15:35 h patógenos en matriz agua: Metodología Sonia … · • UNE-EN ISO 5667-5:2006 Water...

15:35 h – 16:05 h Toma de muestras de agentes altamente

patógenos en matriz agua:

Metodología

Sonia Aguayo

Investigador-Científico del CNSA (ISCIII)

Red Ibérica de laboratorios de alerta biológica. Métodos de acreditación para la detección de agentes altamente patógenos

(Grant Agreement number – HOME/2012/ISEC/AG/CBRN/4000003810)

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE TRABAJO PARA LA TOMA DE MUESTRA DE MATRICES AMBIENTALES

ACUÁTICAS PARA LA DETECCIÓN DE MICROORGANISMOS

Toma de muestras de agua para la detección de bacterias, esporas, virus y/u hongos para su posterior identificación, pudiendo ser éstos microorganismos inocuos y/o patógenos



ALCANCE

ÍNDICE



1. Referencias bibliográficas

2. Consideraciones previas a la toma de muestra

3. Equipamiento de toma de muestra

4. Realización de la toma de muestra en aguas naturales

5. Consideraciones posteriores a la toma de muestra

• Manual de Calidad del CNSA, ISCIII, Subdirección General de Servicios Aplicados, Formación e Investigación. Edición 8

• POG_CNSA_01 Procedimiento operativo general para la elaboración y control de documentos

• UNE-EN ISO 5667-1:2007 Calidad del agua. Muestreo. Parte 1: Guía para el diseño de los programas de muestreo y técnicas de

muestreo.

• UNE-EN ISO 5667-3:2013 Calidad del agua. Muestreo. Parte 3: Conservación y manipulación de las muestras de agua.

• UNE-EN ISO 5667-4:1987 Water quality. Sampling. Part 4: Guidance on sampling from lakes, natural and man-made.

• UNE-EN ISO 5667-5:2006 Water quality. Sampling. Part 5: Guidance on sampling of drinking water from treatment works and piped

distribution systems.

• UNE-EN ISO 5667-6:2005 Water quality. Sampling. Part 6: Guidance on sampling of rivers and streams.

• UNE-EN ISO 5667-9:1992 Water quality. Sampling. Part 9: Guidance on sampling from marine waters.

• UNE-EN ISO 5667-14:1998 Water quality. Sampling. Part 14: Guidance on quality assurance of environmental water sampling and

handling.

• UNE-EN ISO 5667-20:2008 Water quality. Sampling. Part 20: Guidance on the use of sampling data for decisions making –

Compliance with thresholds and classification systems.

• UNE-EN ISO 5667-21:2010 Water quality. Sampling. Part 21: Guidance on sampling of drinking water distributed by tankers or

means other than distribution pipes.

• UNE-EN ISO 5667-23:2011 Calidad del agua. Muestreo. Parte 23: Guía para el muestreo pasivo en aguas superficiales.

• UNE-EN ISO 19458:2007 Calidad del agua. Muestreo para el análisis microbiológico.



Referencias bibliográficas

Consideraciones previas a la toma de muestras

• Toma de muestras de agua representativas para el aislamiento, cultivo e identificación de aquellas especies consideradas;

• Agente biológico del grupo 4: Aquél que causando una enfermedad grave en el hombre supone un serio peligro para los

trabajadores, con muchas probabilidades de que se propague a la colectividad y sin que exista generalmente una profilaxis o un

tratamiento eficaz .

• Se tomarán muestras puntuales.

• Toma de muestra que al ser puntual, se realiza en una localización y momento concretos, por lo tanto la información que de ellas

se extrae debe circunscribirse exclusivamente a dichas situaciones

• Planificación sitios de toma de muestra – planificación atendiendo a la categorización de máxima alerta sanitaria de la situación y

de emergencia, alta patogeneicidad de los microorganismos:

Punto para la toma de muestra lo más cercano posible al punto sospechoso de haberse realizado el inóculo en la masa de agua y en el tiempo lo más cercano posible a dicha inoculación

• Aplicar las medidas de correcta seguridad utilización de los EPI apropiados y demás disposiciones conforme a la legislación

competente (Directiva 2000/54/CE - Real Decreto 664/1997 )



Puntos o sitios para la toma de muestras



Preparación de equipamiento de toma de muestra

DESCRIPCIÓN



Equipamiento de toma de muestra

1. Equipamiento

2. Verificación y calibración de equipos

3. Otros materiales

4. Reactivos

5. Patrones y materiales de referencia

Equipos



Verificación y calibración de equipos



Recipientes para la muestra



para ensayos fisicoquímicos

Las muestras se deben tomar en RECIPIENTES normalizados y adecuados para evitar que se rompan o se vierta su contenido en el transporte:

Recipientes abiertos con tapón. Sirven para tomar la muestra en superficie o inmediatamente bajo ésta. Recipientes cerrados botellas con válvulas de apertura y cierre que permiten obtener muestras a distintas profundidades.

Polietileno, polipropileno, poliestireno, etc. en función de: resistencia a temperaturas extremas, resistencia mecánica, facilidad de cierre hermético, tamaño, forma, disponibilidad, coste, posibilidades de limpieza y de reutilización, esterilización,...

para ensayos

microbiológicos

estériles

500 ml

• 500 ml (100 ml/inóculo) • 1000 ml Legionella • > 1000 ml virus, Salmonella spp.,

amebas, oocistos de Cryptosporidium, cistos de Giardia,

Descontaminación de equipos / esterilización

6.1.2 Descontaminación de equipos La descontaminación de los equipos e

instrumentos implicados en la toma de muestra garantizará que los microorganismos captados sean exclusivamente aquellos presentes en el ambiente de nuestra matriz de interés. Se deberán seguir las recomendaciones recogidas en el Manual de Bioseguridad en el Laboratorio (2005, OMS) para la esterilización de equipos.

6.1.2.1 Esterilización

Se destruirán todas las formas de microorganismos (bacterias, esporas, hongos, virus y/o parásitos) presentes en un determinado equipo o instrumento. El mecanismo de esterilización a aplicar va a depender del tipo de equipamiento que manejemos, y más concretamente del material con el que esté fabricado.





1. Control de los recipientes de toma de muestra

1. Ensayo de esterilidad

2. Ensayo de presencia de agentes de inactivación

3. Ensayo de toxicidad residual en los recipientes de toma de muestra

Control de los recipientes

1.- Asegurar la esterilidad de los recipientes de toma de muestra:

• Recipientes normalizados y esterilizados para ensayos microbiológicos: Certificado de

esterilización como condición para su aceptación

• Recipientes preparados según procedimiento interno

• Independientemente del material tanto si son de vidrio como si son de plástico.

Se deben realizar ensayos de esterilidad del lote en uso. Esto corresponde al lote de recipientes tras su etiquetado, adición de agentes de inactivación, si procede, y almacenamiento.

a.- Método del “frasco rodado” b.- Método del caldo líquido

2.- Ensayo de presencia de agentes de inactivación: Los envases normalizados comercializados para la toma de muestras de aguas para ensayos microbiológicos, en general, tienen una concentración de tiosulfato a razón de 20 mg/L, por lo que SE PUEDEN UTILIZAR estos envases, sin ningún sobreañadido de tiosulfato sódico, para aguas que contengan hasta 4 ppm de CRL (Cloro Residual Libre). 3.- Ensayo de toxicidad residual en los recipientes de toma de muestra



Manipulación y transporte de equipos



Mantener la esterilidad e integridad tanto de los soportes para la toma de muestra como de los

equipos implicados en la misma:

durante el periodo de almacenaje de los equipos, previo a la fase de captación,

durante su manipulación y transporte al punto de toma de muestra,

De existir dudas sobre el cumplimiento de alguna de ellas, por un lado para equipos, se deberá

proceder a revisar el funcionamiento de éstos y una vez comprobado, se deberá proceder

nuevamente a su esterilización, y por otro lado, para material fungible, se deberá desechar y

reemplazar por material nuevo.

Procedimiento de la toma de muestra



1.- Realización de la toma de muestra en aguas naturales Toma de muestra desde un puente

1.1.- Toma de muestra en el curso del agua

1.2.- Toma de muestra desde la orilla

1.3.- Toma de muestra desde una embarcación

2.- Toma de muestra de aguas subterráneas

3.- Toma de muestra bajo el hielo

4.- Toma de muestra en playas de baño

Realización de la toma de muestras en aguas naturales



DESDE UN PUENTE

La muestra deberá tomarse en una zona en la que la masa de agua presente una elevada tasa de mezcla para que sea representativa y desde el centro del puente a ser posible.

1.- Retirar el tapón y mantenerlo con una mano libre o dejarlo apoyado en una superficie firme tras darle la vuelta de forma que pueda evitarse la contaminación del interior 2.- Hacer descender el recipiente a la superficie del agua, con precaución 3.- Aclarar el fondo del recipiente poniéndolo en contacto por unos segundos con la superficie del agua para a continuación elevarlo y permitir que cualquier residuo presente en el fondo caiga y se lo lleve la corriente. 4.- Sin llegar a sumergir la boca del recipiente, deberá hacerse descender el equipo unos 15 centímetros en el agua. La corriente reorientará el equipo con el recipiente de manera que el recipiente estará aguas arriba del tomamuestras. Rápidamente deberá hacerse descender el tomamuestras unos 0,5 m para sumergirlo completamente. De este modo se minimiza la toma de muestra de la capa superficial. 5.- Recuperar el recipiente teniendo cuidado una vez más de no provocar la liberación de residuos del puente o de la embarcación sobre la muestra o el equipo. 6.- Asegurar que quede espacio entre la muestra y el tope del recipiente para su posterior mezcla en el laboratorio 7.- Cerrar el recipiente con su tapa cubierta de papel de aluminio.




EN EL CURSO DE AGUA

Procedimiento:

1.- Retirar el tapón y mantenerlo con una mano libre o dejarlo apoyado en una superficie firme tras darle la

vuelta de forma que pueda evitarse la contaminación del interior

2.- Agarrar la base del recipiente

3.- Invertir el recipiente y situarlo en dirección contraria a la corriente y aguas arriba de la posición del técnico se

sumergirá la botella en el agua unos 15 cm para a continuación dirigir la boca del recipiente haría la superficie

del agua. Se dejará el tiempo suficiente para que se llene y a continuación se sacará del curso de agua.

4.- debe retirarse inmediatamente el exceso de muestra para asegurar que quede espacio para su posterior

mezcla en el laboratorio.

5.- volver a cerrar el recipiente con su tapa cubierta de papel de aluminio. Habrá que cerciorarse de que el

aluminio está lo suficientemente abierto como para evitar el contacto con la parte superior o el interior del

recipiente. Igual que al principio del proceso, deberá evitarse el contacto de la mano con la parte inferior o el

interior del tapón.




DESDE LA ORILLA

Para tomar muestra en un lago, embalse o río desde la orilla. 1.- En primer lugar el recipiente cerrado de toma de muestra deberá fijarse en la pértiga mediante su abrazadera o mecanismo de fijación correspondiente. 2.- Desplazarse hasta una localización desde donde pueda tomarse una muestra representativa con ayuda de la pértiga. 3.- Retirar el tapón y mantenerlo con una mano libre o dejarlo apoyado en una superficie firme tras darle la vuelta de forma que pueda evitarse la contaminación del interior 4.- Situar el recipiente en su pértiga en el punto desde el que se pretende realizar la toma de muestra. 5.- Invertir el recipiente y en un movimiento rápido se sumergirá por su boca en el agua unos 15 centímetros. 6.- Subir el recipiente lentamente hacia la superficie con la boca del recipiente hacia arriba hasta que se llene. Cuando se tomen muestras de un lago, lentamente se moverá el recipiente desde su punto de entrada hasta que se llene por completo. 7.- Asegurar que quede espacio para su posterior mezcla en el laboratorio. 8.- Cerrar el recipiente con su tapa. Cuando la muestra deba tomarse desde una orilla, habrá que prevenir la contaminación de la misma por alteración del fondo o de la orilla del curso de agua. En condiciones normales se empleará una pértiga, aunque también se usa frecuentemente un recipiente sujeto a una cuerda.




La toma de muestra desde una embarcación se realizará siguiendo cualquiera de los métodos anteriores pero desde la embarcación, considerando que el movimiento de la embarcación puede suponer un riesgo para el trabajador si se pone de pie, por lo que la toma debería realizarse desde una posición segura.

Cuando se tome la muestra desde una embarcación deben tomarse precauciones para evitar la

contaminación de la muestra por alteración de depósitos o por descargas de cualquier tipo procedentes del propio bote. Por ello es necesario emplear un barco adecuadamente mantenido, y la tripulación debe estar formada convenientemente.

Cuando se esté tomando la muestra a bordo de una embarcación, deberá hacerse siempre aguas

arriba del sistema de refrigeración del motor para evitar cualquier tipo de contaminación

DESDE UNA EMBARCACIÓN

Realización de la toma de muestras en aguas de baño



1.- En primer lugar se deberá avanzar hacia el interior de la masa de agua unos 75 centímetros.

2.- A continuación deberá avanzarse en el agua hasta que ésta alcance el nivel de la rodilla.

3.- En ese momento se abrirá el recipiente y se insertará en el agua con un ángulo de 45 º (con la boca de la botella hacia abajo).

4.- Se girará la botella hacia arriba unos centímetros por debajo de la superficie hasta que se llene. Una vez llena, se sacará y se desechará el exceso hasta que quede una cámara de aire. A continuación deberá cerrarse el recipiente.

5.- Puede utilizarse una pértiga en el caso de que así sea posible evitar tomar muestras alteradas por levantamiento del sedimento.

6.- Deberán entregarse las muestras al laboratorio en 6 horas desde la toma de muestra .

PLAYAS DE BAÑO

Registro de la toma de muestra



- Cada muestra captada deberá ser codificada individual e inequívocamente de forma que permita una identificación única de la misma. En igual medida, se deberá registrar una mínima información respecto al origen y las condiciones en las que fue tomada la muestra y adjuntar dicho registro al soporte de muestreo. El formato de toma de muestra incluirá aquella información relativa a la localización y toma de muestra

Consideraciones posteriores a la toma de muestra



1. Inactivación de desinfectantes

2. Condiciones para la conservación de las muestras

3. Tiempo entre toma de muestra y análisis

4. Transporte de muestras

1. Muestras generales

2. Muestras sospechosas de contener microorganismos altamente patógenos

5. Custodia de la muestra

6. Recepción de muestras

7. Verificación de la calibración del equipamiento empleado

8. Descontaminación y transporte de equipos

Inactivación de desinfectantes



Interrumpir la acción de oxidantes (cloro, cloramina, bromo u ozono) que pudieran estar presentes en las muestras o en los recipientes de muestras:

Se debe inhibir su acción tan pronto como se tome la muestra. Se añade un agente reductor, tal como el tiosulfato de sodio, a los recipientes de muestra.

Conservación de las muestras durante el transporte



TIEMPO y TEMPERATURA

• Tiempo entre la toma de muestra y el inicio del transporte

• Tiempo de transporte • Comienzo de los análisis en el laboratorio La suma de estos tres períodos está limitada a los períodos máximos de conservación

Transporte de las muestras



1. Muestras generales 2. Muestras sospechosas de contener microorganismos altamente patógenos

En todo caso debe tenerse cuidado en: - no colocar los bloques refrigerantes en contacto directo con la muestra, ya que esto puede provocar su

congelación.

- ajustar el número, volumen y posición de los bloques refrigerantes al número de muestras, su masa y su temperatura inicial.

Se documenta el procedimiento requerido para tiempos de transporte más largos (> 8 h). Se deben transportar de forma separada las muestras frías y calientes. Los recipientes que contienen muestras deben protegerse y sellarse durante el transporte de tal modo que no sufran deterioro o pérdida de ninguna parte de su contenido. El embalaje de los recipientes debe proteger a éstos de posible contaminación externa, en particular cerca de la zona de apertura y no deberían constituir en sí mismos una fuente de contaminación.

Guía sobre la reglamentación relativa al Transporte de sustancias infecciosas 2013–2014” emitida por la Organización Mundial de la Salud-OMS.

Embalaje



Figura 1. Embalaje de material biológico peligroso

a.- Recipiente primario b.- Recipiente secundario c.- Material absorbente d.- Envoltura exterior e.- Material de relleno

Custodia de la muestra



• Etiquetado de la muestra

• Libro de registro de la cadena de vigilancia (hoja de campo)

• Hoja de petición de análisis de la muestra

• Envío de la muestra al Laboratorio

• Recepción y almacenamiento de la muestra

De forma previa a la entrega de la muestra en el laboratorio de microbiología de destino, deberá rellenarse por parte del tomador de la muestra un registro con una información relativa a la identificación de la misma. Una vez en el laboratorio de destino, la parte receptora deberá completar este registro con información relativa al proceso de recepción de la muestra, firmando y sellando este registro, de forma que constituya prueba fehaciente de que la muestra ha sido recibida por su parte .

De acuerdo a su propio pc de gestión de muestras

Descontaminación de equipos tras la toma de muestras



Una vez realizada la toma de muestra, en función de la peligrosidad de los microorganismos susceptibles de haber sido captados (patógenos o inocuos), la descontaminación de los equipos será más o menos intensa. Al igual que en la descontaminación de equipos previa a la toma de muestra, se seguirán las recomendaciones recogidas en el Manual de Bioseguridad de la OMS.

1.- Muestras generales

Desinfección de nivel intermedio

Destruye todas las formas bacterianas vegetativas y la mayoría de virus y hongos, pero no destruye necesariamente las esporas. Se utilizan como Agentes desinfectantes:

▪ Etanol (alcohol etílico, C2H5OH) y 2-propanol (alcohol isopropílico, (CH3)2CHOH): 70% (v/v)) que deberán estar en contacto con la superficie a desinfectar como mínimo durante 15 minutos.

▪ Hipoclorito sódico: diluciones de 5 g/l a 10 g/l de cloro libre (mayor concentración en función de la carga de materia orgánica presente) durante un período de 30 minutos.

2.- Muestras sospechosas de contener microorganismos altamente patógenos

Esterilización

El procedimiento de esterilización posterior a la toma de muestra será el mismo que indicábamos al principio de la presentación.

16:05 h – 16:35 h Toma de muestras de agentes altamente

patógenos en matriz suelo/sedimento:

Metodología

Sonia Aguayo

Investigador-Científico del CNSA (ISCIII)

PROCEDIMIENTO NORMALIZADO DE ENSAYO PARA LA TOMA DE MUESTRAS BIOLÓGICAS EN MATRICES

AMBIENTALES SÓLIDAS

El objeto del presente procedimiento es definir, por un lado, una sistemática para la correcta toma de muestra de microorganismos (inocuos y/o patógenos) en matrices ambientales sólidas, el uso correcto de los equipos implicados en dicha toma, y las condiciones de almacenamiento y transporte hasta el laboratorio

OBJETO



ALCANCE

Este procedimiento se aplica a todas las muestras sólidas procedentes del compartimento ambiental de suelo, y en él se recogen las directrices para una correcta toma de muestras tras la liberación (accidental o intencionada) en una matriz ambiental sólida de algún agente biológico potencialmente patógeno.



ISO 10381-1 Calidad del suelo. Muestreo. Parte 1: Directrices para el diseño de los programas de muestreo.

ISO 10381-2 Calidad del suelo. Muestreo. Parte 2: Directrices sobre técnicas de muestreo.

ISO 10381-3 Calidad del suelo. Muestreo. Parte 3: Directrices para la seguridad.

ISO 10381-4 Calidad del suelo. Muestreo. Parte 4: Guía de procedimiento para la investigación de sitios naturales y cultivos.

ISO 10381-5 Calidad del suelo. Muestreo. Parte 5: Guía para la investigación de suelos contaminados de emplazamientos industriales y

urbanos.

ISO 10381-6 Calidad del suelo. Muestreo. Parte 6: Directrices para la toma de muestra, la manipulación y la conservación de suelos en

condiciones aerobias para la evaluación en el laboratorio de procesos, biomasa y diversidad microbiana.

ISO 11074-2 Calidad del suelo. Vocabulario. Parte 2: Términos y definiciones relativos al muestreo.

ISO 18512 Soil quality – Guidance on long and short term storage of soil samples

D6169/D6169M - 13 Standard Guide for Selection of Soil and Rock Sampling Devices Used With Drill Rigs for Environmental

Investigations

D 6907 – 05 Standard Practice for Sampling Soils and Contaminated Media with Hand-Operated Bucket Augers

X 31-100 Qualité des sols. Échantillonnage. Méthode de prélèvement d´échantillons de sol

FD X31-615 Qualité de sol. Méthodes de détection et de caractérisation des pollutions. Prélèvements et échantillonnage des eaux

souterraines dans un forage

D4220 – 95 Standard Practices for Preserving and Transporting Soil Samples

D6911 – 03 Standard Guide for Packaging and Shipping Environmental Samples for Laboratory Analysis

E2770 - 10 Standard Guide for Operational Guidelines for Initial Response to a Suspected Biothreat Agent

Referencias bibliográficas de consulta



Preparación de equipamiento de toma de muestra

DESCRIPCIÓN

Figura 2 – Dispositivo completo y montado de barrena tipo Auger

Equipamiento de toma de muestra

1. Equipamiento

2. Verificación y calibración de equipos

3. Otros materiales

4. Reactivos

5. Patrones y materiales de referencia



Recipientes para la muestra

para ensayos fisicoquímicos

Las muestras se deben tomar en RECIPIENTES / BOLSAS normalizados y adecuados para evitar que se rompan o se COMPACTE su contenido en el transporte:

Recipientes abiertos de boca ancha con tapa de rosca. Recipientes cerrados, bolsas estériles con cierre tipo zip

Polietileno, polipropileno, poliestireno, etc. en función de:

resistencia a temperaturas extremas, resistencia mecánica, cierre hermético, impermeabilidad al agua y gases, tamaño, forma, disponibilidad, coste, posibilidades de limpieza y de reutilización, esterilización, protección frente a la luz.

Para ensayos microbiológicos

estériles

1 kg

Siempre que sea posible se procederá a tomar cinco réplicas para llevar a cabo cinco determinaciones del parámetro que requiera un mayor tamaño muestral. Adicionalmente, se recomienda almacenar 50 g extra. r




6.1.2 Descontaminación de equipos y recipientes

La descontaminación de los equipos e instrumentos implicados en la toma de muestra garantizará que los microorganismos captados sean exclusivamente aquellos presentes en el ambiente de nuestra matriz de interés. Se deberán seguir las recomendaciones recogidas en el Manual de Bioseguridad en el Laboratorio (2005, OMS) para la esterilización de equipos.

6.1.2.1 Esterilización

Se destruirán todas las formas de microorganismos (bacterias, esporas, hongos, virus y/o parásitos) presentes en un determinado equipo o instrumento. El mecanismo de esterilización a aplicar va a depender del tipo de equipamiento que manejemos, y más concretamente del material con el que esté fabricado.




1. Control de los recipientes de toma de muestra

1. Ensayo de esterilidad

2. Ensayo de toxicidad residual en los recipientes de toma de muestra



Manipulación y transporte de equipos

Mantener la esterilidad e integridad tanto de los recipientes para la toma de muestra como de

los equipos implicados en la misma:

durante el periodo de almacenaje de los equipos, previo a la fase de captación,

durante su manipulación y transporte al punto de toma de muestra,

De existir dudas sobre el cumplimiento de alguna de ellas, por un lado para equipos, se deberá

proceder a revisar el funcionamiento de éstos y una vez comprobado, se deberá proceder

nuevamente a su esterilización, y por otro lado, para material fungible, se deberá desechar y

reemplazar por material nuevo.



Índice

1. Aspectos comunes

2. Toma de muestra de suelos superficiales

3. Toma de muestra de suelos subsuperficiales

4. Toma de muestra de suelos a profundidades moderadas en suelos inestables

5. Toma de muestra de suelos en profundidad



Consideraciones iniciales

• Obtención de muestras representativas de microorganismos en matriz sólida, que pueden ser inocuos y/o

patógenos;

• Se tomarán muestras puntuales.

• Toma de muestra que al ser puntual, se realiza en una localización y momento concretos, por lo tanto la

información que de ellas se extrae debe circunscribirse exclusivamente a dichas situaciones

• Planificación sitios de toma de muestra – planificación atendiendo a la categorización de máxima alerta

sanitaria de la situación y de emergencia, alta patogeneicidad de los microorganismos:

Punto para la toma de muestra los puntos para la toma de muestra deberán encontrarse lo más próximos

posibles a los presuntos focos de liberación que se sospechen, si es que los hay. De esta forma la toma de

muestra será efectiva, gracias a lo cual podrán tomarse las medidas oportunas. En caso de que no existiera

ningún tipo de información, se seguirá el procedimiento habitual para elegir el punto de toma de muestra.

• Aplicar las medidas de correcta seguridad utilización de los EPI apropiados y demás disposiciones conforme a la

legislación competente (Directiva 2000/54/CE - Real Decreto 664/1997 )



Puntos o sitios para la toma de muestra



Realización de la toma de muestras

El proceso consta de dos etapas separadas:

a) Ganancia de acceso al punto de toma de muestra.

b) Toma de muestra de suelo.

1. Toma de muestra de suelos superficiales

2. Toma de muestra de suelos subsuperficiales

3. Toma de muestra de suelos a profundidades moderadas en suelos inestables

4. Toma de muestra de suelos en profundidad



Tipos de Muestra

a) Muestras simples

b) Muestras compuestas

c) Muestras alteradas: muestras obtenidas del suelo sin ningún intento de preservar la estructura;

es decir que las partículas del suelo se recogen “sueltas” y se permite que se muevan unas

respecto a otras.

d) Muestras sin alterar: muestras obtenidas del suelo utilizando un método pensado para preservar

la estructura del suelo; es decir se emplea un equipo de muestreo especial de tal forma que las

partículas de suelo y los huecos no puedan cambiar respecto a la distribución que existe en el

suelo antes del muestreo.



Aspectos comunes para la realización de la toma de muestras

Para proceder con la toma de muestra, se recomienda:

• Eliminar toda vegetación superficial, capa de residuos recubiertos musgo, raíces visibles, trozos grandes de plantas o residuos leñosos y cualquier fauna del suelo, para minimizar la adición de carbono orgánico fresco al suelo en un radio de aproximadamente 15 cm en el punto de toma de muestra.

• Comenzar a barrenar rotando el agarrador en “T” mientras se presiona el Auger contra el suelo.

Se pueden desechar los primeros centímetros (depositándolos en una bolsa dispuesta a tal efecto, nunca sobre el suelo para evitar problemas de contaminación).

Siempre que sea posible se procederá a tomar cinco réplicas para llevar a cabo cinco determinaciones del parámetro que requiera un mayor tamaño muestral. Adicionalmente, se recomienda almacenar 50 g extra.



Realización de la toma de muestras

Fuente: http://www.labsuelos.com/muestreo.html

Muestra representativa Puntual o compuesta Los puntos de toma deben poseer unas características representativas, teniendo en cuenta también las variaciones temporales (verticales u horizontales).



Realización de la toma de muestras de suelo superficiales

Si es la interfase superficial del suelo la que debe ser muestreada, se llevará el Auger a la profundidad deseada y una vez se haya tomado la muestra se depositarán los cortes realizados en el contenedor adecuado para su posterior procesamiento.

Este tipo de muestra también puede tomarse con ayuda de una pala.



Realización de la toma de muestras de suelo subsuperficiales

1.- Introducir el Auger hasta la parte superior del intervalo de profundidad deseada y retirar cuidadosamente ese cabezal

2.- Introducir un cabezal limpio y rotarlo para tomar la muestra

3.- Retirar con mucha precaución para evitar contaminación de la muestra con material de las paredes del orificio realizado

4.- Introducir con cuidado la muestra en el recipiente escogido

Para tomar muestras inalteradas, se empleará una barrena Auger plana para limpiar y nivelar la base del orificio

1.- una vez alisada la base, se colocará una barrena Auger tipo Core que será introducida sin tocar las paredes hasta la base del orificio, forzando gradualmente hasta que se complete la toma de muestra

2.- se extrae el dispositivo, se extruye la muestra y se descartan hasta que hayamos alcanzado la profundidad deseada.

Para tomar muestras compuestas, se tomarán tantas muestras como submuestras deban componer la muestra compuesta. A las profundidades deseadas.



Toma de muestra de suelos a profundidades moderadas en suelos inestables

Para la obtención de muestras a profundidades moderadas en suelos inestables, se recomienda reforzar las paredes del orificio con una carcasa. De este modo evitaremos que este colapse antes de continuar tomando muestra. El diámetro interior de la carcasa tendrá que ser ligeramente superior al del cabezal Auger.



Toma de muestra de suelos a profundidad

1.- Sondeos

1.1.- Perforación por percusión con cable. Esta técnica suele emplearse para estudios geotécnicos, pudiéndose llevar a cabo sondeos profundos superiores a 20 m de profundidad.

1.2.- Perforación por rotación. Esta técnica es particularmente útil para la toma de muestras utilizando sólo técnicas apropiadas a mayor profundidad.

1.3.- Barrena mecánica

2.- Sondas y dispositivos de muestreo controlados

Se realizan orificios de sondeo para la toma de muestras. Estas comprenden un tubo hueco con o sin un cono director, o una barra sólida que se introduce en el suelo, utilizando energía hidráulica o fuerza mecánica. Estos sistemas pueden usarse para recoger muestras a diferentes profundidades, para penetrar rápidamente hasta la profundidad donde ha de tomarse la muestra o para conseguir un cilindro continuo.

Pueden utilizarse sondas y muestreadores de ventana, muestreadores continuos o sondas controladas.

3.- Excavaciones (pozos de ensayo)

Esta es una técnica ampliamente utilizada para la recogida de muestras en emplazamientos donde se realizan estudios relacionados con la contaminación. Las ventajas de este método son, su aplicabilidad bajo un amplio rango de condiciones del suelo, la oportunidad de realizar una observación próxima de los estratos y la velocidad con la que puede realizarse el trabajo.



Registro de la toma de muestra

- Cada muestra captada deberá ser codificada individual e inequívocamente de forma que permita una identificación única de la misma. En igual medida, se deberá registrar una mínima información respecto al origen y las condiciones en las que fue tomada la muestra y adjuntar dicho registro al soporte de muestreo. El formato de toma de muestra incluirá aquella información relativa a la localización y toma de muestra



Consideraciones posteriores a la toma de muestra

1. Condiciones para la conservación de las muestras

2. Tiempo entre toma de muestra y análisis

3. Transporte de muestras

1. Muestras generales

2. Muestras sospechosas de contener microorganismos altamente patógenos

4. Custodia de la muestra

5. Recepción de muestras

6. Descontaminación y transporte de equipos



Conservación de las muestras durante el transporte

TIEMPO + TEMPERATURA + OSCURIDAD

• Tiempo entre la toma de muestra y el inicio del transporte

• Tiempo de transporte • Comienzo de los análisis en el

laboratorio La suma de estos tres períodos está limitada a los períodos máximos de conservación

• El suelo debería permanecer tan frío como sea posible pero sin que se produzca la congelación, la desecación o el encharcamiento

• Las muestras para análisis de DNA o ARN deben congelarse rápidamente en campo mediante hielo seco y durante su transporte hasta el laboratorio

• Evitar la exposición a la luz durante periodos prolongados.

• Evitar la compactación física



Transporte de las muestras

1. Muestras generales 2. Muestras sospechosas de contener microorganismos altamente patógenos

En todo caso debe tenerse cuidado en: - no colocar los bloques refrigerantes en contacto directo con la muestra, ya que esto puede provocar su

congelación.

- ajustar el número, volumen y posición de los bloques refrigerantes al número de muestras, su masa y su temperatura inicial.

Se documenta el procedimiento requerido para tiempos de transporte más largos (> 8 h). Se deben transportar de forma separada las muestras frías y calientes. Los recipientes que contienen muestras deben protegerse y sellarse durante el transporte de tal modo que no sufran deterioro o pérdida de ninguna parte de su contenido. El embalaje de los recipientes debe proteger a éstos de posible contaminación externa, en particular cerca de la zona de apertura y no deberían constituir en sí mismos una fuente de contaminación.

Guía sobre la reglamentación relativa al Transporte de sustancias infecciosas 2013–2014” emitida por la Organización Mundial de la Salud-OMS.



Embalaje

Figura 1. Embalaje de material biológico peligroso

a.- Recipiente primario b.- Recipiente secundario c.- Material absorbente d.- Envoltura exterior e.- Material de relleno



Custodia de la muestra

• Etiquetado de la muestra

• Libro de registro de la cadena de vigilancia (hoja de campo)

• Hoja de petición de análisis de la muestra

• Envío de la muestra al Laboratorio

• Recepción y almacenamiento de la muestra





Recepción de la muestra





Descontaminación de equipos tras la toma de muestras

Una vez realizada la toma de muestra, en función de la peligrosidad de los microorganismos susceptibles de haber sido captados (patógenos o inocuos), la descontaminación de los equipos será más o menos intensa. Al igual que en la descontaminación de equipos previa a la toma de muestra, se seguirán las recomendaciones recogidas en el Manual de Bioseguridad de la OMS.

1.- Muestras generales

Desinfección de nivel intermedio

Destruye todas las formas bacterianas vegetativas y la mayoría de virus y hongos, pero no destruye necesariamente las esporas. Se utilizan como Agentes desinfectantes:

▪ Etanol (alcohol etílico, C2H5OH) y 2-propanol (alcohol isopropílico, (CH3)2CHOH): 70% (v/v)) que deberán estar en contacto con la superficie a desinfectar como mínimo durante 15 minutos.

▪ Hipoclorito sódico: diluciones de 5 g/l a 10 g/l de cloro libre (mayor concentración en función de la carga de materia orgánica presente) durante un período de 30 minutos.

2.- Muestras sospechosas de contener microorganismos altamente patógenos

Esterilización

El procedimiento de esterilización posterior a la toma de muestra será el mismo que indicábamos al principio de la presentación.



16:35 h – 16:50 h Ejercicios prácticos en el ámbito del proyecto

IB-BIOALERNET

Francisco Javier Sánchez (ISCIII)



Proyecto cofinanciado por el Programa de Prevención y Lucha contra la Delincuencia (ISEC) de la Unión Europea (Dirección General de Asuntos de Interior) - Gran Agreement No. HOME/2012/ISEC/AG/CBRN/4000003810

http://ib-bioalertnet.isciii.es/

Ejercicios prácticos en el ámbito del proyecto IB-BIOALERTNET

JORNADA “TOMA DE MUESTRAS EN EPISODIOS DE ALERTA BIOLÓGICA”

06 de julio de 2015

Escuela Nacional de Sanidad (ENS)

Dr. Fco. Javier Sánchez Íñigo [email protected]

Proyecto cofinanciado por el Programa de Prevención y Lucha contra la Delincuencia (ISEC) de la Unión Europea (Dirección General de Asuntos de Interior) - Gran Agreement No. HOME/2012/ISEC/AG/CBRN/4000003810

http://ib-bioalertnet.isciii.es/

1. INTRODUCCIÓN

1.1 IB-BIOALERTNET / C.N.S.A.

1.2 UNIDAD DE EMERGENCIAS (UEM) DEL C.N.S.A.

2. EJERCICIOS PRÁCTICOS 2.1 Objetivo

2.2 Ensayos de campo

2.3 Participación en ejercicio “Luñol 2014”

3. CONCLUSIONES

ESQUEMA


1. INTRODUCCIÓN 1.1 IB-BIOALERTNET / C.N.S.A.


ACTIVIDADES DEL CNSA EN IB-BIOALERTNET 1. Desarrollo de procedimientos para la toma de muestras en matriz atmosférica, acuática y sólida (suelo y sedimento)

- Unificación de metodología

- Elaboración de protocolos

2. Implantación de Sistema de Gestión de Calidad

- Elaboración de Plan de Calidad (PLAN DE CALIDAD PARA LA TOMA DE MUESTRAS AMBIENTALES POTENCIALMENTE PATÓGENAS)

- Elaboración de Procedimientos Normalizados Trabajo (PNUs utilización equipos…)

- Ensayos de campo

3. Workshop

1. INTRODUCCIÓN 1.2 UNIDAD DE EMERGENCIAS – UEM / C.N.S.A.


1. Creación y objetivo UNIDAD DE EMERGENCIAS - UEM

2012. Aportar apoyo científico-técnico a las Administraciones Públicas en situaciones de emergencia ambiental que pueda tener consecuencias sobre la salud de la población.

3. Modus operandi

Desplazamiento de un amplio equipo de profesionales junto a dos unidades móviles y un vehículo de apoyo, para tomar muestras en diferentes matrices ambientales y/o realizar del análisis “in situ” de aquellos parámetros involucrados en el episodio.

2. Experiencia

Participación directa en los ejercicios: Palazuelos (Segovia), Luñol (Valencia) y Daimiel (Ciudad Real) organizados por la UME y en Curiex (Cáceres) organizado por Protección Civil

2. EJERCICIOS PRÁCTICOS


2. EJERCICIOS PRÁCTICOS

2. EJERCICIOS PRÁCTICOS 2.1 Objetivo


1.- CUMPLIMENTACIÓN DE FORMATOS REGISTROS

2.- PUESTA A PUNTO DE LOS EQUIPOS: PUESTA EN MARCHA Y FUNCIONAMIENTO

3.- PUESTA A PUNTO DE LAS DISTINTAS TÉCNICAS DE TOMA DE MUESTRA POR MATRIZ

4.- MONTAJE DE LOS DISTINTOS SOPORTES DE TOMA DE MUESTRA

5.- VERIFICACIÓN DE LA OPERATIVIDAD DE LOS PROCEDIMIENTOS MEDIANTE SU PUESTA EN PRÁCTICA

2. EJERCICIOS PRÁCTICOS 2.2 Ensayos de campo


2. EJERCICIOS PRÁCTICOS 2.3 “Luñol 2014”


LUÑOL 2014 Ubicación: Buñol (Valencia)

Fecha: 31 de marzo a 3 de abril 2014

Contexto: Simulacro sísmico de gran magnitud

Impacto: Daños en dos plantas químicas (pesticidas y fertilizantes)

- La UEM del CNSA simula la toma de muestras para identificación de agentes biológicos en las

matrices ambientales agua y suelo.



Establecer los recursos, secuencia de operaciones, personal y técnicas operativas respecto a la toma de muestra de agentes biológicos



Incidencia 411: Accidente Transporte

mercancías peligrosas

- Vertido de gasóleo al río “Luñol”

Incidencia 441: Vertido de industrias

cárnicas

- Rotura en depósito de desperdicios cárnicos

Toma de muestra de agua

Toma de muestras de agua y sedimento

Toma de muestras de agua y sedimento



Incidencia 422: Explosión en empresa de plaguicidas

- Liberación de 2000 l de malation al 90%

Incidencia 431: Empresa petroquímica

- Explosión de tanque de combustible

Toma de muestra de suelo

Toma de muestras de suelo

Toma de muestras de suelo y sedimento



Toma de muestra de bacterias / virus

Incidencias 403 y 404: Fuga de amoníaco anhidro

licuado en un tanque de 30000 l

- Nube tóxica de amoníaco

Toma de muestra de bioaerosoles

SE VERIFICÓ LA OPERATIVIDAD DE LOS PROCEDIMIENTOS DE TOMA DE MUESTRA, Y FUE ADECUADA

- Se sugiere la realización de más ejercicios “in situ”. - Posibilidad de trasladar estos procedimientos a los Cuerpos y Fuerzas de Seguridad del Estado así como a las Fuerzas Armadas para que organismos ajenos verifiquen su aplicabilidad.

3. CONCLUSIONES



A USTEDES POR SU ATENCIÓN…

… y a todo el personal del CNSA involucrado en las actividades

realizadas por la UEM.

15:35 h patógenos en matriz agua: Metodología Sonia … · • UNE-EN ISO 5667-5:2006 Water...

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