdan en sugerir diferencias estructurales entre la proteína ND2 del linaje UChA y
la del linaje UChB. La subunidad ND2 es, por lo tanto, de interés para realizar estudios
funcionales diseñados para determinar diferencias en su actividad biológica.
4.5 Secuencias nuevas A la fecha, hay 15 genomas mitocondriales completos de rata disponibles en GenBank
entre los que se encuentran genomas de ratas silvestres y genéticamente
seleccionadas para diversos estudios. Se ordenaron estas cepas de ratas según el
número de genes o proteínas iguales (Tablas 4A y 4B respectivamente) que tienen con
los linajes UChA o UChB.
4.5.1 Secuencias génicas nuevas Las secuencias de los siete genes de cada uno de los linajes UChA y UChB se
compararon con las secuencias ya reportadas en la base de datos GenBank mediante
el programa BLAST (Altschul y cols., 1990) con el objeto de determinar si alguna de
Tabla 4. Identidad de los siete genes y las siete subunidades del complejo I de los linajes UChA y UChB con los de otras cepas de ratas Se indican los códigos de acceso GenBank de todos los genomas mitocondriales de rata que se identificaron y analizaron por BLAST. Se consigna si los respectivos genes (Tabla 4A) o subunidades (Tabla 4B) del complejo I que se estudiaron en esta memoria de título son idénticos a los de los linajes UChA (tabla superior) o UChB (tabla inferior). Los puntos indican que dicha cepa tiene un gen o subunidad de tipo A o de tipo B. Las casillas en blanco indican que las ratas correspondientes tienen genes o subunidades distintas a las que poseen los linajes UChA o UChB. En achurado se indican genes o subunidades del linaje UChA o UChB nuevos en la base de datos por lo que no hay ninguna cepa de rata que tenga un gen o subunidad con esa misma secuencia. En gris, genes o subunidades que tienen la misma secuencia en ambos linajes. Ver detalles de las cepas en la Tabla 5.
Tabla 4A.
Siete genes del complejo I mitocondrial: linaje UChA
Acceso GenBank Cepa Nd1 Nd2 Nd3 Nd4L Nd4 Nd5 Nd6
DQ673911 GH/OmrMcwi • • DQ673907 WKY/NCrl • • DQ673913 GK/Swe • • DQ673912 GK/Far • AY769440 F344 x BNF1 • DQ673908 ACI/Eur • DQ673909 F344/NHsd • DQ673910 FHH/Eur • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • DQ673915 T2DN/Mcwi • DQ673917 Wild/Tku • AJ428514 rata silvestre •
NC_001665 BN/SsNHsdMCW • AC_000022 Wistar DQ673916 Wild/Mcwi
Siete genes del complejo I mitocondrial: linaje UChB
Acceso GenBank Cepa Nd1 Nd2 Nd3 Nd4L Nd4 Nd5 Nd6
AY769440 F344 x BNF1 • • • • DQ673908 ACI/Eur • • • DQ673909 F344/NHsd • • • DQ673910 FHH/Eur • • • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • • • DQ673915 T2DN/Mcwi • • • DQ673917 Wild/Tku • • DQ673911 GH/OmrMcwi • DQ673907 WKY/NCrl • DQ673913 GK/Swe • AJ428514 rata silvestre •
NC_001665 BN/SsNHsdMCW • AC_000022 Wistar DQ673912 GK/Far DQ673916 Wild/Mcwi
Tabla 4B.
Siete subunidades del complejo I mitocondrial: linaje UChA
Acceso GenBank Cepa ND1 ND2 ND3 ND4L ND4 ND5 ND6
DQ673911 GH/OmrMcwi • • • • • DQ673907 WKY/NCrl • • • • DQ673912 GK/Far • • • • DQ673913 GK/Swe • • • • DQ673908 ACI/Eur • • • DQ673909 F344/NHsd • • • DQ673910 FHH/Eur • • • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • • • DQ673915 T2DN/Mcwi • • • NC_001665 BN/SsNHsdMCW • • • DQ673916 Wild/Mcwi • • DQ673917 Wild/Tku • • AY769440 F344 x BNF1 • • AJ428514 rata silvestre •
AC_000022 Wistar •
Siete subunidades del complejo I mitocondrial: linaje UChB
Acceso GenBank Cepa ND1 ND2 ND3 ND4L ND4 ND5 ND6
DQ673908 ACI/Eur • • • • • DQ673909 F344/NHsd • • • • • DQ673910 FHH/Eur • • • • • DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi • • • • • DQ673915 T2DN/Mcwi • • • • • NC_001665 BN/SsNHsdMCW • • • • AY769440 F344 x BNF1 • • • • DQ673916 Wild/Mcwi • • • DQ673911 GH/OmrMcwi • • • DQ673907 WKY/NCrl • • • DQ673912 GK/Far • • • DQ673913 GK/Swe • • • DQ673917 Wild/Tku • • • AJ428514 rata silvestre • • •
AC_000022 Wistar • •
ellas era nueva. Las búsquedas se restringieron a secuencias descritas para roedores
los que incluyen, entre otros, la rata (Rattus norvegicus) y el ratón (Mus musculus).
Se determinó que las secuencias nucleotídicas de los genes Nd1, Nd5 y Nd6, tanto
para la línea UChA como para la UChB, son nuevas. En cambio, las secuencias de los
genes Nd2, Nd3 y Nd4L para ambos tipos de animales resultaron ser idénticas a
alguna secuencia de rata ya descrita en GenBank (Tabla 4A), siendo las variantes de
los genes Nd2 y Nd3 del linaje UChB más comunes que las variantes respectivas del
linaje UChA. En cuanto al gen Nd4 sólo la secuencia de la rata UChA resultó ser una
nueva variante entre roedores. En total, de las catorce secuencias génicas obtenidas
en este trabajo de memoria (siete para cada linaje), siete constituyen alelos nuevos.
4.5.2 Secuencias proteicas (deducidas) nuevas Se sometieron las secuencias nucleotídicas de los siete genes mitocondriales a un
análisis mediante BLAST, pero utilizando la variante blastx (Altschul y cols., 1997), que
traduce primero la secuencia nucleotídica analizada a peptídica, considerando en este
caso el código genético alternativo de la mitocondria, y la compara con las secuencias
proteicas descritas en la base de datos. En este caso también se restringió la
búsqueda sólo a roedores, incluyendo la rata y el ratón.
Se determinó cuál de los alelos nuevos (Nd1, Nd5 y Nd6 de ambos linajes (UChA y
UChB) y Nd4 para la rata UChA) correspondía a una nueva variante proteica
(Tabla 4B). Se encontró que la proteína ND4 del linaje UChA y las dos subunidades
ND5 (UChA y UChB) son nuevas, es decir, no hay secuencias peptídicas de roedores
descritas en la base de datos que sean idénticas a las secuencias (deducidas) de estas
subunidades. En cambio, la proteína deducida de ambos alelos del gen Nd1 y las
proteínas deducidas de los dos alelos del gen Nd6, resultaron ser idénticas a proteínas
ND1 y ND6 de rata ya descritas.
En cuanto a la similitud de los linajes en estudio con las otras cepas de ratas,
considerando el número de subunidades idénticas del complejo I que comparten, la
rata de acceso GenBank DQ673911 es la más parecida al linaje UChA: tiene cinco
proteínas iguales a las del linaje UChA por lo que se encuentra en la primera posición
de la Tabla 4B. Para el linaje UChB, son cinco las ratas que tienen cinco proteínas
iguales a las del linaje UChB (ACI/Eur, F344/NHsd, FHH/Eur, SS/JrHsd/Mcwi y
T2DN/Mcwi). Así como para el linaje UChA, todas las ratas que tienen el mayor
número de subunidades iguales al linaje UChB corresponden a ratas consanguíneas
obtenidas por cruzamientos selectivos (ver Discusión).
Por otra parte, se encontró que las subunidades ND1, ND3 y ND4L se conservan en la
mayoría de las ratas analizadas, es decir, la mayoría de las cepas tienen variantes de
estas subunidades que son iguales a las que comparten las ratas UChA y UChB. En el
caso de las subunidades ND2 y ND6, la mayoría de las ratas analizadas tiene una de
dos variantes que corresponden a las que tienen los linajes UChA y UChB. A partir de
estos análisis las subunidades del complejo I codificadas en la mitocondria se pueden
ordenar en términos de cuan conservadas están entre las ratas que han sido
caracterizadas, siendo el orden de mayor a menor conservación ND4L, ND3, ND1,
ND6, ND2, ND4 y ND5.
4.5.3 Publicación de secuencias en GenBank La combinación de los siete genes que codifican subunidades del complejo I
mitocondrial, tanto para el linaje UChA como para el UChB, constituyen nuevas
variantes no descritas en las bases de datos, es decir, hay dos complejos I nuevos,
uno para la rata UChA y otro para la rata UChB. Se depositaron en la base de datos
GenBank las siete secuencias de los genes del complejo I de cada uno de los linajes,
obteniéndose 14 nuevos códigos de acceso GenBanK, siete para cada linaje. Los
códigos de acceso y las diferencias nucleotídicas y aminoacídicas encontradas, se
resumen en la Figura 10 que se muestra a continuación.
Figura 10 Genes del complejo I mitocondrial: diferencias entre ratas UChA y UChB Se muestran las diferencias nucleotídicas (nt) y aminoacídicas (aa) de los siete genes que codifican siete subunidades del complejo I mitocondrial. Además, se muestran los tamaños de los genes en pares de bases (pb) y los códigos de acceso GenBank obtenidos para los siete genes de los linajes UChA y UChB.
Gen nt aalargo pb
Nd-1 Nd-1 7 957 0EU104717 EU104724
Nd-2 Nd-2 9 1038 4EU104718 EU104725
Nd-3 Nd-3 3 348 0EU104719 EU104726
Nd-4L Nd-4L 0 297 0EU104720 EU104727
Nd-4 Nd-4 9 1378 2EU104721 EU104728
Nd-5 Nd-5 13 1830 1EU104722 EU104729
Nd-6 Nd-6 3 519 1EU104723 EU104730
Accesos GenBank UChA UChB
5. DISCUSIÓN
5.1 Algunas consideraciones de la estructura del genoma mitocondrial de mamíferos y su expresión Si bien las mitocondrias llevan millones de años conviviendo con las células
eucariontes, todavía mantienen características de sus ancestros las protobacterias. En
este sentido hay algunas características de la mitocondria en cuanto a la estructura de
su genoma, a su transcripción y a su traducción que vale la pena mencionar. Por
ejemplo, la mitocondria de los mamíferos posee un genoma de DNA circular con un
tamaño de alrededor de 16 kb (16,3 kb para la rata). En él se encuentran genes de
proteínas que forman parte de los diversos componentes de la cadena respiratoria
mitocondrial (complejos I, II, III, IV y V), así como secuencias que codifican todos los
tRNAs y los RNAs ribosomales que la mitocondria necesita (ver Figura 4). Además, se
pueden identificar en el genoma mitocondrial dos hebras, una pesada y una liviana que
pueden ser separadas mediante una gradiente de CsCl debido a su distinta
composición de G+C. En la hebra pesada se encuentran codificados la mayoría de los
tRNAs, rRNAs y los genes para subunidades de los complejos de la cadena
respiratoria mitocondrial, en cambio en la hebra liviana solamente se encuentran
codificados algunos tRNAs y el gen Nd6 (Taanman, 1999).
Están descritos dos promotores para la expresión de los diversos genes mitocondriales
(ver Figura 4). Uno de ellos se encuentra en la hebra pesada (HSP, heavy strand
promoter, promotor de la hebra pesada) y controla la expresión de todas las
secuencias que se encuentran en esa hebra. El otro promotor se encuentra en la hebra
liviana (LSP, light strand promoter, promotor de la hebra liviana) y controla la expresión
de los genes de esa hebra, entre los que se encuentra el Nd6. Es poco probable que
las diferencias bioquímicas entre las ratas se deban a diferencias en los promotores, es
decir, que el promotor de una subunidad tuviese alguna mutación que afectara su
transcripción y con esto la cantidad del transcrito y de la proteína. De ser así, en la
hebra pesada estaría afectada la transcripción de todos los genes correspondientes,
incluyendo las subunidades de otros complejos, tRNAs y rRNAs, puesto que hay
muchos genes que se encuentran bajo el control de dicho promotor. El mismo
fenómeno ocurriría en la hebra liviana con la diferencia de que no hay secuencias de
rRNAs bajo el control de ese promotor. Así, serían varios los complejos afectados por
este tipo de mutaciones y no sólo el complejo I como lo indica la evidencia
experimental de Quintanilla y cols. (2005b).
Durante la transcripción de los genes mitocondriales de ambas hebras se producen
moléculas largas de RNA, es decir, al igual que en bacterias, un policistrón contiene
todas las secuencias de los rRNAs, tRNAs y mRNAs de esa hebra. Posteriormente,
este transcrito largo de RNA es cortado por RNasas específicas para los tRNAs
(RNasa P y RNasa Z), liberando así mRNAs, tRNAs y rRNAs, formando cistrones
individuales (Taanman, 1999). Son éstos los que son traducidos por el ribosoma, si
corresponde, dando origen a las subunidades peptídicas de los distintos componentes
de la cadena respiratoria mitocondrial. En este punto tiene sentido pensar que las
diferencias nucleotídicas en sí pudieran alterar la estabilidad de los mensajeros (ver
más abajo), y con esto su traducción, ya que son segmentos individuales y no una sola
gran molécula de RNA. Posteriormente, continúa el proceso de maduración de los
distintos mensajeros, por ejemplo los mRNAs son en algunos casos poliadenilados en
su extremo 3’, ya que algunos mensajeros poseen un codón de término incompleto
faltándoles una o dos adeninas. A los precursores de los tRNAs en cambio, se les
agrega en el extremo 3’ un triplete CCA al cual luego se le adicionará el aminoácido
respectivo.
5.2 Acerca de las diferencias genéticas Entre los genes que codifican variaciones aminoacídicas (Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6), hay
dos que llaman la atención. El gen Nd2 tiene diferencias entre linajes que establecen
cuatro diferencias aminoacídicas en la subunidad ND2 que al estar representada ocho
veces en el brazo hidrofóbico del complejo I (Chomyn y cols., 1986), probablemente
tenga un mayor impacto en la estructura y/o actividad del complejo I que las otras
proteínas en estudio que están representadas dos veces. Por otra parte, el gen Nd4
determina dos diferencias aminoacídicas en la subunidad ND4, una de éstas
corresponde a leucina en las ratas UChB y prolina en las ratas UChA y es la más
sugerente de todas las variaciones encontradas debido a que la prolina es un conocido
desarmador de la estructura secundaria. En cuanto a las diferencias encontradas en
ND5 y ND6, si bien no parecen afectar de manera importante la estructura de la zona
donde se encuentran dada la similitud de los aminoácidos en cuestión (en ambas
subunidades hay isoleucina o valina), no hay que descartarlas puesto que alteren o no
la estructura de las proteínas pueden tener consecuencias sobre la función del
complejo I (ver más abajo).
Se encontraron también diferencias nucleotídicas en los genes Nd1 y Nd3. Sin
embargo, estas diferencias son silentes lo cual implica que las subunidades ND1 y
ND3 de ambas ratas son iguales. Por otra parte, no se encontraron diferencias en la
secuencia del gen Nd4L entre las ratas de ambos linajes. Esto sugiere que estas
subunidades (ND1, ND3 y ND4L) deben cumplir un rol importante de manera que tener
diferencias en las proteínas podría llevar a la inhibición completa del complejo I, ya sea
porque no se puede ensamblar correctamente o porque esas subunidades son más
importantes para la actividad del complejo I. Otro efecto que podrían tener las
diferencias nucleotídicas en general es sobre la estabilidad de los mRNAs de manera
tal que puede haber transcritos que sean degradados más fácilmente que otros,
traduciéndose en una menor cantidad de proteína para esa subunidad.
Experimentalmente, se podría investigar si esta proposición se cumple o no midiendo
la estabilidad de los transcritos en cuestión, así como la cantidad de proteína.
5.3 Alteraciones del complejo I determinadas por mutaciones de las subunidades hidrofóbicas Cabe preguntarse si las variaciones encontradas serán capaces de provocar
alteraciones en la actividad del complejo I, que está formado por alrededor de
46 subunidades distintas. En humanos, se han encontrado cambios aminoacídicos
vinculados a diversas enfermedades en todas las subunidades del complejo I
codificadas en la mitocondria. Entre dichas patologías se encuentran la neuropatía
óptica hereditaria de Leber (LHON, Leber hereditary optic neuropathy), la
encefalomiopatía mitocondrial, acidosis láctica y episodios del tipo infarto (MELAS,
mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes), la epilepsia
mioclónica con fibras rojas desgarradas (MERRF, myoclonic epilepsy with ragged red
fibers) y otras más conocidas como son la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de
Alzheimer y la diabetes (Ruiz-Pesini y cols., 2007). Ello indica que todas las
subunidades codificadas en la mitocondria son fundamentales para la actividad normal
del complejo I. También se han descrito variaciones nucleotídicas silentes asociadas a
algunas de las enfermedades mencionadas. Esto apoya en parte lo dicho acerca de la
estabilidad de los transcritos asociada a su desaparición. Así, probablemente hay
transcritos que no alcanzan a tener un procesamiento apropiado, lo que lleva a la
formación de péptidos aberrantes. Estas enfermedades mitocondriales tienen en
común, en general, un complejo I de menor capacidad oxidativa que el de los
individuos que no las poseen (Lenaz y cols., 2004), fenómeno similar a lo que ocurre
con las ratas UChA respecto a las UChB. Esto quiere decir que es posible que tanto
mutaciones silentes como variaciones nucleotídicas que conducen a cambios
aminoacídicos en estas subunidades, independientemente de su naturaleza, alteren la
funcionalidad del complejo I. Entre las variaciones aminoacídicas descritas en la
literatura se encuentran cambios de aminoácidos de la misma familia (Ruiz-Pesini y
cols., 2007), que son los que menos se espera que provoquen algún cambio en la
estructura de una proteína, como por ejemplo valina por isoleucina. Este tipo de
variación es la que se encontró en esta memoria en las subunidades ND5 y ND6 por lo
que no se puede descartar su efecto en la actividad del complejo I.
Otro indicio de que las variaciones entre aminoácidos que tienen características
fisicoquímicas similares pueden alterar la estructura de una proteína y así su función,
viene de los resultados obtenidos de los análisis in silico (predicción tridimensional y de
segmentos de transmembrana) realizados a la subunidad ND2 de ambos linajes. Se
determinó que los cuatro cambios aminoacídicos son responsables de diferencias a
nivel estructural entre las subunidades de ambos linajes. La subunidad ND2 del linaje
UChA posee un segmento de transmembrana menos que la del linaje UChB, lo que se
traduce en (i) ubicaciones distintas de los aminoácidos 265, 304 y 318 respecto a la
membrana y (ii) en la forma más extendida de la subunidad ND2 del linaje UChA con
respecto a la del linaje UChB.
En resumen, podemos suponer que la limitación en la función del complejo I de las
ratas UChA en comparación con la de las ratas UChB debe ser lo suficientemente
importante como para provocar diferencias a nivel bioquímico entre los complejos I
pero no tan importante como para traerle complicaciones a las ratas UChA a nivel de
músculos, visión, etc, como sucede con las personas que padecen alguna de las
enfermedades de la mitocondria asociadas a mutaciones de las subunidades del
complejo I.
Resulta de interés promover estudios orientados a caracterizar en mayor detalle la falla
funcional del complejo I de las ratas UChA y determinar cuáles de las diferencias
aminoacídicas encontradas son las responsables de las diferencias bioquímicas entre
los linajes UChA y UChB. Los estudios de función pueden incluir estudios cinéticos
(usando inhibidores), medición de especies reactivas del oxígeno (ROS) y cambios en
el potencial de membrana de la mitocondria, ofreciendo una imagen más clara de lo
que este fenómeno está produciendo en la célula.
Los estudios funcionales de las diferencias aminoacídicas individuales son, sin duda,
los más difíciles de abordar debido a que el complejo I está compuesto por muchas
subunidades codificadas tanto en el genoma nuclear como en el mitocondrial. Además,
el gran número de mitocondrias que hay en una célula representa una dificultad al
tratar de modificar la mitocondria genéticamente. Sin embargo, una aproximación es
utilizar bacterias para estudiar cuáles son los cambios aminoacídicos que provocan
cambios en la actividad de la estructura bacteriana análoga al complejo I de las
mitocondrias. Existen bacterias que tienen parecidos evolutivos con las mitocondrias
(por ejemplo Paracoccus denitrificans) y que se utilizan para este tipo de estudios, pero
también hay trabajos en que se utiliza Escherichia coli. Las bacterias en general tienen
un complejo I rudimentario llamado NDH1 que está formado por 14 subunidades
distintas (Yagi y cols., 1998). Corresponde a la mínima expresión del complejo I de
mamífero y es capaz de realizar casi las mismas funciones. Estructuralmente, el NDH1
también tiene dos dominios principales, uno que apunta hacia el citoplasma de la
bacteria y otro que se encuentra embebido en la membrana bacteriana y cataliza la
transferencia de electrones desde el NADH o el NADPH a través de otros complejos y
aceptores lipídicos hacia el oxígeno. El complejo NDH1 también posee siete genes que
codifican subunidades de membrana que son homólogas a las siete subunidades del
complejo I codificadas en la mitocondria.
Hay experimentos en los cuales se han incorporado en genes bacterianos del NDH1
variaciones nucleotídicas que conducen a cambios aminoacídicos y que corresponden
a las descritas en enfermedades mitocondriales como LHON y MELAS (ver más
arriba), específicamente, en genes homólogos bacterianos que codifican subunidades
homólogas a ND1 (Kervinen y cols., 2006) y ND4L (Kao y cols., 2005). Al evaluar el
efecto de estos cambios sobre la actividad del complejo bacteriano NDH1, se vio una
disminución importante de la actividad en las mutantes que tenían cambios asociados
a las enfermedades mitocondriales.
La idea es comparar mediante alineamientos múltiples las subunidades bacterianas y
las de ratas UChA y UChB para las cuatro proteínas que tienen diferencias entre ellas
(ND2, ND4, ND5 y ND6) para encontrar las posiciones bacterianas equivalentes a las
ubicaciones en que se encuentran las diferencias aminoacídicas entre los linajes de
ratas. Finalmente, mediante mutagénesis sitio dirigida, incorporar dichas variaciones en
los genes respectivos. Así, se podrían analizar por separado y en conjunto las
variaciones aminoacídicas y su relación con la actividad del complejo I.
5.4 Análisis de secuencias De la Tabla 4B se desprende que las cepas de ratas más parecidas a los linajes UChA
o UChB corresponden a animales consanguíneos que han sido obtenidos mediante
cruzamientos selectivos y que se utilizan para diversos estudios, por ejemplo diabetes
e hipertensión (Tabla 5). En cambio, las secuencias proteicas deducidas de las ratas
silvestres (accesos DQ673917, DQ673916 y AJ428514) están dentro de los animales
que menos proteínas tienen en común con los linajes UChA y UChB.
Es posible que, por ejemplo, debido a factores como la formación de especies
reactivas del oxígeno (ROS), se modifique la secuencia de un gen mitocondrial, de
Tabla 5. Genomas mitocondriales de rata utilizados para los análisis comparativos
Se identifican y ordenan los genomas mitocondriales de rata con los cuales se compararon los genes de los linajes UChA y UChB según su código de acceso GenBank. Se especifican las cepas por nombre y descripción y se incluyen las referencias respectivas. Todos estos archivos GenBank corresponden a genomas mitocondriales completos obtenidos a partir de DNA total de rata. Los códigos de acceso se encuentran ordenados alfabética y numéricamente.
Acceso DNA Cepa Descripción Referencia
AC_000022.2 Wistar sin información Saccone C y cols., GenBank 1989
AJ428514 Rata silvestre capturada sin información Nilsson MA y cols., 2003
AY769440 F344xBNF1 sin información Pak JW y cols., 2005
DQ673907 WKY/NCrl Wistar Kyoto Schlick NE y cols., 2006
DQ673908 ACI/Eur August x Copenhagen Irlanda Schlick NE y cols., 2006
DQ673909 F344/NHsd Fisher 344 Schlick NE y cols., 2006
DQ673910 FHH/Eur Fawn-hooded hipertensa Schlick NE y cols., 2006
DQ673911 GH/OmrMcwi Genéticamente hipertensa Schlick NE y cols., 2006
DQ673912 GK/Far Subcepa Goto-Kakizaki (Florida) Schlick NE y cols., 2006
DQ673913 GK/Swe Subcepa Goto-Kakizaki (Suecia) Schlick NE y cols., 2006
DQ673914 SS/JrHsd/Mcwi Dahl, sensible a la sal Schlick NE y cols., 2006
DQ673915 T2DN/Mcwi Nefropatía diabética tipo 2 Schlick NE y cols., 2006
DQ673916 Wild/Mcwi Silvestre, Milwaukee Schlick NE y cols., 2006
DQ673917 Wild/Tku Silvestre, Tokyo Schlick NE y cols., 2006
NC_001665.2 BN/SsNHsdMCW Brown Norway McLeod MP y cols., GenBank 2006
manera que teóricamente coexistan en un genoma mitocondrial segmentos de
secuencias génicas que son propios de linajes distintos. Sin embargo, no se encontró
ninguna secuencia mitocondrial en GenBank que codifique simultáneamente proteínas
que son exclusivas de ambos linajes, sólo se encontraron casos en los que las
proteínas son iguales a las del linaje UChA o del linaje UChB.
La cepa GH/OmrMcwi, que corresponde a una rata genéticamente desarrollada para
tener hipertensión, posee las mismas proteínas ND2 y ND6 de las ratas UChA (ver
Tabla 4B). Al cruzar una rata hembra con estas características con alguna rata híbrida
UChA/UChB (de la F2) (ver Figura 2), que posea un genotipo Aldh22/2, una mitocondria
eficiente y fenotípicamente un elevado consumo de alcohol, se obtendría en su
descendencia F2 una rata que tiene un bajo consumo de alcohol con genotipo Aldh22/2
y la mitocondria más parecida a las ratas UChA (mitocondria deficiente) siempre que la
o las subunidades responsables de las diferencias bioquímicas entre los complejos I de
las ratas UChA y UChB sean las proteínas ND2 y ND6. Los otros linajes o cepas de
ratas que también se parecen a las ratas UChA (GK/Swe, GK/Far y WKY/NCrl) tienen
una variante distinta a la subunidad ND2 de los linajes UChA y UChB, pero tienen la
variante del linaje UChA de la subunidad ND6 por lo que también podrían utilizarse
para estudiar el efecto de la subunidad ND6 sobre el consumo de alcohol.
Con respecto al linaje UChB también se pueden utilizar cualquiera de las cinco ratas
que tienen proteínas iguales a las ratas UChB (T2DN/Mcwi, SS/JrHsd/Mcwi, FHH/Eur,
F344/NHsd y ACI/Eur) para cruzarlas, por ejemplo, con una rata UChA macho
genotipificada como Aldh22/2 que posea una mitocondria deficiente y cuyo consumo de
alcohol sea bajo. En su descendencia F2, las ratas homocigotas para el alelo Aldh22 y
que tengan la mitocondria más parecida a las ratas UChB tendrán un consumo elevado
de etanol. El objetivo es tratar de individualizar el o los genes responsables de las
diferencias bioquímicas en el complejo I entre los linajes. Además, se puede medir el
consumo de oxígeno de las mitocondrias de las ratas que tienen estas similitudes con
los linajes bebedor y no bebedor y compararlo con el consumo de oxígeno de las
mitocondrias de las ratas UChA y UChB.
En cuanto a la comparación entre los genes mitocondriales se encontraron menos
relaciones puesto que hay una mayor variación entre sus secuencias nucleotídicas
(44 variaciones) que entre las respectivas proteínas (ocho variaciones). Sin embargo,
se puede decir que la secuencia nucleotídica del gen Nd4L (que es el mismo en ambos
linajes) se encuentra muy conservada entre las ratas analizadas y corrobora lo
encontrado en el análisis de subunidades. Además, las variantes del linaje UChB de
los genes Nd2 y Nd3 son las más conservadas, ya que hay un mayor número de ratas
que también las poseen.
5.5 Genes de herencia materna Se mencionó que el complejo I está formado por múltiples subunidades codificadas en
los cromosomas no sexuales y nueve subunidades de origen materno localizadas en la
membrana de la mitocondria, siete ya abordadas aquí y otras dos codificadas en el
cromosoma X. Éstas son las subunidades MWFE y ESSS, codificadas por los genes
Ndufa1 (Zhuchenko y cols., 1996) y Ndufb11 (Carroll y cols., 2002) respectivamente.
Estas subunidades también pueden ser las responsables de las diferencias en las
capacidades del complejo I de los linajes, por lo que su secuenciación también se ha
abordado. Nuestro grupo de investigación ha secuenciado los tres exones del gen
Ndufa1 (L. Lobos y A. Sapag) y los tres exones del gen Ndufb11 (G. Encina y A.
Sapag) de las mismas diez ratas de este estudio (cinco UChA y cinco UChB). Las
secuencias nucleotídicas de dichos exones son las mismas para las ratas UChA y
UChB haciendo muy improbable que las proteínas MWFE y ESSS determinen
diferencias entre los linajes.
5.6 Secuenciación, detalles experimentales La secuenciación directa de amplicones, es decir, sin clonarlos previamente, arrojó en
general buenos resultados. Si bien se necesitó un gran número de reacciones de
amplificación y secuenciación para secuenciar los genes de las diez ratas, el tiempo
que hubiese tomado la clonación de diez amplicones para cada gen y su posterior
secuenciación llevaron a descartar la clonación como parte de la estrategia
experimental adoptada, aunque la secuenciación de plasmidios es, en general, de
mayor calidad que la de amplicones. Además, con la serie de reacciones de
secuenciación podemos decir que no hay una receta para una secuenciación exitosa.
La concentración del molde y las características de los partidores son algunos de los
elementos que influyen en la calidad de una reacción de secuenciación, pero a una
determinada concentración de molde, hay distintos tipos de partidores, esto es, de baja
o de alta Tm que pueden dar igualmente buenas reacciones de secuenciación. En
general, partidores de baja Tm (entre 50 y 54°C) han dado buenos resultados,
justamente esto es lo que recomienda el servicio de Macrogen para garantizar una
buena corrida, pero algunos partidores de Tms mucho mayores también han dado muy
buenos resultados, por lo que se secuenció con los partidores de la amplificación,
sintetizando unos de baja Tm sólo al requerir partidores adicionales. Para este trabajo
se diseñaron originalmente partidores de alta Tm puesto que el molde sobre el cual se
iba a amplificar contenía DNA genómico total y los partidores de Tm mayores ayudan a
tener una mayor especificidad sobre el molde de interés que en este caso es el del
DNA mitocondrial.
Otro factor que influye en la calidad de la reacción de secuenciación de genes
mitocondriales es la posible coexistencia de variantes mitocondriales (heteroplasmia)
que pueden, dependiendo de su porcentaje y tipo, producir reacciones sobrelapadas
que no son posibles de discriminar y que no permiten obtener secuencias útiles o bien
que generan confusión en la interpretación de los datos.
5.7 Efectos de la heteroplasmia Heteroplasmia quiere decir que en una célula puede haber varios tipos de
mitocondrias, unas con un DNA distinto al de otras y que puede variar en uno o varios
genes. Homoplasmia quiere decir que todas las mitocondrias de una célula poseen el
mismo genoma mitocondrial. El concepto de heteroplasmia es muy importante al
pensar en las enfermedades asociadas a las mitocondrias, puesto que el porcentaje
que se tenga para una determinada mutación va a determinar la gravedad de la
patología (Ruiz-Pesini y cols., 2007). En este trabajo de memoria, al secuenciar los
genes mitocondriales de ambas ratas era posible que surgiera heteroplasmia para
algunos o todos los genes. Sin embargo, esto no ocurrió. Si bien no podemos descartar
la heteroplasmia en algunas posiciones nucleotídicas, hay ciertas cosas que decir al
respecto.
Los posibles casos de heteroplamia corresponden a situaciones en que en el
electroforetograma de secuenciación se observaron dos picos bien definidos
compartiendo el mismo espacio pero de distinta altura. En dichos casos la altura del
pico menor no sobrepasa el 20% de la intensidad del pico mayor, por ejemplo, un pico
de T que tiene superpuesto un pico de C siendo la altura de este último no superior al
20% de la del primero. Dadas las características del método, es decir, la secuenciación
automática por capilar, las heteroplasmias menores al 20% no pueden ser detectadas
porque se confunden con el ruido basal de la señal. Además, ese 20% puede deberse
a mutaciones introducidas por la DNA polimerasa en una de las cinco reacciones de
PCR agrupadas para la secuenciación. Otro aspecto a considerar es que estas ratas
son jóvenes, ya que a mayor edad se acumulan más mutaciones en el mtDNA, por lo
que debiera ser mucho menor la heteroplasmia. Estas ratas han sido seleccionadas
alrededor de 50 años, por lo que si en un principio había heteroplasmia (las primeras
ratas con que comenzaron las series de cruzamientos) se debe haber diluido
estableciéndose en ambas líneas de ratas las variantes mitocondriales dominantes. Si
bien no podemos descartar completamente la existencia de heteroplasmia en algunas
posiciones nucleotídicas, si existiera no debiese ser mayor al 20%, es decir, en una
célula podría haber hasta un 20% de mitocondrias con un genoma distinto al 80%
restante. Además, hay razones para justificar la inexistencia aparente de heteroplasmia
en los genes mitocondriales de las ratas UChA y UChB.
La heteroplasmia puede variar de un tejido a otro, es decir, la población mitocondrial
heterogénea encontrada en el hígado no es necesariamente la misma que la del
pulmón o el cerebro, por ejemplo. Por ello resulta ventajoso que el gDNA disponible
haya sido obtenido del hígado y no de otro tejido como la sangre, ya que el órgano que
contribuye más al metabolismo del alcohol es el hígado.
5.8 Implicancias para el alcoholismo de las diferencias de secuencia encontradas en los genes mitocondriales Las diferencias en los genes mitocondriales heredados exclusivamente por línea
materna establecen nuevos polimorfismos que son posibles determinantes del
consumo de alcohol. En otras palabras, las variaciones en los genes mitocondriales
que codifican las subunidades hidrofóbicas del complejo I pueden jugar un papel
importante en la disponibilidad del NAD+ que es necesario para la transformación de
alcohol a acetaldehído por la ADH y luego de acetaldehído a acetato por la ALDH2
(Figura 1). Entonces, al heredar un complejo I eficiente un individuo podría beber gran
cantidad de alcohol (independientemente de la ALDH2 que tenga) si el medio en que
se encuentra favorece esta conducta. Por el contrario, un complejo I deficiente tendría
que coincidir con una ALDH2 de Km alta para que un individuo consuma poco alcohol.
Entonces, en un medio que favorece el consumo de alcohol, una madre alcohólica
puede tener mayor incidencia sobre su descendencia en el desarrollo del alcoholismo
que un padre alcohólico. Esta hipótesis es corroborada en parte por estudios con niños
adoptados que tenían un padre biológico alcohólico o una madre biológica alcohólica;
los hijos adoptados de madres biológicas bebedoras tienden a ser más bebedores que
los niños que provienen de padres biológicos bebedores y las hijas son más bebedoras
cuando tienen una madre biológica alcohólica que cuando el padre biológico es el
bebedor (Bohman y cols., 1981). Sería interesante determinar en humanos si hay
alguna relación entre la herencia de un complejo I eficiente y el alcoholismo, o bien
analizar los genes mitocondriales ya mencionados y determinar su relación con un
mayor consumo de alcohol.
Otra aproximación es investigar las características de las mitocondrias en individuos de
la población asiática oriental que beben poco alcohol, ya que se espera encontrar un
complejo I deficiente en estas poblaciones similar a lo que ocurre en las ratas UChA.
Esta idea se fundamenta en la evidencia de que la población asiática oriental que no es
bebedora ha heredado no sólo la variante ALDH2∗2 del gen de la ALDH2 como factor
protector del consumo de alcohol, sino que también ha heredado variantes de la ADH
(ADH1B∗2 y ADH1C∗1) que metabolizan rápidamente el alcohol y elevan los niveles de
acetaldehído rápidamente desincentivando el consumo de alcohol (Pöschl y Seitz,
2004). En resumen, el fenotipo no bebedor en la población asiática está asociado a
diversos factores, haciendo lógico pensar que, además de estas variantes de la ADH y
de la ALDH2, los individuos no bebedores hayan heredado una mitocondria deficiente
en la capacidad de transportar electrones a partir del complejo I, como las mitocondrias
que posee el linaje UChA.
Las mitocondrias del linaje UChA, al ser deficientes en comparación con las del linaje
UChB, pueden generar más radicales libres ya que, como se mencionó anteriormente,
las subunidades del complejo I con mutaciones asociadas a enfermedades, conducen,
en general, a menores capacidades respiratorias y mayor producción de ROS (Lenaz y
cols., 2004) que las subunidades silvestres del complejo I. Las ROS son capaces de
modificar, entre otras cosas, las bases nucleotídicas, produciendo mutaciones en el
DNA que alteran la maquinaria celular y en casos extremos provocan su muerte. Esta
proposición concuerda con estudios en la población japonesa bebedora de alcohol y
que posee la variante de la ALDH2 que está asociada al bajo consumo de alcohol
(ALDH2∗2). Se ha encontrado que en este tipo de bebedores hay un aumento de
cánceres de la vía oral, en comparación con los bebedores que tienen la variante
permisiva de esa enzima (ALDH2∗1) (Pöschl y Seitz, 2004). Así, la ingesta de alcohol
en presencia de una mitocondria de baja capacidad transportadora de electrones
puede llevar a una mayor producción de radicales libres que pueden modificar el DNA
y generar así células tumorales. No hay que olvidar el efecto de otros factores que
también pueden generar células tumorales, como es el discutido efecto mutagénico del
acetaldehído, el cual está presente en niveles elevados en la saliva de estos individuos
bebedores. La mayor o menor producción de radicales libres en los distintos tipos de
mitocondrias puede descartarse o corroborarse mediante la medición de la producción
de especies radicalarias en suspensiones mitocondriales de los linajes UChA y UChB,
en la presencia de, por ejemplo, agentes atrapadores de electrones que permiten
estabilizar las especies radicalarias y cuantificarlas mediante resonancia de espín
electrónico (ESR, electron spin resonance). Se espera encontrar que las mitocondrias
del linaje UChA produzcan más especies reactivas que las del linaje UChB sólo cuando
se agregan sustratos que aportan NADH a la mitocondria y no cuando los sustratos
aportan FADH2. Así, la combinación de alcohol y una mitocondria deficiente puede ser
muy perjudicial debido a la mayor generación de ROS que presentan las mitocondrias
deficientes en comparación con las mitocondrias eficientes.
Finalmente, las diferencias nucleotídicas reportadas para los genes mitocondriales del
complejo I, en especial las conducentes a variaciones aminoacídicas como las
encontradas en los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6, establecen una posible base genética
de las diferencias bioquímicas en la actividad del complejo I entre ambos linajes. Los
polimorfismos aquí descritos tienen el potencial de influir en la regeneración del NAD+ y
el consumo de alcohol, constituyendo, por lo tanto, nuevos factores maternos
permisivos o protectores del alcoholismo.
6. CONCLUSIONES
• Los linajes de ratas UChA no bebedoras y UChB bebedoras de alcohol se diferencian
en los genes mitocondriales Nd1, Nd2, Nd3, Nd4, Nd5 y Nd6 del complejo I. No se
encontraron diferencias nucleotídicas en el gen Nd4L entre ambos linajes.
• Los genes Nd1 y Nd3 sólo tienen diferencias nucleotídicas silentes entre ambos linajes.
Los genes Nd2, Nd4, Nd5 y Nd6 tienen además diferencias nucleotídicas conducentes
a cambios aminoacídicos.
• Cuatro proteínas difieren entre linajes: las subunidades ND2 se diferencian en cuatro
posiciones aminoacídicas, (UChA/UChB) posiciones 150 (Ser/Asn), 265 (Thr/Ala), 304
(Met/Thr) y una inserción de His en la posición 318 (His/---), las subunidades ND4 se
diferencian en las posiciones 23 (Thr/Ile) y 419 (Pro/Leu), las subunidades ND5 en la
posición 37 (Val/Ile) y las subunidades ND6 en la posición 139 (Val/Ile).
• Las variaciones aminoacídicas en las posiciones 150, 265, 304 y 318 de la proteína
ND2 determinan cambios estructurales evidentes en un modelo tridimensional y en el
número de segmentos de transmembrana.
• Hay un sólo tipo de mitocondria por linaje, es decir, para cada gen, las ratas UChA son
iguales entre sí y las ratas UChB son iguales entre sí; no se encontró heteroplasmia.
• Las secuencias nucleotídicas de los genes Nd1, Nd5 y Nd6 de los linajes UChA y
UChB y la secuencia nucleotídica del gen Nd4 del linaje UChA, son secuencias
génicas nuevas entre los roedores.
• La secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND5 de los linajes UChA y UChB
y la secuencia aminoacídica deducida de la subunidad ND4 del linaje UChA son
secuencias proteicas nuevas entre los roedores.
• Los polimorfismos génicos aquí reportados en subunidades del complejo I mitocondrial,
en especial los responsables de variaciones aminoacídicas, pueden establecer nuevos
factores (permisivos o protectores) de herencia exclusivamente materna que influyen
en la capacidad mitocondrial de regenerar el NAD+ y, así, en el consumo de alcohol.
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8. ANEXO Alineamientos múltiples de las subunidades ND1, ND2, ND3, ND4L, ND4, ND5 y ND6 de Rattus norvegicus Se muestran los alineamientos múltiples, realizados mediante el programa ClustalW,
de las subunidades de los linajes UChA y UChB con las secuencias peptídicas
deducidas de genomas mitocondriales completos de Rattus norvegicus. Se utilizaron
los parámetros establecidos por defecto en el programa, entre los que se encuentra la
matriz Gonnet. El asterisco (*) indica que es el mismo aminoácido en toda esa
columna, los dos puntos (:) indican que las variaciones aminoacídicas en esa columna
son conservadas y el punto (.) indica que las variaciones aminoacídicas en esa
columna son semiconservadas. Las posiciones de variación entre el linaje UChA y el
linaje UChB se destacan en un sombreado gris.
A continuación de los alineamientos propiamente tales, se incluye una representación
gráfica de los mismos. Los bloques grises claros representan las zonas de la proteína
que poseen los mismos aminoácidos en los 17 linajes comparados, las barras negras
representan las variaciones aminoacídicas conservadas y las barras grises oscuras
representan las variaciones aminoacídicas semi conservadas.
Alineamiento múltiple de secuencias, subunidad ND1 (CLUSTAL W 1.83)gi|108773517|gb|ABG11806.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773502|gb|ABG11792.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773482|gb|ABG11773.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773474|gb|ABG11766.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|110189715|ref|YP_665629.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 Alelo_UChA_Nd-1 MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 Alelo_UChB_Nd-1 MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773530|gb|ABG11818.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773558|gb|ABG11844.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773544|gb|ABG11831.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773586|gb|ABG11870.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773572|gb|ABG11857.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|54145372|gb|AAV31039.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773600|gb|ABG11883.1| MYFINILTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|108773614|gb|ABG11896.1| MYFINTLTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|19577314|emb|CAD21559.1| MYFINTLTLLIPILIAMAFLTLVERKILGYMQLRKGPNIVGPYGILQPFA 50 gi|110189663|ref|AP_004892.1| MYFINILTLLIPILIAMGLLTLVERKILGYMQLRKGPNNEGPYGKLQPFA 50 ***** ***********.:******************* **** ***** gi|108773517|gb|ABG11806.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773502|gb|ABG11792.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773482|gb|ABG11773.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773474|gb|ABG11766.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|110189715|ref|YP_665629.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 Alelo_UChA_Nd-1 DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 Alelo_UChB_Nd-1 DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773530|gb|ABG11818.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773558|gb|ABG11844.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773544|gb|ABG11831.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773586|gb|ABG11870.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773572|gb|ABG11857.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|54145372|gb|AAV31039.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773600|gb|ABG11883.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|108773614|gb|ABG11896.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|19577314|emb|CAD21559.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 gi|110189663|ref|AP_004892.1| DAMKLFMKEPMRPLTTSMSLFIIAPTLSLTLALSLWIPLPMPHPLINLNL 100 ************************************************** gi|108773517|gb|ABG11806.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773502|gb|ABG11792.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773482|gb|ABG11773.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773474|gb|ABG11766.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|110189715|ref|YP_665629.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 Alelo_UChA_Nd-1 GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 Alelo_UChB_Nd-1 GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773530|gb|ABG11818.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773558|gb|ABG11844.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773544|gb|ABG11831.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773586|gb|ABG11870.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773572|gb|ABG11857.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|54145372|gb|AAV31039.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773600|gb|ABG11883.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|108773614|gb|ABG11896.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|19577314|emb|CAD21559.1| GMLFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMAIIL 150 gi|110189663|ref|AP_004892.1| GMPFILATSSLSVYSILWSGWASNSKYSLFGALRAVAQTISYEVTMALYL 150 ** ********************************************: *
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