0guio de Practiques de Genetica 2012 2013

Prctiques de Gentica. Curs 2012-2013

1

PRCTIQUES DE GENTICA. CURS 2012-2013.

NDEX:

A. ANLISI DE MOSQUES MUTANTS. 1

A1. CONEIXEMENT I MANIPULACI DE D. MELANOGASTER. 1

A1.1. Cicle biolgic.

A1.2. Identificaci dels sexes.

A1.3. Manipulaci de les mosques.

A1.4. Obtenci de femelles verges.

A1.5. Mutants utilitzats.

A2. ANLISI D'UN MUTANT I DETERMINACI DEL SEU GRUP DE LLIGAMENT. 6

A2.1. Material per a manipular mosques.

A2.2. Procediment experimental.

A2.2.1. Observaci de mascles i de femelles.

A2.2.2. Observaci de mosques salvatges i de mosques mutants.

A2.2.3. Disseny experimental.

A2.2.4. Mutant dulls blancs.

A2.2.5. Mutant dulls taronges.

B. ANLISI DUN PEDIGREE HUM. 16

B1. METODOLOGIA I DESENVOLUPAMENT EXPERIMENTAL. 16

C. GENTICA MOLECULAR. 19

C1. METODOLOGIA BSICA. 20

C2. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL. 21

C2.1. Amplificaci de DNA a partir duna mostra de saliva.

C2.2. La identificaci de lespcie dorigen a partir de productes lactis.

C2.3. Caracteritzaci molecular del mutant dulls taronges de Drosophila melanogaster.

Prctiques de Gentica Anlisi de mosques mutants

1

A. ANLISI DE MOSQUES MUTANTS.

En aquestes prctiques sutilitza com a material biolgic a lespcie Drosophila melanogaster,

tamb coneguda com a mosca de la fruita o del vinagre. D.melanogaster s, des de la seva

introducci en l'experimentaci gentica l'any 1909 per Castle i Morgan, un material excellent

de laboratori i ha perms descobrir nombroses i importants lleis gentiques.

Figura 1. Exemplar de D.melanogaster amb fenotip salvatge.

A1. CONEIXEMENT I MANIPULACI DE D. MELANOGASTER.

A1.1. Cicle biolgic.

D.melanogaster s un insecte (dpter) holometbol que en el seu desenvolupament a partir

dou, passa per les etapes segents: larva, pupa i finalment imago o insecte adult (veure Figura

2). La durada del cicle, aix com de les diferents fases, depn de la temperatura de cultiu. A 20

C el cicle s duns 15 dies i a 25 C noms duns 9 dies. A aquesta temperatura, la fase dou

dura unes 22 hores, la de larva uns 4 dies i la de pupa tamb uns 4 dies (veure Taula 1).

Taula 1: Cronologia del desenvolupament de D. melanogaster a 25 C.


2

Figura 2. Estadis en el desenvolupament de D.melanogaster

A1.2. Identificaci dels sexes.

s obvi que per a poder realitzar els experiments s'han de reconixer, sense cap mena de

dubte, aquells aspectes morfolgics que permeten distingir inequvocament els mascles de les

femelles. A la fase adulta, les diferncies entre mascles i femelles sn diverses i clares (veure

Figura 2 i Figura 3): la pigmentaci de la cara dorsal de la part distal de l'abdomen s contnua

en els mascles, formant una taca fosca sobre els ltims segments abdominals; les femelles sn

una mica ms grans que els mascles i l'extrem de l'abdomen s ms punxegut en les femelles i

ms rom en els mascles. Recordeu la presncia de pintes sexuals noms en els mascles

(observables al binocular).

Mirant la genitalia amb el binocular, s'aprecia que a l'extrem distal de la cara ventral de

l'abdomen, a ms de la placa anal, hi ha en les femelles una plaqueta vaginal de color clar,

mentre que els mascles tenen una estructura de color terrs: l'arc genital (Figura 3).


3

Figura 3. Vista ventral posterior de Drosophila melanogaster

A1.3. Manipulaci de les mosques.

Quan s'han de realitzar encreuaments experimentals o b observar i classificar els individus

d'un cultiu, cal anestesiar-los. La cambra d'anestsia consisteix simplement en un flasc,

similar o igual als de cultiu, que es tapa amb un cot impregnat amb ter etlic, substncia

anestsica d's normal per a aquest fi (lter etlic s txic i la seva manipulaci al laboratori ha

de fer-se amb molta cura).

Per introduir les mosques a l'eteritzador, es destapa aquest flasc i el flasc amb el cultiu de

Drosophila, encarant rpidament les boques dambds flascons en posici vertical. Per tal

d'evitar que les mosques puguin escapar-se conv donar, abans de destapar-lo i en posici

vertical, uns cops secs al flasc de cultiu. Una vegada encarats els dos flascons, se subjecten

les dues boques amb una nica m i es colloca l'eteritzador en posici inferior; mitjanant uns

cops suaus, les mosques cauran en aquest des del flasc amb el cultiu. S'ha d'evitar

moviments i cops bruscos ja que sin podria caure tamb a l'eteritzador el medi de cultiu. Quan

s'han de donar cops als flascons, es recomana de fer-ho sobre una placa de suro que

esmorteeix el cop i el soroll.

Una vegada les mosques (o gran part d'elles) s'han transferit al flasc eteritzador, es tapa

aquest amb el cot impregnat amb ter i s'espera uns segons fins que hagin perdut la seva

mobilitat. Les mosques anestesiades es colloquen sobre una cartolina blanca i ja poden ser


4

observades i classificades. s important no sotmetre les mosques a una exposici massa llarga

a lter (uns 30 segons s, moltes vegades, suficient) ja que llavors es moren, la qual cosa es

veu molt b perqu les ales i potes queden en posici perpendicular, separades del cos.

Tamb s'ha de tenir cura de no impregnar molt el tap de cot, si goteja ter no s'ha de collocar

i hem d'esperar o eliminar l'excs dter abans d'utilitzar-lo.

Normalment, les mosques romanen anestesiades d'aquesta manera d'uns 5 a 10 minuts. Si

durant l'observaci les mosques comencen a despertar-se, s'han de reeteritzar. Els exemplars

eteritzats successivament moltes vegades poden tenir problemes d'esterilitat, el que no s

desitjable pels individus que s'han d'encreuar. Per aix es convenient eteritzar cada vegada

noms una quantitat dexemplars adequada a les nostres capacitats d'anlisi, repetint el procs

fins que s'han analitzat tots els exemplars del flasc de cultiu.

Per a la manipulaci del exemplars s'utilitza un pinzell petit, per exemple del n 0. Els individus

que desprs de la seva classificaci no sn mai ms necessaris sn sacrificats collocant-los en

un flasc que cont alcohol de 70.

Quan s'han de transferir individus anestesiats a un flasc de cultiu, no s'han de tirar directament

a l'interior ja que poden quedar enganxats irreversiblement al medi de cultiu i morir. Per tal

d'evitar aquest gran problema podem dipositar les mosques sobre la paret de vidre, conservant

el flasc en posici horitzontal (sense que rodi) fins que despertin completament.

A1.4. Obtenci de femelles verges.

Una femella de Drosophila pot emmagatzemar i utilitzar l'esperma d'una nica inseminaci per

a la major part de la seva reproducci. Els mascles adults poden copular amb femelles recent

emergides de la pupa, diverses hores abans que comencin a ovopositar. Per tant, per a

realitzar els encreuaments experimentals cal disposar de femelles verges per a la generaci

parental, les quals sacostumen a obtenir de la segent manera: del flasc en el qual estan

eclosionant les pupes es retiren totes les mosques, aix tenim la seguretat de que tots els

individus nascuts en les sis primeres hores sn verges i se separen les femelles dels mascles,

mantenint ambds sexes en flascons separats fins el dia de l'encreuament. La virginitat de les

femelles aix obtingudes pot ser comprovada cultivant el flasc on les hem mantingudes

separades dels mascles; si apareixen larves en aquest flasc, no totes les femelles eren verges

i per tant shan de descartar.

A1.5. Mutants utilitzats.

De la gran quantitat de mutants fenotpics, els que s'escullen per a ser utilitzats en el

desenvolupament de les prctiques sn d'identificaci fcil, per tal de no dificultar la tasca de

l'alumne (Figura 4). Moltes vegades no es fa necessari utilitzar el binocular pel seu

reconeixement.


5

Les mutacions escollides les podem classificar segons mutacions que afecten:

a) A les ales i altres apndixs: forma, mida i venaci.

b) Al cos: color.

c) Als ulls: forma, mida i color.

d) A les quetes: forma, mida i nombre.

Figura 4: Morfologia de diversos mutants que es podeu observar a Drosophila .


6

A2. ANLISI D'UN MUTANT I DETERMINACI DEL SEU GRUP DE LLIGAMENT.

L'objectiu de la prctica s analitzar la naturalesa d'una mutaci problema (dominncia o

recessivitat) i el seu tipus d'herncia (autosmica o lligada al sexe) a partir del fenotip.

Sestudiaran creuaments a on els progenitors sn soques pures homozigtiques que difereixen

en un determinat carcter.

La primera generaci dun creuament s la generaci parental (P), la descendncia dels

progenitors de la generaci P es denomina primera generaci filial (F1) i la descendncia

provinent del creuament dindividus de la F1 es denomina segona generaci filial (F2).

Dominncia i recessivitat. En un locus amb 2 allels, lallel que codifica pel tret que sempre

sexpressa al llarg de totes les generacions sanomena dominant (A) i lallel que no sexpressa

en combinaci amb el dominant sanomena recessiu (a). Aix els individus amb dotaci AA i Aa

presentaran el fenotip A i els individus amb dotaci aa presentaran el fenotip a.

Autosmic o lligat al sexe. Parlem dun carcter autosmic quan el loci que el controla es troba

a un cromosoma somtic (no sexual) i parlem dun carcter lligat al sexe quan aquest es

localitza al cromosoma sexual (X, en aquest cas).

En el cas de treballar amb 2 loci, aquests poden provenir de 2 cromosomes diferents i es

transmeten independentment o del mateix cromosoma (lligats), es poden entrecreuar o no.

A2.1. Material per a manipular mosques.

-Eteritzador

-ter

-Placa de suro

-Pinzell

-Cartolina de color blanc

-Lupa binocular

-Tubets de vidre amb i sense medi de cultiu

-Flasc amb etanol 70.


7

A2.2. Procediment experimental.

A2.2.1. Observaci de mascles i de femelles.

Cal adormir les mosques per poder realitzar una observaci amb lupa de diferents caracterstiques. Apunta

les caracterstiques principals que et permeten distingir un mascle duna femella.

Caracterstiques Femella Mascle

Mida

Forma del cos

Extrem de labdomen

Potes

A2.2.2. Observaci de mosques salvatges i de mosques mutants.

Cal adormir les mosques per poder realitzar una observaci amb lupa de diferents caracterstiques.

Mutants que vegis

Carcter Salvatge

Color dels ulls

Forma de les ales

Forma de les quetes

Forma de les antenes

Color del cos

A2.2.3. Disseny experimental.

Cal establir quin seria el disseny experimental ms adequat per poder determinar el tipus dherncia que

presenten els diferents carcters mutats.

A partir daqu comencem a treballar en parallel amb dues soques mutants (mutants dulls blancs,

mutant dulls taronja). Els procediments sindiquen per separat a cada soca.


8

A2.2.4. Mutant dulls blancs.

A2.2.4.1. Encreuaments.

Fes un esquema del disseny experimental que sutilitzar per descriure el tipus dherncia daquest mutant.

Indica, sempre que puguis, el fenotipus de tots els individus/generacions que surtin a lesquema. Indica

clarament quines parts de lexperiment no han estat realitzades pels alumnes, i a partir de quines mosques

ha comenat lexperiment daquest mutant.


9

A2.2.4.2. Observaci i comptatge de mosques.

Utilitza les taules segents per descriure i comptar les mosques que formen part de lexperiment. Pot ser

que no hagis dutilitzar totes les files.

Generaci Fenotipus Descripci del fenotipus Total de mascles

Total de femelles

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula


Total de femelles

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula


10

A2.2.4.3- Descripci del tipus dherncia.

Cal fer una hiptesi sobre el tipus dherncia, a partir de la qual es calculen unes freqncies esperades.

Aquestes freqncies esperades caldr comparar-les amb les freqncies observades mitjanant una 2.

Hiptesi(s) Qu es deriva daquesta hiptesi que ens permet fer un clcul de

les freqncies esperades?

Freqncies esperades

Freqncies observades

2 g.ll.

Clcul de la 2


11

Taula de valors de la 2

Quin tipus dherncia presenta el carcter dulls blancs? Raona la teva resposta.


12

A2.2.5. Mutant dulls taronja.

A2.2.5.1. Encreuaments.

Fes un esquema del disseny experimental que sutilitzar per descriure el tipus dherncia daquest mutant.

Indica, sempre que puguis, el fenotipus de tots els individus/generacions que surtin a lesquema. Indica

clarament quines parts de lexperiment no han estat realitzades pels alumnes, i a partir de quines mosques

ha comenat lexperiment daquest mutant.


13

A2.2.5.2. Observaci i comptatge de mosques.

Utilitza les taules segents per descriure i comptar les mosques que formen part de lexperiment. Pot ser

que no hagis dutilitzar totes les files.


Total de femelles

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula


Total de femelles

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula

Grup Grup

Taula Taula


14

A2.2.5.3- Descripci del tipus dherncia.

Cal fer una hiptesi sobre el tipus dherncia, a partir de la qual es calculen unes freqncies esperades.

Aquestes freqncies esperades caldr comparar-les amb les freqncies observades mitjanant una 2.

Hiptesi(s) Qu es deriva daquesta hiptesi que ens permet fer un clcul de

les freqncies esperades?

Freqncies esperades

Freqncies observades

2 g.ll.

Clcul de la 2


15

Taula de valors de la 2

Quin tipus dherncia presenta el carcter dulls taronges? Raona la teva resposta.

Prctiques de Gentica Anlisi dun Pedigree Hum

16

B. ANLISI DUN PEDIGREE HUM.

La descripci de fenotips estranys o que criden latenci en lespcie humana es comen a produir a

partir del segle XVIII. Des daleshores els investigadors desenvoluparen una tcnica simple dinvestigaci

daquests casos: lestudi de la informaci familiar. Daquesta manera, i ats a la impossibilitat de realitzar

creuaments controlats en lespcie humana, el gentic ha de recrrer a lescrutini dels aparellaments

produts per casualitat.

El membre duna famlia que crida latenci es denomina propsit o propositus i el seu fenotip s

excepcional. Aleshores, linvestigador rastreja la histria del carcter dinters cap endarrera en la famlia i

dibuixa un arbre genealgic o pedigree tot utilitzant certs smbols normalitzats (veure Taula A). Observant

laparici daquest fenotip s possible determinar el patr dherncia.

Aquesta metodologia clssica es denomina anlisi del pedigree i els gentics lhan utilitzada durant dcades

conjuntament amb les dades mdiques per a determinar el tipus dherncia de molts carcters. Actualment

sutilitza conjuntament amb les tcniques danlisi molecular.

B1. METODOLOGIA I DESENVOLUPAMENT EXPERIMENTAL.

Lalumne haur de realitzar un pedigree familiar propi dun dels cinc carcters que sexposen a continuaci:

1- Daltonisme: Impossibilitat de diferenciar tots els colors.

2- Pic de la vdua: Lnia del cabell termina en un pic al centre del front.

3- Enroscament de llengua: Possibilitat denrotllar la llengua.


17

4- Clotet a la barbeta: Presncia dun clotet a la barbeta.

5- Lbuls separats: Lbul de la orella separat.

Quins sn el teus fenotipus pels diferents carcters a estudiar?:

Carcter: Fenotipus:

1- Daltonisme

2- Pic de la vdua

3- Enroscament de llengua

4- Clotet a la barbeta

5- Lbuls separats

Un cop escollit el carcter, lalumne realitzar el seu arbre genealgic incloent-hi tots els individus

emparentats (pares, germans, fills, oncles i avis). Shauria dintentar tenir un mnim de 15 individus i 3

generacions. Una vegada complert el pedigree familiar pel carcter estudiat, lalumne haur de determinar

lherncia del carcter a partir del seu propi pedigree o dels seus companys de curs, aix com el seu propi

genotip.


18

Taula A. Smbols que sutilitzen en lanlisi de pedigree humans

Prctiques de Gentica Gentica Molecular

19

C. GENTICA MOLECULAR.

Des de fa uns anys que la gentica molecular ha experimentat un espectacular progrs a causa

del desenvolupament de tcniques molt eficients com ara la seqenciaci, la clonaci i,

sobretot, la reacci en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR va ser descrita lany 1987 per

K. Mullis i aquest descobriment li va suposar l'obtenci del Premi Nobel.

La PCR permet fer in vitro moltes cpies (amplificar) dun fragment concret del genoma d'una

manera rpida i efica. L'obtenci de gran quantitat de cpies de fragments concrets de DNA

amb una mida mxima de 2 o 3 kilobases (Kb), permet la simplificaci de moltes tcniques que

daltra manera no es podrien fer de forma rutinria.

La PCR t dues grans qualitats que la fan una eina realment efectiva i molt simple com a

tcnica de laboratori.

1.-Lespecificitat, ja que noms amplifica una secci molt concreta del genoma.

2.-La robustesa, perqu amplifica a partir de mostres poc purificades.

La PCR te moltes utilitats, entre daltres sutilitza per a clonar i seqenciar gens, per a observar

polimorfismes dels fragments de restricci, per a les tcniques de mutagnesi dirigida. De tota

aquesta metodologia nhan resultat moltes aplicacions. Algunes delles sn les que tenen

alguna aplicaci forense (identificaci individual, paternitats, sexatge), els genotipatges de

mutacions, la identificaci despcies i la reconstrucci de filognies.

Al llarg de les sessions de prctiques es treballaran les tcniques bsiques utilitzades en un

laboratori de gentica molecular. Es realitzaran metodologies d'extracci de DNA a partir de

diferents teixits, electroforesi en gel d'agarosa, reacci en cadena de la polimerasa (PCR),

tcniques de genotipatge i protocols de diagnstic. L'aplicaci d'aquestes metodologies

permetr resoldre els segents casos prctics:

1. Amplificaci de DNA a partir duna mostra de saliva.

2. Identificaci de l'espcie d'origen (vaca, ovella o cabra) a partir de productes lactis.

3. Caracteritzaci molecular del mutant dulls taronges de Drosophila melanogaster.

Els materials i aparells a utilitzar seran:

MATERIAL APARELLS Puntes de micropipetes Centrfuga

Eppendorf Micropipetes Gradetes Estufa

Rotulador de vidre Termociclador Guants Fonts i cubetes delectroforesi

Transiluminador Calculadora


20

C1. METODOLOGIA BSICA:

Abans de comenar cal:

1. Comprovar que portem l'equip de protecci individual que necessitem.

2. Netejar la taula de laboratori i les micropipetes, si s possible amb alcohol, per evitar

contaminacions.

3. Sempre que es treballa al laboratori cal portar guants, tant per evitar la contaminaci

com per a protegir-se dels reactius perillosos.

4. s molt important sempre retolar clarament els tubs.

En els diferents protocols s'utilitzaran les tcniques moleculars bsiques, com sn l'extracci de

DNA, PCR i electroforesi en gel d'agarosa. Els fonaments d'aquestes tcniques sn els

segents:

EXTRACCI DE DNA. En primer lloc, ser necessari obtenir una adequada quantitat i qualitat

de DNA a partir del material biolgic de partida. Per a aix hem d'aplicar una srie de

tractaments que ens permetran allar i purificar el DNA. Hi ha multitud de procediments

d'extracci de DNA i l'elecci dun dependr fonamentalment del tipus de material biolgic de

partida, del tipus de DNA que es vol obtenir, aix com del material disponible al laboratori. La

major part dels protocols d'extracci presenten dues etapes, una primera etapa

d'homogenetzaci i l'etapa final de separaci i purificaci del DNA. L'etapa d'homogenetzaci

consisteix en trencar les estructures cellulars que protegeixen el DNA perqu pugui ser

accessible als reactius i s'aconsegueix aplicant diferents mtodes fsics, qumics o enzimtics o

una combinaci d'aquests. La intensitat del tractament d'homogenetzaci dependr de la

dificultat de trencament de les estructures biolgiques del material de partida. Un cop en

dissoluci, la gran mida i la naturalesa hidroflica del DNA ens permetr separar-lo de la resta

de components. A ms haurem de separar el DNA de les estructures a les que s'associa de

manera natural, principalment de protenes. La separaci i purificaci del DNA es pot

aconseguir a partir de multitud de tcniques, com l'eliminaci de protenes amb dissolvents

orgnics, la precipitaci d'cids nucleics amb alcohols, la digesti enzimtica, la sedimentaci o

la combinaci d'aquestes.

PCR: El principi bsic de la tcnica de la PCR s molt simple. Sutilitzen dos encebadors

oligonucleotdiques o primers (daproximadament 20 parells de bases) de seqncia coneguda

i que hibriden amb les regions que flanquegen el fragment de DNA que volem amplificar.

Aquests primers actuen com a encebadors perqu la DNA-polimerasa actu i pugui amplificar el

fragment. Com que cada cpia nova pot servir de motlle per a una nova amplificaci, el nombre

de cpies del fragment creix exponencialment. Els encebadors utilitzats durant el procs

damplificaci de DNA se sintetitzen basant-se en lalineament de les zones conservades de

seqncies disponibles en bases de dades.


21

La PCR consta de tres etapes (Figura 1):

I. La desnaturalitzaci, a temperatures normalment entre 90-95 C, del DNA de doble

cadena per a obtenir-nen de cadena senzilla.

II. La uni dels encebadors al DNA motlle de cadena senzilla. La temperatura de l'etapa

depn de la composici nucleotdica del encebador, normalment entre 50-60 C

III. Lelongaci de la cadena de nova sntesi, a temperatures normalment entre 70-74C.

ELECTROFORESI EN GEL D'AGAROSA. S'utilitzar per a la comprovaci de la qualitat del

DNA. L'agarosa s un polisacrid compost principalment per agar i es mpliament utilitzada

com a suport en electroforesi de fragments de DNA. L'agarosa s insoluble en medis aquosos a

temperatura ambient i es dissol en ells a una temperatura de 100 C. Quan es refreda, la

dissoluci d'agarosa forma un entramat de fibres i pels seus porus es poden desplaar les

molcules de DNA quan se'ls hi aplica un camp elctric. El DNA t crrega negativa i es

desplaa per lagarosa a diferent velocitat en funci de la seva mida. Per tal de visualitzar el

DNA sutilitza el bromur detidi, un agent intercalant que se situa entre les dues cadenes del

DNA i t la particularitat demetre fluorescncia quan s illuminat amb llum ultraviolada. El

BROMUR D'ETIDI s MOLT MUTAGEN i s'han de portar guants quan es manipula qualsevol

soluci amb aquesta substncia.

C2. PROCEDIMENT EXPERIMENTAL.

C2.1. Amplificaci de DNA a partir duna mostra de saliva.

s possible extreure DNA de gaireb qualsevol tipus de mostra biolgica, i de fet, lnic

requeriment s que hi hagi cllules nucleades. Tot i aix, segons el tipus de mostra, pot ser

ms o menys difcil purificar el DNA, i la quantitat pot arribar a ser molt escassa.


22

A la taula segent, tens uns exemples de mostres biolgiques, indica si s possible

extreuren DNA o no, i si en podem obtenir molta o poca quantitat.

Mostra Extracci (S/No) Quantitat

Sang

Cabell

Ungles

Semen

Mscul

C2.1.1. Extracci de DNA a partir de saliva.

Lextracci es realitza mitjanant un protocol molt senzill:

Acumular saliva a la boca, al mateix temps que amb la llengua es freguen les dents i

les galtes.

Escopir la saliva en un tub de 15 ml (tap vermell).

Afegir-hi 2 ml de tamp de lisi TT. Aquest tamp cont un detergent (SDS), que trenca

les membranes cellulars i allibera el DNA.

Afegir-hi 200 l de NaCl 5M.

Afegir-hi aproximadament 2 volums detanol absolut, refrigerat a -20C.

Invertir el tub unes 10 vegades, fins que precipiti el DNA, que t una estructura similar

al cot.

Amb una punta de pipeta neta, pescar el DNA i posar-lo en un tub eppendorf de

1,5 ml.

Assecar el precipitat a lestufa, amb el tub obert.

Resuspendre en 500 l de tamp TE.

Durant lextracci hem fet servir un seguit de reactius. Quina creus que s la seva funci?

Reactiu Funci en lextracci

Tamp TT

NaCl 5M

Etanol absolut

Tamp TE

Com qualificaries lextracci en termes de qualitat i quantitat de DNA? Quin origen t,

aquest DNA?


23

C2.1.2. PCR de lextracci de saliva.

Amb aquesta mostra realitzarem dues PCR diferents, amb dos parells de primers diferents:

PCR 1:

Reactiu Concentraci

estoc Concentraci

final Volum (VF=30 l) N=___ mostres

Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

Primer-F1 10 M 0,2 M

Primer-R1 10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/ l

Aigua

Mostra 1 l

PCR 2:

Reactiu Concentraci

estoc Concentraci


Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

Primer-F2 10 M 0,2 M

Primer-R2 10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/ l

Aigua

Mostra 1 l

Un cop muntada la PCR, cal posar els tubets al termociclador. El programa que far laparell

s:

Fase o pas Temperatura Temps Cicles

Desnaturalitzaci 94 3 1

Desnaturalitzaci 94 30

35 Hibridaci 55 145

Extensi 72 145

C2.1.3. Comprovaci de la PCR i anlisi de resultats.

Finalment, per comprovar la reacci damplificaci cal fer un gel dagarosa al 2 %:

tamp TAE Agarosa

100 ml


24

Carregar, al pou que correspongui, 15 l de la PCR +5 l de tamp de crrega (per donar

densitat a la mostra).

Amplifiquen tots dos parells de primers?

Desprs que el professor us digui qu sn els parells de primers que heu fet servir, qu

diries en relaci a lorigen del DNA que sha extret de la mucosa bucal?

C2.2. La identificaci de lespcie dorigen a partir de productes lactis.

La identificaci despcies sutilitza en camps tant diversos com poden ser la conservaci de

recursos naturals, la gentica forense o la indstria agroalimentria. En general, ls daquestes

metodologies ha de permetre identificar, a partir de diferents mostres biolgiques, lespcie

dorigen, determinar barreges de productes de diferent origen (sobretot en mostres daliments)

o fins i tot detectar algun tipus de contaminacions o dadulteracions.

Per tal de poder identificar correctament lespcie dorigen duna mostra s indispensable

disposar de dues eines fonamentals: una tcnica danlisi i una mostra de referncia.

Segons el tipus de mostra es poden utilitzar tcniques danlisi molt diverses. Per exemple, les

anlisis morfolgiques amb lupa sutilitzen en mostres de pinsos de cereals, lobservaci al

microscopi es fa servir en alguns tipus de mostres forenses i les anlisis qualitatives de

protenes permeten caracteritzar productes lctics. Tot i aquesta diversitat de metodologies, en

general sutilitzen tcniques danlisi basades en lamplificaci del DNA perqu sn rpides,

repetibles, fcils dinterpretar i no requereixen coneixements especfics per cada tipus diferent

de mostra. No obstant aix, aquests protocols funcionen malament en mostres molt

processades, a causa de la degradaci que pateix la molcula de DNA.

En general, la mostra de referncia s una mostra dorigen conegut que podem comparar amb

la mostra problema i aix fer una identificaci correcta. En els protocols basats en lanlisi de

DNA, aquestes mostres de referncia les trobem, habitualment, en grans bases de dades en

lnia, pbliques i que contenen milions de seqncies de DNA. Un cop analitzada al laboratori

la mostra problema podem comparar-la amb tota la informaci de les bases de dades

mitjanant diferents eines informtiques i assignar-la a una espcie determinada.

C2.2.1. Extracci de DNA a partir de formatge.

Lextracci es realitza mitjanant el segent protocol:

Talla un tros petit de la mostra de formatge i posal dins dun eppendorf.

Afegir-hi 550 l de tamp de lisi TT. Aquest tamp cont un detergent (SDS), que

trenca les membranes cellulars i allibera el DNA.


25

Afegir-hi 10 l de protenasa K (20 mg/ml) i sincuba 12 hores a 56C.

Afegir-hi 600 l de NaCl 5M i centrifugar-lo a 12.000 rpm 10 min.

Transfereix 400 l de la fase aquosa (200 l +200 l) a un eppendorf nou.

Precipita amb 800 l de etanol absolut a -20 C.

Invertir el tub dues vegades.

Centrifugar-lo a 12.000 rpm 10 min i decantar el sobrenedant.

Afegir-hi 800 l de etanol 70% a -20C.

Centrifugar-lo a 12.000 rpm,10 min i decantar el sobrenedant.

Deixa assecar les restes detanol a lestufa 94 C durant 1 minut (anar controlant).

Resuspendre amb 200 l de tamp TE.

Per comprovar lextracci de DNA genmic es prepara un gel dagarosa a l1%:

tamp TAE Agarosa

100 ml

Carregar 10 l d extracci +5 l tamp de crrega.

Durant lextracci hem fet servir un seguit de reactius. Quina creus que s la seva funci?

Reactiu Funci en lextracci

Tamp TT

Protenasa K

NaCl

Etanol Absolut

Etanol 70%

Tamp TE

Com qualificaries lextracci en termes de qualitat i quantitat de DNA? Quin origen t,

aquest DNA?

C2.2.2. PCR espcie-especfiques.

Amb aquesta mostra realitzarem tres PCR diferents, amb tres parells de primers diferents, que

amplifiquen en productes dorigen ov (parell OA), cabrum (parell CH) i bov (parell BT).


26

Encebador Seqncia (53)

OA12S959 ATATCAACCACACGAGAGGAGAC

OA12S1130 TAAACTGGAGAGTGGGAGAT

CH12S144 CGCCCTCCAAATCAATAAG

CH12S469 AGTGTATCAGCTGCAGTAGGGTT

BT12S916 GTACTACTAGCAACAGCTTA

BT12S1171 GCTTGATTCTCTTGGTGTAGAG

PCR 1:

Reactiu Concentraci

estoc Concentraci


Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

10 M 0,2 M

10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/ l

Aigua

Mostra 1 l

PCR 2:

Reactiu Concentraci

estoc Concentraci


Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

10 M 0,2 M

10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/ l

Aigua

Mostra 1 l


27

PCR 3:

Reactiu Concentraci

estoc Concentraci


Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

10 M 0,2 M

10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/ l

Aigua

Mostra 1 l


s:




35 Hibridaci 50 145

Extensi 72 145

C2.2.3. Comprovaci de la PCR i anlisi de resultats.

Finalment, per comprovar la reacci damplificaci cal fer un gel dagarosa al 2 %.

tamp TAE Agarosa

100 ml

Carregar, al pou que correspongui, 15 l de la PCR +5 l de tamp de crrega.

Omple la taula segent amb els resultats de lelectroforesi:

Mostra PCR BT PCR OA PCR CH

Formatge 1

Formatge 2

Formatge 3

Formatge 4

En aquesta prctica, qu hem fet servir de mostres de referncia?


28

Comproveu, amb el professor, si els vostres resultats quadren amb les indicacions de les

etiquetes dels productes que heu analitzat.

C2.3. Caracteritzaci molecular del mutant dulls taronges de Drosophila melanogaster.

A nivell molecular, la base gentica del mutant dulls taronges s una inserci a lintr 2 del

locus White, que naltera la funci. Al llarg de lexperiment, a part de determinar quin tipus

dherncia presenta aquesta mutaci, podrem identificar exactament el genotipus de les

mosques, i per tant, comprovar com es correspon amb els fenotipus observats.

Lallel salvatge del locus White (el que t la seqncia sense canvis i per tant no t la funci

alterada) el detectarem mitjanant la PCR1 (combinaci de primers We2F2 i We3R2), que

genera un fragment de 362 pb.

Ex 2 Ex 3

Intr 2 Primer: We2F2

Primer: We3R2

PCR1: Estructura de l al lel salvatge del locus White

362 pb

Ex 2 Ex 3

2 Primer: We2F2

PCR1: Estructura de l al lel salvatge del locus White

362 pb

Ex 2 Ex 3


Primer: WcopiaR1

PCR2: Estructura de l al lel apricot del locus White

300 pb

Element copia

Primer: We3R2

> 5 kb

No funciona!

Ex 2 Ex 3


Primer: WcopiaR1

PCR2: Estructura de l al lel apricot del locus White

430 pb

Element copia

> 5 kb

No funciona!


29

Tal com us indica lesquema, tant lallel salvatge com lallel apricot tenen tota la seqncia

dels exons i dels introns, i lnic canvi s la inserci de Copia. Aquest element fa que la PCR1

no pugui utilitzar lallel apricot de motlle, perqu s massa llarg.

Lallel mutant (apricot) t una inserci dun element anomenat Copia a lintr 2 del locus White.

Aquest fragment t una mida de ms de 5 kilobases, i el detectarem mitjanant la PCR2

(combinaci de primers We2F2 i WcopiaR1), que genera un fragment de 430 pb.

En un homozigot per lallel salvatge, qu esperarem que passi a la PCR1? I a la PCR2? I en

un heterozigot? I en un homozigot per lallel apricot?

Genotipus PCR1 PCR2

Homozigot salvatge

Heterozigot

Homozigot apricot

Hi ha alguna categoria genotpica ms que no hgim tingut en compte?

C2.3.1. Extracci de DNA.

Lextracci de DNA es realitza mitjanant el protocol de Chelex, una resina quelant que permet,

duna manera molt senzilla, obtenir DNA de qualitat.

Cal separar les mosques individualment en un tub eppendorf d1.5 ml.

Afegir-hi 300 l de tamp Chelex 10% .

Afegir-hi 20 l de protenasa K (a 20 mg/ml).

Sincuba una hora a 56C i tot seguit es posa 5 a 94C.

Finalment, cal vortejar el tub durant 1 i centrifugar-lo a 12.000 rpm 1.

Per qu en aquest cas no comprovem lextracci amb una electroforesi en gel dagarosa?


30

C2.3.2. PCR.

Reactius i concentracions:

Reactiu Concentraci estoc Concentraci final

Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

Primer 1 10 M 0,2 M

Primer 2 10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/l

Cal que feu els clculs per poder preparar les reaccions de PCR.

PCR 1:

Reactiu Concentraci

estoc Concentraci


Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

We2F2 10 M 0,2 M

We3R2 10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/ l

Aigua

Mostra 1 l

PCR 2:

Reactiu Concentraci

estoc Concentraci


Tamp 10X 1X

MgCl2 50 mM 1,5 mM

We2F2 10 M 0,2 M

Wcopia R1 10 M 0,2 M

dNTP 2 mM 200 M

Taq 5 u/l 0,025 u/ l

Aigua

Mostra 1 l


31


s:




35 Hibridaci 55 145

Extensi 72 145

C2.3.3. Comprovaci de la PCR i lectura de resultats

Finalment, per comprovar la reacci damplificaci cal fer un gel dagarosa al 2 %.

tamp TAE Agarosa

100 ml

Carregar, al pou que correspongui, 15 l de la PCR +5 l de tamp de crrega.

Fenotipus Generaci Sexe N PCR 1 PCR 2 Genotipus

Els genotipus es corresponen correctament amb els fenotipus? Fes una taula amb els

resultats observats i els esperats.

0guio de Practiques de Genetica 2012 2013

Documents

Transcript of 0guio de Practiques de Genetica 2012 2013