DISCIPLINAS POST-GENÓMICAS

APLICADAS AL ESTUDIO DE

INTERACCIONES HOSPEDANTE –

PATÓGENO: ANALISIS INTEGRADO

TRANSCRIPTÓMICA Y METABOLÓMICA

PARTE II

Ruth Heinz

Instituto de Biotecnología

INTA Castelar

TRANSCRPTOMICA

MICROARREGLOS

Ventajas:

• tecnología madura, con años de análisis y validaciones

• Procesamiento y comparación simultánea de muchas

muestras en paralelo

• Han sido extensamente estudiados en interacciones H-P

Desventajas:

• Limitados a identificar transcriptos de genes conocidos

• Background puede ser alto por señales inespecíficas

• Señal saturada a altos niveles de expresión génica

TRANSCRIPTÓMICA POR RNA-seq

Se han generado ESTs de 18 especies de

hongos fitopatógeno y 2 Oomicetes,

Estas bases no son completas, no sirven para

análisis cuantitativos.

NGS de segunda y tercera generación estan

empezando a revertir esas falencias

principalmente en hongos.

Genoma de referencia:

• Se mapean las lecturas sobre el genoma de referencia, utilizando programas de detección de sitios de splicing.

• Se pierden sitios no canónicos comunes en plantas, hongos, oomicetes

Sin genoma de referencia

• Ensamblado “de novo”.

• Bioinformaticamente mas complejo que secuenciación Genómica “de novo” .

• Requiere normalización de colecciones ADNc antes de la secuenciación masiva

TRANSCRPTOMICA POR RNA-seq

EJEMPLOS DE TRANSCRIPTOMICA EN

FITOPATÓGENOS

P. syringae pathovar tomato strain DC3000,

• RNASeq por Illumina GA2

• 30 milliones de lecturas de 32 nucleotidos

• Comparación con genoma de referencia arrojaron algunas discrepancias

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Xcv)

• dRNA-seq (enriquecimiento en secuencias 5’) y 454 seq, permitió identificar sRNA implicados en el proceso de virulencia.

Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 5

EJEMPLOS DE TRANSCRIPTOMICA EN EL

ESTUDIO DE RELACIÓN H-P

Journal of Pathogens

Volume 2011, Article ID 716041, 11 pages

Ploplar Melampsora larici-populina: LCM – 454 pirosecuenciación

IDENTIFICACION DE FACTOR Avr Ve1 EN

Verticilliun dahliae POR RNA-SEQ

5110–5115 | PNAS | March 27, 2012 | vol. 109 |

no. 13

Estrategia de secuenciación genómica de

variantes y RNA seq por ILLUMINA para la

identificación del Factor de Avr Ve1 de

Verticillium dahliae que interactua con el gen R

Ve1 de tomate.

METABOLÓMICA

• Disciplina postgenómica que permite analizar cambios en metabolitos originados por cambios a nivel genético, transcriptómico o proteómico

• Permite evaluar el efecto de un transgene en el metabolismo primario y secundario

• Recientemente se ha difundido el uso de varias estrategias de análisis de metabolitos para el estudio de la respuesta de plantas a patógenos, plagas y estreses abióticos

VENTAJAS Y LIMITANTES DE LA METABOLOMICA

Ventajas

Dado que los metabolitos constituyen el producto final de la

expresión de los genes, el estudio cuali y cuantitativo de la

composición metabólica de un organismo permite identificar la

función de muchos genes.

Permite conocer el estado metabólico de un organismo

La metabolómica constituye la herramienta más informativa a

nivel funcional entre todas las tecnologías ‘omicas’

Limitantes

Incapacidad de estudiar el exhaustivamente todo el metabolismo

limitaciones técnicas, complejidad química del metabolismo, variabilidad de los organismos.

TECNOLOGÍAS UTILIZADAS PARA ESTUDIOS

METABÓLICOS

Para obtener un perfil metabólico completo, es necesario el uso de

diferentes tecnologías:

• IR Espectroscopía Infrarroja

• FTIR Espectroscopía Infrarroja con Transformación de Fourier

• NMR Resonancia Magnética Nuclear

• EC Electroforesis Capilar

• TLC Cromatografía en capa delgada

• GC Cromatografía Gaseosa

• HPLC Cromatografía Líquida de Alta Resolución

• Cromatografías acopladas a Espectrometría de Masa (CG-MS, LC-MS,

UPLC-MS)

• Cromatografías acopladas a Espectrometría en Tándem (LC/MS/MS, etc)

LA ELECCIÓN DE LA TÉCNICA CORRECTA ES UN COMPROMISO ENTRE

RAPIDEZ, SENSIBILIDAD Y SELECTIVIDAD, DEPENDIENDO DEL

OBJETIVO DE ESTUDIO

METABOLÓMICA EN PLANTAS

• Metabolitos identificados en el reino vegetal: 100-

200.000 correspondientes a metabolismo primario y

secundario

• Técnicas que permiten realizar un “fingerprinting”:

detección masiva de metabolitos en una muestra sin

identificación

• Técnicas de análisis de perfiles: detección,

cuantificación e identificación de metabolitos

ESTRATEGIAS DE ANÁLISIS

METABOLÓMICO

GC-MS: separación por cromatografía (GC or LC) acoplada a espectrometría de

masa (MS). Compuestos termo estables y volátiles, polares y no polares

ESI-MS: infusión directa por electrospray - MS . Para fingerprinting. Requiere

validación posterior para identificación

NMR (menor sensibilidad que GC) , Fourier transform (FT)-IR spectroscopy

LC-MS: para metabolitos secundarios, de mayor tamaño

CRONOLOGÍA DE ESTUDIO DE METABOLÓMICA EN RELACIONES

HOSPEDANTE-PATÓGENO

(__)General MS profiling (gene function analysis/physiological analysis/development/ protocols); (__ ), plant–host studies; (__ ),

FT-IR fingerprinting; (__ ), NMR fingerprinting/profiling. Allwood et al.. Physiol. Plantarum 132: 117–135. 2008

Estudios de perfiles metabólicos GC-MS

Metabolismo primario: •Aminoacidos •Azúcares •Alcoholes •Acidos organicos •Acidos grasos Metabolismo secundario: alcaloides, fenilpropanos, terpenos,

Estudios de perfiles metabólicos por GC-MS

Agente

Metabolómica de la respuesta de girasol al patógeno Sclerotinia sclerotiorum

Antecedentes

Agente Causal:

• Sclerotinia sclerotiorum (necrotrófico)

Factores de patogenicidad:

• Ácido oxálico • Enzimas hidrolíticas (poligalacturonasas)

Síntomas de la enfermedad:

• Maceración de tejidos del capítulo • Formación de esclerocios

Análisis transcriptómico y metabolómico:

resistencia a Sclerotinia sclerotiorum en girasol

Material Vegetal

Días post-inoculación

Estadio reproductivo

D0 D2 D4 D12

R5.2 R5.6 R5.8 R6

Extracción muestras de tejido objeto (incluyendo un estandar de masa y un

estandar de tiempo de corrida)

Derivatización

Inyección en GC-MS. se inyectaron 2 volúmenes (100 y 200 ml)

debido a la alta concentración de los

azucares.

Estudios de perfiles metabólicos

IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS

Cromatogramas iónicos totales obtenidos por la técnica de GC-MS de extractos de frutos de tomate (A), de flores de girasol (B) y de una mezcla estequiométrica de extractos de frutos de tomate y flores de girasol (C).

RUTAS METABÓLICAS INVOLUCRADAS EN LA RESPUESTA AL

S.CLEROTIORUM

Peluffo et al. 2010, Phytochemistry 71: 70-80

Se identificaron 63 metabolitos

en flores de girasol y se

cuantificaron 50 por GC-MS

Se identificaron metabolitos cuyo perfil

varia significativamente en respuesta

al patógeno en el genotipo R y S

Se identificaron metabolitos

que permiten discriminar los genotipos

por su respuesta al patógeno

•71 (70–80)

Análisis los niveles en cada genotipo a distintos DPI (ANOVA)

HA89 Susceptible

RHA801 Moderadamente resistente

Análisis los niveles en cada genotipo a distintos DPI (ANOVA)

Azúcares Polioles Int. Fosforilados

Ác. Grasos

Ácidos del TCA

Ácidos Orgánicos Aminoácidos

HA89 (S)

RHA801 (MR)

En el genotipo R:

Cambios significativos

en azucares (trealosa), azúcares

alcoholes (manitol, glicerol),

ácidos grasos(metabolitos TCA)

En el genotipo S:cambios

en niveles de aminoácidos

como prolina

Análisis del complemento metabólico en genotipos

resistentes y susceptibles

Análisis de agrupamiento Análisis correlación entre metabolitos

El complemento metabólico del genotipo R

Se aparta del control sin inocular a 2 y 4DPI,

mientras que para el genotipo S esto ocurre mas tardíamente

El genotipo R presenta una mayor concertación de cambios

metabólicos dentro de ciertas rutas metabólicas como el ciclo

de TCA, asociado a foto respiración. Los intermediarios

de TCA aumentan significativamente a los 2 y 4 DPI,

y luego disminuye, en forma concomitante con el aumento de

actividad catalasa en ese periodo

Asociación de los cambios metabólicos con el nivel de susceptibilidad/resistencia

Objetivo: Corroborar si alguno de los cambios detectados en las distintas vías metabólicas

tienen un correlato con las actividades de las enzimas asociadas a dichas vías

DPI 0 1 2 4 1 2 4

Sacarosa Sintasa (nmol UDP-glu . min -1 . mg proteina -1 )HA89 8,590,78 - - 9,340,56 - - 9,420,96

RHA801 7,300,66 - - 10,820,51 - - 9,481,17

Invertasa de Pared celular (µmol azúcares reductores . min-1

. gDW-1

)HA89 2,87010 - - 2,690,02 - - 2,780,06

RHA801 2,750,03 - - 2,350,10 - - 2,410,15

Invertasa citosólica (nmol azúcares reductores . min -1 . mg proteina -1 )HA89 0,510,01 - - 0,200,01 - - 0,280,02

RHA801 0,590,05 - - 0,430,13 - - 0,400,03

Invertasa vacuolar (nmol azúcares reductores . min -1 . mg proteina -1 )HA89 1,130,05 - - 0,500,02 - - 0,670,04

RHA801 1,460,09 - - 0,980,22 - - 1,040,07

Catalasa (Unidades . mg proteina -1 )HA89 3,930,39 5,360,83 4,720,62 4,371,14 3,180,71 5,461,03 4,250,55

RHA801 2,640,64 2,510,32 2,570,27 1,880,22 3,610,61 2,380,32 5,651,21

Fenilalanina ammonio-liase (nmol ácido cinamico . min-1

. µg proteina-1)HA89 1,660,04 0,580,09 1,200,18 0,690,09 0,240,07 0,910,05 0,270,02

RHA801 0,630,01 0,650,05 nd nd 0,340,08 0,110,02 nd

Inoculado con agua (mock ) Inoculado

Enzimas claves del

metabolismo primario del

carbono

Fotorrespiración

Metabolismo de los

fenilpropanoides

De las enzimas evaluadas, la actividad de la catalasa corroboró los cambios metabólicos

Fenilalanina amonio-liasa

ANÁLISIS DE PERFILES TRANSCRIPCIONALES POR QRT-PCR

Y HORMONALES POR LC-ESI-MS/MS

La expresión de genes candidatos con similitud a:

elemento de respuesta a etileno, WRKY7 y quitinasa

se induce en tiempos tempranos post infección en el

genotipo R.

Otros genes como PR5 se detectan en mayores

niveles hacia el 2 y 4 DPI tanto en plantas NI como I;

indicando en este caso que los niveles de este gen no

son inducibles sino pre existentes.

Peluffo 2010, Tesis doctoral

Línea: DPI

El nivel de ácido jasmónico es

superior en flores del genotipo

R respecto del S, en días

tempranos post infección

Los niveles de acido salicílico

fueron mayores en plantas S inoculadas a

partir de 2 DPI, mientras que el genotipo

R no presenta diferencias entre

I y NI y los niveles son muy

inferiores

RHA801 (MR) HA89 (S)

Análisis de perfiles

metabólicos

Construcción de clonotecas

diferenciales y análisis

transcripcionales de genes

candidatos

Análisis de perfiles

hormonales (SA y JA)

Mediante estos análisis se

encontraron diferencias en los

componentes metabólicos que

pudieron ser asociadas al

comportamiento contrastante de

las líneas frente a S.

sclerotiorum.

Fue posible correlacionar cambios en los perfiles

metabólicos con variaciones en los niveles de las fitohormonas

analizadas.

Se encontró una correlación

entre los niveles de estas

fitohormonas y la

susceptibilidad (SA) y

resistencia (JA).

Se identificaron 3 genes

que estarían implicados en

la respuesta de defensa de

la línea de girasol RHA801

(MR) frente a la inoculación

con S. sclerotiorum.

• Se valido la técnica de GC-MS para identificación y cuantificación de metabolitos en capítulos de girasol

• Se detectaron cambios significativos en metabolitos en estadios tempranos del proceso de infección en genotipos con respuesta contrastante al patógeno S. sclerotiorum

• El genotipo R presento cambios en niveles metabólicos significativos en los D 2y D4 post infección

• Los estudios concertados de metabolitos muestran patrones de regulación diferencial en genotipos R y S, presentando el genotipo R mayores interacciones intermódulo, lo que señalaría mayor concertación de determinadas rutas metabólicas

• Alcoholes (ononitol, glicerol, malitol), derivados de pared celular (xilosa, ramnosa, gluconato) carbohidratos como la trealosa.

• Los metabolitos relacionados con la producción de polifenoles (cafeato y clorogenato), presentan mayores cambios en el genotipo S .

• Metabolitos asociados con removilización de N (aumento de prolina) se han detectado en el genotipo S

RESUMEN RESULTADOS CAMBIOS METABÓLICOS CLAVES

ASOCIADOS A LA INTERACCIÓN GIRASOL –SCLEROTINIA

Resistente PI594754 (Rpp1)

Susceptible BRS 184

INFECCIÓN

I

I

NI

NI

V2 o V3 MUESTRAS (6 replicas por muestra)

0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección

0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección

0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección

0, 6, 12, 24, 72, 96 y 192 horas post infección

Ensayo experimental desarrollado en EMBRAPA Londrina

6 h PI 12 hpi 94 hpi 6 réplicas biológicas

Estudios de perfiles metabólicos por la técnica GC/MS en un sistema de interacción con hongo biótrofo (soja- Phakopsora pachyrhizi )

Determinación del complemento metabólico en hojas de soja en las líneas

BRS 184 (S) PI594754 (R) inoculadas con roya

ANOVA para los niveles en cada

genotipo, tiempos PI y estados

de inoculación (I y MI)

99 metabolitos cuantificables

Análisis de

coordenadas

principales (PCA)

175 metabolitos

Análisis de

correlaciones

y de redes

Resistente PI594754

Susceptible BRS 184

I

NI

• Identificar cambios metabólicos asociados a la respuesta al patógeno

• Identificar rutas metabólicas involucradas en el proceso de resistencia/susceptibilidad

• Contribuir a la identificación de genes candidatos

102 metabolitos cuantificables e identificados

Genotipo R y S

21

Tiempo: 6, 12 y 96 h PI

Tratamiento (I vs NI)

21

1 4

14

3 Shikimato

Análisis de varianza (ANOVA) de perfiles metabólicos diferenciales

Aspartato Glucosa Eritrose Histidina Treitol

0

7 metabolitos interacciones tratamiento 7 metabolitos interacción tiempo*línea 31 metabolitos no mostraron diferencias para ningún factor o interacción

Glutámico Nonadecano Xilulosa

Hexadecane Myo-inositol-2-phosphate

Erytrose Nonadecane Treitol

Análisis de Componentes Principales

Efecto genotipo

R S

Correlaciones línea resistente

(PI594754)

Control: 65 correlaciones significativas Inoculado: 83 correlaciones significativas

Control: 57 correlaciones significativas Inoculado: 47 correlaciones significativas

Correlaciones línea susceptible (BRS 184)

Citrate

Aconitate

Isocitrate

2-oxoglutarate

Succinyl-

CoA

Succinate

Fumarate

Malate

Oxalacetate

Acetil- CoA

Glucose

G6P

F6P

3PGA

PEP

Pyruvate

Glutamat

e

Arginine

Glutamin

e

Pyroglutamate

Ornithine

Prolin

e

ɣ-aminobutyrate

Hydroxyproline

Palmitate

Stearate

Saccharat

e

Shikimate

Quinate

Tryptopha

n

Phenylalanine

Tyrosine Tyramine

Caffeate

Benzoate

Chlorogenate

Glycerate Glycerol Glycerol-

P

Fructose

Mannitol

Sorbos

e

Mannose L-Ascorbate

Dehydroascorbat

e

Galactarate

Threonat

e

Sucros

e

Meiezitose Raffinose

Gluconolacton

e Trehalose

Galactose

Glucose 1-

P Maltose

Ribose

Psicose

Myo-Inositol-1P

Maltitol

Myo-Inositol Ononitol

Xylogluca

n Rhamnogalacturan

Xylose

Fucose

Arabinose

Gluconate

Galacturonic

Glycine Serine

Alani

ne

Valine

Leucine

Aspartate

Homoserine

Threonin

e

Isoleucin

e

Asparagine

Lysine

Glutaric Acid

ß-Alanine

Glycolate

Glyoxylate

Ctrl1 Ctrl2 Ctrl3

WS1 WS2 WS3

-4 0

4

D-Galactono-1,4-lactone

Galactinol

Talose

Urea

Methionine

Pyrroline-2-carboxylate

Malonate

TCA cycle

Nicotinate

Uracil

Nicotiamine

Cystine Cysteine

Histidine

Rhamnose

Lactate

Threitol

Lactulose

2-Coumarate

Cambios metabólicos en plantas asociados a respuestas de

defensa inducidas

Parker et al., (2009)The Plant Journal 59, 723–737

MUCHAS GRACIAS