Post on 22-Jan-2016
Efecto del surfactante sobre la fibrosis pulmonar: estudios in
vitro e in vivo
Efecto del surfactante sobre la fibrosis pulmonar: estudios in
vitro e in vivoDr. Luis Guillermo Vázquez de Lara Cisneros.
SUSTANCIA TENSIOACTIVA PULMONAR (SURFACTANTE)SUSTANCIA TENSIOACTIVA
PULMONAR (SURFACTANTE)
Complejo lipoproteínico producido por los neumocitos tipo II, destaca en su composición un alto contenido de DPPC y la presencia de apoproteínas específicas
Complejo lipoproteínico producido por los neumocitos tipo II, destaca en su composición un alto contenido de DPPC y la presencia de apoproteínas específicas
Composición del Surfactante Pulmonar (SP)
Composición del Surfactante Pulmonar (SP)
1 Y. Y. Zuo, et al., "Current perspectives in pulmonary surfactant--inhibition, enhancement and evaluation," Biochim. Biophys. Acta 1778(10), 1947 (2008).
PC insaturada33%
DPPC36%
PG10%
PE3%
PI1%
SPM2%
Chol2%
DG1%
Lyso-bis-PA2%
Proteinas 10%
PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DEL SURFACTANTE
PROTEÍNAS ESPECÍFICAS DEL SURFACTANTE
• HIDROFÓBICAS• SP-B• SP-C
• HIDROFÍLICAS• SP-A• SP-D
• HIDROFÓBICAS• SP-B• SP-C
• HIDROFÍLICAS• SP-A• SP-D INMUNIDAD NATURAL
Sistema del surfactanteSistema del surfactante
• Función biofísica– Disminuye la tensión
superficial– Evita el colapso
alveolar– Estabiliza el alveolo– Disminuye el trabajo
respiratorio
• Función biofísica– Disminuye la tensión
superficial– Evita el colapso
alveolar– Estabiliza el alveolo– Disminuye el trabajo
respiratorio
2P
r
Ley de Laplace
Diámetro de la burbujaTe
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pe
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N/m
2
Sistema del surfactanteSistema del surfactante
• Función en la inmunidad:– Fracción lípida
• Bacteriostático
– SP-D• Aglutinación de bacterias
– SP-A• Opsonización de bacterias• Aumenta la fagocitosis por los macrófagos alveolares.• Modulación de la secreción de citocinas en macrófagos y
linfocitos alveolares
• Función en la inmunidad:– Fracción lípida
• Bacteriostático
– SP-D• Aglutinación de bacterias
– SP-A• Opsonización de bacterias• Aumenta la fagocitosis por los macrófagos alveolares.• Modulación de la secreción de citocinas en macrófagos y
linfocitos alveolares
El surfactante en enfermedades pulmonares
El surfactante en enfermedades pulmonares
• Modificación de:– Concentración
• Enfermedad de membrana hialina
– Estructura• Deficiencia de SP-B o SP-C
– Función• Inactivación por proteínas, fosfolipasas, ácidos
grasos– SIRPA– Síndrome de aspiración de meconio– Infecciones
• Modificación de:– Concentración
• Enfermedad de membrana hialina
– Estructura• Deficiencia de SP-B o SP-C
– Función• Inactivación por proteínas, fosfolipasas, ácidos
grasos– SIRPA– Síndrome de aspiración de meconio– Infecciones
Sistema del surfactanteSistema del surfactante
• Otras funciones:– Modulador de la actividad de células que no
pertenecen al sistema inmune• Fibroblastos pulmonares• ?
• Otras funciones:– Modulador de la actividad de células que no
pertenecen al sistema inmune• Fibroblastos pulmonares• ?
Fibrosis Pulmonar IdiopáticaFibrosis Pulmonar Idiopática
• Se caracteriza por la proliferación de fibroblastos y acumulación de matriz extracelular
• Las regiones de lesiones crónicas con cicatrización y panalización contrastan con regiones de lesión aguda en donde se observan focos de fibroblastos y miofibroblastos que proliferan activamente .
Cool y col.
FPIFPI
• Histológicamente se observan zonas fibróticas en forma de panal de abejas que se alternan con áreas aparentemente sanas.
Fibrosis Pulmonar IdiopáticaFibrosis Pulmonar Idiopática
• Incidencia 30 casos por 100 000• No hay tratamiento• Muerte 3 a 5 años después de los
primeros síntomas
PatogénesisPatogénesis
Teoría de una reparación aberrante
Teoría de una reparación aberrante
• Activación aberrante del epitelio • Liberación de mediadores fibrogénicos
por parte de las células epiteliales• Estimulación de focos de fibroblastos,
disminuyendo su apoptosis y aumentando la liberación de factores fibrogénicos.
ANTECEDENTESANTECEDENTES
• En algún momento de la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos entran en contacto con el surfactante.
• El surfactante disminuye la proliferación y la secreción de mediadores de la inflamación en fibroblastos de pulmón.
• En algún momento de la patogénesis de la fibrosis pulmonar, los fibroblastos entran en contacto con el surfactante.
• El surfactante disminuye la proliferación y la secreción de mediadores de la inflamación en fibroblastos de pulmón.
Efecto del surfactante sobre fibroblastos de pulmón
humano normal
Efecto del surfactante sobre fibroblastos de pulmón
humano normal
OBJETIVOSOBJETIVOS
• Determinar el efecto sobre la tasa de crecimiento y apoptosis de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de surfactante.
• Determinar la expresión de mRNA para colágena tipo I, TIMP-1, MMP-1 en cultivos de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de las sustancias mencionadas.
• Determinar el efecto sobre la tasa de crecimiento y apoptosis de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de surfactante.
• Determinar la expresión de mRNA para colágena tipo I, TIMP-1, MMP-1 en cultivos de fibroblastos de pulmón incubados en presencia de las sustancias mencionadas.
EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO CELULAR EN MEDIO
SIN SUERO
EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA TASA DE CRECIMIENTO CELULAR EN MEDIO
SIN SUERO
ENSAYO DE ELISA PARA FRAGMENTACIÓN DE DNA
ENSAYO DE ELISA PARA FRAGMENTACIÓN DE DNA
0
0.5
1
1.5
2
Control Survanta Survanta + SP-A
DE
NS
IDA
D O
PT
ICA
EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLÁGENA
EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLÁGENA
1 2 3 4
1) CONTROL
2) SP-A 50 g/ml
3) SURVANTA 500 g/ml
4) SURVANTA + SP-A 0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
CONTROL SP-A SURV SURV SP-A
RE
LA
CIO
N C
OL
AG
EN
A/1
8S
COLÁGENA
18 S
EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE COLÁGENA EN EL
MEDIO DE CULTIVO
EFECTO DE SURVANTA SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE COLÁGENA EN EL
MEDIO DE CULTIVO
EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLAGENASA
EFECTO DE SP-A Y SURVANTA SOBRE LA EXPRESIÓN DE mRNA DE COLAGENASA
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
RE
LA
CIÓ
N C
OL
AG
EN
AS
A/G
AP
DH
R 0 0 0,36775056 0,17025796
1 2 3 4
1) CONTROL
2) SP-A 50 g/ml
3) SURVANTA 500 g/ml
4) SURVANTA + SP-A
1 2 3 4
COLAGENASA
18 S
CONCLUSIONESCONCLUSIONES
• SURVANTA:– Induce la apoptosis en cultivos de fibroblastos
de pulmón humano normal.
– Disminuye la expresión génica y síntesis de pro 1(I) colágena.
– Aumenta la expresión génica de MMP-1 y actividad colagenolítica en el medio.
En conjunto, estos resultados sugieren que el surfactante puede tener un
efecto antifibrosante In vivo
En conjunto, estos resultados sugieren que el surfactante puede tener un
efecto antifibrosante In vivo
Efecto de la DPPC, el PG, y la PE sobre la expresión de colágena, en cultivos de
fibroblastos de pulmón humano normal
Efecto de la DPPC, el PG, y la PE sobre la expresión de colágena, en cultivos de
fibroblastos de pulmón humano normal
Yair Romero L
ObjetivoObjetivo
Determinar el efecto de los fosfolípidos más representativos del surfactante pulmonar en la
expresión de colágena en fibroblastos de pulmón humano normal.
Efecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mg*L-1
sobre la expresión génica de colágena
Efecto de Survanta, DPPC, PG y PE 600 mg*L-1
sobre la expresión génica de colágena
Efecto de los componentes del SP a dosis fisiológicas por 24 hrs.
Efecto de los componentes del SP a dosis fisiológicas por 24 hrs.
Curva dosis respuesta de la PE a 48 hrs Curva dosis respuesta de la PE a 48 hrs
Efecto de la PE 50 mg*L-1 en el tiempoEfecto de la PE 50 mg*L-1 en el tiempo
ConclusionesConclusiones
• A dosis altas dipalmitoilfosfatidilcolina, fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina disminuyen la expresión de colágena.
• A dosis que corresponden a la concentración del surfactante pulmonar en el interior del alveolo, sólo la PE disminuye significativamente la expresión de colágena.
• La fosfatidiletanolamina actúa de manera tiempo y dosis dependiente.
Efecto del surfactante y la fosfatidiletanolamina sobre la fibrosis
pulmonar en un modelo in vivo
Efecto del surfactante y la fosfatidiletanolamina sobre la fibrosis
pulmonar en un modelo in vivo
Modelo de fibrosis pulmonar in vivo
Modelo de fibrosis pulmonar in vivo
• Administración de bleomicina transtraqueal a ratones susceptibles.
• Cepa C57BL/6• Se midió:
– Curva ponderal de los animales– Colágena con la técnica de hidroxiprolina y/o
Sircoll– Analisis histopatológico
• Tinción de Masson
Administración del surfacante pulmonar por vía inhalada
Administración del surfacante pulmonar por vía inhalada
Protocolo para la administración de surfactante inhalado
Protocolo para la administración de surfactante inhalado
• Los fosfolípidos del surfactante se metabolizan aproximadamente en 48 horas.
• En el modelo de bleomicina, la fibrosis se obtiene alrededor del día 20
Diseño experimentalDiseño experimental
Grupo 1
Solucion salina intrataqueal
Nebulizaciones con solución
salina
Grupo 2
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con solución
salina
Grupo 3
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con surfactante
Grupo 4
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con surfactante
+ PE
Grupo 5
Bleomicina intratraqueal
Nebulizaciones con PE
Concentración de colágenaConcentración de colágena
Grupo n Colágena total (µg/mL) (promedio±SD)
p (comparado con grupo 2)
Control (grupo 1) 7 51.9 ± 22.1 .003Salina (grupo 2) 7 99.2 ± 8.1Survanta (grupo 3) 7 73.6 ± 18.8 .327Survanta enriquecido con PE (grupo 4)
6 51.02 ± 29.7 .004
PE 5 56.63 ± 24.1 .02
Estudio histopatológicoEstudio histopatológico
H & E
M
Control (no bleomicina)
PESurvanta + PE
SurvantaSalina
ConclusionesConclusiones
• El surfactante enriquecido con fosfatidiletanolamina mejora la fibrosis cuando es administrado tempranamente en el modelo murino de fibrosis pulmonar.
IMPLICACIONESIMPLICACIONES
• En conjunto, estos resultados sugieren que la administración temprana de surfactante pudiera tener un efecto terapéutico en patología pulmonar que conduce a fibrosis del parénquima
AgradecimientosAgradecimientos
• Yair Romero López• Nathalie Rosales• Beatriz Tlatelpa