1 metodos de estudio en células.
44
Métodos de Estudio en Biología Celular. Análisis Morfológico. MV. Dr. Daniel M. Lombardo. Curso de Biología Celular y Molecular Maestría de Salud Animal. FCV - UBA
-
Upload
alicia-monica-loca -
Category
Education
-
view
180 -
download
9
Transcript of 1 metodos de estudio en células.
Métodos de Estudio en
Biología Celular.
Análisis Morfológico.
MV. Dr. Daniel M. Lombardo.
Curso de Biología Celular y Molecular
Maestría de Salud Animal.
FCV - UBA
¿Cómo podemos observar las células?
Las células son elementos pequeños y complejos.
Conocerlas depende de las herramientas disponibles.
Organización estructural.
Composición molecular.
Funcionamiento.
La microscopía de luz es un método poco destructivo.
GFP un marcador que permite ver interacciones y desplazamientos.
La MO permitió elaborar la teoría
celular: Schleiden y Schwann - 1838
Concepto: Examinar células vivas o muertas depende de
generar un contraste.
La MO vs la ME una cuestión de detalles en la escala de valores, ¡ Un
siglo después !.
La reconstrucción 3D una herramienta detallista.
El detalle depende de
la WL
Luz visible
0.4 µm – 0.7 µm
Violeta - Rojo
La luz tiene naturaleza ondulatoria
Marcha de los rayos en el MO
La naturaleza
ondulatoria de la luz
genera efectos
ópticos de
difracción.
Efectos de interferencia a gran
aumento
¿ Que pasa con:
• Objetos puntuales
• Objetos separados ?
LR = 0.2 µm
¿Como observamos las células vivas?
La preparación de las muestras para MO significa una
preocupación para los microscopistas
Microscopio de contraste de
fase.
Microscopio de contraste
interferencial.
Microscopio de campo oscuro.
Microscopía de Contraste de Fase
Como se ven las células vivas.
Microscopía de Contraste Interferencial
Mediante un procesador de imágenes se
pude incrementar el LR y los detalles en
función del aumento de contraste.
Concepto: El ojo humano no puede ver
bien bajo una luz extremadamente débil
y no puede percibir pequeñas
diferencias de intensidad de luz sobre
un fondo brillante
Técnicas electrónicas y digitalización de las imágenes
¿ Como observamos células muertas ?.
La fijación y los fijadores.
El corte y los micrótomos
Las coloraciones selectivas:
Basofilia – H
Acidofilia - E
¿ En que se basa la microscopía de fluorescencia ?
La energía de absorción es mayor que la de emisión
Las longitudes de onda mas largas
son las menos energéticas
Triple fluorescencia
Inmunofluorescencia
Marcación fluorescente por
anticuerpos
¿ Es posible obtener imágenes 3D de objetos complejos en MO ?.
MAC = TACLa decombolución se basa en la función
de dispersión de un punto
Función de “CONVOLUCIÓN”
Microscopía Con focal, una
herramienta que genera
imágenes bidimensionales
Reconstrucción 3D
en Microscopía con
focal
Constituye una técnica
analógica y no digital
pues manipula la luz
antes de llegar al objeto.
El ME resuelve la estructura fina de la
célula
El LR para un haz de electrones es superior que para la luz natural.
La WL de un haz de electrones es inversamente proporcional a su
velocidad.
100.000 v
WL= 0.004 nm
LR= 0.002 nm (100.000 mayor)
• LR real = 0.1 nm (aberraciones electrónicas)
• LR real = 2 nm (preparación de la muestra y el
calor del bombardeo) – 100 veces mayor que el
MO.
Similitudes y diferencias MO vs MET
¿ Como se preparan las muestras para ME ?
• Fijación
• inclusión y corte (50 – 100 nm)
¿ Como aseguramos que luego del
procesamiento de la muestra para ME su
imagen representa la realidad ?
Congelamiento rápido
Estado de “Gel Vitreo”
El contraste de la muestra depende del número
atómico de sus átomos
C; O; H; N Bajo N° atómico ¡ Hay que contrastar !
En ME las macromoléculas se pueden inmuno localizar.
Técnica de detección con
partículas de oro coloidal
Sólo para superficies
La reconstrucción 3D en ME se
hace dificultosa
Mediante SEM se pueden obtener
imágenes de superficie.
MET vs SEM
Sombreado con metales para
observación de superficies mediante MET
¿ Como podemos observar el interior de
las células en ME ?
Criofractura • Congelación
• Corte
• Metalizado con Platino
• Disolver la materia orgánica
Observación de Partículas de Intramembrana
Grabadp por congelación
Frezze - Etch
• Congelación
• Corte
• Sublimación de H20 en vacio
• Sombreado
La Tinción negativa brinda mas resolución
• Se usa para ver macromoléculas
Se coloca sobre una película de carbono.
Se metaliza con Ac. De Uranilo.
Se bombardea con el haz de electrones.
El haz de electrones atraviesa
donde no hay metal y da una
imagen negativa de la
macromolécula.
Imágenes tomadas desde distintas direcciones se pueden
combinar para dar lugar a una reconstrucción tridimensional
Imágenes por micro
tomografía electrónica
Como observar las células vivas
Visualización de la movilización de Ca ++
intracelular utilizando sustancias
luminicentes y fluorescentes
LuminiscenciaFluorescencia
Métodos utilizados para introducir en la célula una
sustancia para la cual la membrana es impermeable
Cito química análoga fluorescente.
Inyección de atc bloqueantes.
La activación inducida por la luz de moleculas precursoras
“empaquetadas” facilita el estudio de la dinámica intracelular
Moléculas empaquetadas de Ca++, AMPc, GTP e I3P
Determinación del flujo de microtúbulos del
huso mitótico utilizando fluoresceina
empaquetada unida a tubulina.
Estructura de GFP
Marcaje con GFP
Dinámica del
marcaje con GFP
Las moléculas se pueden
marcar con radio isótopos.
Las moléculas se pueden marcar con radio
isótopos para seguir su dinámica en la célula
Ensayo de
pulso y caza
