Posgrado en Ciencias Biológicas
GENÉTICA DE CHILE HABANERO (Capsicum chinense
Jacq.) DE LA PENÍNSULA DE YUCATÁN"
Tesis que presenta
MAESTRO EN CIENCIAS
Mérida, Yucatán, México
POSGRADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
/
Por medio de la presente, hago constar que el trabajo de tesis titulado "ESTUDIOS
MOLECULARES SOBRE LA DIVERSIDAD GENÉTICA DE CHILE HABANERO
(Capsicum chinense Jacq.) DE LA PENÍNSULA DE YUCATÁN" fue realizado en los
laboratorios de la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas y GeMBio del
Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. , bajo la dirección de la Dra. Nancy
Santana Buzzy y co-dirección de la Dra. Daisy de la Caridad Pérez Brito, dentro de la
opción de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, perteneciente al Programa de
Posgrado en Ciencias Biológicas de este Centro.
Atentamente,
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de Investigación
Científica de Yucatán, A.C. , y que a razón de lo anterior y en contraprestación de los
servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados, dicha información, en términos
de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial , le pertenece
patrimonialmente a dicho Centro de Investigación. Por otra parte, en virtud de lo ya
manifestado, reconozco que de igual manera los productos intelectuales o desarrollos
tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo correspondiente a dicha información, le
pertenecen patrimonialmente al Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C. , y en
el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este trabajo productos intelectuales o
desarrollos tecnológicos, en lo especial , estos se regirán en todo caso por lo dispuesto por
la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo
expuesto en la presente Declaración.
Firma: ------::(]~:u---------~
QFB. REFUGIO GUADALUPE HERRERA DÍAZ
Este trabajo se llevó a cabo en la Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas y
en el Laboratorio GeMBio, del Centro de Investigación Científica de Yucatán, y forma
parte del proyecto titulado "Conservación y caracterización del germoplasma de chile
habanero (Capsicum chinense Jacq.) existente en la península de Yucatán" bajo la
dirección de la Dra. Nancy Santana Buzzy y de la co-dirección de la Dra. Daisy de la
Caridad Pérez Brito.
AGRADECIMIENTOS
Al CICY por permitirme utilizar sus instalaciones, en especial al laboratorio 9 de la Unidad de Bioquímica y al laboratorio de GeMBIO, por el uso de sus equipos y reactivos que me proporcionaron para la realización de la tesis y desarrollo académico.
Al CONACYT por la beca otorgada con número 242996 durante la realización de esta investigación.
A la Dra. Nancy Santana Buzzy, por su ayuda en la elaboración de este trabajo de investigación, sus conocimientos aportados y consejos durante toda la maestría, así como estar conmigo en este largo recorrido con tanta comprensión , apoyo y enseñarme que todo se puede con dedicación.
A la Dra. Daisy de la Caridad Pérez Brito, por brindarme su apoyo en la parte molecular del presente trabajo, darme la oportunidad de realizarla en los laboratorios de GeMBio, por las enseñanzas brindadas para tratar de comprender la ciencia, aunado a su valioso apoyo académico y humano a lo largo de esta investigación.
Al Dr. Raúl Tapia Tussell , por todo el apoyo técnico y académico aportado a lo largo de esta investigación, apoyarme en mi formación académica, brindarme su tiempo y por todos sus conocimientos compartidos durante la elaboración de esta tesis , su amistad y enseñarme que hay que entregarse de fondo para lograr los objetivos.
A la Dra. Lourdes Iglesias Andreu , por su contribución en la elaboración de esta tesis , sus conocimientos aportados, sus importantes observaciones y sugerencias, así como su apoyo y amistad , durante la maestría.
Al comité Tutorial integrado por la Dra. Daisy Pérez Brito, Dra. Nancy Santana Buzzy, y Dra. Lourdes Iglesias Andreu.
A los distinguidos miembros del comité revisor Dr. Raúl Tapia Tussell , Dra. Daisy Pérez Brito, Dra. Nancy Santana Buzzy, Dra. Maricarmen Montalvo Peniche y Dra. Lourdes Iglesias Andreu, por sus comentarios y sugerencias sobre el documento final de tesis.
A mis compañeros y amigos del laboratorio de Química forense, sobre todo a los compañeros del turno de jueves y domingo, Q.F.B. Ruth Herrera Díaz, Q.F.B. Laura Llanes Peraza, Q.B.B. José Alfredo de la Fuente Ortegón y a mis suplentes Q.F.B. Pablo Rodríguez y Q.F.B. Katherine Aguado, por apoyarme enormemente para que pudiera continuar con la maestría.
Al Dr. Jericó Bello Bello por su ayuda, sus consejos y sugerencias aportadas en la maestría.
A la Q.F.B. Rosalba Gamboa Magaña, por los apoyos brindados durante la maestría y estar pendiente de mí.
A la LAE. Arely Ramírez González, por su paciencia y gran ayuda en la estructuración electrónica de este trabajo.
A la M. en C. Adriana Canto Flick, quien me asesoró en la parte técnica del cultivo de material vegetal in vitre, su apoyo en la parte experimental , así como sus conocimientos aportados y su ayuda incondicional a pesar de tener siempre una agenda muy llena, gracias por tu apoyo.
Al I.Q.I. Alberto Cortés Velázquez por el apoyo técnico otorgado en el laboratorio de GeMBio, sus consejos y observaciones en los análisis de datos y su amistad.
A la Dra. Eunice Gómez Puc, por sus valiosos consejos, su manera tan paciente de explicar la ciencia, su apoyo en el laboratorio y su amistad.
A la M. en C. Claudia Torres Calzada, por el apoyo en el análisis del perfil de datos, por haberme auxiliado en repetidas ocasiones en cuestiones académicas y por su amistad.
Al M. en C. Eduardo Balam por ayudarme en la germinación de las accesiones y las variedades, así como su mantenimiento, ser un invaluable maestro y amigo.
Al lng. Agro. Rodolfo Martín Mex, por proporcionar el material vegetal de frutescens para esta investigación, así como el mantenimiento y cuidado de mis plantas, sus importantes consejos y su apoyo académico.
Al M. en C. Anuar Magaña Álvarez, por su gran paciencia, alegría, ser un amigo incondicional y consejero académico, por sacarme de muchos apuros, ... gracias amigo.
A la Dra. Cecilia Rodríguez y a la M. en C. Leticia Peraza, por su apoyo, su amistad y sus consejos académicos.
· A mi amiga la Dra. Rocío Canche y al Dr. Manuel Martínez, porque ellos son los que me dieron ese gran empujón para que inicie esta travesía.
A los estudiantes de maestría I.B.Q. Mario Manuel Puc e lng. Agro. ltzamná Salas, quienes me ayudaron en el mantenimiento y cultivo del material utilizado, así como su apoyo y su amistad.
A mis compañeros y amigos del laboratorio de la Unidad 9 de bioquímica la M. en C. Emily Marín , M. en C. Stephanie López, I.B.Q. Alejandrina Pereira (mis amigas de llanto), Dra. Susana Avilés, M. en C. Dra. Eunice Gómez, M. en C. Raúl Valle , I.B.Q. Karime Zubieta, M. en C. Carlos Regla, Dra. Daniela Salís, Dr. Carlos Lecona, lng. Agro. Jacobo
Pérez, Biol. Liliana Muñoz, Br. Chrizty Castillo, I.B.Q. Mariana Sánchez Gutiérrez. , Lic.Jesua Echeverria Salazar y Br. Pedro Osorio, que de alguna forma siempre me apoyaron y me brindaron su amistad ....
De forma muy cariñosa y especial reconocimiento a mis amigos que comprometieron su valioso tiempo en ayudarme, con su asesoría técnica y sus consejos en esta tesis: I.B.Q. Gamal iel ltzá, I.B.Q. Laura Ch i, M. en C. Andrés Quijano, lng. Agro. Otilio Matú, lng.Agro. Ángel Nexticapan y al Maestro Ángel May Tinal , gracias por su cariño y su amistad.
A mis compañeros y amigos del laboratorio de GeMBio, que me recibieron con los brazos abiertos I.B.Q. Rubí Chable, Biol. Emy Huchín, I.B.Q. Teresita Valencia, M en C. Abril Díaz, lng. Agro. Carla EK, lng. Agro. Jonathan Ríos, I.B.Q. Hansel lnterian e I.B.Q. Rosa Antonina Kancab Uc.
A mis amigos del CICY, M. en C. Miguel Canseco, M. en C. Anahí Arreaga , M. en C. Nancy Eb Rejón , M. en C. Mayra Chim, M. en C. Muhilan Sabari , M. en C. Abril Canche, M. en C. Cristian Alcocer, I.B. Eduardo Zapién, I.B. José Antonio Cruz, M. en C. Leonel Segovia, M. en C. Fernando García, M. en C. Freddy navarro, M. en C. Fanny Paredes, M. en C. Aldo Contreras, M. en C. Denisse Gutiérrez, M. en C. Fabiola Zizumbo y M. en C. Francisco Javier Magritte.
A las fam ilias Herrera Díaz, May Tinal y Díaz Pérez, por su apoyo incondicional durante la realización de mis estudios de posgrado.
Gracias a todos, porque sin ustedes, no hubiera podido lograrlo ... que Dios los bendiga
"No tenía miedo a las dificultades: lo que la asustaba era la obligación de tener que escoger un camino. Escoger un camino significaba abandonar otros".
Paulo Coelho (1947-?) Escritor brasileño
DEDICATORIAS
A ti , señor Jesús Cristo,
Porque has sido mi consuelo, porque me has puesto donde debo de estar, y has sido el motor que me levanta siempre.
A mis Padres María y Cesar,
Que me enseñaron que una vez que empiezas algo debes terminarlo, y que con sus ánimos me llenaron de fuerza y esperanza, por ser ambos piezas importantes de mi vida y mi fuerza ... gracias.
A mi amado esposo Alfredo,
Con profundo agradecimiento, por su amor, tenacidad, espíritu crítico y fuerza inspiradora que me acompañaron siempre durante este proceso, pero también por ser mi amigo, cómplice y ser muchas veces mi consuelo ... gracias amor mío.
A los ángeles terrenales: mis hermanos,
Sara ... gracias por darme tu cariño y estar pendiente siempre de mi, y darme esa gran luz en mis momentos de tristeza (Omarcito).
Pedro .. . gracias por decirme siempre que me quieres, ayudarme con mi casa, mi auto, mis plantas y sacarme siempre de mis apuros.
Ruth ... por ser una segunda mamá que me protege, una eterna amiga, y mi cómplice siempre.
Bibiana ... porque has sido un ejemplo para mí, has sacrificado mucho para lograr tus metas, y también porque Alena, mi tía Maco y tú han sido muy importantes en mi vida.
A la niña de mi corazón: Romina,
Por darme un motivo más para continuar en esta vida, por darme una nueva ilusión.
A los amigos que en todo momento me escucharon , me alentaron, que estuvieron
pendientes de mí y me brindaron ese abrazo cuando más lo necesitaba.
"SIEMPRE ESTAN EN MI CORAZÓN"
IN DICE
1.1.1 ORIGEN DISTRIBUCIÓN E IMPORTANCIA .... .... .... .. ........ .. .... .. .......... .. .. .... .......... ...... .... ............ 5
1.1.2 TAXONOMÍA Y DESCRIPCIÓN BOTÁNICA ........ .... ...... ...... .. ........................ .............................. 7
1.2 ESTUDIOS DE MEJORAMIENTO Y DIVERSIDAD GENÉTICA EN CAPSICUM SPP ...... ............ 9
1.3 TÉCNICAS MOLECULARES USADAS EN ESTUDIOS DE DIVERSIDAD GENÉTICA .... .. .. . 11
1.4 USO DE MARCADORES MOLECULARES ............................................................................ 13
1.5 HIPÓTESIS ...... ...... ..... .. ......... ................................................... .. ...... .......... ... ... ............. ... ...... 16
1.6 JUSTIFICACIÓN .................................... ............ ................................... ....... .. ........... .... ..... .... . 17
1.7 OBJETIVOS ...... .... .. ..... ........ ... ... ... ................. ............................. ........ ... ....... ............. ... .......... 18
1.8 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL ............................. ... .. ... ........ .. ... .. ..... ..... ...... ... .. ... ......... ... ..... 19
UNA COLECCIÓN DE CHILE HABANERO ....... .... .. .. .... ... .......... ... ...... ...... ....... ......... .... .... .. ... .... 29
2.1 INTRODUCCIÓN ...... ..... ...... ...... .. ... .......................... .. ...... .............. .. .. ... .. .. ... ...... ....... .... ... ...... 29
2.2.1 SELECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL .................... .... .......................................................... 31
2.2.2 EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO .............. ................ .. ........... .. .......................................... 33
2.2.3 CALIDAD E INTEGRIDAD DEL ADN .................. .. ................ .. ........................................ ........ .. 33
2.2.4 SELECCIÓN DE CEBADORES ..... .............. .... ... ... .... ....... .. .... .... ....... .... ..... ..... .. .. .. .. .... .... ... ...... 34
2.2.5 HUELLAS GENÉTICAS .......... ... .... ... .. ... .. .. .... .... .......... ... ... ... ... ...... ............ ...... .. ... .... ..... .... ... ... 38
2.2.6. ELECTROFORESIS DE GELES DE ACRILAMIDA .. ........... .................... .. ....... ......................... . 39
2.2.7 ANÁLISIS DE DIVERSIDAD GENÉTICA. .......................... .. ..... ..... .. .. .... .. .. .. ................ .. ............. 39
2.3 RESULTADOS ....... ......... ... ..... .... ............... .................. .... .... .. .. ....... ....... ....... .. ....... ................. 40
2.4 DISCUSIÓN .......... ...... ... ....... ...... .... .. ........ ....... .... ........ ....... ...... .. .. ....... ..... ......... .. ....... .. .......... 55
3.1 DISCUSIÓN GENERAL ...... ... ... ........... .................... ...... ... ... .... ... .. .. .. ... ...... ...... .. .... ....... ... ....... 61
LISTADO DE FIGURAS
Figura 1.1 Producción de chile habanero en los estados de la Península de Yucatán
durante los ciclos otoño-invierno y primavera-verano 2011 ... .... ...... .............. .... ........... ..... . 6
Figura 1.2 Estrategia experimental. .... ......... .... ... .... .................. .......... ... ... ............... ........ 19
Figura 2.1 Perfiles SSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, en gel de poliacrilamida, obtenidos con el oligonucleótido AGI096 ... 40
Figura 2.2 Perfiles SSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, en gel de poliacrilamida, obtenidos con el cebador AGI1 01 .......... ... . 41
Figura 2.3 Perfiles SSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, en gel de poliacrilamida, obtenidos con el cebador AGI1 04 .............. 42
Figura 2.4 Perfiles SSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, en gel de poliacrilamida, obtenidos con el cebador EPMS305 ..... ..... 43
Figura 2.5 Perfiles SSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, en gel de poliacrilamida, obtenidos con el cebador EPMS387 .. ... .. ... 44
Figura 2.6 Perfiles SSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, en gel de poliacrilamida, obtenidos con el cebador GPMS202 ..... .... 45
Figura 2.7 Dendograma obtenido con UPGMA, basado en el análisis de todos los SSR.47
Figura 2.8 Perfiles ISSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, obtenidos con el cebador IS04 ... ..... .... ............................................. 50
Figura 2.9 Perfiles ISSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, obtenidos con el cebador IS19 ... .. ........... .... ...... .... .. .. .......... .... ... ...... 51
Figura 2.1 O Perfiles ISSR de las variedades y accesiones de chile habanero y de las
especies controles, obtenidos con el cebador IS21 ............ .... .... .... ..... ......... .. .. ......... ...... 52
V
Figura 2.11 Dendograma obtenido con UPGMA, basado en el análisis de los datos del
iniciador ISSR {IS21 )o 000000000000 o o oooo o oo o oooooo o o o o o oo oo oo o oooooo o ooo o ooo o oo o oo o o oo oo O OOoO OO oOOOOO 000000000000000000 0 0 0 00 53
vi
Cuadro 1.1 Clasificación taxonómica de chile habanero ......... ... .... .. .... .. ........ ........... ... .... . 7
Cuadro 1.2 Caracterización morfológica de 14 variedades y accesiones de chile habanero
···· ····· ············ ······· ····· ········· ····· ···· ··· ·· ···· ···· ······ ·· ··· ·· ······ ··· ····· ·· ······················ ··· ····· ············· 10
Cuadro 2.1 Variedades y accesiones de chile habanero y materiales de referencia usados
en este estudio .... ............. .... .. ....... ... ... ... .... ... ... ............. .. ............ .... .. .... .... .... .... .... .. .... .... 32
Cuadro 2.3 Iniciadores inter-microsatélites ..... ... ......................... .. .. ... ... ........ ........ .. ... ..... 37
Cuadro 2.4 Patrones de huellas genéticas de las variedades y accesiones de chile
habanero obtenidas con los marcadores SSR .... .... ..... ... ........ ... ... .. ... ... ... ...... .... ............. . 48
Cuadro 2.5 Huellas genéticas de las variedades y accesiones de chile habanero
obtenidas con los marcadores ISSR. ....... ........ ..... ........ ... .. ..... .. .... ...... .... ... ..... ...... ....... .... 54
vii
ABREVIATURAS
ADN
AFLP
APS
BPD
CTAB
cv
dNTP
EDTA
EPMS
FAO
FISSR
GPMS
IBPGR
IMPI
IPGRI
ISSR
MAS
mg
NTC
PAST
PCR
Amplified Fragment Length Polymorphism (polimorfismo en la longitud de los fragmentos amplificados)
Peroxidisulfato amónico (persulfato de amonio)
3,3,5,5 -tetrabromofenol sulfonftaleína (Azúl de bromofenol)
Cetyl trimethyl ammonium bromide (Bromuro de cetil trimetilamonio)
Cultivar
Marcadores microsatélites provenientes de secuencias de bases de datos
Organización de alimento y agricultura de las Naciones Unidas
ISSR fluorescente
lnternationa/ Plant Genetic Resources lnstitute
lnterspread Single Sequence Repeats (secuencias intercaladas entre microsatélites)
Marker Assisted Selection
Polimerase Chain Reaction (reacción en cadena de la Polimerasa)
ix
QTL
RAPO
RFLP
RNasa
SGN
SIAP
SNICS
SSAP
SSR
TBE
Td-PCR
TEMED
TG
Tris
UPGMA
var
VMT
XC
X
Randomly Amplified Polimorphism DNA (ADN polimórfico amplificado al azar)
Restriction Fragment Length Polimorphism (polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción)
Ribonucleasa
(SOL Genomics Networks) Base de datos del genoma de las Solanáceas
Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera
Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas
Polimorfismos Amplificados de Secuencias Específicas
Single Sequence Repeats (secuencias simples repetitivas o microsatélites)
Tris Borate EDTA buffer(tampón de electroforesis Tris Borato EDTA)
T ouch- down PCR
Tris Glicina
Unweighted Pair Group Method using Arithmetic A verages
Variedad
Xilencianol
RESUMEN
Se considera que en México, la mayor variabilidad genética del chile habanero ( Capsicum
chinense J.) se encuentra en la Península de Yucatán . Sin embargo, ésta se ve
amenazada, entre otras razones, por la siembra de semillas no certificadas o provenientes
de otros países, problemas fitosanitarios, polinización cruzada y la ausencia de bancos de
germoplasma que conserven in vivo la diversidad existente. En el Centro de Investigación
Científica de Yucatán, se estableció una colección de chile habanero con el objetivo de
resguardar los recursos genéticos de esta especie. Hasta el momento la misma ha sido
caracterizada morfológicamente, pero es necesario complementar dicho estudio con la
caracterización molecular de las accesiones. En este trabajo se seleccionaron 14
variedades y accesiones de chile habanero con diferentes características morfológicas,
con el fin de obtener la huella genética de las mismas y conocer la diversidad genética
existente, para ello se usaron marcadores moleculares del tipo microsatélite e
intermicrosatélites. Los resultados del estudio mostraron que la diversidad intraespecífica
de C. chinense es superior a la reportada en otros estudios con germoplasma de diferente
procedencia. Aunque ambos tipos de marcadores SSR e ISSR fueron útiles para revelar
la diversidad genética de C. chinense, los intermicrosatélites fueron los que mostraron
perfiles genéticos únicos para cada accesión, dentro de estos, el IS21 fue el más
resolutivo. Estos marcadores moleculares permitieron distinguir entre y dentro de los
diferentes tipos de chiles habanero, lo cual será de mucha utilidad en los programas de
mejoramiento genético, en el trabajo de conservación de dichas accesiones en el banco
de germoplasma y en el mantenimiento de la pureza genética de la semilla.
ABSTRACT
In México it's considered that in Yucatán Peninsula , exists the higher genetic variability of
habanero pepper (Capsicum chinense J.). However, th is variability is endangered by,
among other reasons, for planting not certified seeds or introduced from other countries,
phytosanitary problems, crossed pollination and lack of germplasm banks which could
preserve in vivo the existing diversity. In the Yucatan Center for Scientific Research
(CICY) it was established a collection of habanero pepper in order to preserve the genetic
resources of this species. Up to the moment, that collection had been morphologically
characterized, but it's necessary to complete this study with the molecular characterization
of the accessions. For this work, 14 accessions of habanero pepper, with different
morphological characteristics were selected in order to obtain the fingerprint of all of them
and determine the genetic diversity present. There were used microsatellite and inter­
microsatell ite molecular markers for these purposes. Results show that intraspecific
diversity of C. chinense is higher than that reported in other studies with germplasm of
different origin. Although both types of markers, SSR and ISSR were useful to reveal the
C. chinense genetic diversity, the inter-microsatellites were the ones that showed unique
genetic profiles for each accession, among those, the IS21 was the most decisive. These
molecular markers made it possible to distinguish inside and among the different types of
habanero peppers, what is going to be of higher usefulness for genetic improvement
programs, works of preservation of those accessions in the germoplasm bank and the
genetic purity preservation of the seed
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
Dentro de las hortalizas que se cultivan en México, el chile habanero (Capsicum chinense
Jacq.) destaca tanto por su presencia en las esferas social y cultural , como en la
económica (Latournerie et al. , 2006). Esta especie tiene diversos usos, los cuales se han
incrementado en las últimas décadas (Latournerie, 2001 ). Esto se debe a que el chile
habanero además de servir como condimento, planta ornamental en jardines y para
elaborar medicinas, también se utiliza como materia prima en diferentes industrias
(Govindarajan y Sathyanarayana, 1991; Bosland , 1994 ). Esta amplia gama de usos se
debe en gran medida a la pungencia de sus frutos, de la cual son responsables los
compuestos denominados capsaicinoides.
Se ha reportado que una parte importante de la diversidad genética del chile habanero en
México, se encuentra en la Península de Yucatán , esto posibilitó que se le haya otorgado
a dicha región la denominación de origen . Sin embargo, este cultivo atraviesa por una
serie de circunstancias desfavorables, entre las cuales se encuentran la falta de
conocimiento de la diversidad genética de los materiales en producción, la carencia de
semillas certificadas, la falta de bancos de germoplasma con suficientes accesiones de C.
chinense que garanticen el material genético para el mejoramiento, problemas
fitosanitarios, polinización cruzada y una notable disminución en la calidad y pungencia
del fruto, circunstancia que posiblemente corresponda a la reducción del contenido de
capsaicina en los mismos. Esto último se atribuye a que varios productores siembran
semillas importadas de Estados Unidos. Todo lo anterior ha provocado que el
germoplasma del chile habanero presente pérdidas en su diversidad (erosión genética)
(FAO, 1993; Latournerie, 2001 ).
La diversidad genética ha jugado un papel primordial en la evolución , ya que es la base
para la adaptación y la especiación. Niveles altos de diversidad permiten a los
mejoradores encontrar materiales con características deseables como altos rendimientos,
mejores propiedades organolépticas, resistentes a estreses ambientales y/o bióticos
(Hedrick, 2001 ). Éste ha sido precisamente uno de los principales usos de la diversidad
genética de Capsicum (Latournerie, 2001 ). En el caso específico de C. chinense, esta
especie es poseedora de caracteres agronómicos importantes como son la resistencia al
virus del mosaico del tabaco (VMT) y múltiples frutos por nudo (Subramanya, 1983) por lo
que se le ha considerado punto de partida para el mejoramiento genético del género
1
INTRODUCCIÓN
Capsicum (Livingstone et al. , 1999).
En la Península de Yucatán se considera que hay una gran diversidad intraespecífica de
chile habanero, que se expresa en las diferentes formas , tamaños, colores, sabores y
pungencia de las variedades. Por ello, se han realizado estudios para profundizar en el
conocimiento de la diversidad morfológica de chiles regionales en Yucatán (Latournerie,
2001 ; Trujillo-Aguirre y Pérez-Lianes, 2005; Canto-Fiick, 2007), y de la pungencia
(Cázares et al. , 2005; Canto-Fiick, 2007; Antonious et al., 2009). Sin embargo, existen
muy pocos datos sobre las características moleculares de estas variedades (Montalvo­
Peniche, 2007), por lo cual es necesario revelar la diversidad que existe a nivel genotípico
a fin de complementar la información existente.
Los marcadores moleculares detectan variaciones a nivel del ADN y tienen ventajas tales
como ser abundantes y universales, carecer de efectos pleiotrópicos y no están influidos
por el ambiente, ni por el estado de desarrollo del organismo bajo estudio. Las
propiedades mencionadas los hacen extremadamente útiles, comparados con cualquier
otro tipo de marcadores (Valadez-Moctezuma y Kahl, 2000; Cardone et al. , 2004).
Al posibilitar el análisis genético más detallado, los marcadores moleculares son muy
usados como auxiliares en el mejoramiento de las plantas. En Capsicum hay varios
reportes del uso de éstos marcadores para el análisis de diversidad genética,
establecimiento de huellas genéticas, mapeo de genes de interés con especial referencia
a pungencia y resistencia a estrés, análisis de pureza de semillas, estudios filogenéticos y
construcción de bibliotecas genómicas (Deepu , 2006; Nagy et al., 2007; lnce et al.,
2010a).
El CICY se ha dado a la tarea de establecer una colección de chile habanero con el
objetivo de resguardar los recursos genéticos de esta especie presentes en la península
de Yucatán . Como parte de este trabajo fue necesario caracterizar adecuadamente las
variedades y accesiones que . integran dicha colección. Hasta el momento se ha
desarrollado prácticamente todo el estudio morfológico, sin embargo, la identificación
molecular aún no se ha llevado a cabo.
El objetivo de este trabajo fue por lo tanto, comenzar a revelar la diversidad genética que
existe dentro de las variedades registradas y las accesiones de chile habanero, de la
colección establecida en el CICY con germoplasma de la Península de Yucatán. Para ello
se seleccionaron 14 accesiones de chile habanero, que incluían 8 variedades registradas,
con diferencias reconocidas a nivel morfológico, para establecer sus huellas genéticas
2
INTRODUCCIÓN
en inglés) e intermicrosatélites (ISSR, lnter Secuencias Simples Repetidas, por sus siglas
en inglés) (Cardone et al. , 2004).
Los resultados obtenidos enriquecerán el conocimiento que actualmente existe sobre la
variación genética de la especie, proporcionarán mayor información sobre el
germoplasma con que se cuenta y permitirán sentar las bases para programas de
conservación y mejoramiento genético con múltiples fines (rendimiento, resistencia a
estreses, etc.), que promuevan una mayor producción y calidad de los frutos, a fin de
solucionar el problema de la escasez de semilla
3
1.1.1 ORIGEN DISTRIBUCIÓN E IMPORTANCIA
El género Capsicum se ubica dentro de la familia de las Solanaceaes. Se considera nativo
de las regiones tropicales y subtropicales de las Américas (Pic~ersgill, 1997, Hunziker,
1950). Remanentes arqueológicos de chile (Capsicum spp) que datan de 7000 y 5000
años A.C. , permitieron determinar que las especies de este género se domesticaron en
diferentes partes de América, principalmente en México (Long-Solís, 2004) y
Centroamérica, que son considerados lugar de origen y centros de distribución y
diversidad de C. annuum (Hawkes, 1991 ). El sureste y centro de Europa, África, Asia y el
resto de América Latina se consideran centros de distribución secundarios.
Por otra parte las tierras bajas amazónicas, Bolivia, Perú, sureste de Brasil, los Andes y
Colombia se indican como centros de origen de C. frutescens L. y C. chinense Jacq.
Algunas variedades de estas especies también se pueden encontrar en África y el sureste
de Asia , ya que fueron introducidos por los portugueses en la época colonial (IBPGR,
1983; Cheng, 1989; Dewitt y Bosland 1993; McLeod; 1980; González-Estrada et al. 2005).
Debido a los hallazgos arqueológicos, en la costa de Perú , de la cultura Chavin que datan
de 1200 A.C, se considera que la domesticación de C. chinense comenzó en el norte de
América del Sur, y que posteriormente poblaciones silvestres y cultivadas de esta especie
se dispersaron desde el área amazónica hasta México (León , 1987).
La especie C. chinense representa un papel importante en la cultura culinaria del Caribe y
de África. El historiador Edward Long relató haberlo encontrado en uno de sus viajes a
Jamaica en 1774, con el nombre de Scotch Bonnet. Después de la conquista española de
América se introdujo al continente africano. La llegada de esta especie a Yucatán, se
produjo a través del Caribe, también después de la conquista (Long-Solís, 2004 ),
específicamente durante la segunda mitad del siglo XIX y llegó con el calificativo de
"habanero", junto con otros productos como el ron y el tabaco. Su establecimiento y
diversificación en la península de Yucatán se atribuyen al ambiente húmedo, con
temperaturas nocturnas cálidas, muchas horas de sol y las características del suelo de la
5
zona.
La importancia económica del chile habanero para la Península de Yucatán es alta,
mucho más desde que recibió la denominación de origen en 201 O, ya que esto garantiza
un valor agregado a su comercialización .
El valor de la producción de chile en los estados que comprenden la Península de
Yucatán, según datos del SIAP (2012), se presentan en la Figura 1.1:
e g e -o ·e:; u ::::¡
"' o o:
Estados
Figura 1.1 Producción de chile habanero en los estados de la Península
de Yucatán durante los ciclos otoño-invierno y primavera-verano 2011
(SIAP, 2012).
CAPÍTULO 1
1.1.2 TAXONOMÍA Y DESCRIPCIÓN BOTÁNICA
El género Capsicum, de la familia So/anaceae, está formado por 27 especies de las
cuales cinco han sido domesticadas: C. annuum L., C. baccatum L., C. chinense Jacquin,
C. frutescens L. y C. pubescens Ruiz & Pavon , y las otras 22 son silvestres y endémicas
de los trópicos de América (Portis et al., 2006; Csilléry, 2006):
Cuadro 1.1 Clasificación taxonómica de chile habanero (Soria-Fregoso, 2002).
Reino Plantae
Subreino Embriophyta
División Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Solana/es
Familia Solanaceae
Especie Capsicum chinense Jacquin
El nombre específico de chinense se debe al taxónomo holandés Nicoláus Von Jacquin,
quien lo nombró en su libro Hortus botanicus vindobonensis, publicado en 1776,
presentando una descripción del C. chinense, y otorgándole una nomenclatura de
"chinense o sinense" (Long-Solís, 2004; Bosland 1996; Long y Attolini, 2009).
El chile habanero es una planta herbácea, anual , autógama, pero que puede llegar a tener
hasta un 40% de alogamia. Sus características botánicas principales se presentan a
continuación :
RAÍZ: Pivotante, generalmente el sistema radicular está bien desarrollado. Puede
alcanzar profundidades de 0.40 a 1.20 m, aunque puede alcanzar longitudes mayores a
los dos metros. Su tamaño depende de la edad de la planta, las características del suelo
y/o las prácticas de manejo que se le proporcionen (González y Orellana, 2003; Tun,
2001 ).
7
CAPÍTULO 1
TALLO: Es grueso, erecto y robusto ; generalmente tiende a formar tres tallos en la
primera ramificación , con una altura de 0.3 a 1.2 m. Dependiendo de la variedad posee 4
ramas primarias y 4 secundarias. Carece de pubescencia, aunque ocasionalmente se
observan plantas con pelos cortos o tricomas (Aipizar-Lara et al. , 2002).
HOJAS: Son simples, lisas, de forma lanceolada, de tamaño variable y de color verde
oscuro. Con una nutrición adecuada pueden llegar a superar los 15 cm de largo y 1 O cm
de ancho (Tun, 2001 ).
FLORES: La planta puede tener de dos a seis flores por nudo. Los pedicelos
generalmente son decl inantes, pero los hay erectos. El número de sépalos y pétalos es
variable (5 - 7) aún dentro de la misma especie, lo mismo que la longitud del pedúnculo
floral. El cáliz es liso, sin pelos, pero presenta una pequeña depresión marcada entre la
base y el pedúnculo. La constricción circular debajo del cáliz es el principal carácter
morfológico que permite diferenciar a C. chinense de C. frutescens.
El color de la corola es blanco, amarillo verdoso o blanco verdoso y las anteras son
azules, con una corola de tamaño variable entre 1.5 y 2.5 cm de diámetro (González y
Orellana, 2003, Tun, 2001 ).
FRUTO: Es una baya hueca formada por dos o hasta ocho carpelos, las paredes que los
separan son incompletas y en la parte apical se unen formando estructuras membranosas
llamadas venas. La forma de la baya es esférica o alargada, aunque en ocasiones parece
un trompo con áreas hundidas. El pericarpio puede ser liso o arrugado. Presenta en su
interior la placenta, que es de color blanco amarillento, de forma irregular y esponjosa y se
inserta en la base del fruto, que es la zona donde se sintetizan los capsaicinoides (IMPI ,
2007).
Los colores del fruto varían , ya que dependen de la presencia de dos tipos de pigmentos:
los carotenoides y las antocianinas. La combinación en diferentes proporciones de estos
dos tipos de pigmentos da lugar a los diferentes colores que se aprecian en las
variedades cultivadas de chile habanero: amaril lo, rojo , naranja y morado (Cholnoky et al.,
1955; Deli et al. , 2001 ).
PUNGENCIA: Los compuestos alcaloides son los responsables del picor del chile
habanero, los principales son la capsaicina y la dihidrocapsaicina, que corresponden al
90% del total de los capsaicinoides (Antonious et al. , 2009; Suzuki et al., 1981 ). El picor
puede fluctuar de 300,000 a 400,000 unidades de Scoville (Cázares et al. , 2005).
8
1.2 ESTUDIOS DE MEJORAMIENTO Y DIVERSIDAD GENÉTICA EN Capsicum spp
En genética, tanto desde el punto de vista de la mejora como de la conservación, el
principal objetivo que se persigue es medir la variación existente, entre y dentro de los
individuos de una población (Aranguren-Méndez et al. , 2005).
Tradicionalmente para este tipo de estudio se han empleado caracteres morfológicos y
agronómicos (Azofeifa-Delgado, 2006). Pickersgill et al. , (1979) mediante estudios de
taxonomía numérica basados en caracteres morfológicos señalaron que de alguna
manera los chiles (C. annuum) domesticados son más heterogéneos que los silvestres.
Por el contrario estudios comparativos con isoenzimas dividieron a la especie C. annuum
en tres subgrupos y se encontró que las distancias genéticas entre las accesiones
domesticadas y semidomesticadas eran menores que entre las silvestres (Loaiza­
Figueroa et al. , 1989).
En el Centro de Investigación Científica de Yucatán A.C. (CICY) el grupo dirigido por la
Dra. Nancy Santana Buzzy ha llevado a cabo diferentes estudios para conocer la
diversidad genética presente en el germoplasma de chile habanero en la Península de
Yucatán. Como parte de estos trabajos destacan los referidos a la caracterización
morfológica y determinación de los niveles de capsaicina en 18 accesiones de chile
habanero (Canto-Fiick, 2007) y a la conservación in vitre y caracterización molecular del
germoplasma de chile habanero en la Península de Yucatán (Montalvo-Peniche, 2007).
Aunado a lo anterior se llevó a cabo un proceso de selección masal con un grupo de
accesiones de chile habanero correspondientes a distintos tipos (rojos, amarillos,
naranjas, morados) del que resultó la obtención de 8 variedades registradas ante el
Servicio Nacional de Inspección y Certificación de Semillas (SNICS). En el Cuadro 1.2 se
presentan las características morfológicas más sobresalientes de las variedades y
accesiones que se utilizaron en el presente estudio.
9
1
- 1 o .....J ::J J- a.. <( i o
Cuadro 1.2 Caracterización morfológica de 14 variedades y accesiones de chile habanero (Montalvo-Peniche, 2007; Canto-Fiick, 2007)
Nombre
Rojo claro
266 1 2.346
382.43 1 3.22
166 1 1.636
292.5 1 3.15
301.4 1 3.06
296.6 1 5.73
137 1 1.485
evidenciar variaciones (polimorfismos) en la secuencia del ADN entre dos individuos, sin
importar que éstas modifiquen o no su fenotipo (Ribaut y Hoisington, 1998).
Las principales aplicaciones de los marcadores moleculares en plantas incluyen la
obtención de "huellas genéticas" (fingerprinting) de individuos, variedades y poblaciones;
el análisis de la estructura y diversidad genética en poblaciones naturales y de
mejoramiento (Prince et al. , 1992; Azurdia et al. , 1995), estudios de estabilidad genética en
el cultivo de plantas in vitro, caracterización y protección legal de germoplasma (Arauja et
al., 2001 ; Patzak, 2003; Cardone et al., 2004), el establecimiento de relaciones
filogenéticas entre diferentes individuos y especies; la construcción de mapas genéticos
de alta cobertura genómica y la localización de genes de interés económico, mapeo de
características de herencia cuantitativa QTL (Quantitative Trait Loci ) y selección asistida
por marcadores MAS (Marker Asisted Selection) (Jansen y Stam, 1994; Ribaut y
Hoisington, 1998; Swati et al., 1999).
En el amplio grupo de los marcadores moleculares los más usados son los basados en la
PCR (Polimerase Chain Reaction), dentro de éstos destacan los microsatélites y los
intermicrosatélites (Ribaut y Hoisington, 1998).
Las Secuencias simples repetidas (SSRs) o microsatélites, son regiones hipervariables,
dispersas a través del genoma eucariótico, que se componen de secuencias de unos
pocos pares de bases (uno a seis) repetidas muchas veces en "motivos" específicos como
son (AT)n , (GT)n , (ATT)n ó (GACA)n , etc. Las secuencias de ADN que flanquean a los
microsatélites son generalmente conservadas entre individuos de la misma especie, esto
ha permitido la selección de oligonucleótidos iniciadores que a través de la reacción de
PCR, pueden amplificar los SSRs presentes en todos los genotipos. La variación en el
número de repeticiones en tándem resulta en diferentes longitudes de productos PCR, por
lo que dichas repeticiones son altamente polimórficas. Su herencia es codominante
(Aravanopoulos 2003; Pica et al. 2004 ).
El empleo de marcadores microsatélites ha sido de gran ayuda en los análisis de
diversidad genética, identificación de cultivares y relaciones genéticas en diversos cultivos
como trigo (Stachel et al., 2000; Manifesto et al. , 2001 ), arroz (Ni et al. , 2002), cebada
11
CAPÍTULO 1
(Struss y Plieske, 1998) y maíz (Bonamico et al. , 2004 ). En cocotero, se utilizaron para
evidenciar heterocigotos tanto en el grupo de los cocoteros gigantes como en el de los
enanos y han sido de ayuda para confirmar teorías previas en la evolución y sus rutas de
diseminación a través del mundo (Perera et al., 2000). También se han utilizado para
confirmar la presencia de polimorfismo en una colección de 49 cultivares del
germoplasma de uva para vino (Lopes et al. , 1999). En sorgo, los microsatél ites
confirmaron su utilidad en la genotipificación de 19 accesiones, al revelar que 14 líneas de
estos genotipos eran distintos (Dean et al. , 1999).
Por su parte en los intermicrosatélites o intersecuencias simples repetidas (ISSR) se
emplea un único iniciador, compuesto de una secuencia microsatélite anclada en el
extremo 3' ó 5', por dos a cuatro nucleótidos que son a menudo arbitrarios y degenerados.
No se requiere previo conocimiento de la secuencia del genoma para el diseño del
iniciador. Por lo que pueden ser utilizados ampliamente, especialmente en evaluación de
germoplasma de plantas y diversidad genética (Reddy et al., 2002; Zhao et al., 2006;
Meng et al., 2011 ).
1.4 USO DE MARCADORES MOLECULARES
En numerosos estudios que han tenido como objetivo el género Capsicum se han
utilizado marcadores moleculares. El primer mapa para chile fue el realizado por Tanksley
et al. , (1988) utilizando marcadores RFLPs y que se hizo a partir de una cruza entre C.
annuum y C. chinense.
Otro de los primeros reportes que utilizaron RFLP para evaluar la variación genética de 25
accesiones de chile (Capsicum spp.) fue el de Prince et al. (1992). Ellos lograron
demostrar una clara división entre las accesiones del norte y las del sur de México,
representadas por dos taxas distintas: Capsicum annuum en el norte y C. frutescens en el
sur, así como también encontraron que la accesión de C. chinense era la más separada
genéticamente de las demás.
Posteriormente Paran et al. (1998), llevaron a cabo un estudio entre 34 accesiones de
Capsicum annuum, utilizando marcadores RAPOs, en combinación con AFLPs, para
detectar variaciones entre cultivares con una relación muy estrecha. Ellos encontraron
mayores polimorfismos entre las accesiones de chiles picantes que entre las dulces. En
este caso los marcadores AFLPs fueron cuatro veces más eficientes en la detección del
polimorfismo que los RAPOs.
Por su parte los marcadores intermicrosatélites también han demostrado su utilidad en
estudios de diversidad genética. En este sentido usando marcadores ISSR-PCR y FISSR­
PCR (ISSR Fluorescente) se obtuvieron perfiles de AON que permitieron diferenciar sin
ambigüedad cuatro muestras en disputa de una variedad élite de Capsicum annuum
(Kumar et al. , 2005).
En un estudio de diversidad genética entre y dentro de poblaciones in situ y ex situ de
accesiones de chiles chiltepines (Capsicum annuum var. glabriusculum) procedentes del
bosque Nacional Coronado, Sonora, Chihuahua y Guatemala se emplearon marcadores
RAPO, que revelaron la mayor diversidad genética en las accesiones de Guatemala en
comparación con las accesiones de Estados Unidos de América y México (Votava et al.,
2002).
También se han util izado los marcadores del tipo RFLPs, AFLPs y SSRs para estudios de
cartografía genética, un ejemplo de esto, es el mapa de ligamiento molecular integrado,
de chile , obtenido para plantas derivadas del cruce inter-específico de Capsicum annuum
13
TF68 x C. chinense cv .Habanero (Lee y Kim, 2003).
Portis et al., (2006) emplearon marcadores RAPOs y AFLPs, para evaluar el efecto que
han causado los criterios de selección adoptados por los agricultores, sobre la
composición genética de una población de 60 individuos de la variedad de chile
(Capsicum annuum L.) conocida como "Cuneo". Con ambas técnicas se detectaron
cambios en la frecuencia génica, que fueron atribuidas entre otras causas a las prácticas
agrícolas.
En el caso de los microsatélites, éstos han demostrado ser muy útiles en estudios de
caracterización molecular. Lee et al. , (2004), desarrollaron 77 marcadores SSR
polimórficos, no redundantes, en 11 líneas del género Capsicum (C. baccatum,
C.frutescens, C. chacoense, C. pubescens, C. chinense cv P1159236, C. chinense cv
Habanero, C. annuum de varios cultivares) y los integraron a un mapa molecular
previamente existente de ch ile. De los microsatélites obtenidos 25 fueron de la secuencia
motivo (GT)n, 24 de (TTG)n, 21 de (GA)n , 20 de (AT)n y 5 de (ATT).
Entre los estudios de diversidad genética destaca el de Geleta et al. , (2005), en el que se
anal izó la divergencia de 39 genotipos de Capsicum annuum L. , que incluían accesiones
locales e introducidas, para ello se usaron datos morfológicos y marcadores AFLP. Se
encontró que los AFLPs tienen una mayor fuerza discriminatoria (0.60) que la obtenida
con datos morfológicos (0.48). En este mismo sentido, Guzmán et al. , (2005), también
utilizaron marcadores AFLPs para revelar variación genética entre 34 accesiones de
especies de Capsicum colectadas en jard ines domésticos (24 semicultivadas de C.
annuum, 3 de C. pubescens, 1 de C. frutescens y 1 de C. chinense) , así como de 40
accesiones de la colección del Banco Nacional de Genes y comparar ambos grupos. Se
concluyó que las accesiones colectadas de los jardines domésticos, fueron una muestra
altamente representativa del total de la diversidad que actualmente se preserva en la
colección nacional de Guatemala.
Tam et al., (2005) utilizaron los Polimorfismos Amplificados de Secuencias Específicas
(SSAP) para comparar la diversidad genética en colecciones de tomate y chile. En este
estudio se emplearon tres sistemas marcadores, retrotransposones basados en SSAP,
AFLPs y SSRs. Los resultados mostraron que la combinación de polimorfismo y el
elevado número de bandas por ensayo, hacen de los SSAP, el sistema marcador más
informativo de los tres evaluados; para la evaluación de la variación genética y la
inferencia de relaciones genéticas entre colecciones de tomate y chile.
14
CAPÍTULO 1
~n una investigación realizada en Hungría, se encontró que de un conjunto de 154
marcadores microsatélites originados a partir de bibl iotecas genómicas y de secuencias
de bases de datos, 147 mostraron productos de amplificación específicos y detectaron
polimorfismos al menos entre dos líneas de un total de 33 líneas que se probaron y que
representaban genotipos silvestres y cultivados de Capsícum spp. También los resultados
mostraron que la frecuencia de todas las repeticiones trinucleótidas fue superior (39.2%) a
la de las repeticiones mono (33.1 %) y dinucleótidas (26.3%) respectivamente. En cuanto a
los motivos de las repeticiones, los tipos más frecuentes en chile fueron AAG, ACC y ATC
(Nagy et al. , 2007).
En C. annuum, lnce et al., (201 Oa) estudiaron los perfiles de expresión de genes
contenidos en microsatélites, en 16 diferentes tejidos de chile y en diferentes estados de
desarrollo, y encontraron que los genes específicos de tejidos contenían más
microsatélites dinucleótidos que los genes housekeeping, los cuales contenían más SSR
con motivos trinucleótidos. En otro trabajo, lnce et al. , (201 Ob) desarrollaron 45 pares de
iniciadores microsatélites usando bases de datos de secuencias etiquetadas expresadas
en Capsícum y los probaron en diferentes especies de este género y otras de la familia
Solanaceae, los resultaron mostraron que los SSR amplificaron las regiones objetivos de
los genomas de las especies estudiadas con segregaciones mendelianas de 1 :2:1 o 3:1,
indicando esto que este tipo de marcadores son transferibles entre especies del género.
También se observó que los marcadores derivados de secuencias que contenían
repeticiones dinucleótidas fueron generalmente más polimórficos al nivel intraespecífico
que las secuencias que contenían repeticiones trinucleótidas. Sin embargo, se detectó
que el número de locí polimórficos detectados en Capsícum spp es menor que el de otras
especies de plantas cultivadas.
Si los marcadores microsatélites e intermicrosatélites son multiloci , pueden resultar de
gran utilidad para la caracterización de variedades de C. chinense de la Península de
Yucatán.
16
Como resultado de la caracterización morfológica y agronómica, mediante los
descriptores de Capsicum establecidos por el IPGRI (1991 ), se han detectado diferencias
marcadas entre los diferentes fenotipos (accesiones) de chile habanero; sin embargo, se
desconoce si esos fenotipos son genéticamente diferentes, por lo que este trabajo está
dirigido a realizar la caracterización molecular de un grupo de accesiones para la
obtención de sus perfiles genéticos (huella genética). Esto permitirá certificar variedades,
así como poder contar con mayor información relevante a la hora de realizar estudios de
mejoramiento genético de chile habanero, dirigidos a obtener mejores variedades desde
el punto de vista agronómico y que cuenten con resistencia a diferentes tipos de estrés
biótico y abiótico.
accesiones de chile habanero procedentes de la Península de Yucatán.
1.7.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
caracterizar molecularmente variedades de Chile Habanero.
)> Establecer la huella genética de 14 accesiones de chile habanero
correspondientes a los diferentes tipos conocidos.
18
Selección de 14 accesiones de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.)
caracterizadas morfológicamente
Obtención de la huella genética de las 14 accesiones selecionadas
Análisis de los resultados
Figura 1.2 Estrategia experimental
capsaicinoides en chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) Colectados en
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2.1 INTRODUCCIÓN
El género Capsicum pertenece a la familia de las Solanaceaes, la cual comprende
alrededor de 2500 especies, entre las que se encuentran algunas muy importantes para el
ser humano desde el punto de vista alimenticio, como la papa (Solanum tuberosum L.), el
tomate (Lycopersicum esculentum L.), la berenjena (Solanum melongena L.) y desde el
punto de vista industrial como el tabaco (Nicotiana tabacum L), la belladona (Atropa
beladona L.), el estramonio (Datura stramonium L.) por solo citar algunas. También
plantas ornamentales muy populares pertenecientes a géneros como Petunia,
Schizanthus y Salpiglossis. Desde hace algunos años el enfoque hacia los marcadores
moleculares ha prevalecido en los estudios conducidos en esta familia.
Internacionalmente destaca la SOL Genomics Network (SGN), una base de datos
orientada a ciados, que contiene información taxonómica, genómica, genética y fenotípica
de los genomas de plantas, y que incluye a varias especies de la familia Solanaceae
(Bombarely et al. , 201 0).
Los sistemas de marcadores moleculares más comúnmente usados son aquellos que se
basan en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), dentro de éstos destacan:
random amplified polymorphic DNA (RAPO), amplified fragment length polymorphism
(AFLP) y simple sequence repeats (SSR) o microsatélites. Las principales limitaciones de
éstos métodos son la baja reproducilidad de los RAPOs, el alto costo de los AFLPs y la
necesidad de conocer las secuencias flanqueantes para desarrollar oligonucleótidos
específicos para microsatélites. Los marcadores denominados inter simple sequence
repeats (ISSR) superan la mayoría de estas limitaciones mencionadas, por ello se han
empleado en varios campos del mejoramiento de plantas, así como en áreas de
diversidad genética, estudios filogenéticos , etiquetados de genes, mapeo genómico y
biología de evolución . En éste método los microsatélites son usados como iniciadores
para amplificar principalmente las regiones intermicrosatélites (Reddy, 2002).
Nagy et al., (2007), con un nuevo conjunto de 147 marcadores microsatélites de
Capsicum annuum L. que obtuvieron a partir de bibliotecas genómicas (61) y una base de
29
CAPÍTULO 11
datos pública de secuencias de ADN (86), evaluaron el polimorfismo de 33 genotipos de
chile , que incluían variedades cultivadas, líneas puras (C. annuum), y especies silvestres
de Capsicum (C. frutescens, C. chinense, C.pubescens, C.baccatum, C.chacoense, C.
eximium, C.praetermissum) para examinar la transferibilidad de estos marcadores a
través de especies, todos los marcadores microsatélites desarrollados fueron examinados
también en algunas especies de la familia Solanaceaes (S.pimpinellifolium, línea pura
Wawa700; S. lycopersicum, línea pura 4889; y Solanum tuberosum "Desiree"). Con este
trabajo se demostró la utilidad de estos nuevos marcadores para estudios de diversidad
taxonómica y para la construcción de árboles filogenéticos basados en polimorfismos
microsatélites.
En el CICY se lleva a cabo desde el 2002 un programa dirigido por la Dra. Santana Buzzy,
que consiste en la colecta de semillas de chile habanero (Capsicum chinense Jacq.) en la
península de Yucatán. Hasta la fecha se cuenta con el germoplasma de 150 accesiones
procedentes de colectas en los estados de Yucatán , Quintana Roo y Campeche. Estas
accesiones se están caracterizando morfológicamente, siguiendo los descriptores (peso,
tamaño, color, número de lóculos, etc. ) sugeridos por el Instituto Internacional de
Recursos Fitogenéticos (IPGRI). Las accesiones se encuentran conservadas en un banco
de germoplasma en la unidad de Bioquímica del CICY (Santana-Buzzy et al. , 2005).
Sin embargo, estas accesiones necesitan ser caracterizadas molecularmente tanto para
su uso en diferentes estudios como para su registro y conservación. Considerando que la
mejor forma de obtener su huella genética es con el uso de marcadores moleculares,
específicamente del tipo SSR e ISSR, se emplearán los reportados en varios estudios
realizados en el género para este fin (Nagy et al., 2007; lnce et al. , 201 Oa y b,) y en otras
especies de plantas (Zhao et al. , 2006; Favoretto et al, 2011 ).
30
2.2.1 SELECCIÓN DEL MATERIAL VEGETAL
En el banco de germoplasma ubicado en el laboratorio N°9 de la Unidad de Bioquímica y
Biología Molecular de plantas (UBBMP) del CICY, se seleccionaron 14 accesiones de
ch ile habanero (Capsicum chinense Jacq.) representativas de los tipos naranja, amarillos,
morados y rojos. Específicamente dentro de los ch iles tipo rojo , se cuenta con tres
accesiones que en su etapa inmadura son de un color verde tenue y se les conoce como
"blancos" y tres accesiones que a diferencia de los anteriores en su etapa inmadura son
verde intenso; también se seleccionaron dos materiales de referencia Capsicum annuum
(California Wonder) y Capsicum frutescens (Tabasco) (Cuadro 2.1 ). Las semillas del
material seleccionado fueron germinadas y posteriormente se tomaron muestras foliares
que fueron liofilizadas.
31
Cuadro 2.1 Variedades y accesiones de chile habanero y materiales de referencia usados en este estudio.
2 Mayan Chac® C. chínense Blanco Rojo - -
3 BA1 C. chínense Blanco Rojo - -
4 Mayan Chan® C. chinense Verde Rojo - -
6 AF C. chínense Verde Rojo - - --
7 Mayan Kíin® C. chínense Verde Amarillo
8 NIT C. chinense Verde Amarillo
9 NT C. chinense Verde Amarillo -- . -
10 Mayan Ba'alche® C. chínense Verde Naranja -- -
11 Mayan Ek® C. chinense Verde Naranja - ~
12 Mayan Kauil® C. chínense Verde Naranja - -
13 Mayan lxchel® C. chinense Verde Naranja - -
14 MCH C. chínense Verde Morado -
15 MT C. chínense Verde Morado ~- - -
16 California Wonder C. annuum Verde Rojo g¡ - ~- - 18 Tabasco C. frutescens Verde Rojo
:::J _1- 11..
2.2.2 EXTRACCIÓN DEL ADN GENÓMICO
El ADN total se aisló de acuerdo al protocolo reportado por Tapia-Tussell et al. , (2005), el
cual se describe a continuación:
El tejido vegetal liofilizado (30 mg) de cada muestra fue transferido a un tubo estéril de 2
mi. Posteriormente se agregaron 1000 ~L de buffer de extracción (CTAB) previamente
incubado a 65°C y 16 ~L de RNasa A (1 O mg/mL). Se incubaron a 65° C durante 30 min.
con homogenización a intervalos de 1 O m in. Se añadieron 500 ~ 1 de cloroformo y se
homogenizó por inversión durante 1 O m in. Las muestras se centrifugaron a 13 000 rpm
durante 1 O m in. La fase acuosa (sobrenadante) se transfirió a un tubo nuevo y estéril de
1.7 mi; se agregaron 700 ~1 de isopropanol frío y se mezcló por inversión ; se incubaron a
-20° C durante 20 min . Nuevamente se centrifugaron por 5 min. a 13 000 rpm, se decantó
el sobrenadante, y se agregaron 500 ~1 de etanol al 70% para lavar el precipitado. Se
decantó el etanol y las muestras se secaron al vacío en un concentrador centrífugo (DNA
11 O Speed Vac) . El ADN obtenido se reconstituyó en 50 ~1 de agua libre de
endonucleasas.
2.2.3 CALIDAD E INTEGRIDAD DEL ADN
La determinación de la calidad e integridad del ADN, se realizó a través de electroforesis
en geles de agarosa al 0.8 % (p/v), teñidos con bromuro de etidio. Las muestras se
corrieron en amortiguador TBE 1X (Tris-Borato-EDTA) a 90 V por 30 min. Los geles se
visualizaron en un transiluminador UVP. Las imágenes fueron digitalizadas y procesadas
con el programa UVB Biolmaging Systems.
La concentración y pureza del ADN genómico se determinaron mediante la lectura de
absorbancia a 260 y 280 nm en un espectrofotómetro (Nanodrop 2000). La relación entre
las lecturas de absorbancia a 260/280 nm (002601280) aportó una estimación de la pureza
de los ácidos nucléicos.
2.2.4 SELECCIÓN DE CEBADORES
Se seleccionaron un total de 42 pares de iniciadores microsatélites SSR, de los cuales 25
fueron obtenidos de secuencias aisladas del genoma nuclear de Capsicum annuum por
lnce et al., (201 Ob) y los restantes 17 pares de iniciadores fueron desarrollados por Nagy
et al., (2007), de ellos, siete marcadores microsatélites GPMS son provenientes de una
biblioteca genómica de C. annuum y diez son derivados de marcadores microsatélites
EPMS procedentes de una base de datos de secuencias del género Capsicum (Cuadro
2.2).
En el caso de los intermicrosatélites se utilizaron los universales reportados por Zhao et
al. , (2006) que ya han sido usados en análisis de diversidad genética de diferentes
especies (Cuadro 2.3).
34
Cuadro 2.2 Iniciadores microsatélites usados en el estudio (*lnce et al., 2010, ** Nagy et al. , 2007)
AGi030* [CA]11 F: CGAGGCTTTTCTTCCCTATC R: GCCCGTTTGATTTCTTTGA 60 AGi033* [CAA]g F: CGGGTCGTAGTCAAGAACAAG R: CCTCTCAACCAAGCCAAACT 60 AGi042* [AAC]1 F: CTCATCAACCCACCTTCATCA R: TTTTCGGAGACGGAGCAG 66
AGi0 55* [AAAACA]s F: CTTTGCTTTGTCCATTTTCG R: TCTGGTCTTCTTGGGAATCA 60
AGi086* [CTG]s F: AGTCCTTGCCGATGTTGAAG R: GCAGCAGCAGTTAACCATGA 60 AGi096* [CAT]1 F: GGGAAGAGAAATTGTGAAAGCA R: ATGCCAACAATGGCATCCTA 60 AGi098* [AGA]12 F: TTCCGAGATTGACACACTGG R: AGCAACTTCAGCAGCAACC 60 AGi101 * [TCA]14 F: TGAGGAGACAAACTTCAACTGG R: GATGAGGACAAAACCAAGGACT 60 AGi104* [CTG]13 F: GTCCTTGCCGATGTTGAAG R:CAAAGCAGTGAAAAATGAGTGC 60 AGi111 * ¡cn13 F CTGCCCTCCTCAACCCT AA R CGGTCACTGGACTCTGATGTT 60 AGi115* [TCA]1o F: CGTCTTTCACTTGTCTTTTG R: TAGCCTCTTCCTGTAGTTCC 60 AGi121 * [CA]1s F:AACACGCCAAGAAAATCATC R: TGGAGACCTGAGCCATTG 60
F: GACGAGGGGATTATGTAGCA R: TATTCAGGGGAGGTGAGAAA 60 AGi003* [CTTC]4 F: TGTCCCAACTTTCACCTGCT R: GGGGTTTTCTTCTACCTCCTGA 60 AGi009* [GATns F: GAGGCTTTTTAGCAGGGTGA R: GCAGACAACTTCGCATCTACA 60 AGi038* [GAAGAG]4 [TGA]? F: TGATGAAGGTGGTGGTGAAG R: TGTGTGTGAAGGAGA TTTAGCC 60 AGi043* [GT]1o F: CTCACAACTTCGGCTCTT R: AGGCTCTTCAGCACACTT 60 AGi052* [AGA]1 F: CCGACCTGTTATGGGATTTC R: AGCGGGTTGAGAGAGTTGAG 60 AGi064* [TC]1s F: CTTCTCGTTATCAGCACACT R:AGCATCCATCTTGACTGAAG 64 AGi065* [TAAns F:ATCTTGCTTCCACAAACCCTAT R: GTTGCTTTCCCCCAATGA 60 AGi068* [TTG]s F:GACTTGCTGTCGTTTGTTGG R: GGGAGAGAGGATAAGGATTGTG 60
' ~ AGi083* rcAn~ F:ATCCAGGGAGGAAGAGAACG R: GCATCAAGACCCACCATCAG 60 e r
(.V I 1 o 01
o ....J :J J­ o.. <{ u
EPMS305**
EPMS335**
EPMS377**
EPMS387**
GPMS37**
GPMS29**
GPMS100**
GPMS113**
GPMS197**
GPMS202**
EPMS480**
GPMS194**
EPMS374**
EPMS382**
EPMS386**
EPMS402**
EPMS410**
(CTT)l(CAT)g
(T)s(GT),2
(C),2(A)7
(TA)11(GA),2
Cuadro 2.3 Iniciadores inter-microsatélites reportados por Zhao et al. , (2006).
IS01 54 50
IS04 64 60
IS05 60 50
2.2.5.1 ANÁLISIS CON MICROSATÉLITES (SSR)
La amplificación de los 25 iniciadores descrito por lnce et al. , (201 Ob) se realizó mediante
tres programas de touch-down (Td-PCRs), en un volumen de reacción de 25 IJI, que
contenían 80 ng de ADN genómico, 0.5 IJM de cada par de iniciadores (Cuadro 2.2), 1X
de buffer PCR (20 mM Tris-HCI, 50 mM KCL, pH 8.4), 0.28 mM de dNTPs (lnvitrogen), 3
mM MgCI2, y 2U de Go Taq ADN polimerasa (Promega).
Los Td-PCRs se realizaron en un termociclador 1-Cycler (Bio Rad), con los siguientes tres
tipos de perfiles de amplificación de touch-down (cuadro 2.2): 3 min. de calentamiento a
94 oc, seguido por 1 O ciclos de pre-PCR, que constan de 20 s. a 94 oc de
desnaturalización, 30 s. a 60°C, o 30 s. a 64°C, o 30 s. a 66°C para el alineamiento y 1
min . de extensión a 72°C. La temperatura de alineamiento fue reducida en 0.5°C por ciclo,
en los 1 O primeros ciclos. La amplificación continuó durante otros 30 ciclos a una
temperatura constante de 55°C (Td-PCR tipo A) ó a 59°C (Td-PCR tipo B) ó 61 oc (Td­
PCR tipo C) en la temperatura de alineamiento, y el resto de los parámetros de la pre­
PCR permanecieron sin cambios, con una extensión final de 1 O m in. a 72°C (lnce et al. ,
2010b).
Para los restantes 17 iniciadores desarrollados por Nagy et al. , (2007), las condiciones de
reacción se describen a continuación: la amplificación se realizó en un volumen final de 25
IJL, que contenían 80 ng de ADN genómico como molde, 1 X de buffer PCR (20 mM Tris­
HCI, 50 mM KCL, pH 8.4), 0.20 mM de dNTPs (lnvitrogen), 2.5 mM MgCI2, 0.5 IJM de cada
iniciador y 1 U Go Taq ADN polimerasa (Promega).
La reacción de amplificación se realizó en el termociclador 1-Cycler (Bio Rad) , con el
siguiente programa: un paso de desnaturalización inicial a 94°C por 3 min. , seguido de 35
ciclos a 92°C por 1 min., 60°C por 1 min. y una extensión a 72°C por 1 min., la reacción
fue terminada con un último paso de extensión a 72°C por 7 min .
38
CAPÍTULO 11
Los 11 pares de iniciadores ISSR utilizados en este estudio se presentan en el Cuadro
2.3.
Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en un volumen final de 25 IJL, conteniendo
50 ng de ADN genómico, 1X de amortiguador de PCR (20 mM Tris-HCI, 50 mM KCL, pH
8.4), 2.5 mM de MgCI2 (lnvitrogen), 0.20mM de dNTPs (lnvitrogen), 1 IJM de cada iniciador
y 1 U de Taq ADN polimerasa (lnvitrogen).
La amplificación se realizó en un termociclador 1-Cycler (Bio Rad). La temperatura óptima
de alineamiento de cada juego de iniciadores se determinó con un programa de gradiente
de temperatura, que fue el que se empleó en las reacciones y q