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INTI-Lácteos PTM-Agosto 2004 1
LIPÓLISISLIPÓLISIS
Licenciada Mónica Campanaro INTI Lácteos Rafaela
Agosto 2004
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Hidrólisis enzimática de la materia grasa
que produce acumulación de ácidos grasos libres ( FFA ) y provoca la aparición de rancidez en la leche y en los productos
lácteos.
Sustrato Glóbulo de Grasa
Enzima Lipasas
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¿QUÉ SON LAS LIPASAS?¿QUÉ SON LAS LIPASAS?
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CLASIFICACIÓNCLASIFICACIÓN
1) Naturales: propias de la leche
2) Leucocitarias: secretadas por las células somáticas
3) Microbianas: secretadas por la flora psicrótrofa
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LIPASAS NATURALES:LIPASAS NATURALES:
Secretadas por las glándulas mamarias
Son termolábiles
pH óptimo entre 8 y 9
Se inhiben en condiciones a altas concentraciones de: sales, AGL y proteínas
Atacan preferentemente las posiciones extremas del glicerol → AGLs producidos son ricos en AGs de cadena corta
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LIPASAS MICROBIANASLIPASAS MICROBIANAS Provienen esencialmente de bacterias psicrótrofas (principalmente P. Fluorescens)
Su producción se ve favorecida por la presencia de caseínas y proteínas del lactosuero
pH óptimo entre 8 y 9, 50% de activiadad al pH de la leche
Temperaturas óptimas de acción entre 30 y 40ºC
Atacan preferentemente los triglicéridos homogéneos, con AG de cadena corta o insaturadas
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SUSTRATOSUSTRATO
Glóbulo de Grasa
↓
Triglicéridos protegidos por una
“membrana”
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TIPOS DE LIPÓLISISTIPOS DE LIPÓLISIS
1) 1) LIPÓLISIS INDUCIDALIPÓLISIS INDUCIDA
Cuando la leche cruda se somete a tratamientos físicos o químicos que rompen la membrana del glóbulo de grasa y facilitan el acceso de la lipasa a los triglicéridos.
Este tipo de tratamientos se denominan de “Tratamientos de activación” y se producen durante y después del ordeñe.
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a) a) Tratamientos de Activación:Tratamientos de Activación:
Agitación y formación de espuma
Cambios de temperatura
Homogenización
Procesos de congelación y derretimiento
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b) b) ¿Cómo afecta la temperatura ¿Cómo afecta la temperatura a estos tratamientos?a estos tratamientos?
Durante la activación: a menor temperatura más resistencia a la activación mantener la leche refrigerada
Durante el almacenamiento: una vez activada mantener la leche a bajas temperaturas.
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c) c) Problemas en el tamboProblemas en el tambo
Ordeñadoras:diseños inadecuados y poco mantenimiento
Entrada de aire en pezoneras
Juntas que pierden
Agujeros y rajaduras en tubos de goma
Bajos caudales de leche
Favorecen entrada de aire → lipólisis
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Cañerías : mayor activación a mayor longitud y número de juntas
Tanque de enfriamiento : formación de espuma, caída de la leche al tanque baja activación⇒
Bombeo: Utilización de bombas centrífugas debajo de su capacidad y admisión de aire a través de juntas defectuosa alta activación⇒
c) c) Problemas en el tamboProblemas en el tambo
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Almacenamiento• la cantidad de lipólisis aumenta con el tiempo y la
temperatura de almacenamiento• La velocidad a la cual ocurre la lipólisis va
disminuyendo pero no se frena completamente hasta la inactivación de la lipasa ( pasteurización ).
• A mayor tiempo de almacenamiento mayor es la posibilidad del crecimiento bacteriano que también contribuye significativamente a la lipólisis
c) c) Problemas en el tamboProblemas en el tambo
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- - no es determinante y está asociada al pasaje de la leche por las bomba
- debe ser refrigerado
d) d) Problemas en el transporteProblemas en el transporte
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e) e) Problemas en fábricaProblemas en fábrica
Excesivo bombeo → alta agitación y mezcla con aire
Desnatado → activación por cambios de T↳ daño mecánico
Mezcla de leche cruda con leche homogenizada Refrigeración deficiente Largos tiempos de almacenaje
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TIPOS DE LIPÓLISISTIPOS DE LIPÓLISIS
2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEA2) LIPÓLISIS ESPONTÁNEA
• cuando la leche presenta lipólisis en forma natural sin ningún tipo de activación
• Se las denomina “leches naturalmente activas”, “leches susceptibles” o “leches espontáneas”
• Leches “normales” son las que no presentan lipólisis espontánea
• Porcentaje de vacas en un tambo que producen leche espontánea se estima entre 3 y 35%
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a) a) Características de leche espontánea:Características de leche espontánea:
Efecto de enfriamiento
Enfriamiento a T < 15 ºC inmediatamente después del ordeñe mayor grado de lipólisis
Mezcla con leches normales
La leche espontánea disminuye su actividad lipolítica
Susceptibilidad a la lipólisis inducida
Es más susceptible a los distintos tipos de activación, probablemente debido a membranas más débiles
Factores bioquímicos
Membranas más débiles
Cantidad de lipasa
Escasa presencia de inhibidores
( presentes en leches normales )
Presencia de activadores de lipasa
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b) b) Factores relacionados a la vacaFactores relacionados a la vaca
Estado de lactancia
Alimentación y estado nutritivo
Estación del año
MástitisRaza
Producción de leche y de grasa
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TIPOS DE LIPÓLISISTIPOS DE LIPÓLISIS
3) 3) LIPÓLISIS MICROBIANALIPÓLISIS MICROBIANA
Producida principalmente por bacterias psicrótrofas, cuya característica es crecer a bajas temperaturas ( ej. Pseudomonas )
Las lipasas microbianas pueden atacar al glóbulo de grasa intacto
Muchas de ellas son termorresitentes, no se inactivan por procesos de pasteurización y pasan a los productos lácteos donde producen rancidez
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LIPÓLISIS LIPÓLISIS
EN EN
PRODUTOS LÁCTEOSPRODUTOS LÁCTEOS
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¿ Por qué nos interesa estudiar la Por qué nos interesa estudiar la lipólisis ?lipólisis ?
La lipólisis produce ácidos grasos libres , que junto a otros compuestos, son los responsables del aroma y sabor de la leche y productos lácteos
Según la naturaleza y la cantidad de estos AGLs se producen defectos del flavor.
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Contribución de los sitemas enzimáticos a Contribución de los sitemas enzimáticos a la lipólisis de los productos lácteosla lipólisis de los productos lácteos
AGL en productos lácteos
Lipólisis pre-manufactura:AGL provinientes de la leche Inducida – Espontánea
Lipólisis post-manufactura:AGL desarrollados en los productos.-Crecimiento microbiano.-Pobre Higiene.-Actividad de enzimas termorresitentes
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Defectos del flavor:Defectos del flavor:
C4 – C12
responsables del flavor lipolítico
C4 al C8
Sabor rancio
C10 y C12
Sabor jabonoso
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Ácidos débiles que se distribuyen en la leche y en los productos lácteos según su solubilidad y la cantidad de agua del producto.
En los procesos tecnológicos:
los AGL de cadena corta siguen la fase acuosa
Los de cadena larga se van con la grasa
Ácidos Grasos Libres:Ácidos Grasos Libres:
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Producto Valor (BDI) FFA probables causas de problemas
FFA en rango normal
Leche, leche en polvo 1.5 – 2.0 0.3 – 1.0
Crema 1.7 – 2.1 0.5 – 1.2
Manteca 2.0 0.5 – 1.0
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Leche comercialLeche comercial- la lipólisis no parece ser un tema importante
- Aparece sabor rancio en valores de BDI > 1.5
- A bajos niveles la rancidez hidrolítica en estos productos se aprecia organolépticamente como sabor a viejo, sucio o sabor a vaca.
- A altos valores los defectos se perciben como sabor a cabra, amargo, butírico y rancio
- Otros off flavors ( como oxidado ) pueden enmascarar bajos niveles de rancidez.
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Crema y MantecaCrema y Manteca- la crema presenta valores de BDI mayores a
los de la leche.- si la leche utilizada en la producción es
rancia, los AGL responsables de la rancidez se van parcialmente con el agua.
- generalmente la lipólisis desarrollada es post-manufactura
- La sal inhibe la acción de las lipasas- Los defectos se perciben como sabor a
sucio, amargo, rancioy aceitoso- Otros off flavors ( como oxidado ) pueden
enmascarar bajos niveles de rancidez.
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QuesosQuesos- Los AGL contribuyen en gran parte al
flavor característico de muchos tipos de quesos.
- El grado de “aceptación” de esa lipólisis depende del tipo de quesos
-Generalmente presentan lipólisis de post-manufactura debido al agregado de enzimas lipolíticas o a la adición y crecimiento de microorganismos productores de enzimas lipolíticas
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Sin agregado de agentes generadores de lipasas: características organolépticas poco pronunciadas, por ej. quesos blandos y semiduros
Con agregado de lipasas fúngicas: aroma y sabor pronunciados, por ej. Roquefort, Stilton, Camembert
Con agregado de lipasas gástricas o naturales: características organolépticas bien marcadas, por ej. Quesos duros italianos como Parmesano, Romano, Provolone
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Cuándo consideramos rancidez en un Cuándo consideramos rancidez en un queso?queso?
- Dependerá del tipo de queso y se apreciará organolépticamente, estableciéndose una relacíón entre BDI y umbrales de percepción de rancidez.
- Excesivos valores de AGLs dan sabores rancio, sucio o butírico.
- La rancidez será responsabilidad de las lipasas bacterianas ya que las naturales de la leche se inactivan en las condiciones de pH y contenido de sal del queso.
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Dificultad en el batido de la cremaPérdida de grasa en el suero de mantecaInhibir las bacterias de starters por FFA (leches fermentadas o cultivadas)Retardar y debilitar acciones del cuajoDisminuye el rendimiento queseroBaja la capacidad del espumado de la leche
CONSECUENCIAS TECNOLÓGICASCONSECUENCIAS TECNOLÓGICAS
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MÉTODOS DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN DETERMINACIÓN
DE AGLsDE AGLs
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Generalidades:Generalidades:
No existe un método de Referencia
Los métodos se pueden clasificar en:
Determinan la “acidez global” Métodos ⇒de rutina
Determinan individualmente cada AGL ⇒
métodos cromatográficos.
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Expresión de los resultados:mmol/100g de grasa ó mmol/l
⇓Depende del método utilizado
Métodos de aislación de los AGLs:
Desestabilizan la emulsión y separan la
grasa: BDI
Extracción con solventes
orgánicos:métodos cromatográficos, Deeth
Generalidades:Generalidades:
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Aspectos a tener en cuenta en el Aspectos a tener en cuenta en el análisis de AGLs:análisis de AGLs:
1)Prevención e inhibición de la lipólisis: Inhibición química → no es la más adecuada, existen ejemplos de uso de Dicromato y H2O2. Inactivación térmica → se inactiva térmicamente la lipasa. Ejemplos: termisar las muestras hasta 72ºC en un baño y dejarlas 15s una vez alcanzada la T. Inhibición físico-química → se mezcla la muestra con la mezcla extractiva. Por ej.:en métodos con extracción con solventes, la grasa y los AGLs se extraen con una mezcla nopolar ácida ( la lipasa se inactiva a bajos pH ).
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2) Aislación de los AGLs:
Método de Frankel y Método de Frankel y TarassukTarassuk
Método BDIMétodo BDI
Aislación de la grasa como tal
Método del batidoMétodo del batido
Método de DoleMétodo de Dole
Método de DeethMétodo de Deeth
Uso de ácido SalicílicoUso de ácido Salicílico
Extracción usando solventes orgánicos
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3) Determinación de los AGLs:
Determinación Determinación de la acidez de la acidez
globalglobal
Determinación Determinación de los AGL de los AGL individualesindividuales
Titulación
Cambio de color en un indicador
Formación de complejos coloreados
Métodos Cromatográficos:
GLC, HPLC
Análisis de los éstres metílicos
Análisis directo
de los AGL
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Método de DeethMétodo de Deeth
Se aplica a leche fluída y leche en polvo
Procedimiento:
3 ml de leche + 10 ml mezcla ( Isopropílico:Epetrólero:H2SO4 4N) + 6 ml EP + 4 ml de H20
Se agita 15 seg y se deja en reposo 4 minutos
se toman 5 ml de la capa superior
Se agrega fenolftaleína
Se titula con KOH metanólico 0.02 N
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Cálculos:
ųequivalentes/ml de leche = V tit * N * 1000 P*Val
donde Vtit = Volumen del titulante
N = Normalidad del titulante
P= Volumen alícuota/ Volumen capa supeior
Val = Volumen de leche utilizada
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Método del BDIMétodo del BDI
Acidez Titulable de la Grasa: es la
cantidad de álcali requerida para neutralizar
los ácidos grasos libres contenidos en una
masa de grasa presente en la muestra.
Se expresa en:
mmoles de álcali/100 gr. de grasa.
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Principio: Una cantidad de muestra (leche, crema, dulce de leche, queso) es mezclada cuidadosamente con una solución conteniendo Tetrafosfato de sodio y un agente tensioactivo, y calentando en un baño de agua hirviendo para separar la grasa.
Una cantidad medida de grasa es disuelta en un solvente orgánico y titulada con álcali alcohólico.
Precisión del método: 0.2-2 mmoles /100 gr. de grasa. Repetibilidad: 0.05 mmoles/100 gr. de grasa.
Método del BDIMétodo del BDI
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- En un butirómetro para crema o queso cerrar uno de los extremos y llenar con 16 0.5 ml de leche + 4.5 0.1 ml de reactivo de BDI.
- Cerrar y homogeneizar en ángulos de 180 º por 10 veces.- Ajustar la escala con el tapón inferior.
- Colocar en Baño María a 95 ºC durante 15 minutos hasta separación de la grasa. - El agua debe estar por arriba del nivel de la muestra.
- Pasar a un Baño de 45 ºC hasta que la grasa alcance 45 ºC.
Separación de la grasa
Método del BDIMétodo del BDI
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- 0.25 gr. de grasa + 5 ml de Fat solventTitular con sn. valorada de TBHA 0.01 M hasta viraje de amarillo a
verdoso en ausencia de CO2.
BDI = 100 x V x C = mmoles/100 gr. de grasa
masa muestra
Titulación
Método del BDIMétodo del BDI
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Método Cromatográfico de DeethMétodo Cromatográfico de Deeth Se aplica a leche y productos lácteos
Se determinan los AGL sin previa esterificación
Se extraen los AGL con mezcla ácida de Eter étílico y Hexano
Se agrega estándar interno ( C5 )
La separación de los AGL se realiza pasando el extracto etéreo en columna de alúmina desactivada, los AGL quedan adsorbidos a la alúmina.
Los AGL se desorben de la columna mediante el agregado de una mezcla de éter isopropílico con 6% de ácido fórmico.
Se inyecta al GLC.
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MétodosMétodos parapara determinacióndeterminación de AGLsde AGLs
Obtención de AGL + grasa
Referencia Aislamiento de los AGL
Determinación de los AGL
Por batido
. Método del batido Titulación
Uso de solución de detergente ( BDI )
. Thomas et. Al (1955 )
. Driessen et al. ( 1977 ) Titulación
Extracción por solventes: . etanol + e.etílico . ácido silícico medio ácido medio alcalino . Solvente de Dole . Éter Etílico acidificado . CHM mezcla 49/49/2 Cloroformo/Heptano/ Metanol
. Frankel y Tarassuk( 1955) . Harper et. Al (1956) . Woo & Lindsay (1980) . Heeschenn et al. (1975) . Deeth et al. ( 1975) . Deeth et al. ( 1983 ) . Needs et al ( 1983) . Koops & Koops ( 1977 ) . URCIL (1982)
.Elución con 5% butanol en CHCl3 . Elusión con EE y ácido fórmico . Autoanalizador . Autoanalizador . Adsorción en alúmina . Adsorción en resina . Como sales de Cobre . . Como sales de Cobre
.Titulación . GLC . Titulación . Titulación . GLC .GLC . Colorimétrico . Colorimétrico