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Universidad Politcnica de Valencia
Departamento de Qumica
Tesis Doctoral
INMUNOENSAYOS RPIDOS PARA LA DETERMINACIN
DE RESIDUOS DE PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS
EN ACEITE DE OLIVA
Marta Garcs Garca
Directores
Dr. ngel Maquieira Catal - Dra. Rosa Puchades Pla
Valencia, 2008
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1. Introduccin
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1. Introduccin
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1.1. Plaguicidas: medio ambiente y seguridad alimentaria
La contaminacin del medio ambiente y de los alimentos es un problema general
que afecta a todo el mundo. Parte de dicha contaminacin es debida a la aplicacin deproductos fitosanitarios, especialmente plaguicidas, en agricultura, horticultura y
silvicultura.
Los plaguicidas son sustancias que sirven para combatir los parsitos de los
cultivos, del ganado, de los animales domsticos, y del hombre y su ambiente (1).
Aunque estas sustancias se conocen desde la antigedad, fue a partir de la dcada 1920-
1930, y especialmente despus de la Segunda Guerra Mundial, cuando se extendi su
empleo -con la aparicin de los plaguicidas orgnicos-, con el fin de aumentar laproduccin de alimentos.
En Espaa, desde mediados de los aos noventa el uso de plaguicidas experiment
un incremento que vino a romper el fuerte descenso iniciado a finales de la dcada de
los ochenta. Aunque la aplicacin de las reformas de la Poltica Agraria Comn (PAC)
de 1992 contribuy parcialmente a reducir su uso, la implantacin de sistemas de
intensificacin agraria aument su consumo, agravando el problema. As, desde 1995 se
est produciendo un incremento del uso de plaguicidas, en estrecha relacin con la
produccin agrcola; como puede apreciarse en la Figura 1, en el ao 2004 en Espaa se
alcanz la cifra de 3,35 kg por ha (2).
La desigual intensificacin de la agricultura en las diferentes comunidades
autnomas se refleja tambin en el uso de plaguicidas (Figura 2), que es mucho mayor
en Canarias (125,05 kg/ha), Cantabria (28,14 kg/ha) y en las regiones hortcolas,
sobresaliendo la Comunidad Valenciana (26,41 kg/ha), la Regin de Murcia (22,15
kg/ha) y La Rioja (21,13 kg/ha), como se muestra en la Tabla 1. Los datos del consumo
de plaguicidas que se presentan estn referidos a venta de producto, sin especificar la
composicin de su materia activa.
El uso indebido de los productos fitosanitarios (dosis excesivas, aplicacin
reiterada, utilizacin de productos no permitidos, incumplimiento de los plazos de
seguridad, etc.) y la contaminacin cruzada entre cultivos puede dar lugar a que las
producciones agrcolas contengan residuos de plaguicidas, que potencialmente pueden
llegar al consumidor (3, 4). Debe tenerse en cuenta que todos los plaguicidas, como
biocidas que son, presentan cierta toxicidad y, por tanto, sus residuos suponen un riesgo
para los consumidores si se superan determinados lmites.
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1. Introduccin
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1990 1991 1992 1993 1994 1995 1996Total Fitosanitarios (t) 39.562 39.147 31.839 29.406 31.243 27.852 33.236Total superficie (1000 ha) 16.010 16.034 15.911 15.415 14.953 14.983 15.284
1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004
Total Fitosanitarios (t) 34.023 35.070 36.332 38.027 40.894 40.727 41.586 47.445Total superficie (1000 ha) 15.327 15.102 15.076 15.082 14.533 14.749 14.628 14.182
Figura 1. Consumo de productos fitosanitarios (kg de ingrediente activo/ha) en Espaaen los ltimos quince aos.Fuente: MAPA, AEPLA
Figura 2.Distribucin del consumo de fitosanitarios por comunidades autnomas en2004. Fuente: MAPA, AEPLA
kg/ha
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1. Introduccin
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Tabla 1. Dosis (kg/ha) de fitosanitarios aplicados por comunidades autnomas en2004*
CC.AA. Insecticidas Fungicidas Herbicidas Otros Total
Andaluca 1,93 3,84 2,86 3,42 12,05
Aragn 0,85 0,79 1,18 0,35 3,17Asturias 1,72 1,00 7,54 4,92 15,18Baleares 0,80 1,20 0,86 3,30 6,16Canarias 14,67 68,38 6,76 35,25 125,05Cantabria 4,09 5,60 11,02 7,43 28,14Castilla La Mancha 0,47 0,81 0,71 0,38 2,37Castilla y Len 0,20 0,54 1,36 0,14 2,25Catalua 2,14 4,46 3,09 1,67 11,36C. Valenciana 6,41 5,09 5,90 9,01 26,41Extremadura 1,97 1,76 1,78 1,35 6,86Galicia 1,02 4,56 2,91 0,99 9,48
La Rioja 2,48 12,48 4,11 2,06 21,13Madrid 0,83 0,71 3,01 0,91 5,46Murcia 4,65 7,52 4,12 5,86 22,15
Navarra 0,48 0,57 1,95 0,39 3,40Pas Vasco 0,98 5,26 5,00 2,10 13,33ESPAA 1,42 2,44 2,07 1,86 7,79
* Datos referidos a la venta de productos formuladosFuente: MAPA, AEPLA
Para proteger el medio y, especialmente, la salud de los consumidores, muchos
pases han restringido el uso de plaguicidas, estableciendo directrices sobre los lmitesmximos de residuos (LMRs) que pueden aceptarse en diferentes productos (5, 6). El
lmite mximo de residuo es la cantidad mxima de un determinado plaguicida que
puede presentar un producto agrcola.
El marco legislativo sobre el uso de plaguicidas se recoge en la Orden PRE / 266 /
2006, de 6 de febrero, que transpone diversas directivas europeas. Esta legislacin
establece las condiciones que han de cumplir los productos fitosanitarios para su
aprobacin y uso, a travs -entre otros lmites- de los LMR admitidos para los diferentes
productos agrcolas. De este modo se protege al consumidor, y se crean las bases para
un mercado nico y homologado en la Unin Europea. Tambin proporciona a los
productores la garanta de que, utilizando los fitosanitarios correctamente, sus productos
tienen cabida en el mercado.
En general, el contenido mximo de residuos de plaguicidas en alimentos se sita en
0,01 mg/kg. Este lmite de referencia es aplicable por defecto, es decir, en todos los
casos en que no se haya fijado un LMR de forma especfica para un producto o tipo de
producto.
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1. Introduccin
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La Unin Europea tambin ha elaborado un catlogo de productos fitosanitarios
considerados peligrosos para el medio acutico, estableciendo una lista -popularmente
conocida como Lista Negra- formada por 39 plaguicidas (76/464/EEC) (7); de ellos
(Tabla 2), 19 pertenecen a la familia de los organofosforados -por ejemplo, fentin ymalatin-, 8 son organoclorados, 2 triazinas, 2 fenilureas y 5 fenoxicidos. Por otro
lado, la Directiva comunitaria sobre calidad de aguas (8) fija los productos qumicos
prioritarios a controlar en las mismas.
Tabla 2. Lista de plaguicidas considerados peligrosos para el medio acutico
Aldrn Disulfotn MonolinurnAtrazina Endosulfan Ometoato
Azinfos-etil Endrn Oxidemetn-metilAzinfos-metil Fenitrotin Paratin-etilClordano Fentin Paratin-metilCoumafos Heptaclor Phoxim2,4-D HCB PropaniloDDT Linurn PirazonaDemetn Malatin SimazinaDiclorpop MCPA 2,4,5-TDiclorvos Mecoprop TriazofosDieldrn Metamidofos TriclorfonDimetoato Mevinfos Trifularina
Fuente: Directiva 76/464/ECC de la Unin Europea (Lista Negra)
Los planes de seguridad alimentaria han de garantizar la inocuidad de los alimentos
y la incorporacin de elementos de control en todos los eslabones de la cadena
alimentaria, de forma habitual, peridica y programada. Por ello, existen programas de
vigilancia de residuos de plaguicidas que requieren la existencia de una red de
laboratorios pblicos y privados acreditados que cubran un amplio abanico de
determinaciones analticas.
1.1.1. Determinacin de residuos de plaguicidas
La aplicacin de programas de control y vigilancia de residuos de plaguicidas en
alimentos implican la determinacin de los niveles residuales en los productos a
controlar, de forma peridica y por muestreo. Para ello, hay que utilizar metodologas
analticas contrastadas capaces de identificar y cuantificar mnimas cantidades deplaguicidas (del orden de g/kg) en matrices complejas.
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1. Introduccin
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En general, la determinacin de residuos de plaguicidas conlleva diferentes etapas:
toma y preparacin de las muestras para el anlisis, extraccin de los residuos,
purificacin o limpieza del extracto, y finalmente, la etapa de determinacin.
Las metodologas analticas utilizadas para la determinacin de residuos deplaguicidas en alimentos son muy variadas dependiendo del tipo de producto, y la clase
y nmero de plaguicidas que se quieran analizar. No obstante, los mtodos
rutinariamente aplicados en los laboratorios de control son los denominados mtodos
multirresiduo, caracterizados por ser aplicables a una gran variedad de alimentos y
determinar, de forma simultnea, un gran nmero de plaguicidas.
Las tcnicas cromatogrficas son ampliamente usadas para la determinacin de
plaguicidas y sus metabolitos en muestras medioambientales y alimentos. As, lacromatografa de gases (GC) es la ms utilizada, especialmente en el caso de
plaguicidas organofosforados y organoclorados (9-11), mientras que la cromatografa
lquida (LC) es ms utilizada para determinar plaguicidas polares y termodegradables
(12-14).
En la actualidad, la cromatografa gaseosa (GC) acoplada a la espectrometra de
masas (MS) es la tcnica de referencia empleada para la determinacin de residuos de
plaguicidas en alimentos. La mayora de estos procedimientos utilizan espectrometra de
masas en modo SIM (15-18), trampa de iones, o en tndem (MS/MS) (19-21). El uso de
GC acoplada a espectrometra de masas de triple cuadrupolo (QqQ) es una alternativa
ms rpida para la determinacin de niveles traza de plaguicidas.
Adems, tambin se utiliza la cromatografa lquida acoplada a espectrometra de
masas (LC-MS) (22, 23) para compuestos polares, no voltiles, trmicamente inestables
o de alto peso molecular, que no pueden ser determinados mediante GC-MS.
Otras tcnicas instrumentales como la cromatografa en capa fina (24) o la
electroforesis capilar (25, 26) tambin son aplicadas.
Adems, existen otros mtodos, denominados bioensayos, que permiten la
deteccin del analito por su toxicidad, inhibicin de determinadas enzimas (27), o por la
presencia de sus metabolitos en sangre u orina.
Aunque las tcnicas cromatogrficas son extraordinariamente tiles para la
determinacin de residuos de plaguicidas, su aplicacin a programas de control
medioambiental y de seguridad alimentaria no est exenta de importantes
inconvenientes, entre los que cabe destacar los derivados del elevado coste de la
instrumentacin y el alto precio de los anlisis (ver Tabla 3), la necesidad de personal
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altamente cualificado y los dilatados tiempos de anlisis, que incluyen etapas de
limpieza (28-30) y derivatizacin (31-33) de la muestra. Adems, el uso de protocolos
con mltiples etapas conlleva problemas de prdida de analito y falta de
reproducibilidad. Tambin es problemtico el uso de disolventes orgnicos por sutoxicidad y elevado precio (34, 35), y la termolabilidad de algunos analitos (36).
Tabla 3.Precios pblicos por la realizacin de anlisis de muestras agroalimentarias.Identificacin y cuantificacin de residuos fitosanitarios y otros productossimilares
Actividad a realizar Precio/muestra ()
Preparacin de muestras para el anlisis (extraccin, destilacin, mineralizacin,etc.)
19
Identificacin o cuantificacin de una sustancia, o grupo de sustancias, porcromatografa en capa fina
25
Identificacin o cuantificacin de una sustancia mediante tcnicasespectrofotomtricas (UV/V, IR, AES, AAS, etc.)
25
Identificacin o cuantificacin de una sustancia, o grupo de sustancias, mediantetcnicas separativas (GC, LC, SFE, CE, etc.)
49
Determinacin de una sustancia mediante kits especficos (anlisis enzimticos,inmunoensayo, etc.)
49
Identificacin o cuantificacin de una sustancia, o grupo de sustancias, mediante
GC-MS
61
Identificacin o cuantificacin de una sustancia, o grupo de sustancias, medianteLC-MS
240
Identificacin o cuantificacin de una sustancia mediante tcnicascromatogrficas combinadas con tcnicas inmunolgicas de purificacin
73
Fuente: Orden SCO/47/2004, de 14 de enero, por la que se fijan los precios pblicos por la realizacinde actividades del Centro Nacional de Alimentacin. Agencia Espaola de Seguridad Alimentaria
As pues, alcanzar estndares elevados en seguridad alimentaria exige, entre otras
cosas, disponer de una metodologa analtica efectiva que permita manejar un grannmero de muestras, tener tiempos de respuesta cortos, operar en condiciones de campo
(37) y ofrecer bajos precios de anlisis.
1.2. Plaguicidas organofosforados
Los plaguicidas organofosforados (OFs) son steres, amidas o tioderivados del
cido fosfrico, fosfnico, fosforotioico o fosfonotioico que controlan una granvariedad de plagas. La frmula estructural de estos compuestos, que se caracterizan por
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la presencia de tres funciones ster, se muestra en la Figura 3, en la que R1y R2 son
radicales alquilo, generalmente metilo o etilo. El grupo X es caracterstico de cada
especie qumica; frecuentemente es un radical arilo y suele contribuir de forma
importante a las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas de este tipo de compuestos.Por otra parte, el nmero de grupos qumicos se ve incrementado por la gran variedad
de radicales que pueden presentar, ya que si bien dos de ellos son siempre metilo o etilo,
el tercer radical es diferente en cada clase de plaguicidas (38).
Figura 3.Estructura genrica de los compuestos organofosforados
En funcin de la posicin que ocupan los diferentes grupos en la molcula, los
organofosforados se pueden dividir en 14 familias; los ms importantes son: fosfatos,
con un O en las posiciones [1] y [2]; O-fosforotioatos (o tionatos), con un S en [1] y un
O en [2]; S-fosforotioatos (o tiolatos), con un S en [2] y un O en [1]; fosforoditioatos (o
tiolotionatos), con un S en las posiciones [1] y [2]; fosfonatos, con R1(en lugar de R1O),O o S en [1] y O en [2]; y fosforoamidatos, con un O en [1] y un N en [2].
A lo largo de los ltimos aos se ha producido un profundo cambio en las prcticas
agrcolas, de modo que los plaguicidas OFs han reemplazado ampliamente a los
organoclorados (OCs), convirtindose -junto a los piretroides- en los insecticidas ms
utilizados (Figura 4) en la actualidad.
La mayor actividad de los OFs es como insecticida, aunque algunos de ellos
presentan tambin actividad nematocida, fungicida o herbicida. Estos compuestos tienenun espectro de accin ms estrecho que los OCs, por lo que su efecto es ms selectivo.
Los plaguicidas OFs son, en general, sustancias biodegradables en la naturaleza, sin
tendencia a acumularse en las grasas del organismo, y que forman parte del grupo de
insecticidas llamados de contacto, al ser absorbidos por medio de los lpidos del
exoesqueleto (caparazn) de los insectos (39).
Algunos OFs poseen baja presin de vapor, incluso a temperatura ambiente, por lo
que los insectos toman o inhalan estos productos a travs de la piel o el tubo digestivo.
En los animales de sangre caliente y en el hombre, se introducen en el cuerpo por
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ingestin, contacto con la piel o por va respiratoria (vapores, polvos o nebulizadores),
distribuyndose rpidamente por el torrente sanguneo (40).
Figura 4. Consumo (en miles de toneladas) de ingredientes activos deorganofosforados y otros insecticidas en EE.UU. (1980-2001).Fuente: U.S. Environmental Protection Agency. Pesticides Industry, Sales and Usage.2000 and 2001 Market Estimates
En general, los OFs son productos de elevada reactividad qumica, lo que les
confiere ciertas ventajas; al tratarse de compuestos muy activos, las dosis aplicadas son
bajas. Adems, se degradan con relativa facilidad, bien mediante reacciones de
hidrlisis que dan lugar a productos inocuos para el medio ambiente, o por reacciones
de oxidacin que conducen a metabolitos ms o menos txicos, pero ms fciles dehidrolizar. Por ltimo, son productos cuya toxicidad aguda es, en general, mayor que la
de los OCs, mientras que la crnica es inferior, ya que tienden a hidrolizarse en lugar de
acumularse en las grasas (38).
Los steres de los organofosforados son muy susceptibles a la hidrlisis, que es la
va de degradacin ms comn. Uno de los factores ms importantes que afecta a la
hidrlisis es el pH del medio. As, por ejemplo, el diazinn se hidroliza rpidamente a
valores altos o bajos de pH (41). Por otro lado, el malatin es un clsico ejemplo de lacomplejidad que presenta el estudio de sus productos de hidrlisis, ya que, adems de
Otros insecticidas
11,25
9
6,75
4,5
2,25
0
Insecticidas organofosforadosMiles
detoneladas
Ao
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los compuestos esperados, pueden formarse otros como malaoxn, dietiltiosuccinato,
cido O,O-dimetilfosfotinico, etc. (42).
1.2.1. Usos y toxicidad
Desde 1942 se han sintetizado ms de 50.000 compuestos organofosforados,
incluyendo derivados. Su uso est muy extendido (43), al ser utilizados tanto en el
medio agrcola como en el domstico (44), en la industria, medicina, e incluso como
armamento qumico, aunque su aplicacin ms relevante es en la agricultura como
insecticidas.
En medicina, los compuestos OFs se han utilizado -debido a su accin
anticolinestersica- para el tratamiento del leo paraltico y atona vesical, enfermedades
neurolgicas degenerativas (45), miastenia grave, parlisis motriz postanestsica,
glaucoma y, ms recientemente, para tratar la retinitis por citomegalovirus (46) y
algunos tumores (47).
A pesar de estar prohibidos (48, 49) a nivel mundial, los OFs todava se utilizan en
algunos pases como armas de guerra qumica (gases nerviosos: sarn, tabn, trilones,
gas GB, gas nervino, etc.) o en acciones terroristas; es el armamento de los pases
pobres, por su elevado potencial mortfero y bajo precio.
Segn la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), el manejo incorrecto de los
insecticidas organofosforados es el responsable de gran nmero de intoxicaciones
agudas -caracterizadas por el desarrollo de sndrome colinrgico- y de mltiples
complicaciones crnicas, siendo la neuropata retardadada una de las ms
representativas. Poseen alta toxicidad, y muchos de ellos son extremadamente dainos
para la salud humana y el ecosistema, al inhibir irreversiblemente la actividad de la
acetilcolinesterasa (ACE) (50-53).Los organofosforados actan sobre insectos y mamferos por fosforilacin de la
enzima acetilcolinesterasa en las terminaciones nerviosas (es decir, por la unin o
enlace qumico de la molcula del organofosforado con la ACE). Esta enzima tiene un
papel importante en la transduccin del impulso nervioso, siendo imprescindible para el
control normal de la transmisin de dichos impulsos desde las fibras nerviosas hasta las
clulas musculares y glandulares, as como hacia otras clulas nerviosas de los ganglios
autnomos y del sistema nervioso central.
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Algunos organofosforados son sistmicos (ver Tabla 4), es decir, son adsorbidos
por las plantas (ya sea a travs del follaje o las races) e introducidos en el sistema
vascular de los vegetales. Posteriormente, son translocados -en su forma original o
modificada- a las diferentes partes de la planta por medio de la savia, siendo su modo deaccin ms eficaz contra insectos chupadores, actuando tambin sobre las personas que
ingieren el alimento, aunque ste se lave previamente.
Tabla 4.Principales plaguicidas organofosforados utilizados en agricultura
Tipo Nombre comn Nombre comercial
No Sistmicos Azinfos-metil Guthion, GusathionClorpirifos Dursban, LorsbanDiazinn Basudin, Diacide, Diazil
Diclorvos Lainsec, VaponaFenitrotin Sumithion, FolithionLeptofos Phosvel, AbarMalatin Malathion, CythionParatin FolidolParatin-metil Folidol-M, MetacideTriclorfn Dipetrex, Neguron, Dylox
Sistmicos Dimetoato Cygon, PerfektionFentin DMTP, Lebaycid, Fenthion 4EForato ThimetMetamidofos Monitor, TamarnMevinfos PhosdrinOxidemetn-metil Metasyst oxGlifosato (Herbicida) Roundrup
Una vez en el interior del organismo, los OFs son activados por desulfuracin
oxidativa, transformando los grupos P=S en P=O (54). Estos derivados P=O atacan al
sistema nervioso y, ms concretamente, a la ACE, enzima encargada de hidrolizar la
acetilcolina en colina y cido actico a nivel de la sinapsis nerviosa. La poblacinafectada por la accin txica de estos plaguicidas presenta inhibicin de la actividad
enzimtica de la ACE al encontrarse sta fosforilada, lo que provoca desde anoxia y
dolores de cabeza a dosis bajas, hasta nuseas, contracciones musculares e incluso la
muerte por fallo respiratorio y paro cardaco, a mayores dosis (55).
Por otra parte, la biotransformacin de la mayor parte de los plaguicidas tiene lugar
por combinacin de varias reacciones qumicas, desarrollndose -generalmente- en dos
fases (56, 57):
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-Fase I- incluye reacciones de preconjugacin basadas en oxidacin, reduccin e
hidrlisis, que permiten introducir un grupo polar (OH, NH2, COOH y SH) en la
molcula.
-Fase II- consiste fundamentalmente en reacciones de conjugacin de los productosresultantes de la fase I con una o varias molculas endgenas (cido glucurnico,
sulfato, glicina, etc.), dando lugar a productos hidrosolubles que pueden ser excretados
por va renal o heptica (orina o bilis, respectivamente).
Aunque este metabolismo es muy rpido en el caso de los OFs, es posible detectar
los productos iniciales en sangre y orina, sobre todo en casos de intoxicaciones agudas o
exposiciones continuadas. De este modo, su cuantificacin indicar el nivel de afeccin
del individuo o de la poblacin expuesta.Los organofosforados difieren mucho en su toxicidad, distinguindose tres
categoras:
Categora I (LD50: 0-50 mg/kg)
Dicrotofos, DDVP (Vapona), Paratin-etil, Metamidofos, Azinfos-metil,
Ometoato, Monocrotofos, Quinalfos, Fenamifos, Clofenvinfos y otros
Categora II (LD50: 50-500 mg/kg)
Dimetoato, Fentin, Metidatin, Paratin-metil, Triclorfn, Etin,
Clorpirifos, Fenitrotin y otros
Categora III (LD50>500 mg/kg)
Mercaptotin, Malatin, Diazinn
1.2.2. Mtodos de determinacin de residuos de plaguicidas organofosforados
La bibliografa indica que la determinacin de residuos de organofosforados se
efecta principalmente mediante tcnicas cromatogrficas, adems de utilizando
biosensores enzimticos y mtodos inmunoqumicos (estos ltimos se discutirn ms
adelante).
Los mtodos cromatogrficos requieren procesos de preparacin de muestra,
basados, generalmente, en extraccin lquido-lquido (LLE) (58, 59) y en fase slida(SPE) (60, 61). Estas tcnicas consumen mucho tiempo y grandes cantidades de
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disolventes orgnicos, por lo que -actualmente- se han desarrollado nuevos
procedimientos como la microextraccin en fase slida (SPME) (62) o la extraccin
mediante adsorcin en barras magnticas (SBSE), acoplados a CG-MS, para la
cuantificacin de cantidades traza de estos compuestos en muestras acuosas (63).Utilizando SPME pueden alcanzarse lmites de deteccin en el intervalo de g/L a
ng/L (64). Las fibras para SPME son relativamente caras y frgiles, pudiendo
deteriorarse durante el proceso de extraccin (60, 61, 65, 66). En ocasiones, para
matrices complejas se requieren etapas de limpieza previas al uso de las fibras SPME, o
desarrollar mtodos de proteccin de las mismas (67, 68).
La SBSE es un mtodo desarrollado recientemente, basado en la agitacin de la
muestra con una barra magntica recubierta con polidimetilsiloxano (PDMS). Debido algran volumen de material de recubrimiento (69), pueden alcanzarse lmites de deteccin
para compuestos voltiles o semivoltiles del orden de ng/L o inferiores (70).
Finalmente, la microextracin en fase lquida (LPME) puede ser tambin una
alternativa atractiva, por su facilidad de uso, rapidez y automatizacin (71).
Para la determinacin de residuos de OFs se utilizan mtodos basados en
cromatografa gaseosa (GC) con diferentes detectores (72-74), caracterizados por
presentar bajos lmites de deteccin, alta sensibilidad y precisin -por ejemplo los
mtodos oficiales de la AOAC (75)-, HLPC con deteccin UV (76, 77), o
espectrometra de masas (SIM) para la deteccin de niveles traza (78-80). Sin embargo,
estos mtodos presentan los mismos inconvenientes expuestos previamente en la
seccin 1.1.1., as como la imposibilidad de realizar determinaciones in situ.
Por otro lado, diferentes biosensores basados en la inhibicin de la colinesterasa han
sido desarrollados para la deteccin de plaguicidas. Algunos se basan en la
determinacin del cido actico producido por la hidrlisis de la acetiltiocolina, bien por
medidas conductimtricas (81, 82), o utilizando un sensor de fibra ptica que detecta el
cambio de color de un indicador de pH (83). Un electrodo de pH modificado con una
organofosforado hidrolasa inmobilizada tambin se ha utilizado para la determinacin
potenciomtrica directa de insecticidas organofosforotionatos y fosfatos (84, 85). Estos
biosensores electroqumicos, aunque son sensibles (detectan niveles de ng/mL de
organofosforados en agua), presentan como principal limitacin su baja selectividad. La
deteccin espectofotomtrica (86) ha sido tambin utilizada en biosensores usando
acetiltiocolina como substrato de la acetilcolinesterasa, de modo que la tiocolina
producida reacciona con el reactivo de Ellman (87) para dar un color amarillo.
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1. Introduccin
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El principal biosensor descrito se basa en la oxidacin directa de tiocolina a bajos
potenciales, usando deteccin amperomtrica (88-90). Este tipo de deteccin es
generalmente ms sensible (mantenindose en niveles de ng/mL), sin embargo, presenta
el inconveniente de la inhibicin que sufren las enzimas, lo que limita sus posibles usos.Adems, la actividad enzimtica se puede modificar por la presencia de disolventes
orgnicos.
En la bibliografa se han descrito sistemas ms elaborados basados en biosensores
bi-enzima (91-93), utilizando un sistema de tres enzimas con deteccin amperomtrica
(94) o fluoromtrica tras una etapa de derivatizacin previa (95).
Una considerable mejora de los sensores se produce usando un sistema en flujo
continuo. As, Jeanty et al.(96) detectan la presencia de clorpirifos en agua a niveles de24 ng/mL en 16 minutos.
1.3. Tcnicas inmunoqumicas
En las ltimas dcadas se ha incrementado considerablemente el inters por mejorar
las normas de calidad y los sistemas de control sobre toda la cadena alimentaria. En
materia de inocuidad, los cdigos de prcticas recomendados por el Cdex Alimentario
se basan en la aplicacin de Buenas Prcticas Agrcolas, Buenas Prcticas de Higiene, y
Buenas Prcticas de Manufactura o de Fabricacin.
El concepto de buenas prcticas agrcolas (BPAs) ha ido evolucionando en los
ltimos aos como resultado del inters y compromiso de un amplio sector interesado
en mejorar la produccin, seguridad y calidad alimentarias, y a la mayor sostenibilidad
ambiental de la agricultura. La aplicacin de estas prcticas permite a los agricultores
dar un mayor valor aadido a sus productos, y a los consumidores, alimentos ms
seguros y de mejor calidad.
El control de productos frescos que se consumen sin procesar es crtico, ya que, por
definicin, son los alimentos con mayor probabilidad de afectar a la salud de los
consumidores.
Los aspectos arriba enunciados, junto con el establecimiento de Lmites Mximos
de Residuos cada vez ms bajos y el desarrollo de Planes de Vigilancia ms efectivos,
deben conducir a mantener una elevada seguridad alimentaria. Sin embargo, en la
prctica no basta con disponer de normativas, tambin tienen que haber herramientas
que aseguren la efectividad de las mismas. Por ello, es necesario disponer de
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metodologas analticas alternativas a las oficiales (bsicamente cromatogrficas), que
sean rpidas, sensibles, selectivas, de bajo coste, con gran capacidad de trabajo y que
permitan realizar determinaciones in situ. En este sentido, las tcnicas inmunoqumicas
pueden aportar soluciones muy vlidas (32, 33, 97).La bibliografa recoge un gran nmero de artculos sobre la aplicacin de estas
tcnicas a la determinacin de residuos de plaguicidas, aunque su aceptacin depende
de la calidad y validez obtenida en comparacin con las tcnicas de referencia. La
duracin excesiva de los ensayos y el elevado coste de las tcnicas analticas clsicas
limitan su capacidad de trabajo. Existe pues una necesidad real de desarrollar tcnicas
analticas de campo que sean rpidas, fciles de usar, robustas, sensibles y de bajo coste.
Por estos motivos, y por su simplicidad, los inmunoensayos se han convertido en uninstrumento popular para el monitoreo rpido de componentes minoritarios, incluyendo
contaminantes orgnicos en el medio ambiente y alimentos (98-104).
1.3.1. Principios generales de las tcnicas inmunoqumicas
Las tcnicas inmunoqumicas son mtodos simples, sensibles, selectivos, rpidos y
baratos, muy establecidos en el rea clnica. El primer inmunoensayo fue desarrollado
para la determinacin de insulina en sangre por Yalow y Berson en 1960 (105). Desde
entonces, los inmunoensayos han sido usados en Qumica Clnica para la deteccin de
innumerables compuestos como hormonas, frmacos, drogas y virus.
Actualmente, los mtodos inmunoqumicos son ampliamente usados tanto en
anlisis de rutina como en investigacin, especialmente en el rea Qumica, en
Medicina, Microbiologa, Medio Ambiente y en la industria alimentaria (106-109).
Entre los mtodos inmunoqumicos, el ensayo tipo ELISA (Enzyme Linked
Immunosorbent Assay) ocupa una posicin dominante, representando aproximadamenteel 90% del total de determinaciones efectuadas (110).
Los mtodos inmunoqumicos se basan en el uso de anticuerpos, que se caracterizan
por presentar en sus estructuras sitios de reconocimiento que les permiten establecer
interacciones altamente especficas con los antgenos (32), cuya extensin depende de la
intensidad de la interaccin antgeno/anticuerpo.
Las principales ventajas analticas de los inmunoensayos son la simplicidad y
rapidez de las determinaciones, su alta sensibilidad y selectividad, y el bajo coste delanlisis en relacin con los mtodos cromatogrficos de referencia, con resultados
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comparables (111); adems, la preparacin de muestra es simple, tienen gran capacidad
de trabajo, y presentan posibilidad de automatizacin y aplicacin para anlisis de rutina
en condiciones de campo (112, 113).
A pesar de sus importantes ventajas, los ensayos inmunoqumicos no estn exentosde limitaciones. Hay que tener en cuenta los posibles efectos de los factores
medioambientales en los resultados (114); los ensayos pueden estar afectados por la
matriz de la muestra (materia orgnica, pH, sales, etc.) necesitando, por tanto, un
intervalo de condiciones ptimas de trabajo (115, 116). Adems, la respuesta del
mtodo a compuestos anlogos, metabolitos u otros componentes que puedan estar
presentes en la muestra, es otro problema a tener en cuenta. As pues, la selectividad
(reactividad cruzada) y el efecto matriz son los dos factores que proporcionan mayorincertidumbre a los mtodos inmunoqumicos.
1.3.2. Obtencin y caractersticas de los anticuerpos
Los anticuerpos son glicoprotenas pertenecientes al grupo de las -globulinas, de
ah el nombre de inmunoglobulinas (Igs), que son producidas por el sistema inmunitario
de los vertebrados en respuesta a una sustancia (antgeno) extraa al organismo. Las
inmunoglobulinas estn formadas por varias cadenas polipeptdicas; su masa molecular
oscila entre 150-900 kDa, con un contenido en hidratos de carbono del 2 al 15%, y un
punto isoelctrico (pI) comprendido entre 4,4 y 9,5. En su forma soluble, se encuentran
fundamentalmente en el suero sanguneo, pero tambin estn presentes en otros fluidos
corporales, tejidos y clulas como lgrimas, saliva, intestino, leche, huevos, etc.
Las inmunoglobulinas se dividen en cinco clases o isotipos, en funcin de su
estructura (diferente tipos de cadena pesada: , , , , , distinta composicin de
aminocidos, carga y tamao), actividad funcional, etapa de la reaccin en la queaparecen y lugar donde se encuentran (sangre, leche, saliva, etc.): IgG, IgA, IgM, IgD e
IgE. En mamferos, las inmunoglobulinas IgGs son las que se encuentran en mayor
proporcin (80% del total) y las ms utilizadas en el anlisis inmunoqumico.
La mayora de anticuerpos, excepto los producidos por camlidos y escualos, tienen
una estructura bsica similar formada por cuatro cadenas polipeptdicas, iguales dos a
dos. La Figura 5 esquematiza la estructura bsica de una IgG, con dos cadenas ligeras
(L) iguales y dos cadenas pesadas (H) tambin iguales. Las cadenas pesadas estnunidas entre s mediante dos puentes disulfuro; cada una de ellas est unida a su vez a
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una cadena ligera por otro puente disulfuro. En la regin constante, las cadenas pesadas
tienen hidratos de carbono como grupo prosttico.
Figura 5.Estructura bsica de una IgGa) Esquema bidimensional
b) Representacin tridimensional
En un anticuerpo pueden diferenciarse claramente dos regiones, tanto en la cadena
pesada como en la ligera:- La regin variable, V, en el extremo amino terminal de la molcula,
constituye la zona del anticuerpo que interacciona con el antgeno. Estos
sitios de reconocimiento especficos y activos del anticuerpo (paratopos)
interaccionan con la regin del antgeno capaz de unirse al anticuerpo
(eptopo), y su secuencia de aminocidos es distinta en funcin del tipo
de IgG.
- La regin constante, C, en el extremo carboxilo, es diferente en funcinde la clase de inmunoglobulina, y sirve de anclaje a los receptores de
determinadas clulas.
La obtencin de anticuerpos que reconozcan especficamente a un antgeno requiere
la inmunizacin de un animal con dicha sustancia.
Si el analito es macromolecular, con masa molecular mayor de 5000 Da, la
inyeccin directa del mismo en el organismo productor de anticuerpos genera la
respuesta inmune, y los linfocitos del animal producen IgGs capaces de unirse
selectivamente al agente inyectado. Si el analito es una molcula pequea -caso de los
a b
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plaguicidas-, es necesario conjugarlo covalentemente a una sustancia (generalmente una
protena) ajena al organismo inmunizado, e inyectar este conjugado al animal para
provocar la respuesta inmune (ver Figura 6).
Figura 6.Esquema del proceso seguido para la obtencin de anticuerpos policlonales
En la terminologa utilizada habitualmente, a los compuestos de baja masa
molecular que se unen covalentemente a una sustancia inmunognica (generalmente una
protena), se les denomina haptenos. Los conjugados hapteno-protena capaces de
producir respuesta inmune son los inmungenos.
La generacin de anticuerpos para molculas pequeas requiere llevar a cabo las
siguientes etapas:
1. Diseo de molculas derivadas del analito que contengan un grupo
funcional apropiado (hapteno) para su unin al transportador
2. Sntesis de haptenos
3. Conjugacin covalente del hapteno al transportador
4. Purificacin del inmungeno
5. Inmunizacin del animal
ANALITO
MOLCULA PEQUEA (HAPTENO)MACROMOLCULA
UNIN A PROTENA(CONJUGADO HAPTENO-PROTENA)
RESPUESTA INMUNE
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Los principios bsicos para el diseo de haptenos han sido ampliamente descritos
(117-120). El hapteno tiene que ser lo ms similar posible al analito en estructura y
geometra, distribucin electrnica y capacidad de establecer puentes de hidrgeno, as
como en sus propiedades hidrofbicas (117).Otro aspecto importante a tener en cuenta, es la introduccin de un brazo espaciador
que disponga en su extremo un grupo adecuado para su unin directa a la protena
transportadora, como por ejemplo COOH, -OH, -NH2y SH. Este brazo debe estar
posicionado lo ms lejos posible de los sitios de reconocimiento del hapteno para
favorecer la exposicin del hapteno al sistema inmunitario. Es generalmente aceptado
que la longitud del brazo espaciador es un factor importante en la produccin de
anticuerpos con alta afinidad por el analito, y que la sensibilidad del inmunoensayomejora al aumentar la longitud del mismo (33, 121, 122). Un brazo espaciador largo
puede evitar el enmascaramiento del hapteno por la protena, pero si es demasiado largo
puede conducir al plegamiento del hapteno y reducir su exposicin al sistema
inmunitario (33, 122). Sin embargo, los resultados experimentales que soportan estas
hiptesis son limitados y contradictorios.
En algunos estudios, los haptenos con brazo espaciador de tamao medio (3-6
tomos de carbono) dieron lugar a los ensayos ms sensibles comparados con aquellos
que utilizaban un brazo espaciador ms corto (123-125), con los que se obtuvieron
resultados contrarios (126-128).
En el caso de plaguicidas organofosforados aromticos, el brazo espaciador puede
unirse tanto al grupo tiofosfato como al anillo aromtico. Generalmente, los haptenos
derivatizados por el grupo tiofosfato usan un aminocido como brazo espaciador.
McAdam et al.(129, 130) desarrollaron un mtodo general para sintetizar este tipo de
haptenos, que ha sido aplicado con xito al desarrollo de ELISAs para varios
plaguicidas organofosforados (126, 131-134). Este mtodo se basa en la unin del brazo
espaciador al grupo tiofosfato, e implica varios pasos de proteccin y desproteccin del
mismo. La aplicacin de esta metodologa a la sntesis de haptenos para diazinn ha
demostrado no ser viable, ya que el intermedio final se hidroliza en el paso de
desproteccin que conduce al hapteno. Por ello, Beasley et al. (135) adoptaron una
estrategia diferente, utilizando un aminoalcohol como brazo espaciador para obtener
anticuerpos policlonales contra diazinn. Actualmente, hay trabajos que usan un brazo
aminocarboxlico que no requiere demasiadas etapas de proteccin y desproteccin
(136).
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As, y para cada tipo de compuesto, deben sintetizarse diferentes molculas que,
manteniendo la estructura base, estn funcionalizadas para su unin directa a protenas
transportadoras (inmungenos) o a los marcadores correspondientes (trazadores), con el
fin de obtener los reactivos necesarios para efectuar los ensayos.Como ya se ha comentado, para estimular la produccin de anticuerpos frente a
molculas no inmunognicas es necesario ligarlas a una protena transportadora capaz
de provocar la respuesta inmune. Las protenas ms utilizadas para este fin son:
seroalbmina bovina (BSA), seroalbmina humana (HSA), ovoalbmina (OVA),
hemocianina del molusco Megathura crenulata (KLH) o IgGs de diferentes especies.
Los criterios de seleccin de una protena u otra se basan en su poder inmunizante
(cantidad de determinantes antignicos), solubilidad y facilidad de conjugacin.Adems de protenas, tambin pueden utilizarse polipptidos sintticos como la poli-L-
lisina o polisulfona funcionalizada, azcares, e incluso carbn activo y oro coloidal.
El hapteno debe unirse covalentemente a la protena transportadora, proceso que
generalmente se lleva a cabo utilizando una carbodiimida -que da lugar a un enlace
amida entre un carboxilo del hapteno y un grupo amino de la protena-, entre otros
mtodos de conjugacin ampliamente descritos (137).
Cuando se administra un inmungeno in vivo a un animal, se produce la
estimulacin de distintas clulas del sistema inmunitario (como macrfagos, linfocitos T
y B) del mismo. Los linfocitos B activados y diferenciados a clulas plasmticas,
secretan una mezcla de anticuerpos derivados de la activacin de numerosos clones de
linfocitos B. Este tipo de respuesta se denomina policlonal, y al suero de un animal que
contiene una mezcla de anticuerpos frente a un inmungeno se le denomina antisuero
policlonal. Los sueros policlonales suelen obtenerse en conejos, aunque tambin se
emplean otros animales como ratones, ovejas, cabras, gallinas, etc. La produccin de
anticuerpos policlonales (PAbs) es sencilla, y no requiere equipamiento sofisticado o
medios especiales. Su principal inconveniente radica en la diferente respuesta entre
animales. Un antisuero policlonal es una mezcla heterognea de anticuerpos de
diferentes clases en proporciones arbitrarias, y con diferentes afinidades y selectividades
hacia el analito para el que se ha obtenido.
Una alternativa a los Pabs son los anticuerpos monoclonales (MAbs) (33, 138).
Estos anticuerpos se obtienen utilizando el sistema inmunitario de ratn o rata
(actualmente, incluso conejos), seguido de la aplicacin de la tecnologa de hibridomas.
La tcnica original (ver Figura 7), diseada por Khler y Milstein (139), fusiona
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linfocitos B de animales inmunizados -capaces de producir anticuerpos- con una clula
tumoral (mieloma), dando finalmente clulas hbridas inmortales o hibridomas, que
pueden clonarse in vitro. El desarrollo de estos anticuerpos ha significado un enorme
avance de las tcnicas inmunolgicas, su comercializacin por distintas compaas, y unextraordinario desarrollo en campos como la Medicina, Medioambiente, Inmunologa,
Microbiologa, Parasitologa, y otras ciencias afines.
Figura 7.Esquema de la produccin de anticuerpos monoclonales
Los MAbs son una mezcla homognea de inmunoglobulinas producidas por un
grupo de clulas genticamente idnticas (clon), de modo que todas tienen exactamente
las mismas propiedades. Se pueden producir en cantidad tericamente ilimitada, a
diferencia de los PAbs para los que no puede asegurarse la repeticin de propiedadescomo afinidad y selectividad, incluso reproduciendo exactamente todas las fases de
Fusin celularcon PEG
Clulas mielomaHGPRT-
HAT: Mezcla de hipoxantina,
aminopterina y timidina
Clulas esplnicas(resistentes a HAT)
ANTICUERPOS
MONOCLONALES
Antisuero
Cultivo en HAT(Seleccin) Ensayos para
seleccionar cultivos
ANTGENO
Clonaje de cultivos productores
de anticuerpos
ANTICUERPOSPOLICLONALES
HGPRT-: Hipoxantina-guanina
osforibosiltransferasa
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obtencin de los mismos. La Tabla 5 resume las principales propiedades de los
anticuerpos policlonales y monoclonales.
Tabla 5.Principales caractersticas de los anticuerpos policlonales y monoclonales
Policlonales Monoclonales
Mezcla heterognea de Igs Mezcla homognea de IgsSuministro limitado Suministro ilimitadoPropiedades variables Propiedades idnticasBajos costes de produccin Altos costes de produccinObtencin en tres meses Obtencin en seis meses
Usando MAbs se han desarrollado ELISAs para la determinacin de un gran
nmero de plaguicidas, como por ejemplo fenitrotin, paratin-metil, 2,4-D, molinato,
clorpirifos, carbaril, atrazina, etc. (140-143).
Una tercera posibilidad surge de los avances en las tcnicas de ingeniera gentica,
que han propiciado el desarrollo de anticuerpos recombinantes. En las tecnologas
recombinantes, se generan colecciones o series de protenas de bajo peso molecular con
propiedades similares a los anticuerpos y capacidad de reconocimiento de un compuesto
dado. Su produccin se consigue mediante la expresin de regiones funcionales de los
Abs en sistemas husped, relativamente simples y baratos (144), as como por
modificacin gentica a nivel del ADN. Las aproximaciones de la gentica molecular
permiten expresar secuencias de aminocidos en la superficie de un bacterifago y
despus cribar las secuencias mediante un ensayo tipo ELISA. Ahora es posible clonar
no slo anticuerpos, sino tambin fragmentos conteniendo los sitios de unin del
antgeno (regiones hipervariables de los anticuerpos), en un sistema celular simple como
E. coli (145). Las tecnologas recombinantes hacen posible obtener anticuerpos ms
especficos y afines, mejorar -en algunos casos- la sensibilidad de los inmunoensayos y
la estabilidad de los anticuerpos (146), y alcanzar lmites de deteccin y selectividades
similares a los alcanzados con MAbs y PAbs (147). Por ejemplo, se han usado
anticuerpos recombinantes para la determinacin de atrazina (146), clorpirifos (147),
2,4-D (148) y metamidofos (149). No obstante, los resultados an no son totalmente
satisfactorios.
Junto con los anticuerpos policlonales, monoclonales y recombinantes, en los
ltimos aos tambin se han utilizado anticuerpos sintticos (150), tambin llamados
polmeros de impronta molecular (molecularly imprinted polymers, MIPs). Estosproductos se preparan por polimerizacin de monmeros especiales en un medio que
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tambin contiene el analito. Una vez solidificado el polmero, se elimina el analito, de
modo que los polmeros resultantes contienen cavidades con formas y funcionalidad
qumica capaces de unir selectivamente las molculas de analito.
Las principales ventajas de los MIPs son su estabilidad en una gran variedad deambientes, su comodidad, coste, tiempo y reproducibilidad de preparacin, capacidad de
carga de muestra, y durabilidad del material. Adems, algunos de estos polmeros
presentan elevadas selectividades y constantes de afinidad, comparables a las de los
anticuerpos monoclonales. Sin embargo, sus principales inconvenientes estn
relacionados con la heterogeneidad de los sitios impresos y la dependencia de los
disolventes orgnicos durante su sntesis y utilizacin.
Los MIPs se han usado ampliamente para la determinacin de residuos deplaguicidas utilizando ensayos tipo ELISA, cromatografa de inmunoafinidad e
inmunosensores (150-153).
La comparacin de las tcnicas de obtencin y las propiedades de los diferentes
tipos de anticuerpos (policlonales, monoclonales, recombinantes y de impronta
molecular), conduce a la conclusin de que a pesar de los inconvenientes sealados ms
arriba, la utilizacin de PAbs est ms que justificada por la sencillez de la tcnica y la
calidad de los anticuerpos obtenidos, cuya sensibilidad y selectividad son,
generalmente, similares o superiores a las de los recombinantes y MAbs. Por ello, en
esta Tesis se han utilizado anticuerpos policlonales.
1.3.3. Tipos de inmunoensayos
Dada la amplitud del concepto de inmunoensayo, el nmero de posibles
configuraciones que puede adoptar un inmunoanlisis es enorme, hasta el punto de que
su clasificacin y terminologa es incluso confusa (154).Basndonos en conceptos generales, los inmunoensayos se pueden clasificar
atendiendo a distintos factores (Tabla 6):
Segn el desarrollo de la interaccin antgeno-anticuerpo, pueden ser homogneos
-cuando la reaccin inmunoqumica se produce en el seno de la disolucin sin que haya
separacin fsica entre el analito y el resto de componentes de la matriz- o heterogneos
-cuando la interaccin tiene lugar en la interfase entre un soporte slido y la disolucin,
permitiendo la separacin del analito del resto de la matriz-. Como soporte puedenemplearse plsticos (PMMA, poliestireno, etc.), vidrio, silicio y materiales similares en
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diferentes presentaciones (placas, lminas, membranas, partculas, tubos, etc.). De todos
ellos, las placas de poliestireno de 96 pocillos (placa ELISA) son las ms empleadas.
Tabla 6.Clasificacin de distintos tipos de inmunoensayos
Separacin Ab libre y enlazado S HeterogneoNo Homogneo
Reactivo limitante CompetitivoSDesplazamiento
No No competitivo
Especie inmovilizada Ab DirectoConjugado hapteno-protena Indirecto
Marcador Enzima EIAIstopo radiactivo RIAFluorforoOtros
FIA
En funcin del diseo, los inmunoensayos pueden ser competitivos (o de reactivo
limitado) -cuando el analito rivaliza con un homlogo marcado por los sitios especficos
del anticuerpo, que se encuentra en cantidad limitante-, por desplazamiento-cuando el
antgeno marcado se incuba con el anticuerpo (reactivo limitante) y despus se aade el
antgeno, que desplaza al antgeno marcado del complejo- y no competitivos (o de
reactivo en exceso) -incluye todos los ensayos sin etapa competitiva-. Los
inmunoensayos no competitivos se basan en la medida de los sitios ocupados al usar un
exceso de anticuerpo. Los anticuerpos no marcados se inmovilizan, mientras que los
anticuerpos marcados se aaden al medio. Esta configuracin slo puede utilizarse
cuando el analito de inters posee al menos dos sitios de unin y, por tanto, no es
apropiado para molculas de baja masa molecular como los plaguicidas.
Segn el desarrollo del formato competitivo, los inmunoensayos pueden ser
directos (Figura 8A) -cuando el analito y un hapteno de estructura similar marcado se
encuentran en disolucin y compiten por unirse al anticuerpo, que se encuentra
inmovilizado en un soporte slido-, o indirectos (Figura 8B) -cuando el conjugado
hapteno-protena se encuentra inmovilizado, y el analito y el anticuerpo se aaden en
disolucin -.
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S
Soporte Anticuerpo Anticuerpo Conjugado Trazador Analito Hapteno Substrato Producto OtrosEspecfico Secundario Protena- Coloreado Componentes
Marcado Hapteno
Lavado
SS
Anticuerpoinmovilizado
Adicin de muestra ytrazador
Adicinde substratoenzimtico
A) FORMATO DIRECTO
S S
Conjugado protena-hapteno inmovilizado
Adicin de muestra yanticuerpo especfico
LavadoAdicin deanticuerposecundario
marcado.
Lavado
Adicin desubstrato
enzimtico
B) FORMATO INDIRECTO
Figura 8.Esquema de un inmunoensayo heterogneo competitivo en formato directo(A) e indirecto (B)
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Debido a que la absorcin directa de un antgeno de bajo peso molecular en la
superficie de las placas de poliestireno es difcil, la inmovilizacin (tapizado) se lleva a
cabo utilizando un conjugado protena-hapteno, el cual se adsorbe en la superficie
slida. Con el fin de disminuir las interacciones inespecficas, el conjugado de tapizadodebe usar una protena diferente a la empleada en la sntesis del inmungeno (por
ejemplo, KLH para el inmungeno y OVA para el tapizado).
Segn el tipo de marcaje, los inmunoensayosse denominan enzimticos (EIAs)
cuando utilizan una enzima, radioinmunoensayos (RIAs) si las medidas son
radioqumicas, y fluoroinmunoensayos (FIAs) si el marcador es un fluorforo o una
molcula quimioluminiscente (155).
Adems, existen otros tipos de marcadores como los particulados (ltex, oro, puntoscunticos -quantum dots-), complejos metlicos (Tb3+, Eu3+), cofactores enzimticos
(FAD), etc., y otros tipos de deteccin -msica, electroqumica, etc.-.
Aunque los marcadores fluorescentes y quimiluminiscentes han ganado popularidad
en los ltimos aos, los enzimticos como la peroxidasa de rbano picante (HRP) o la
fosfatasa alcalina (AP) son los ms utilizados. Adems, poseen gran variedad de
substratos (cromognicos, fluorescentes y bioluminiscentes), alcanzndose
sensibilidades iguales o mejores a las obtenidas con otros marcadores.
El inmunoensayo enzimtico en fase heterognea (ELISA) ha sido el ms utilizado
para la realizacin de diversos tipos de anlisis. Los ELISAs estn basados en el uso de
trazadores enzimticos y estn disponibles en diferentes soportes: tubos, partculas
magnticas o microplacas, permitiendo el anlisis de un gran nmero de muestras
simultneamente (32, 156).
En los inmunoensayos competitvos, la cuantificacin se efecta mediante
interpolacin en la curva patrn del analito de inters (156). Las curvas de calibrado
dosis-respuesta representan la seal obtenida (absorbancia, fluorescencia, etc.) frente al
logaritmo de la concentracin de patrn. Existen diferentes modelos para ajustar
matemticamente los resultados experimentales (157); utilizando el ajuste de cuatro
parmetros se obtienen curvas sigmoidales, presentando una zona lineal prxima a la
IC50 (concentracin que provoca un 50% de la disminucin de la seal respecto al
blanco) (32). Otros puntos importantes de la curva son el lmite de deteccin (LD,
concentracin de analito que origina una disminucin de la seal respecto al blanco del
10%) y el de cuantificacin. Los lmites de deteccin y cuantificacin de los ensayos
ms sensibles alcanzados para haptenos de bajo peso molecular son del orden de ng/L,
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[ANALITO]
SEAL
Amax90%
80%
50%
20%
IC50
Intervalode trabajo
LD
Amin
mientras que los lmites superiores varan entre 10 y 100 g/L (158). En este tipo de
curvas de calibrado (Figura 9), el intervalo de trabajo o rango dinmico se define
como el intervalo de concentraciones de analito que produce una seal entre el 80% y el
20% del intervalo definido por las asndotas mxima y mnima (Amaxy Amin).
Figura 9. Curva de calibrado tpica de un inmunoensayo competitivo
1.3.4. Mtodos de barrido (Screening)
En anlisis de rutina, un elevado porcentaje de muestras puede no contener los
compuestos buscados, siendo muy interesante disponer de metodologas queproporcionen respuestas binarias tipo s/no, positivo/negativo o presencia/ausencia.
Estos mtodos indican, mediante barrido rpido, si el compuesto diana est presente por
encima o por debajo de un umbral de concentracin pre-establecido.
La evaluacin de las tcnicas analticas ms usadas en la actualidad en trminos de
productividad, coste y exactitud, demuestra que los mtodos inmunoqumicos son muy
convenientes para el monitoreo de muestras naturales (159-162) con confidencialidad y
minimizacin de errores, debido al escaso o nulo tratamiento de muestra. As, la
aplicacin de estos mtodos como tests de screening-mtodo analtico que es capaz de
llevar a cabo la seleccin de aquellas muestras cuyo contenido es similar o mayor que
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uno previamente establecido como umbral (163)- permite eliminar las muestras
negativas y, si es pertinente, confirmar las positivas mediante un mtodo de referencia
que, en la mayora de los casos, es cromatogrfico, lo que supone un ahorro de tiempo y
costes.En el campo del anlisis inmunoqumico de plaguicidas, la mayora de los mtodos
directos de monitoreo descritos en la bibliografa se han aplicado a matrices
medioambientales (164-166). En el caso de matrices ms complejas como los alimentos,
numerosos kits comerciales para la determinacin de plaguicidas (Tabla 7) necesitan
efectuar un pre-tratamiento de muestra, lo que supone una cierta traba para estos
procedimientos como mtodos de barrido. Otro inconveniente es que las metodologas
inmunoqumicas slo permiten la determinacin de uno o dos analitos simultneamente(167-169).
1.3.4.1. Inmunofiltracin-Ensayos en membrana
Entre los inmunoensayos denominados de barrido se incluyen los basados en
inmunofiltracin, cuya principal ventaja es su facilidad de uso sin una excesiva
preparacin de muestra. Este formato de inmunoensayo es muy apropiado para ser
aplicado fuera del laboratorio, y por personal no especializado.
De entre los diferentes formatos destaca el denominado ELIFA (Enzyme-Linked
Immunoflow Assay) (Figura 10), que combina las caractersticas del ELISA y del
Western blotting. En un ELIFA, las protenas se adsorben en una membrana -en lugar
de en una placa de poliestireno- y las disoluciones se filtran a vaco. Ello permite
concentrar tanto reactivos como analitos; adems, la filtracin ayuda tambin a reducir
el tiempo de anlisis (170).
Las membranas utilizadas como soporte tienen una composicin (nylon,nitrocelulosa, fluoruro de polivinilideno, etc.) adecuada para inmovilizar los
inmunorreactivos y desarrollar el ensayo, permitiendo la determinacin visual directa
(interpretacin del color) de los resultados (171).
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1. Introduccin
28
Carbendazima
Alimentos
SPE,ACN
como
modificadorde
lamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
Carbaril
Alimentos
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
68,5
Benomilo
Carnes
SFEdinmica,
limpiezaSPE
yextraccin
ACN/HX
PM
Strategic
Diagnostics
5ppb
1-14ppb
100
Beno
milo
Frutasy
vegetales
Extraccin
acetona
ykit
preparac
inde
alimento
s
PM
Strategic
Diagno
stics
0,38pp
b
62-1.200ppb
100
Benomilo
(MCB/TBZ)
Frutasy
vegetales
Extraccin
MeOH/H2O
(1/10)
Placa
Millipore
0,02mg/Kg
Atrazina
Carnes
SFE
dinmica,
limpieza
SPEy
extraccin
ACN/HX
PM
Strategic
Diagnostics
1ppb
1-14ppb
100
Atrazina
Alimentos
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
74,6
Aldicarb
Alimentos
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
86,5
Alacloro
Carnes
SFEdinmica,
limpieza
SPE
yextraccin
ACN/HX
PM
Strategic
Diagnostics
1ppb
1-14pp
b
100
Alacloro
Alimentos
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
108
Ta
bla7.Aplicacindekitscomercialesbasadoseninmunoensayoparaladeterminacinderesiduosdeplaguicidasenalimentos
Ana
lito
Matriz
Pretratamiento
dem
uestra
Formato
Fab
ricante
LD RD R(%
)
LD:lmitededeteccin,RD:rangodinmico,R:
recuperacin,PM:partculasmagnticas,SPE:extraccinenfaseslida,SFE:extraccin
confluidosupercrtico,ACN:acetonitrilo,M
eOH:metanol,HX:
hexan
o
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1. Introduccin
29
2,4-D
Carnes
SFEdinmica,
limpiezaSPEy
extraccin
ACN/HX
PM
Strategic
Diagnostics
14ppb
140
2,4-D
Alimentos
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
2,4-D
Frutasy
vegetales
Extraccin
conMeOH/H2O
(1/10)
Placa
Millipore
0,2ppm
Clorpirifos-
metil
Granos
70%de
alcohol
isoproplico
yagitacin
2min T
ubo
Mill
ipore
0,5-10ppb
97,8
-104
Clorpirifos-
metil
Granos
Extraccin
MeOHy
concentracin
a10mL
Placa
Millipore
0,01-2ppm
Clorpirifos
Alimentos
parabebes
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
100
Clorpirifos
Frutasy
granos
Extraccin
conACN
oMeOH
PM
Strategic
Diagnostics
0,1ppb
0,22-3ppb
Cianazina
Alimentos
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
30,4
Carbo
furano
Ca
rnes
SFEdin
mica,
limpiezaSPE
yextrac
cin
ACN/HX
PM
Strateg
ic
Diagnostics
3ppb
1-14p
pb
100
Carbofurano
Alimentos
SPE,ACN
como
modificador
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
79,5
Tabla7.cont.
Analito
Matriz
Pret
ratamiento
dem
uestra
Formato
Fabricante
LD RD R(%
)
LD:lmitededeteccin,RD:rangodinmico,R:rec
uperacin,PM:partculasmagnticas,SPE:extraccinenfaseslida,SFE:extraccinconfluidosupercrtico,ACN:acetonitrilo,MeOH:metanol,HX:hexano
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1. Introduccin
30
Triazinas
Leche
Sintratamiento
Placa
Millipore
Procimido
na
Pimiento
Extraccin
Na2SO4,
etilacetato,
evaporacin
,
reconstrucci
n
enterde
petrleoySPE
Tubo
Millipore
0,6ppb
5-80ppb
70,2-102,9
Procimidona
Vino
Sintratamiento,
filtracin
PM
Strategic
Diagnostics
2ppb
Procimidona
Vino
Dilucinde
lamu
estra
PM
Stra
tegic
Diagnostics
2-100ppb
109
Pirimifos-
metil
Granos
Extraccin
MeOHy
concentradoa
10mL
Placa
Millipore
0,5-2ppm
>100
PCP
Leche
Sintratamiento
Tubo
Millipore
Metolaclo
ro
Alimento
s
SPE,ACN
como
modificado
r
delamatriz
PM
Strategic
Diagnostics
72,6
Fenitrotion
Granos
Extraccin
MeOHy
concentradoa
10mL
Placa
Millipore
0,3-3ppm
Die
ldrin
Ca
rnes
SPEy
solubilizacin
con2m
Lde
0,01%
Tween20
Tubo
Abraxi
s
Diazinn
Frutasy
vegetales
Extraccin
MeOH
y
limpiezaSPE
Placa
Strategic
Diagnostics
0,5ppb
30-500ppt
87
Ta
bla7.cont.
Ana
lito
Matriz
Pretratamiento
dem
uestra
Formato
Fab
ricante
LD RD R(%
)
LD:lmitededeteccin,RD:rangodinmico,R:rec
uperacin,PM:partculasmagnticas,SPE:extraccinenfaseslida,SFE:extraccinconfluidosupercrtico,ACN:acetonitrilo,MeOH:metanol,HX:hexano
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1. Introduccin
31
Figura 10.Esquema de un sistema ELIFA. (1: placa de aplicacin de la muestra, 2:
pocillo de la muestra, 3: membrana, 4: juntas de silicona, 5: cnulas detransferencia, 6: cmara de recoleccin)
Inicialmente, la inmunofiltracin se utiliz para la deteccin de anticuerpos
especficos contra protenas cuyas conformaciones podran verse afectadas por la
adsorcin a diferentes superficies (172, 173). Sin embargo, la inmunofiltracin es muy
verstil, y se ha usado para la seleccin y caracterizacin de soportes para el desarrollode inmunosensores (174), habindose aplicado con profusin en el campo clnico y en
el medioambiental. Por ejemplo, se ha usado para ensayos semicuantitativos de
protenas humanas (175), para la deteccin de estreptomicina en leche (176) o
fumonisim B1 en alimentos conteniendo maz (177), la determinacin de 2,4,6-
trinitrotolueno en agua y suelos (178), sulfonamidas (179) y sulfametacina en orina
porcina (180), y atrazina en aguas y suelos (181).
Otro formato ampliamente utilizado dentro de los inmunoensayos rpidos en
membrana es el basado en tiras reactivas (stripsde flujo lateral, dipsticks, lateral flow
immunoassays o inmunocromatografa). En los inmunoensayos de flujo lateral todos los
reactivos se sitan en un soporte slido y mediante el flujo capilar de la muestra lquida
se determina la presencia o ausencia de un determinado analito. Este formato presenta
importantes ventajas para su aplicacin en screening. Entre ellas destacan su facilidad
de uso, rapized y versatilidad, con costes competitivos.
Existen gran cantidad de tests comerciales que utilizan formato en tiras para
diagnstico veterinario y humano: test de embarazo, hormonas, alrgenos, deteccin de
toxinas (182) y drogas (183); tambin se utilizan para detectar organismos modificados
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1. Introduccin
32
genticamente, y en el monitoreo medioambiental. Su uso como herramienta de
diagnstico para deteccin de plaguicidas se est introduciendo paulatinamente (184-
191), y sus aplicaciones son diversas (192-195). En el mbito agroalimentario se han
utilizado para determinar atrazina (196) y 2,4-D (187) en aguas, naranjas y orina.Tambin se han usado para determinar carbaril (197) y paratin-metil (198) en muestras
vegetales, con un lmite de deteccin visual de 10 g/L en ambos casos, y tiempos de
ensayo de 15 y 30 minutos para carbaril y paratin-metil, respectivamente. Usando un
lector basado en medidas de reflectancia, el lmite de deteccin es de 0,3 g/L para
paratin-metil. Las tiras reactivas tambin se han aplicado a la determinacin de
residuos de organofosforados, concretamente de fentin (199) en arroz y lechuga -tras
triturar, filtrar y diluir el extracto acuoso-, con recuperaciones entre el 87% y el 116%.Este ensayo presenta un lmite de deteccin de 0,5 g/L utilizando medidas de
reflectancia.
1.4. El aceite de oliva
Un aceite vegetal es un extracto orgnico obtenido a partir de semillas o frutos de
plantas como la aceituna, soja, maz, girasol, colza, pepitas de uva, etc. Segn el
Departamento de Agricultura de EE.UU., el consumo mundial de aceites vegetales en el
ao 2000 fue de 84 millones de toneladas (Tabla 8). En el ao 2006, el consumo de
aceite de oliva se situ entre un 1,8% y un 2,2% del total de aceites vegetales, aunque en
Espaa y otros pases mediterrneos como Italia y Grecia, el porcentaje era
considerablemente mayor (>60%), con un consumo aproximado de 13 litros por
habitante y ao.
Tabla 8. Consumo mundial de aceites vegetales en el ao 2000Aceite Consumo (t)
Soja 26.000Palma 23.300Colza 13.100Girasol 8.600Cacahuete 4.200Semilla de algodn 3.600Hueso de palma 2.700Oliva 2.500
Fuente: Departamento de Agricultura de EE.UU.
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1. Introduccin
33
En Espaa, elconsumo de aceite, tanto en usos domsticos como industriales, se
reparte, principalmente, entre aceite de oliva (53%) y aceite de girasol (34%) (Figura
11).
ACEITE CONSUMO TOTAL (t)
Aceite de OLIVA 475.000
Aceite de ORUJO 65.000
Aceite de GIRASOL 310.000
Otros aceites de SEMILLAS 50.000
TOTAL 900.000
Fuente: Anierac. Ao 2006
Figura 11.Consumo de aceites comestibles en Espaa
El aceite de oliva posee un aroma, sabor y color caracterstico que lo diferencia de
otros aceites vegetales (200); su consumo est en alza debido a sus excelentes
cualidades nutritivas y organolpticas, y a la creciente preferencia de los consumidores
por los alimentos mnimamente procesados.
Este producto tiene una gran importancia en la economa de diferentes regiones del
rea mediterrnea. En Espaa, el cultivo del olivar ocupa una superficie de 2.400.000
ha, lo que la sita como lder mundial entre los pases productores de este aceite, con
una produccin de 829.475 t en la campaa 2006/2007 (201).
Aunque son trece las comunidades autnomas que cultivan el olivar en Espaa, la
produccin se concentra en Andaluca, con un 82,1% de la produccin total espaola,
seguida de Castilla-La Mancha (5,2%) y Extremadura (5,2%), Catalua (2,7%),
Comunidad Valenciana (2,2%) y Aragn (1,1%) (Tabla 9). Hay que tener en cuenta que
el cultivo del olivar se caracteriza por ser muy artesanal, existiendo realidades olecolas
muy diferentes en funcin de su ubicacin geogrfica, que hay que contemplar desde un
ACEITE DEGIRASOL
ACEITE DEOLIVA
ACEITE DESEMILLAS
ACEITE DEORUJO
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1. Introduccin
34
punto de vista econmico, sin olvidar los aspectos sociales, culturales, paisajsticos y
agronmicos.
Tabla 9.Produccin espaola de aceite de oliva (t) porcomunidades autnomas
CC.AA. Campaa 2006/2007
Andaluca 681.360Castilla La Mancha 43.459Extremadura 43.207Catalua 22.093Comunidad Valenciana 18.040Aragn 9.239Otras comunidades 12.077Total 829.475
Fuente: MAPA. Ao 2007
La produccin de aceite de oliva rene una serie de particularidades que la
diferencian de la mayor parte de aceites y grasas vegetales: est muy localizada, el
aceite de oliva es un producto natural que puede consumirse tal como se extrae del fruto
y, adems, su volumen es proporcionalmente muy pequeo.
El aceite de oliva representa slo el 3,3 % de la produccin total de aceites y grasas
vegetales, y su produccin se concentra en la cuenca del Mediterrneo. En la Figura 12
puede apreciarse que, aproximadamente, el 75% de esta produccin proviene de pases
de la Unin Europea, y que solo Espaa e Italia producen ms del 50% del aceite de
oliva mundial, aunque las cifras varan segn las cosechas.
La evolucin de la produccin mundial de aceite de oliva en los diez ltimos aos
(Figura 13) muestra una tendencia global al alza. Adems, como muestra la Figura 14,
los principales pases consumidores son tambin los mayores productores. El consumo
en los pases de la Unin Europea representa el 71% del consumo mundial, y el 77% en
los pases de la cuenca mediterrnea. El resto de pases consumidores son Estados
Unidos, Canad, Australia y Japn. Finalmente, es de destacar que pases no recogidos
en el grfico estn incrementando su produccin, especialmente Australia y Estados
Unidos.
El paralelismo observado entre las curvas de consumo mundial y europeo (Figura
15) indica la importancia del consumo de este producto en la Unin Europea. Hay que
tener en cuenta que la distancia entre estas curvas se ha incrementado en los ltimos
aos debido a la apertura de nuevos mercados para el aceite de oliva.
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1. Introduccin
35
Figura 12. Principales pases productores de aceite de oliva y porcentajes deproduccin en 2005.Fuente: Secretariado de la UNCTAD. Datos del Consejo Oleicola Internacional. Ao2006
Figura 13. Produccin de aceite de oliva (millones de t) en el periodo 1993-2005.Fuente: Secretariado de la UNCTAD. Datos del Consejo Oleicola Internacional. Ao 2006
Siria4%
Grecia18%
Portugal1%
Turqua5%
Tnez
8%
Marruecos3%
Espaa36%
Italia25%
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
0
Millonesdetoneladas
1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005
Ao
Marruecos
Siria
Turqua
Resto del mundo
Portugal
Grecia
Italia
Espaa
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1. Introduccin
36
Figura 14. Principales pases consumidores de aceite de oliva y porcentajes de
consumo en 2005.Fuente: Secretariado de la UNCTAD. Datos del Consejo Oleicola Internacional. Ao2006
Figura 15.Produccin y consumo de aceite de oliva (millones de t) a nivel mundialy en la Unin Europea (periodo 1970-2005).Fuente: Secretariado de la UNCTAD. Datos del Consejo Oleicola Internacional. Ao2006
Millonesdetoneladas
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1. Introduccin
37
Los componentes del aceite de oliva pueden clasificarse en dos grupos, la fraccin
saponificable y la insaponificable. La primera est constituida por triglicridos (steres
de cidos grasos y glicerina) y cidos grasos libres. Entre los cidos grasos ms
abundantes (Tabla 10) se encuentran el cido oleico monoinsaturado y, en menorproporcin, los cidos poliinsaturados linoleico y linolnico. Los cidos grasos
saturados se encuentran en cantidades similares -o incluso menores- a las de otros
aceites vegetales.
Tabla 10.Contenido en los principales cidos grasosde los aceites vegetales ms consumidos
Tipo de aceite Porcentaje de cidos grasos
Oleico Linoleico LinolnicoOliva 61-83 2-18 1,5Girasol 15-38 50-72 0,2Maz 22-40 45-65 1,5Soja 20-35 45-60 6-10
La fraccin insaponificable incluye diversos grupos de compuestos: steres de
cidos grasos no glicridos, hidrocarburos, esteroles, alcoholes triterpnicos,
tocoferoles, fenoles, fosfolpidos, clorofilas y compuestos aromticos. Entre los
terpenos se encuentra el escualeno. Los carotenos suponen de 0,5 a 10 mg/kg y
constituyen el factor provitamina A del aceite, siendo responsables, junto a la clorofila,
de la coloracin verde-amarilla de ste. El contenido en -tocoferol representa el 90-
95% de los tocoferoles totales y es el ms activo por su accin como vitamina E.
1.4.1.Tipos, obtencin y produccin del aceite de oliva
La legislacin espaola distingue diversos tipos de aceite de oliva atendiendo al
modo de obtencin:
- Aceite de oliva virgen extra: se obtiene de las aceitunas por medios mecnicos
sin ningn otro tratamiento, pudiendo ser consumido sin refinar. Su acidez debe ser
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1. Introduccin
38
- Aceite de oliva: se obtiene a partir de aceite de oliva refinado al que se aade un
15% de aceite de oliva virgen extra. Esta denominacin da lugar a frecuentes
confusiones. El aceite refinado es normalmente aceite lampante tratado en una refinera
(de ah su nombre) para, por procedimientos qumicos y fsicos, mejorar suspropiedades indeseables (acidez, olor, sabor, etc.). El aceite obtenido no tiene
-prcticamente- sabor o aroma, razn por la que se le aade aceite de oliva virgen o
virgen extra.
- Aceite de orujo de oliva: Se obtiene mediante extraccin con disolventes, a partir
del orujo de aceituna -residuo slido procedente de la extraccin del aceite virgen
(huesos, pieles y pulpa)-. En la etapa de envasado se le adiciona una pequea cantidad
de aceite de oliva virgen.
En una almazara, la extraccin del aceite de oliva virgen se puede llevar a cabo,
fundamentalmente, por dos mtodos: presin y centrifugacin. El sistema clsico es el
de presin, en el que la pasta procedente de las aceitunas molidas se reparte en
capachos, obtenindose por prensado. En una almazara moderna la pasta es batida y se
centrifuga en un equipo de eje horizontal, obtenindose tres fases -aceite, alpechn y
orujo- (Figura 16).En los ltimos aos se ha asistido a un cambio tecnolgico en el sistema continuo
de centrifugacin, obteniendo slo dos fases. Se ha demostrado que utilizando este
nuevo sistema de extraccin, el rendimiento industrial es similar y la calidad del aceite
comparable al que proporciona tres fases.
Desde un punto de vista econmico, el sistema clsico de presin no puede
competir con el sistema continuo o de centrifugacin, debido -fundamentalmente- a los
elevados costes de elaboracin (requiere ms mano de obra), a la discontinuidad de la
produccin, y al elevado coste de los materiales filtrantes.
1.4.2. El aceite de oliva y los plaguicidas
El olivar se ve atacado por una gran variedad de insectos y plagas, principalmente la
mosca de la fruta de la oliva -Bactocera (Dacus) oleae- que afecta a la produccin tanto
en cantidad como en calidad, y que est considerada una de las plagas ms importantes
y temibles del olivo. La mosca adulta pone sus huevos en el fruto y la larva se desarrolla
en el interior alimentndose del mesocarpio, lo que provoca la cada de las aceitunas y
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1. Introduccin
39
la disminucin del peso (20%), y por tanto del rendimiento. Pero lo ms importante es
el dao indirecto que causa en la calidad del aceite de la aceituna atacada. El desarrollo
de la larva origina en los frutos un gran nmero de galeras y agujeros, por donde
penetran hongos (Gloeosporium olivarium) y bacterias que alteran gravemente lacalidad de los aceites -aumento de acidez y deterioro de las caractersticas
organolpticas-.
Figura 16.Esquema del proceso de obtencin del aceite de olivaFuente: UNCTAD. Ao 2005
Los productos fitosanitarios ms aplicados en los olivares de los pases
mediterrneos son los herbicidas y los insecticidas. Algunos de los plaguicidas
utilizados para controlar las plagas pueden persistir hasta la recoleccin y son
lipoflicos, con altos valores de coeficientes de particin n-octanol-agua (kow), lo que
favorece que sus residuos se concentren en el aceite durante el proceso de extraccin,
provocando la contaminacin del mismo. El uso de plaguicidas puede determinar su
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1. Introduccin
40
presencia en las aceitunas y, consecuentemente, en el aceite de oliva, el cual debe de ser
controlado regularmente (202-205).
Los insecticidas ms usados en el cultivo del olivar son los organofosforados (206),
principalmente dimetoato, diazinn, paratin-metil y clorpirifos -se usa en combinacincon endosulfn- (ver Tabla 11). Adems, otros plaguicidas como fentin y malatin han
sido ampliamente utilizados en algunos de los pases productores (204) como, por
ejemplo, Grecia. Actualmente, algunos de los fitosanitarios recomendados que aparecen
en la Tabla 11 han sido prohibidos. Su sustitucin no est bien resuelta a la hora de
evaluar su eficacia como plaguicidas para el olivo.
La Unin Europea, y la Comisin del Codex Alimentario de la Organizacin para
los Alimentos y Agricultura de las Naciones Unidas (FAO), han establecido lmitesmximos de residuos (LMRs) para plaguicidas en aceitunas y aceite de oliva (5).
Actualmente, se estn llevando a cabo varios programas de control de residuos de
plaguicidas en aceite de oliva para establecer nuevas y ms rigurosas regulaciones
concernientes al lmite mximo de residuos en este producto (207).
1.4.3. Determinacin de residuos de plaguicidas en aceite de oliva
La determinacin de residuos de plaguicidas y otros contaminantes orgnicos (por
ejemplo PCBs, dibenzodioxinas cloradas y dibenzofuranos) en muestras grasas requiere
diferentes etapas de preparacin de muestra, bsicamente extraccin y limpieza (clean
up) o purificacin de los extractos.
El aceite de oliva es ms complejo de analizar que otros aceites vegetales -soja,
girasol y germen de trigo-. Esto se debe, en parte, a la presencia relativamente elevada
de lpidos que eluyen en la etapa de limpieza, y a los componentes potencialmente
interferentes (por ejemplo los pigmentos) que co-eluyen cuando se realiza ladeterminacin cromatogrfica (208). As pues, se requieren diferentes tratamientos con
el fin de eliminar las interferencias de la matriz (209). Adems, son bien conocidos los
problemas analticos asociados con la determinacin de plaguicidas en matrices grasas,
ya que incluso pequeas cantidades de lpidos pueden causar daos en columnas y
detectores, haciendo imposible la confirmacin inequvoca de la identidad del analito.
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1. Introduccin
41
Tabla 11.Principales plagas del olivo y tratamientos fitosanitarios recomendados*
Plaga Tratamiento Fecha de aplicacin
Mosca del olivo(Dacus oleae)
Dimetoato, diazinn,deltametrn, malatin,
triclorfn, formotin,metidatin, fosmet,fentin
Julio
Polilla del olivo(Prays oleae)
Dimetoato, carbaril,endosulfan, triclorfn,clorpirifos, diazinn,formotin, fosmet,metidatin
Antes de la floracin yeventualmente sobre lasaceitunas en fase decrecimiento
Arauela del olivo
(Liothrips oleae)
Dimetoato, formotin,
malatin, triclorfn
Primavera y verano
Escarabajo picudo(Coenrrhinus cribipennis)
steres fosfricos Inmediamente despus delcuajado del fruto
Barrenillo del olivo(Phloeotribus scarabaeoides)
Formotin, dimetoato,metidatin
Cochinilla del tizne(Saissetia oleae)
Carbaril, fosmet,pirimifos-metil
Agosto
Abichado del olivo(Euzophera pinguis)
Fosmet, clorpirifos,fenitrotin
Abril-mayo y octubre
Serpeta(Lepidosaphes ulmi)
Malatin Verano
Polilla del Jazmn o Glifodes(Margaronia unionalis)
Carbaril, dimetoato Primavera
Algodn del olivo
(Euphyllura olivina)
Dimetoato y malatin Cuando existan poblaciones
superiores a 10 insectos porinflorescencia*Actualmente se han prohibido algunos de los fitosanitarios recomendados. Su sustitucin no est bien
resuelta a la hora de evaluar su eficacia como plaguicidas para el olivo; de aqu la necesidad de
implementar programas efectivos de vigilancia de la calidad del aceite de oliva.
En la Tabla 12 se muestran los niveles de residuos de diferentes plaguicidas
encontrados en aceite de oliva. De aqu, la necesidad de implementar programas
efectivos de vigilancia de la calidad del aceite de oliva.
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1. Introduccin
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Tabla 12.Residuos de plaguicidas encontrados en aceite de oliva
Analito Tratamiento de muestra/ Tcnica de
determinacin
Concen-tracin
(g/kg)
Procedencia Ref.
Acefato SPE/GC-NPD 10 Espaa 214Azinfos-etil SPE/GC-NPD 90 Italia 116
Carbaril Extraccin lquido-lquido, limpieza con
GPC/ GC-MS/MS
9 Espaa 246
Clorpirifos-metil SPE/GC-NPD 80 Italia 116
Diazinn SPE/GC-NPD 83 Italia 116
Diurn Extraccin lquido-lquido, limpieza con
GPC/ GC-MS/MS
31 Espaa 246
Dimetoato SPE/GC-NPD 61 Italia 116
Dimetoato HS-SPME/GC-FTD 33 Grecia 254
Endosulfn Extraccin lquido-lquido, limpieza encolumna Sep-Pack
alumina-N/ GC-ECD
570 Grecia 226
Endosulfn sulfato Extraccin lquido-lquido, limpieza conGPC/ GC-MS/MS
31 Espaa 246
Etin HS-SPME/GC-FTD 51 Grecia 254
Fentin SPE/GC-NPD 73 Italia 116
Fentin HS-SPME/GC-FTD 93 Grecia 254
Fentin Extraccin lquido-lquido/ GC-FPD
350 Italia 255
Fentin sulfxido HS-SPME/GC-FTD 93 Grecia 254
Formotin SPE/GC-NPD 82 Italia 116
Malaoxon HS-SPME/GC-FTD 22 Grecia 254
Metidatin SPE/GC-NPD 63 Italia 116
Ometoato HS-SPME/GC-FTD 33 Grecia 254
Paratin SPE/GC-NPD 80 Italia 116
Paratin-metil SPE/GC-NPD 56 Italia 116
7/24/2019 validacion de organofosforados en aceites.pdf
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1. Introduccin
43
El mtodo preferido para la determinacin de plaguicidas voltiles en aceites es la
cromatografa gaseosa (GC), debido a su elevada eficiencia de separacin y a la
variedad de mtodos de deteccin disponibles. Entre ellos destacan el detector de
nitrgeno-fsforo (NPD) -denominado tambin deteccin termoinica especfica(TSD)- para compuestos que contienen N o P (75, 117, 204, 210), y el detector de
fotometra de llama (FPD) (211, 212) -ms apropiado para compuestos que contienen P
(213)-.
Sin embargo, desde hace algunos aos, la espectrometra de masas (MS) es el tipo
de deteccin ms utilizado, normalmente en modo monitorizacin de iones (SIM) (214-
218).
Alternativamente, para alcanzar altos niveles de selectividad y bajos lmites dedeteccin en extractos secos (219), puede utilizarse MS en tandem (MS/MS), con
trampa de iones (220) o triple cuadrupolo (221).
En general, la determinacin de residuos en aceites presenta varios problemas: el
primero deriva de la complejidad y diversidad de la matriz; otro problema es el debido a
los propios plaguicidas, a sus metabolitos y productos de degradacin. El tercero es
consecuencia de la baja concentracin en la que generalmente se encuentran estos
compuestos. Adems, los mtodos analticos para la determinacin de residuos de
plaguicidas en alimentos grasos deben cumplir otro objetivo: ser capaces de identificar,
cuantificar y confirmar su presencia a los niveles de tolerancia establecidos por la
legislacin.