8/6/2019 187.pdf,Bi bao moi.Ha

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V o l . 4 2 , N o . 2P P L I E D AND ENVIRONMENTAL M I C R O B I O L O G Y , A u g . 1 9 8 1 , p . 1 8 7 - 1 9 10 0 9 9 - 2 2 4 0 / 8 1 / 0 8 0 1 8 7 - 0 5 $ 0 2 . 0 0 / 0

R e g i o - S e l e c t i v e 1 0 - H y d r o x y l a t i o n o f P a t c h o u l o l , aS e s q u i t e r p e n e , b y P i t h o m y c e s S p e c i e sYASUJI S UHA R A , S A YU R I ITOH, MAYUMI OGAWA, KAZUTERU YOK O SE, T O Y O A K I S AWADA,T A K A S H I SANO, R I E K O N I N O M I Y A , AND H I R O M I B . MARUYAMA*

D e p a r t m e n t o f M i c r o b i o l o g y and C h e m o t h e r a p y , N i p p o n Roche R e s e a r c h C e n t e r , K a j i w a r a , Kamakura-247,J a p a nR e c e i v e d 1 6 O c t o b e r 1 9 8 0 / A c c e p t e d 1 M a y 1 9 8 1

O f some 3 5 0 m i c r o o r g a n i s m s s c r e e n e d , f o u r s t r a i n s o f P i t h o m y c e s s p e c i e s weref o u n d t o c a r ry o u t r e g i o - s e l e c t i v e h y d r o x y l a t i o n o f p a t c h o u l o l , a s e s q u i t e r p e n e , t o1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l : P i t h o m y c e s sp. N R J 2 0 1 , P . c h a r t a r u m N R J 2 1 0 , a n d , t o al e s s e r e x t e n t , P . c y n o d o n t i s A T C C 2 6 1 5 0 a n d P . a t r o - o l i v a c e u s IFO 6 6 5 1 weref o u n d t o c a t a l y z e t h i s r e a c t i o n . A m e t h o d h a s b e e n d e v e l o p e d b y which 1 0 -h y d r o x y p a t c h o u l o l was o b t a i n e d i n 2 5 t o 45% y i e l d s i n 1 - t o 5 - l i t e r f e r m e n t a t i o nj a r s a t 2 t o 4 g o f p a t c h o u l o l p e r l i t e r a n d i s o l a t e d a s pure m a t e r i a l i n 30% y i e l d s .

R e g i o - o r e n a n t i o s e l e c t i v e r e a c t i o n s h a v e b e e no f c o n s i d e r a b l e i m p o r t a n c e i n o r g a n i c s y n t h e s e s .M i c r o b e s a r e w e l l k n o w n t o c a r r y o u t s u c h r e -a c t i o n s , a s i l l u s t r a t e d b y t h e o x i d a t i o n o f v a r i o u ss t e r o i d s , some o f w h i c h a r e p r o d u c e d b y m i -c r o b e s o n a n i n d u s t r i a l s c a l e ( 2 , 1 0 ) . I n c o n t r a s t ,o n l y a f e w r e p o r t s h a v e b e e n p u b l i s h e d o n t h em i c r o b i a l r e g i o - s e l e c t i v e r e a c t i o n s o f t e r p e n e s( 8 ) . A r e c e n t e x a m p l e d e s c r i b e s t h e s e l e c t i v eh y d r o x y l a t i o n o f p a t c h o u l o l [ F i g . 1 , I ; 3 , 4 , 4 a f l ,5 , 6 f l , 7 , 8 , 8 a - o c t a h y d r o - 4 a , 8 a l ? , 9 , 9 - t e t r a -m e t h y l - 1 , 6 - m e t h a n o n a p h t h a l e n - 1 , 8 ( 2 H ) - o l ] , as e s q u i t e r p e n e i s o l a t e d f r o m p a t c h o u l i o i l ( e s s e n -t i a l o i l f r a g r a n c e f r o m P o g o s t e m o n c a b l i nB e n t h . ) a t C - 1 0 b y r a b b i t s a n d d o g s a s r e p o r t e db y Luu e t a l . ( 9 ) . We h a v e s c r e e n e d s o i l m i c r o -o r g a n i s m s c a p a b l e o f s u c h a r e g i o - s p e c i f i c t r a n s -f o r m a t i o n a n d f o u n d t h a t a f e w P i t h o m y c e ss t r a i n s c o n v e r t e d t h i s s u b s t r a t e t o 1 0 - h y d r o x y -p a t c h o u l o l ( F i g . 1 , I I ) i n a h i g h y i e l d . O t h e rf u n g i , i n c l u d i n g P e n i c i l l i u m , P a e c i l o m y c e s , a n dPh o ma s t r a i n s , a l s o c a r r y o u t t h i s r e a c t i o n a sr e p o r t e d e l s e w h e r e ( A . F u j i w a r a , M . T a z o e , Y .S h i o m i , a n d M. F u j i w a r a , A b s t r . V I t h I n t . F e r m .S y m p . , 1 9 8 0 , F - 2 0 . 9 , p . 1 7 6 ) . T h i s r e a c t i o n mayp r o v i d e a n e c o n o m i c p r o d u c t i o n o f n o r p a t c h o u -l e n o l ( 9 ; F i g . 1 , I V ) , a n e x p e n s i v e f r a g r a n c e ( 1 2 ) .T h i s p a p e r d e s c r i b e s t h i s h y d r o x y l a t i o n p r o c e s sb y a f e w s t r a i n s o f P i t h o m y c e s .( P o r t i o n s o f t h i s w o r k w e r e p r e s e n t e d a t t h e1 0 t h a n n u a l m e e t i n g o f t h e P h a r m a c e u t i c a l S o -c i e t y o f J a p a n [ A b s t r . A n n u . M e e t . P h a r m . S o c .J p n . 1 0 0 t h , T o k y o , J a p a n , p . 2 7 2 , 1 9 8 0 ] . )

M A T E R I A L S A N D M E T H O D SM i c r o o r g a n i s m s u s e d . P i t h o m y c e s s a c c h a r iATCC 2 4 3 2 3 , P . c y n o d o n t i s ATCC 2 6 1 5 0 , P . c h a r -t a r u m ATCC 2 2 6 3 7 , a n d P . a t r o - o l i v a c e u s I F O 6 6 5 1

w e r e u s e d . I n a d d i t i o n , t w o s t r a i n s o f t h i s g e n u s ( P i -t h o m y c e s s p . N R J 2 0 1 - p - 2 f [ N R J 2 0 1 ] a n d P . c h a r -t a r u m N R J 2 1 0 - p - l f [ N R J 2 1 0 ] ) , s e l e c t e d f r o m 3 1 3 c u l -t u r e s , w e r e i s o l a t e d f r o m s o i l s a m p l e s c o l l e c t e d i nA i c h i a n d N a g a n o P r e f e c t u r e s , J a p a n , b y t h e e n r i c h -m e n t t e c h n i q u e w i t h 0 . 0 1 g o f p a t c h o u l o l p e r m l a s t h es o l e c a r b o n s o u r c e a n d g a v e 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l i nm o r e t h a n 2 0 % y i e l d . O n l y t r a c e s o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h -o u l o l w e r e p r o d u c e d b y 1 0 5 o t h e r f u n g a l i s o l a t e s . N o n eo f t h e b a c t e r i a l s t r a i n s c a r r i e d o u t t h e r e a c t i o n . C u l -t u r e s w e r e m a i n t a i n e d o n a n a g a r s l a n t c o n t a i n i n gmedium G ( s e e b e l o w ) a t room t e m p e r a t u r e , t r a n s -f e r r e d m o n t h l y o r l y o p h i l i z e d i n 1 0 % s k i m m e d m i l k .S t o r a g e a t - 2 0 o r - 1 9 6 C c a u s e d a l o s s o f t h e t r a n s -f o r m i n g a c t i v i t y , b u t t h e c e l l v i a b i l i t y k e p t w e l l .C u l t u r e c o n d i t i o n s and m e d i a f o r p a t c h o u l o lt r a n s f o r m a t i o n . Med i um F c o n t a i n e d 5% g l u c o s e ,0 . 0 5 % N a N O 3 , 1 . 0 % p o l y p e p t o n e , a n d t r a c e m e t a l s .Medium G c o n s i s t e d o f 1 % g l u c o s e , 1 % c o m s t e e pl i q u o r , a n d 0 . 1 % p e p t o n e ; medium Ro 4 2 2 , w h i c h w a su s e d f o r s c r e e n i n g , c o n t a i n e d 5 . 0 % g l u c o s e , 0 . 1 2 5 % c o r ns t e e p l i q u o r , 0 . 2 % N a N O 3 , 0 . 0 5 % M g S O 4 . 7 H 2 O , 0 . 1 %K 2 H P O 4 , 0 . 0 5 % K C I , a n d F e S O 4 . 7 H 2 0 . A 1 0 0 - m l p o r -t i o n o f t h e m e d i u m i n a 5 0 0 - m l E r l e n m e y e r f l a s k w i t hb a f f l e s w a s i n o c u l a t e d w i t h t h e s p o r e s o r w i t h 5 m l o fa 2 4 - t o 7 2 - h s e e d c u l t u r e . A f t e r 1 t o 5 d a y s o f i n c u -b a t i o n ( 2 7 0 C , 1 8 0 s t r o k e s p e r m i n ) , 2 0 0 t o 8 0 0 m g o fp a t c h o u l o l ( s u s p e n d e d i n 1 0 m l o f 2 0 % Tween 8 0 ) w a sa d d e d t o e a c h f l a s k . The i n c u b a t i o n was c o n t i n u e d f o ra n a d d i t i o n a l 1 6 8 h , a n d a s a m p l e w as a s s a y e d b y g a sc h r o m a t o g r a p h y . S c a l e - u p f e r m e n t a t i o n s were c a r r i e do u t i n 1 - a n d 5 - l i t e r j a r f e r m e n t o r s ( c y l i n d e r - p r o p e l l e rs t i r r i n g t y p e , M J - 5 - 6 ; M a r u b i s h i R i k a ) u n d e r t h e c o n -d i t i o n s f o u n d o p t i m a l i n t h e s h a k e n f l a s k s .A s s a y f o r p a t c h o u l o l and 1 0 - h y d r o x y p a t c h -o u l o l . The a n a l y s i s was c a r r i e d o u t b y g a s c h r o m a t o -g r a p h i c m e t h o d s w i t h S h i m a z u G C - 4 C M ( P F ) . A sam -p l e ( 1 . 5 m l ) o f t h e b r o t h was d i l u t e d w i t h 4 . 0 m l o fw a t e r , e x t r a c t e d w i t h 4 . 0 m l o f e t h y l a c e t a t e c o n t a i n i n g0 . 4 0 m g o f m e t h y l s t e a r a t e p e r m l a s t h e i n t e r n a l s t a n -d a r d , a n d c e n t r i f u g e d . The e x t r a c t ( 4 p i ) w a s a s s a y e do n a c o l u m n ( 2 m b y 3 - m m i n n e r d i a m e t e r ) p a c k e d

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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

HO HO@ 0 2 , P t O 2 HO+4 P b ( O A c ) 4HO Pithomyces s p . ii' H 2 0 H I C O O H

PATCHOULOL 10-HYDROXY NOR--PATCHOULOL PATCHOULENOLF I G . 1 . O v e r a l l p r o c e s s f o r n o r p a t c h o u l e n o l ( I V ) p r o d u c t i o n f r o m p a t c h o u l o l ( I ) .

w i t h 5% S E - 3 0 o n C h r o m o s o r b W ( D M C S ) ( c a r r i e r ,h e l i u m a t 3 0 m l / m i n ; i n j e c t i o n a n d d e t e c t o r t e m p e r a -t u r e , 2 6 0 0 C ; t e m p e r a t u r e a t c o l u m n , 2 3 0 0 C ; d e t e c t i o n ,F I D ) . R e t e n t i o n t i m e s o f p a t c h o u l o l , 1 0 - h y d r o x y -p a t c h o u l o l , a n d t h e i n t e r n a l s t a n d a r d s w e r e 2 . 3 , 4 . 4a n d 6 . 0 m i n , r e s p e c t i v e l y . T h e p e a k - h e i g h t r a t i o w a sc o n v e r t e d t o t h e c o n c e n t r a t i o n v a l u e b y r e f e r e n c e t ot h e c a l i b r a t i o n c u r v e s ( r a n g e : 0 . 0 1 t o 0 . 7 m g / m l f o rp a t c h o u l o l , 0 . 0 2 t o 1 . 5 m g / m l f o r 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u -l o l ) .M e r c k F 2 5 4 s i l i c a g e l p l a t e s w e r e u s e d f o r q u a l i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n s ( b e n z e n e - a c e t o n e , 5 : 2 ) a n d v i s u a l i z e db y a n i s a l d e h y d e - s u l f u r i c a c i d ( R f v a l u e s o f p a t c h o u l o la n d 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l w e r e 0 . 6 3 a n d 0 . 3 4 , r e s p e c -t i v e l y ) .C h e m i c a l s . P a t c h o u l o l a n d 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o lw e r e p r o v i d e d b y M . M o n t a v o n , F . H o f f m a n n - L aR o c h e A G , B a s e l , S w i t z e r l a n d .R E S U L T S

B i o t r a n s f o r m a t i o n o f p a t c h o u l o l b y P i -t h o m y c e s s p e c i e s . When p a t c h o u l o l ( F i g . 1 , I )( 1 , 3 , 1 1 ) w a s a d d e d t o t h e 7 2 -h s u s p e n s i o n s o fs i x P i t h o m y c e s s t r a i n s ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 2 . 0a n d 5 . 6 g / l i t e r ) a n d i n c u b a t e d f o r a n a d d i t i o n a l5 t o 7 d a y s , i t w a s c o n v e r t e d t o 1 0 - h y d r o x y p a t c h -o u l o l a n d t o m i n o r p r o d u c t s ( T a b l e 1 ) .T h e s o i l i s o l a t e , P . c h a r t a r u m N R J 2 1 0 , g a v ea y i e l d o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l o f u p t o 2 0 % .A TCC 2 2 6 3 7 o f t h e same s p e c i e s p r o d u c e d n od e t e c t a b l e amount o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l b u tc o n v e r t e d m o r e t h a n 5 0 % o f p a t c h o u l o l t o o t h e rm o n o - a n d d i h y d r o x y l a t e d p r o d u c t s ( b y t h i n -l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ) , t h e s t r u c t u r e s o f w h i c ha r e u n d e r i n v e s t i g a t i o n . S i m i l a r p r o d u c t s c o n -s i s t i n g o f t h r e e t o s i x d i s t i n c t d e r i v a t i v e s o fp a t c h o u l o l w e r e d e t e c t e d i n t h e b r o t h s o f P .s a c c h a r i a n d P . c y n o d o n t i s .C h a r a c t e r i s t i c s o f t h e h y d r o x y l a t i o n . 1 0 -H y d r o x y l a t i o n o f p a t c h o u l o l b y t h e t w o m o s te f f i c i e n t s t r a i n s ( P i t h o m y c e s s p . NRJ201 a n d P .c h a r t a r u m N R J 2 1 0 ) w a s f u r t h e r s t u d i e d i n f l a s kf e r m e n t a t i o n s c o n t a i n i n g medium G o r F ( 2 t o8 g o f p a t c h o u l o l p e r l i t e r a d d e d t o 4 - d a y - o l dm y c e l i u m ) . F i g u r e 2 s h o w s t h e t i m e c o u r s e o ft h e h y d r o x y l a t i o n a t v a r i o u s s u b s t r a t e c o n c e n -t r a t i o n s . P i t h o m y c e s s p . NRJ201 g a v e t h e h i g h -e s t y i e l d ( 4 0 t o 4 5 % ) a t 2 g / l i t e r o f p a t c h o u l o l ,b u t t h e y i e l d d e c r e a s e d i n v e r s e l y w i t h t h e i n -c r e a s i n g s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n . P . c h a r t a r u mNRJ210 y i e l d e d a s much a s 2 5 % o f 1 0 - h y d r o x y -p a t c h o u l o l w i t h i n t h e r a n g e o f 2 t o 6 g o f s u b -

TABLE 1 . H y d r o x y l a t i o n o f p a t c h o u l o l w i t hP i t h o m y c e s s t r a i n sS u b - % l 0 - H y d r o x y - O t h e rp a t c h o u l o l p r o -S t r a i n d u c e d a t :concn p r o d -( m g / m l ) 7 2 - 9 6 h 1 6 8 h U C t a

P i t h o m y c e s a t r o - o l i v a - 2 0 6 c e u s I F O 6 6 5 1P i t h o m y c e s s a c c h a r i 2 0 0 +A T CC 2 4 3 2 3P i t h o m y c e s c y n o d o n t i s 2 3 1 9 +ATCC 2 6 1 5 0P i t h o m y c e s s p . N R J 2 0 1 2 1 5 4 0 +P i t h o m y c e s c h a r t a r u m 2 0 0 A T CC 2 2 6 3 7P i t h o m y c e s c h a r t a r u m 5 . 6 1 7 2 0 +N R J 2 1 0s t r a t e p e r l i t e r ( F i g . 2 b ) . A t 2 g / l i t e r , P . c h a r -t a r u m NRJ210 d e g r a d e d t h e f o r m e d 1 0 - h y d r o x -y p a t c h o u l o l u p o n a n e x t e n d e d i n c u b a t i o n ( 7d a y s ) , w h e r e a s P i t h o m y c e s s p . NRJ201 d i d n o t .I n r e p e a t e d t r i a l s , t h e d e v i a t i o n r a n g e o f t h ey i e l d i n 3 t o 5 d a y s o f f e r m e n t a t i o n b y t h e s t r a i nN R J 2 0 1 w a s 4 0 t o 5 0 % ( 2 0 0 mg o f p a t c h o u l o l /1 0 0 m l , 1 8 0 s t r o k e s p e r m i n , 1 0 0 m l o f mediumF p e r 5 0 0 - m l b a f f l e d f l a s k ) . T h e r e p r o d u c i b l e g a sc h r o m a t o g r a p h y p a t t e r n o f t h e p r o d u c t s i ss h o w n i n F i g . 3 .F i g u r e 4 s h o w s t h e e f f e c t o f t i m i n g o f t h ep a t c h o u l o l a d d i t i o n o n t h e y i e l d o f 1 0 - h y d r o x y -p a t c h o u l o l . Due t o a w e a k a n t i f u n g a l a c t i v i t y o fp a t c h o u l o l a g a i n s t P i t h o m y c e s s t r a i n s , t h e a d -d i t i o n o f p a t c h o u l o l a t 0 h r e s u l t e d i n o n l y af a i n t g r o w t h a n d h e n c e n o p r o d u c t i o n o f 1 0 -h y d r o x y p a t c h o u l o l . F u l l g r o w t h w a s n e e d e d b e -f o r e t h e p a t c h o u l o l a d d i t i o n f o r r a p i d p r o d u c t i o no f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l , a l t h o u g h t h e f i n a ly i e l d w i t h NRJ201 w a s n o t s o much a f f e c t e d b yt h e t i m i n g o f t h e p a t c h o u l o l a d d i t i o n . T h u s , i nt h e c a s e o f 5 % s e e d i n o c u l a t i o n , t h e a d d i t i o na f t e r 2 t o 3 d a y s p r e c u l t u r e g a v e t h e b e s t p r o -d u c t i o n o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l i n t h e f e r m e n -t a t i o n p e r i o d o f 4 t o 5 d a y s .The m a x i m a l p r o d u c t i o n w a s a l s o i n f l u e n c e db y t h e medium c o m p o s i t i o n , e s p e c i a l l y b y g l u -c o s e c o n c e n t r a t i o n . When t h e g l u c o s e c o n c e n t r a -t i o n i n medium G w a s r e d u c e d f r o m 5 t o 1 % , t h ei n i t i a t i o n o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l p r o d u c t i o nw a s s h o r t e n e d t o 3 d a y s , w h e r e a s 1 0 - h y d r o x y -p a t c h o u l o l , o n c e p r o d u c e d , t e n d e d t o d e c r e a s emore r a p i d l y a f t e r r e a c h i n g t h e maximum.

1 8 8 S U H A R A E T A L .

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M IC R O B I A L H Y D R O X Y L A T I O N O F A S E S Q U I T E R P E N E 1 8 9

5 6 7 8 3D AY S A F T E R S U B S T R A T E A DD I T I O N

F I G . 2 . T i m e c o u r s e o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l p r o d u c t i o n f r o m p a t c h o u l o l b y P i t h o m y c e s s p . NRJ201 ( a )and P . c h a r t a r u m NRJ210 ( b ) . Medium F w a s u s e d a s s u b s t r a t e a t c o n c e n t r a t i o n s o f 2 g l l i t e r ( - ) , 4 g l l i t e r( 0 ) , 6 g l l i t e r ( * ) , a n d 8 g l l i t e r ( A ) .

O 2 4 6 8RETENTION TIME (MIN.)F I G . 3 . Ga s c h r o m a t o g r a p h y assay f o r b r o t h c o n -t a i n i n g b o t h 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l a n d p a t c h o u l o l .S e e t e x t f o r d e t a i l s .

I s o l a t i o n o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l . T o i s o -l a t e 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l , 5 m l o f a s e e d c u l t u r eo f P i t h o m y c e s s p . NRJ201 w a s i n o c u l a t e d i n5 0 0 - m l f l a s k s c o n t a i n i n g 1 0 0 m l o f medium G ,i n c u b a t e d f o r 4 8 h ( a t w h i c h t i m e 2 0 0 m g o fp a t c h o u l o l i n 1 0 m l o f s a l i n e c o n t a i n i n g 2 0 %Tween 8 0 w a s a d d e d t o e a c h o f 1 0 0 f l a s k s ) , a n dt h e c o n v e r s i o n w a s c o n t i n u e d f o r a n a d d i t i o n a l1 1 4 h . T h e c o m b i n e d f e r m e n t a t i o n b r o t h s w e r ee x t r a c t e d t w i c e w i t h 1 0 l i t e r s o f d i c h l o r o m e t h -a n e , a n d t h e e x t r a c t s w e r e e v a p o r a t e d u n d e rr e d u c e d p r e s s u r e . The r e s i d u e w a s s u b j e c t e d t oc o l u m n c h r o m a t o g r a p h y s e p a r a t i o n o n s i l i c a g e l( W a k o g e l C - 2 0 0 , 5 . 3 b y 8 7 c m ) . T he m a t e r i a lw a s e l u t e d w i t h b e n z e n e - e t h y l m e t h y l k e t o n e( 1 0 : 1 ) , m o n i t o r e d b y t h i n - l a y e r c h r o m a t o g r a p h y ,a n d c o l l e c t e d i n 1 5 - m l f r a c t i o n s . F r a c t i o n s 4 2 1t h r o u g h 8 3 0 w e r e c o m b i n e d , e v a p o r a t e d u n d e rr e d u c e d p r e s s u r e , a n d g a v e a c r y s t a l l i n e r e s i d u e .R e c r y s t a i z a t i o n f r o m b e n z e n e - h e x a n e ( 1 : 1 ) a f -f o r d e d 5 . 1 1 g o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l a s c o l o r -l e s s n e e d l e s . The m o t h e r l i q u o r w a s c o m b i n e dw i t h o i l s , o b t a i n e d f r o m f r a c t i o n s 3 5 7 t h r o u g h4 2 0 a n d 8 3 1 t h r o u g h 1 , 0 4 0 , w h i c h c o n t a i n e d 1 0 -h y d r o x y p a t c h o u l o l a n d s m a l l a m o u n t s o f o t h e rh y d r o x y l a t e d p r o d u c t s , a n d t h e s o l v e n t w a se v a p o r a t e d . The r e s u l t i n g m a t e r i a l w as s u b -j e c t e d t o c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y o n s i l i c a g e l( W a k o g e l C - 3 0 0 , 3 . 3 b y 6 1 c m ) , a n d t h e c o l u m nw a s e l u t e d w i t h b e n z e n e - a c e t o n e ( 1 5 : 1 ) . F r a c -t i o n s 7 1 t h r o u g h 1 2 0 w e r e c o m b i n e d a n d e v a p -o r a t e d u n d e r r e d u c e d p r e s s u r e a n d t h e r e c r y s -t a l l i z e d r e s i d u e f r o m b e n z e n e - h e x a n e ( 1 : 1 )y i e l d e d a n a d d i t i o n a l 1 . 7 9 g o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h -o u l o l a s c o l o r l e s s n e e d l e s . T he c o m b i n e d y i e l dw a s 6 . 9 0 g ( 3 2 . 1 % y i e l d ) .H y d r o x y l a t i o n s c a l e - u p . A d e t a i l e d e x a m i -n a t i o n o f t h e e f f e c t o f m e d i a c o m p o s i t i o n , a n t i -

V O L . 4 2 , 1 9 8 1

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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .

- I

0z

J

0

_ 3 5 7 9DAYS AFTER SUBSTRATE A D D I T I O N

F I G . 4 . E f f e c t o f t i m i n g o f t h e s u b s t r a t e a d d i t i o n t op a t c h o u l o l on t h e p r o d u c t i o n o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u -l o l . A d d i t i o n o f p a t c h o u l o l a t d a y s 1 ( 0 ) , 2 ( A ) , 3( A ) , and 4 ( 0 ) a f t e r t h e i n o c u l a t i o n . S u b s t r a t e c o n -c e n t r a t i o n s w e r e 2 g l l i t e r ( P i t h o m y c e s s p . NRJ 2 0 1 )( a ) and 6 g l l i t e r ( P . chartarum N R J 2 1 0 ) ( b ) . Otherc o n d i t i o n s w e r e t h e same a s d e s c r i b e d i n l e g e n d t oF i g . 3 .f o a m , i n i t i a l p H , a e r a t i o n , a g i t a t i o n , a n d t e m -p e r a t u r e on t h e h y d r o x y l a t i o n o f p a t c h o u l o l t o1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l was m a d e and t h e f o l l o w -i n g c o n d i t i o n s were f o u n d o p t i m a l : ( i ) a c u l t u r emedium o f 1 . 0 % c o r n s t e e p l i q u o r , 2 . 0 % g l u c o s e ,0 . 5 % p e p t o n e , 0 . 2 % N a N O 3 , 0 . 0 5 % F e S O 4 . 7 H 2 0 ,0 . 1 % K2HPO4 ( p H 5 . 8 ) , 4 0 0 ml p e r 1 - l i t e r a n d 3l i t e r s p e r 5 - l i t e r j a r s ; ( i i ) i n o c u l u m s i z e o f 5%s e e d ; ( i i i ) a c u l t u r e p e r i o d b e f o r e t h e s u b s t r a t ea d d i t i o n o f a b o u t 3 0 h ; ( i v ) a s u b s t r a t e o f 2 g /l i t e r ( f i n a l ) i n 20% T w e e n 8 0 ; ( v ) a e r a t i o n a t 0 . 5v o l u m e s o f a i r / v o l u m e o f m e d i u m p e r m i n ; ( v i )a g i t a t i o n a t 3 0 0 r p m ; ( v i i ) t e m p e r a t u r e a t 2 4 t o2 7 0 C ; ( v i i i ) p H , no c o n t r o l ; a n d ( i x ) S h i n - e t s uS i l i c o n e KM-70 a n t i f o a m a t 0 . 2 5 t o 0 . 5 % . U n d e rt h e s e c o n d i t i o n s , P i t h o m y c e s NRJ201 gave c o n -s t a n t l y a 3 5 t o 45% ( 1 - l i t e r j a r ) a n d a 2 5 t o 3 5 %( 5 - l i t e r j a r ) y i e l d s ( F i g . 5 a ) o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h -o u l o l f r o m 2 g o f p a t c h o u l o l p e r l i t e r , w h e r e a s P .c h a r t a r u m NRJ210 p r o d u c e d 0 . 8 g o f 1 0 - h y -d r o x y p a t c h o u l o l p e r l i t e r f r o m 4 g o f p a t c h o u l o lpe r l i t e r ( 1 5 t o 22% y i e l d ) i n 5 - l i t e r j a r f e r m e n -

t a t i o n . The o v e r a l l y i e l d b y t h e i s o l a t i o n p r o c e -d u r e i n F i g . 5 a was 3 0 % . T h u s , s t a r t i n g w i t h 1 0l i t e r s o f c u l t u r e f e d w i t h 2 0 g o f p a t c h o u l o l , 6 . 4 5g o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l w a s o b t a i n e d a s c o l o r -l e s s c r y s t a l : m e l t i n g p o i n t = 1 0 4 0 C ; [ a ] D ' =- 1 1 9 . 5 C ( c = 1 . 0 i n C H C 1 3 ) ; p r o t o n m a g n e t i cr e s o n a n c e ( i n C 0 0 1 3 ) : 8 3 . 4 5 ( d , J = 7 H 2 , 2 H ) .

DISCUSSIONI n 1 9 7 3 , T e i s s e i r e ( 1 2 ) f o u n d t h a t t h e f r a g r a n tp r i n c i p l e i n p a t c h o u l i o i l i s n o r p a t c h o u l e n o l ( F i g .1 , I V ) b u t t h a t i t s c o n t e n t i n t h e o i l a m o u n t e d

3 0 . 8P A TC HO U L O L \7a 2 0 ~ ~ A D D I T I O N 6

IN10C_UXATIONN L51 0 -0

1 0 1 2 3 4 50 .00 b0

0 . 6 P A T C H O U L 0 1ADDITION0 . 4 -

0 . 2 -C1 2 3 4 5 6 7DAYS A F T E R S U B S T R A T E A DD I T I O NF I G . 5 . T i m e c o u r s e o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l p r o -d u c t i o n i n 5 - l i t e r j a r f e r m e n t a t i o n w i t h P i t h o m y c e ss p . NRJ201 ( a ) and P . c h a r t a r u m N RJ210 ( b ) a t 2 g /l i t e r ( a ) and v a r i o u s s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s ( b ) .M o d i f i e d m e d i u m , R o 4 2 2 c o n t a i n e d 2 % o g l u c o s e , 0 . 5 %p o l y p e p t o n e , 1% c o r n s t e e p l i q u o r , 0 . 2 % o N a N O 3 , 0 . 0 5 %M g S O 4 . 7 H 2 0 , 0 . 1 % K 2 H P O 4 , and 0 . 0 5 % F e S O 4 . 7 H 2 0i n a t o t a l v o l u m e o f 3 l i t e r s . O t h e r c o n d i t i o n s : ( a )a e r a t i o n , 0 . 5 v o l u m e o f a i r p e r v o l u m e o f medium p e rm i n ; a g i t a t i o n , 3 0 0 r p m ; t e m p e r a t u r e , 2 6 . 5 0 . 5 0 C ;p H , n o c o n t r o l and ( b ) a e r a t i o n , 0 . 5 v o l u m e o f a i r p e rv o l u m e o f medium p e r m i n ; a g i t a t i o n , 3 0 0 r p m ; t e m -

p e r a t u r e , 2 6 . 5 0 . 5 C ; p H , n o c o n t r o l ; s e e d c u l t u r e ,4 8 h ; p r e c u l t u r e , 3 1 h , i n o c u l u m s i z e , 5 % . ( a ) 1 0 -h y d r o x y p a t c h o u l o l ( 0 ) and p a t c h o u l o l ( 0 ) w e r e p r o -d u c e d . ( b ) 1 0 - H y d r o x y p a t c h o u l o l w a s p r o d u c e d a t t h es u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n s o f 2 g l l i t e r ( 0 ) , 4 g l l i t e r( 0 ) , and 8 g l l i t e r ( A ) .

1 9 0 S U H A R A E T A L .

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M I C R O B I A L H Y D R O X Y L A T I O N O F A S E SQ U I T E R P E N E 1 9 1o n l y t o 0 . 3 % o r l e s s . O u r s t u d y w a s u n d e r t a k e nt o d e v e l o p a p r a c t i c a l s y n t h e s i s o f n o r p a t c h o u -l e n o l f r o m p a t c h o u l o l , t h e m a j o r c o m p o n e n t i nt h e o i l . S i n c e t h e c o n v e r s i o n o f 1 0 - h y d r o x y -p a t c h o u l o l t o n o r p a t c h o u l e n o l v i a t h e i n t e r m e -d i a t e ( F i g . 1 , I I I ) i s e a s i l y a t t a i n e d b y c h e m i c a lm e t h o d s ( 9 ) , w e f o c u s e d o n t h e s e l e c t i v e c o n v e r -s i o n o f p a t c h o u l o l t o 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l ,w h i c h i s p r a c t i c a l l y i m p o s s i b l e t o o b t a i n b yc h e m i c a l m e t h o d s . T h e s t u d y l e d t o t h e e s t a b -l i s h m e n t o f a m i c r o bi a l p r o c e s s w h i c h y i e l d s 3 5t o 5 0 % o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l f r o m p a t c h o u l o li n 1 - a n d 5 - l i t e r f e r m e n t a t i o n j a r s . A l t h o u g hr a b b i t a n d d o g l i v e r h o m o g e n a t e s a r e r e p o r t e dt o p e r f o r m i t ( 9 ; G e r m a n p a t e n t 2 , 5 2 9 , 6 0 3 , F e b -r u a r y 1 9 7 6 ; S w i s s a p p l i c a t i o n 1 0 , 6 7 6 / 7 4 , A u g u s t1 9 7 4 ; U . S . p a t e n t 4 , 0 5 5 , 5 9 4 , O c t o b e r 1 9 7 7 ) , t h i sm i c r o b i a l h y d r o x y l a t i o n i s t h e o n l y p r a c t i c a lm e t h o d f o r o b t a i n i n g 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l .H y d r o x y l a t i o n o f a - k e s s y l a l c o h o l ( 4 ) , c y p e r -o t u n d o n e ( 5 ) , q u a i o x i d e ( 6 ) , a n d l i g u l o x i d e ( 7 )b y C u n n i n g h a m e l l a , C o r t i c i u m , M u c o r , a n dS t r e p t o m y c e s s p e c i e s , r e s p e c t i v e l y , h a s b e e n r e -p o r t e d a n d c o n t r i b u t e d t o e l u c i d a t e t h e s t e r e o -c h e m i s t r y o f t h e s e t e r p e n e s . O u r f i n d i n g s d e m -o n s t r a t e t h a t P i t h o m y c e s s p e c i e s a r e a l s o a b l e t oh y d r o x y l a t e t h e s e k i n d s o f c o m p o u n d s a n d t h a tt h e y c a n b e u s e d t o p r e p a r e t h e d e s i r e d p r o d u c ta s a r e s u l t o f r e g i o - s e l e c t i v e h y d r o x y l a t i o n .W h e t h e r t h i s s e l e c t i v i t y c a n b e a s c r i b e d t o t h ei n t r i n s i c n a t u r e o f a p a r t i c u l a r h y d r o x y l a s e o r i sd u e t o t h e r a t i o o f m o r e t h a n s e v e r a l e n z y m e s o fd i f f e r e n t r e g i o - s p e c i f i c i t i e s o r t o t h e c o n d i t i o n a lr e g u l a t i o n o f r e g i o - n o n s p e c i f i c h y d r o x y l a s e ( s ) i sn o t k n o w n a t p r e s e n t . T h e e n z y m a t i c s y s t e ma p p e a r s t o b e n o n i n d u c i b l e , s i n c e t h e a d d i t i o n o fp a t c h o u l o l a s a n i n d u c e r d i d n o t c a u s e a n y i n -c r e a s e o f 1 0 - h y d r o x y p a t c h o u l o l . A s i n t h e c a s eo f o t h e r s e s q u i t e r p e n e h y d r o x y l a t i o n s ( 4 , 6 , 7 ) ,t h e s t r a i n s f o u n d p o s i t i v e b y o u r s c r e e n i n g w e r ee x c l u s i v e l y f u n g i , a n d b a c t e r i a w e r e i n e f f e c t i v ei n t h i s r e s p e c t .S t r a i n NRJ210 w a s i d e n t i f i e d a s a v a r i e t y o fP . c h a r t a r u m b y i t s c o n i d i o p h o r e m o r p h o l o g y

a n d b y o t h e r t a x o n o m i c p r o p e r t i e s . I t s h y d r o x -y l a t i n g a b i l i t y d i f f e r s g r e a t l y f r o m t h e t y p e c u l -t u r e s t r a i n o f P . c h a r t a r u m A TCC 2 2 6 3 7 ( T a b l e1 ) . S t r a i n NRJ201 r e s e m b l e d P . c y n o d o n t i s b u tc o u l d b e d i f f e r e n t i a t e d f r o m i t , t h u s i n d i c a t i n g an o v e l t a x o n . T a x o n o m i c d e t a i l s w i l l b e r e p o r t e de l s e w h e r e .

L I T E R A T U R E CITED1 . B u c h i , G . , a n d R . E . E r i c k s o n . 1 9 5 6 . T e r p e n e s . V . T h es t r u c t u r e o f p a t c h o u l y a l c o h o l . J . Am. C h e m . S o c . 7 8 :1 2 6 2 - 1 2 6 3 .2 . C h a r n e y , W . , and H . L . H e r z o g . 1 9 6 7 . M i c r o b i a l t r a n s -f o r m a t i o n s o f s t e r o i d s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , N e w Y o r k .3 . H e f e n d e h l , F . W. 1 9 7 7 . D i e a n a l y t i s c h e B e w e r t u n g v o nP a t c h o u l i o l . S e i f e n O e l e F e t t e W a c h s e 1 0 3 : 1 5 9 - 1 6 1 .4 . H i k i n o , H . , Y . T o k u o k a , Y . H i k i n o , and T . T a k e m o t o .1 9 6 8 . B i o c h e m i c a l s y n t h e s e s . I . M i c r o b i a l t r a n s f o r m a -

t i o n o f a - k e s s y l a l c o h o l t o k e s s y l g l y c o l a n d k e s s a n e - 2 , B ,7 - d i o l . T e t r a h e d r o n 2 4 : 3 1 4 7 - 3 1 5 2 .5 . H i k i n o , H . , K . A o t a , Y . T o k u o k a , a n d T . T a k e m o t o .1 9 6 8 . B i o c h e m i c a l s y n t h e s e s . I I . M i c r o b i a l t r a n s f o r m a -t i o n o f c y p e r o t u n d o n e t o s y g e o n o l a n d i s o p a t c h o u l - 4 -e n - 3 - o n - 8 a - o l . C h e m . P h a r m . B u l l . ( T o k y o ) 1 6 : 1 0 8 8 -1 0 9 0 .6 . I s h i i , H . , T . T o z y o , M . N a ka a mu r a , a n d H . M i n a t o .1 9 7 0 . S t u d i e s o n s e s q u i t e r p e n o i d s . X I X . S t r u c t u r e a n da b s o l u t e c o n f i g u r a t i o n o f l i g u o x i d e , l i g u l o x i d o l a n d l i g -u l o x i d o l a c e t a t e . T e t r a h e d r o n 2 6 : 2 9 1 1 - 2 9 1 8 .7 . I s h i i , H . , T . T o z y o , 1 W . N a k a m u r a , and E . Y u n k e . 1 9 7 2 .M i c r o b i a l t r a n s f o r m a t i o n o f s e s q u i t e r p e n o i d s . V . P r e p -a r a t i o n o f 1 - e p i l i g u l o x i d e , t h e s i x t h s t e r e o i s o m e r o fg u a i o x i d e . C h e m . P h a r m . B u l l . ( T o k y o ) 2 0 : 2 0 3 - 2 0 5 .8 . K i e s l i c h , K . 1 9 7 6 . M i c r o b i a l t r a n s f o r m a t i o n s o f n o n - s t e -r o i d c y c l i c c o m p o u n d s , p . 5 6 . G e o r g e T h i e m e P u b l i s h -e r s , S t u t t g a r t .9 . L u u , B . , G . O u r i s s o n , and P . T e i s s e i r e . 1 9 7 5 . H y d r o x -y l a t i o n o f p a t c h o u l o l b y r a b b i t s . H e m i - s y n t h e s i s o f n o r -p a t c h o u l e n o l , t h e o d o u r c a r r i e r o f p a t c h o u l i o i l . T e t r a -h e d r o n L e t t . , p . 2 2 1 1 - 2 2 1 4 .1 0 . P e t e r s o n , D . H . 1 9 6 3 . M i c r o b i a l t r a n s f o r m a t i o n s o f s t e -r o i d s a n d t h e i r a p p l i c a t i o n t o t h e p r e p a r a t i o n o f h o r -m o n e s a n d d e r i v a t i v e s , p . 5 3 7 - 6 0 6 . I n C . R a i n b o w a n dA . H . R o s e ( e d . ) , B i o c h e m i s t r y o f i n d u s t r i a l m i c r o o r -g a n i s m s . A c a d e m i c P r e s s , I n c . , L o n d o n .1 1 . S e n i c h , v . Y . , G . Z . S c h i s d h k o v , and B . V . A r t e m ' e v .1 9 7 6 . O n t h e c o n t e n t o f p a t c h o u l i a l c o h o l i n p a t c h o u l io i l s a m p l e s o b t a i n e d b y e x t r a c t i o n . I z v . V y s s h . U c h e b n .Z a v e d . P i s h c h . T e k h n o l . 1 : 4 4 4 5 .1 2 . T e i s s e i r e , P . 1 9 7 3 . C h e m i s t r y o f p a t c h o u l i o i l . R i v . I t a l .E s s e n z e P r o f u m i P i a n t e O f f i c . A r o m i S a p o n i C o s m e t .A e r o s o l 5 5 : 5 7 2 - 5 9 2 .

V O L . 4 2 , 1 9 8 1