Modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología alimentaria R. Osta.

Modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología

alimentaria

R. Osta

Introducción 1/68

Animal transgénico para la Animal transgénico para la Esclerosis Lateral AmiotróficaEsclerosis Lateral Amiotrófica

Definición4/68

¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?¿ Qué son los organismos modificados genéticamente?

Cualquier organismo cuyo material genético ha sido modificado de una manera que no se produce de forma natural en el apareamiento o en la recombinación natural.

(Directiva 90/220/CEE)

¿Qué vamos a tratar?.¿Qué vamos a tratar?.

- Modificación genética en organismos unicelulares

-Modificación genética en organismos pluricelulares.

- Aplicaciones de esta metodología y clonación.

- Modificación genética en organismos unicelulares

-Modificación genética en organismos pluricelulares.

- Aplicaciones de esta metodología y clonación.

Indice

Figura 1 Esquema de mejora genética de levaduras vínicas mediante el uso de técnicas de DNA recombinante

Modificación de organismos

unicelulares: bacterias y

levaduras.

¿Si vemos un ¿Si vemos un video?video?

Modificación genética en organimso unicelulares

DefiniciónIntroducción2/68

Pero ,¿qué Pero ,¿qué necesitaremos necesitaremos

recordar?recordar?

Introducción 3/68

Estructura de un gen

PROMOTOR

RNA (cDNA)

IntronesExones

PROTEÍNA

Recombinación Recombinación homólogahomóloga

Al azarAl azar

TRANSGÉNESISTRANSGÉNESIS

Tipos de transgénesis

GENOMAGENOMA

GENGEN

TRANSGÉNTRANSGÉN

GENGEN

Al azarAl azar

TRANSGÉNTRANSGÉN

ConcatémerosConcatémeros

Gen crucialGen crucial

Zonas metiladasZonas metiladas

GENGEN

TRANSGÉNTRANSGÉN

Recombinaciónhomóloga

TRANSGÉNTRANSGÉN

•Expresión

•Localización de la expresión

•Regulación de la expresión.

•cDNA, DNA genómico.

•Promotor.

•Enhancer, elementos cis y trans.

¿De qué constará el ADN que queremos insertar?

Transgénesis al azar

s1-antitripsina

humana

s1-antitripsina

humana

Promotor-lactoglobulina

bovina

Transgén simpleTransgén simple

¿Por qué no lo ¿Por qué no lo pones en la pones en la

pizarra que nos pizarra que nos enteraremos enteraremos

más?más?

Knock-in: Animal creado mediante recombinación homóloga para que un gen se exprese bajo el promotor que deseemos.

Knock-out: (fuera de combate)Animal creado mediante recombinación homóloga para evitar la expresión de un gen.

Términos utilizadosTérminos utilizados

Transgénesis por recombinación homóloga

-Zona homólogas al gen de interés.

-Resistencia a antibióticos/mismo gen:

- Kanamicina (procariotas)- Neomicina (eucariotas)

¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?¿De qué consta una construcción para la recombinación homológa?

-Opcional:- Gen marcador- Gen de expresión.

ock-in

GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO GENOMA DE LAS CÉLULAS EN CULTIVO

CONSTRUCCIÓN GENÉTICA

MMGenGen

marcadormarcador

ResistenciaResistencia

Recombinación homólogaRecombinación homóloga

PromotorPromotor

pp DNADNA

DNADNADNADNA

MMMMGen Gen

marcadormarcadorGen Gen

marcadormarcador

ResistenciaResistenciaResistenciaResistencia

PromotorPromotor

DNADNADNADNA

MMMMGen Gen

marcadormarcadorGen Gen

marcadormarcador

ResistenciaResistenciaResistenciaResistencia

PromotorPromotor

MODOS DE INTRODUCCIÓN DEL TRANSGEN

Modos de introducción del transgen

DIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARESDIRECTAMENTE EN EMBRIÓN.REALIZABLES EN CULTIVOS CELULARES

IN VIVOIN VIVOIN VIVOIN VIVO

IN VITROIN VITROIN VITROIN VITRO

SÓLO EN CULTIVOS CELULARESSÓLO EN CULTIVOS CELULARES

•DIRECTOS•DIRECTOS

•INDIRECTOS•INDIRECTOS

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Esponda, P.C.B.I. y C.S.I.CEsponda, P.C.B.I. y C.S.I.C

ESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDESESPERMATOZOIDES

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.

• Partículas de tungsteno u oro Partículas de tungsteno u oro • Descarga con helio.Descarga con helio.

Características:Características:– Capacidad de introducción limitada.Capacidad de introducción limitada.

HA SIDO MUY HA SIDO MUY UTILIZADA EN UTILIZADA EN

PLANTASPLANTAS

Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.Biolística o método de Biolística o método de bombardeo.bombardeo.

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

• Microinyección en el Microinyección en el pronúcleo masculino.pronúcleo masculino.

• Microinyección en el Microinyección en el citoplasma del huevo.citoplasma del huevo.

Añaden protección al DNA Añaden protección al DNA (polilisinas, etc.)(polilisinas, etc.)

MICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓNMICROINYECCIÓN

•Transgen

•Cigotos

•Introducir el transgén en el cigoto

•Desarrollar el embrión

•Construcción al azar.

•Animales donadores.

•Micromanipulador.

• Madres receptoras

¿Qué necesitamos para realizar la microinyección?

•Ovulación cíclica y corta (ratón, rata).

– Machos y hembras donadoras

– Hembras receptoras y machos vasectomizados

•Otras especies

– Tratamientos hormales en las hembras.

– Hembras donadoras y receptoras y machos.

¿Como consigo los cigotos?

MicromanipuladorMicromanipulador

Pronúcleo masculinoPronúcleo masculino

En animales domésticos (sobre

todo en la especie porcina)

es necesario centrifugar el huevo

debido al vitelo.

•INDIRECTOS•INDIRECTOS- Bacterias/Virus

- Liposomas

- Bacterias/Virus

- Liposomas

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

- Liposomas

- Bacterias/Virus

- Liposomas

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Agrobacteriumtumefaciens con gen de interes

DNA de la planta

Co-cultivo 48 horas22ºC

Formación de callos

Aislamiento de posiblesplantas transformadas

DNA insertadoen el genoma

Pruebas genéticasque permitancontrolar la inserción del gen

- Liposomas

- Bacterias/Virus

- Liposomas

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

• CATIÓNICOSCATIÓNICOS– Su carga positiva reacciona con la

negativa del DNA formando un complejo.

• pH SENSIBLE O ANIÓNICOpH SENSIBLE O ANIÓNICO– Mediante una desestabilización por bajo

pH el DNA entra en “núcleo del liposoma”.

LIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMASLIPOSOMAS

MÉTODOS “IN VITRO”MÉTODOS “IN VITRO”(Cultivos celulares)(Cultivos celulares)

Las células modificadas Las células modificadas genéticamente deberán genéticamente deberán

ser introducidas ser introducidas posteriormente en el posteriormente en el

embrión u óvuloembrión u óvulo

- Liposomas

- Bacterias/Virus

- Liposomas

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

- Liposomas

- Bacterias/Virus

- Liposomas

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

•QUÍMICOS•QUÍMICOS

•FÍSICOS•FÍSICOS

Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio

•Coprecipitación de DNA y calcio Coprecipitación de DNA y calcio (presencia de fosfato).(presencia de fosfato).

•Introducción por endocitosis.Introducción por endocitosis.•Eficiencia de transfección 1% (max. Eficiencia de transfección 1% (max. 10%)10%)

Características:Características:- Pequeña expresión del transgén.- Introducción de varias copias.- No hay toxicidad para las células.

FOSFATO DE CALCIOFOSFATO DE CALCIOFOSFATO DE CALCIOFOSFATO DE CALCIO

- Liposomas

- Bacterias/Virus

- Liposomas

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

Espermatozoid

- Biolística

Microinyección

•QUÍMICOS•QUÍMICOS

•FÍSICOS•FÍSICOS

Precipitación con fosfato de calcioPrecipitación con fosfato de calcio

•FÍSICOS•FÍSICOS ElectroporaciónElectroporación

ELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓNELECTROPORACIÓN•Introducción del transgén por poros nucleares tras un choque eléctrico.

•Factores de eficacia: naturaleza, distancia entre electrodos, buffer y CÉLULAS.

Características:Características:- Mucha muerte celular

- Tendencia a introducir una sola copia. Método de elección para la recombinación homóloga.

¿Cómo consigo un animal

adulto a partir de células en

cultivo?

¿Cómo consigo un animal

adulto a partir de células en

cultivo?

DOS OPCIONESDOS OPCIONES

Células indiferenciadas que sean capaces de colonizar

un embrión y formar parte de su organismo, incluidos los gametos.

Células transformadas en indiferenciadas:

CLONACIÓN2

Células ES o indiferenciadasCélulas ES o indiferenciadas

SÓLO AISLADAS EN RATÓNSÓLO AISLADAS EN RATÓNModos de introducción del transgen

NUMEROSOS INTENTOS PERO......NUMEROSOS INTENTOS PERO......

Las células ES no se han aislado en otras especies

animales

(Experiencias realizadas en peces)

OTROS CULTIVOS CELULARES:Fibroblastos, Glándula

mamaria, etc.

Clonación de células somáticas

DOLLYDOLLY

DOLLY DOLLY

- Baja la transcripción.

- Baja la traducción.

- Condensación de la cromatina

PRODUCCIÓN DE: Millie,

Christa, Alexis, Carrel y Dotcom

Polejaeva, I.A. y cols. (2000)Nature, 407, 86-90Polejaeva, I.A. y cols. (2000)Nature, 407, 86-90

1. Cambio de características de organismos

utilizados en la producción de alimentos

2.-Producción de sustancias terapéuticas en

- Organismos unicelulares.

- Biotecnología de corral.

3.Nuevos alimentos

- Cambio cuantitativo

- Cambio cualitativo

Aplicaciones

AplicacionesAplicaciones

3.Nuevos alimentos

Aplicaciones

linalol linasa

Gen LIS

Sintesis de linalol

Asociado a los componente de aroma afrutado y floral

Aplicaciones

Introducción del Gen LIS en levadura viníca

3.Nuevos alimentos

Aplicaciones

Producción de proteínas recombinantes en organismos

unicelulares

Transformación

Crecimiento secundario

Purificación proteína

Crecimiento a gran escala

Salida al mercado

Biotecnología de corral

- Transgénicos clásicos hasta ahora ya que no existían células indiferenciadas en los animalesque nos interesan.

- Producción de proteínas de interés en

sanidad.Ejemplo (ya creado):Tracy

(Roslin Institute - PPL Therapeutics)

Aplicaciones

TRACYTRACY

s1-antitripsinahumana

Aplicaciones

Primeros ensayos en ratón:

4.3 Kb Promotor

WAP de ratón

6.6 Kb de AAT-humanocDNA

12.5 gr./litroObtienen microlitros

de leche

Volumen/año gr./año Producción vital

8 litros400 litros10.000 l.

0.04 Kg.2 kg. 50 kg

1 Kg.100 kg.

toneladas

ConejaOvejaVaca

Aplicaciones

Roslin Institute-PPL Therapeutics(lo que sabemos......)

s1-antitripsinas1-antitripsina

FibrinógenoFibrinógeno

Factor VII y Proteína CFactor VII y Proteína C

Factor XIFactor XI

BSSL (lipasa)BSSL (lipasa)

Anticuerpos humanizadosAnticuerpos humanizados

Aplicaciones

POLLY: Primer clon transgénicoPOLLY: Primer clon transgénico

Aplicaciones

3.Nuevos alimentos

Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentosModificaciones cuantitativas

- Muchos intentos realizados.

- Transgénicos clásicos.

- Animales y plantas usados en

alimentación.

Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentos

REINO VEGETAL

Aplicaciones

Ejemplo (ya creado):Un Salmón (Aqua Bounty Farms):

- Promotor: AFP (proteína anticongelación)- cDNA: Hormona del crecimiento.

LA REVOLUCIÓN AZUL!!!!

Producción Animal/Nuevos alimentosModificaciones cualitativas

alimentación.

Reino vegetal: la mayoría de los alimentos.Reino animal: Proyectos de creación.

Aplicaciones

Producción Animal/Nuevos alimentosReino vegetal

alimentación.

- Tomate Flavr-Savr. - Maíz Bt.

- Tolerancia a los herbicidas 54% - Resistencia a insectos (Bt) 37%

- Resistencia vírica 14% - Rasgos cualitativos >1%

Aplicaciones

- Promotor: 35 S virus mosaico de coliflor.- RNA antisentido de la enzima poligalacturonasa (actuá sobre la pectina)

- Tomate Flavr-Savr: Primer producto transgénico comercializado en el mundo (Mayo de 1994). Maduración retardada.

Aplicaciones

Maíz que expresa la toxina del Bacillus thuringiensis se une a los receptores del tubo digestivo del insecto (taladro).

- Maíz Bt:Muchisima presion social.

Aplicaciones

¿Qué es un alimento transgénico?

-Productos vegetales: tomate "Flavr Svr”, Maiz Bt...

- Productos de animales transgénicos:salmones, leche sin determinadas proteínas, etc.

- Alimentos que en su preparación se utilizan sustancias modificadas genéticamente (cuajo recombinante)

- Animales tratados con proteínas recombinantes...

- Animales alimentados con alimentos transgénicos

Aplicaciones

Modificación de los genomas para su aplicación en biotecnología alimentaria R. Osta.

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