Post on 16-Nov-2014
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Cambio de Cultura
PCR en Tiempo Real ®
Dra. Yamile SandovalPruebas diagnósticasPROMED
Lic. Catherine HerreraAplicaciones de Biología MolecularPROMED
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PRESENTAMOS EL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR MAS PEQUEÑO DEL MUNDO
GeneXpert® System
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Sistema GeneXpert®
1). Primer instrumento de diagnóstico molecular homologado por la FDA
2). El sistema GeneXpert es el único en combinar una preparación de muestra abordo con PCR en tiempo real
3). Resultados de muestras no procesadas en aproximadamente una hora.
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PCR EN TIEMPO REAL
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PCR
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
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TARGET
8 COPIES
4 COPIES
CYCLE 3CYCLE 2CYCLE 1
16 COPIES
CYCLE N =
2(N-1) COPIES
PCR CiclosPCR Ciclos
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Principios de PCR en Tiempo Real
1). Se monitoriza ciclo a ciclo el producto amplificado, a través de una señal de fluorescencia en el momento en que se está dando la reacción de PCR
La región “Blanco” será amplificada en presencia de un reportero.
El Instrumento excita el reportero, detecta la señal del reportero y colecta los datos fluorescentes.
2). La señal de fluorescencia incrementa en proporción al producto amplificado
3). La señal fluorescente será colectada en la fase exponencial de la PCR ciclo a ciclo.
4). La medición puede ser graficada en forma logarítmica o lineal.
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ENSAYO Taqman®
PRINCIPIO USADO EN LA PCR EN TIEMPO REAL
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BASELINE
LOG-LINEAR
PLATEAU
EXPONENCIALEXPONENCIAL
Curva de Amplificación de PCR en Tiempo RealCurva de Amplificación de PCR en Tiempo Real
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CICLAJE Threshold (Ct)
(fluorescence units)
CYCLE THRESHOLD
THRESHOLD LINE
END POINT FLUORESCENCE
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Tecnología GeneXpertTecnología GeneXpert
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Sistema de Diagnóstico GeneXpertSistema de Diagnóstico GeneXpert®®
Componentes del Sistema
GeneXpert
Módulo
Precisión de las fluídicas
Sistema térmico / Óptico
Cartucho
Contenedor seguro, y de un solo uso
Reactivos
Secos y Húmedos
Computadora
Software, código de barras, impresora, UPS
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Tecnología de Reactivos Cepheid
Perlas enzimáticas
Taq Polymerase
Componentes Generales de PCR
Perlas TSR
Primers y sondas dirigidas a las regiones blanco y secuencias conocidas
Perlas SPC
Bacillius globigii (Bg)
Control Interno Cepheid (CIC)
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Motor de la Jeringuilla
Tarjeta Madre
I-CORE
Uniframe
Motor de la válvula
Horno UltrasónicoPuerta del
Módulo
GeneXpertGeneXpert®® Módulo Módulo
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CÁMARAS DE PROCESAMIENTO
TUBO DE REACCIÓN
CUERPO DE LA VÁLVULA
Cartucho GeneXpertCartucho GeneXpert®®
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GeneXpert®: Un laboratorio de Biología Molecular en un cartucho
• Contiene todos los reactivos para una prueba en particular
• Control de contaminación:
• Ni la muestra ni el reactivo salen del cartucho
• Preparación universal de la muestra
• Corre nested PCR
• Capacidad de tests reflejo
• El material biológico se desecha fácilmente
Cartridge Bodywith Multiple ReagentReservoirs
PCR ReactionTube
Ultrasonic Interface
Rotary Valve
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I-CORE ModuloIntelligent Cooling/Heating Optical Reaction Module
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Kit GeneXpert
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GeneXpert® 6 Canales
Channel Excitation Range Emission Range Dyes
1 375-405 nm 420-480 nm CF1
2 450-495 nm 510-535 nm FAM
3 500-550 nm 565-590 nm Alexa Fluor® 532
4 555-590 nm 606-650 nm Texas Red®
5 630-650 nm 665-685 nm Alexa Fluor® 647
6 630-650 nm >700 nm CF6
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REPORTES SENCILLOS Y CON ACCESO A SISTEMAS LIS DEL LABORATORIO
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CUALIDADES DEL SISTEMACUALIDADES DEL SISTEMA
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GeneXpert® PCR en tiempo real
1). Extracción automatizada de ADN o ARN de una muestra biológica
2). Cartucho cerrado de un solo uso
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GeneXpert® Escalas posibles del sistema
GX-I GX-IV GX-XVI GeneXpert Infinity Series
GeneXpert Module
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Simple, Fácil, Walk-away
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FÁCIL
Uso
RÁPIDO
Respuestas
CONFIABLES
Resultados
Pruebas Moleculares en corto tiempo y con resultados confiables
Xpert MTB/RIF – Romain Prieur
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Sources: Eveillard et.al., J Hosp Infect (v. 59, 2005); Salgado et.al., SHEA 2003, abstract 28, p. 61; Bhalla et a,
Infect Control Hosp Epidemiol (v. 25, 2004) – Special thanks to Becton, Dickinson and Company.
Los cultivos de bacteriología solo captan
““la punta del Iceberg”la punta del Iceberg”
La transmisión se da no solo por pacientes La transmisión se da no solo por pacientes infectados, sino también por pacientes infectados, sino también por pacientes
colonizadoscolonizados
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GeneXpert® PCR en tiempo real
PRUEBAS DISPONIBLES
Análisis Clínicos (IVD-Enfermedades virales e infecciosas)
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Xpert® vanA/vanB
Xpert® MRSA
complete
Xpert® MRSA/SA
SSTI
Xpert® MRSA/SA
Nasal
Xpert® MRSA/SA BC
Xpert® MTB/RIF
Xpert® C. Difficile
Xpert® GBS
Xpert® EV
Xpert® Flu A Panel
Xpert® HemosIL® FII & FV
Xpert® BCR-ABL
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Xpert® MTB/RIFPrueba de PCR en tiempo real que permite detectar cepas
del complejo M. Tuberculosis y de las cepas resistentes a la Rifampicina
Permite un análisis semicuantitativo in vitro de muestras de esputo y concentrado de lavado bronquial
Preparación : 2 minutos
Tiempo de incubación :15 minutos
Resultado: 90 minutos vs 1-2 sems en cultivos líquidos y 4-6 sems en los sólidos
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MTB/RIF - Xpert® permite
1- 1- La detección del ADN del complejo MTB en muestras de esputo o sedimento concentrado ya sea de esputo o LBA, BAAR + o BAAR -
2- La detección de la mutación del gen rpoB /región 81bp que esta
asociada a la resistencia a la rifampicina en pacientes de alto riesgo
3- La prueba MTB/RIF-Xpert® esta indicada en pacientes con sospecha clínica de TBC y en pacientes que no han recibido tratamiento, pacientes con menos de 7 días de tx. o pacientes que no han recibido tx en los últimos 60 días
GeneXpert® PCR en tiempo real
Cepheid Confidential & Proprietary
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Sensibilidad de las Pruebas de susceptibilidad Genotípicas
Droga Blanco Sensibilidad
Rifampicina rpoB 98%INH (katG), inhA 85%PZA pncAEtambutol emB
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GeneXpert® PCR en tiempo real
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Xpert® vanA/vanB
Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico
Detección de los genes VanA y VanB que confieren al enterococcus la resistencia a la Vancomicina
1:8 de las infecciones hospitalarias son por enterococcus y de estas 30% resistentes a la Vancomicina
Pacientes de mayor riesgo UCI e inmunocomprometidos
Resultado: 45 minutos
Tipo de muestra: hisopado rectal y perianal
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Xpert® SA/MRSA complete Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico
>60% de las infecciones hospitalarias son por staphilococcus aureus
Alta mortalidad
Ha demostrado tener una mayor sensibilidad diagnóstica que los métodos de cultivo cromogénico
Resultado: 56 minutos
Muestra: Hisopado nasalPruebas que demandan en Control de Infecciones Nosocomiales
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GeneXpert® PCR en tiempo real
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GeneXpert® PCR en tiempo real
• Causa la mayor morbilidad y mortalidad neonatal1
• Afecciones neurológicas • Fatal en el 5% de los infantes infectados
• Las guías del CDC especifican que se debe hacer la prueba a todas las pacientes embarazadas
• La única prueba aceptada hasta el momento ha sido el cultivo
• Los cultivos toman tiempo – no es una opción para los nacimientos antes de término, ni para las mujeres sin control del embarazo o cuando los resultados no están disponibles (15 al 30% de los nacimientos)
• Antibióticos profilácticos — la resistencia cada vez es mayor
Xpert® GBS
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BOX 2. Procedures for processing clinical specimens for culture of group B Streptococcus (GBS ---Detection of GBS can be determined directly from broth media using latex agglutination, probes or nucleic acid amplification tests (NAAT) such as PCR.
Comprison of culture and 2 real-time polymerase chain reaction assays to detect group B Streptococcus during antepartum screening. Diagn Microbiol Infect Dis 2007;59:17–22. Block T, Munson E, Culver A, Vaughan K, Hryciuk JE.
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Para que una prueba sea considerada clinicamente útil en el período intraparto como método de tamizaje para GBS debe poder ser realizada de manera sencilla al lado de la cama del paciente, ya sea por el personal de la sala de labor o parto, deben obtenerse resulatdos en menos de 30 min y debe poseer una sensibilidad y especificidad >90%Revisión de las Guías CDC, 2010
Preparación : 2 minutosPreparación : 2 minutosResultado: 30 minutosResultado: 30 minutosMuestra: hisopado Muestra: hisopado
vaginal y vaginal y rectalrectal
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Xpert® C. difficile
Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico
Prueba diagnóstica rápida ~56 min.
Detección de cepas toxigénicas y epidémicas de Clostridium difficile 027/NAP1/B1
Pacientes de riesgo: hospitalizados, exposición a AB, edad avanzada
Tipo de muestra: heces fecales
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GeneXpert® PCR en tiempo real
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Xpert® EVDiagnóstico molecular rápido de meningitis causada por enterovirus
GeneXpert – Test de 2 horas Puede reducir la necesidad de otras pruebas y el uso de antibióticos
Acceso a la prueba 24/7Tipo de muestra: LCR Volumen de muestra 140µLPreparación: 5 minutosResultado: 2.5 horas
***Detectará 60 serotipos de Enterovirus
La secuencia Target está en el 5’ UTR del RNA del enterovirus
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GeneXpert® PCR en tiempo real
Xpert® Influenza
Prueba con FDA, para uso de Diagnóstico Clínico
Prueba diagnóstica rápida ~menos de 1 hora, resultados en tiempo real STAT
Detecta especímenes Flu A y H1N…diseño múltiplex
Mejor desempeño que pruebas rápidas EIA, que no detectan hasta 70% de las infecciones
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1) Poca manipulación de las muestras: no más de 6 minutos
2) Aprobación del FDA
3) Aprobación CE (Comunidad Europea)
4) Resultados: entre 30 minutos a 2 horas dependiendo de la prueba
5) No se requiere de espacios especiales
6) No se requiere de personal especializado en biología molecular
7) Descarte de material biológico sin riesgo de contaminación
Sistema GeneXpert®
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GRACIAS
Cambio de ParadigmaSistema GeneXpert®