EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO

Ed Cont Lab Cln 2005;8:63-72 DIAGNSTICO DE LAS ENFERMEDADES METABLICAS HEREDITARIAS Teresa Pmpols Ros Institut de Bioqumica Clnica, Corporaci Sanitria Clnic, Barcelona INTRODUCCIN Las enfermedades metablicas hereditarias o errores innatos del metabolismo son enfermedades genticas abrumadoras y a menudo letales, implican cargas familiares y sociales importantes y conllevan un elevado consumo de recursos sanitarios debido a las necesidades de hospitalizacin, especialmente en la edad peditrica. De las que se conocen, mas del 50 % presentan sntomas durante el primer ao y un 30 % entre el primer ao y la pubertad. La esperanza de vida est reducida en 2/3 de ellas, un 30 % de los pacientes fallecen antes de los 10 aos y un 20 % entre los 10 y los 30. El 70 % de los fenotipos implican ms de un sistema anatmico y funcional, siendo el sistema nervioso el ms frecuentemente afectado (43 %). Muchos de los fenotipos compatibles con una supervivencia prolongada estn asociados a minusvalas graves que limitan el acceso a la escolarizacin y al trabajo. Consideradas bajo el trmino de enfermedades raras o enfermedades hurfanas debido a sus bajas incidencias individuales y a la ausencia de tratamiento para la mayora, acumulativamente son mucho ms comunes de lo que se cree, pero a menos que estemos preparados para reconocerlas, la mayora permanecern sin ser diagnosticadas o lo sern errneamente. Las enfermedades metablicas hereditarias tienen su origen en variaciones en los genes. De acuerdo con el flujo molecular de informacin, cuando se altera un gen (mutacin), el patrn de su producto gnico especfico (protena) puede ser daado, en este caso, la prdida de sus funciones altera la homeostasis fisiolgica (patognesis), induciendo las manifestaciones clnicas y el fenotipo (enfermedad) (Figura 1). En la expresin fenotpica juegan un papel eventos post-traduccin y factores celulares, genes situados en otros locus y factores ambientales y estocsticos, por lo que las enfermedades metablicas hereditarias se comportan a menudo como caracteres complejos. En ms de la mitad de las enfermedades metablicas hereditarias que se conocen, el producto gnico alterado es una protena

enzimtica, lo cual suele producir bloqueos en las vas metablicas, con acmulos previos al bloqueo, desviaciones hacia la produccin de compuestos anmalos indeseables o dficits de sntesis de productos relevantes. En la clasificacin funcional de los productos gnicos, hay una elevada representacin de protenas enzimticas (alrededor del 45 %), pero tambin se han identificado defectos en protenas implicadas en la transduccin de seales, en el plegamiento y degradacin de otras protenas, en el transporte y secrecin, en el metabolismo de los cidos nucleicos, en la recepcin e internalizacin de macromolculas, protenas ribosomales, extracelulares y del citoesqueleto, hormonas peptdicas, protenas sanguneas (incluidas las que tienen un papel transportador circulatorio: lipoprotenas, hemoglobina), factores de coagulacin, colgeno y protenas implicadas en el sistema inmune. Dado que un gen tiene un papel predominante en la determinacin de la enfermedad, se heredan en forma monognica o mendeliana (60 % autosmica recesiva, 20 % autosmica dominante y 12 % ligada al cromosoma X), son excepcin las debidas a defectos en el DNA mitocondrial que se heredan con herencia materna (alrededor de un 8 %). Las cuatro primeras entidades fueron descritas por Archibald Edward Garrod (1857-1936), que supo reconocer un importante mensaje biolgico en cuatro trastornos humanos, alcaptonuria, albinismo, cistinuria y pentosuria. Observ que se transmitan familiarmente, que en tres de ellos haba un exceso de un compuesto (alcaptonuria, cistinuria y pentosuria), y en uno un defecto (la falta de pigmentos en el albinismo), y que uno de los trastornos, la pentosuria no produca enfermedad. Garrod introdujo en medicina un paradigma nuevo para su poca, la bioqumica era dinmica y diferente de la naturaleza esttica de la qumica orgnica y ello le llev a pensar en vas metablicas y a reconocer que la variacin en la herencia mendeliana podra explicar estos errores innatos del metabolismo.

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A) DNA ( Genoma )

B) Producto gnico( Proteoma)

C) Vas/Productos Metablicos(Metabonoma )

Fenotipo ( Phenoma )

Transcripcin a RNA(Transcriptoma)

Traduccina polipptido

Efectos Ambientales(Environome)Procesamiento

post-traduccin e intervencin de factores celulares

(Complexoma)

Figura 1. Los genes hablan bioqumica y fisiologa. las enfermedades metablicas hereditarias tienen su origen en

variaciones en nuestros genes. De acuerdo con nuestro flujo molecular de informacin, cuando se altera un gen (mutacin), el patrn de su producto gnico especfico (protena) puede ser daado, en este caso, la prdida de sus

funciones altera la homeostasis fisiolgica (patognesis) induciendo las manifestaciones clnicas y el fenotipo (enfermedad). ( Esquema T.Pmpols)

En esta poca, y sin tener idea de la naturaleza de un gen, Garrod fue todava mucho mas lejos y plante la idea de la variabilidad qumica como el fenmeno natural que sera el sustrato para la seleccin natural y la evolucin y la idea de individualidad qumica, postulando que las propiedades bioqumicas individualizadas implicaran que cada persona tendra una susceptibilidad heredada a la enfermedad. Hoy en da, se sabe que estas propiedades son conferidas por una combinacin de genes nica para cada individuo y que, de hecho, todas las enfermedades presentan un componente gentico: su husped. Las enfermedades metablicas hereditarias no solo son un modelo paradigmtico de enfermedad gentica, sino la ilustracin ms evidente de variacin gentica que afecta a la salud y un modelo de enfermedad para el cual se encuentra

el sustrato o explicacin a nivel molecular, enfoque que imprimir carcter a la medicina el siglo XXI. En la era post-genmica (se emplea este trmino para designar el perodo que sigue a la consecucin del hito cientfico de la secuenciacin del genoma humano), se comprende el lenguaje de los genes, se sabe que los genes hablan bioqumica y fisiologa, y la capacidad para interpretar y diagnosticar enfermedades metablicas hereditarias se ha incrementado espectacularmente (Figura 2). Ha contribuido a ello los impresionantes avances de la tecnologa analtica y del conocimiento bioqumico en general, lo cual junto con el desarrollo de la biologa celular, las facilidades para los cultivos celulares y la tecnologa del DNA recombinante, han transformado completamente las perspectivas para el estudio de las enfermedades genticas.

T. Pmpols. Diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias 65

450

400

350

300

250

200

150

100

50

0

500

Nm

ero de Entidades

1902

Garrod

4 inborn errorsof metabolism

19957

19896

19835

19784

19723

19662

19601

AoEdicin del MMBID

7892

121148

200

374

469

Figura 2. Representacin grfica del aumento exponencial de la capacidad para reconocer y diagnosticar enfermedades metablicas hereditarias (Esquema T.Pmpols segn datos del libro MMBID: The Metabolic and

Molecular Basis of Inherited Diseases) ( Editado por Scriver y cols.2001). La capacidad para tratar las enfermedades metablicas hereditarias tambin ha aumentado, pero de manera ms lenta. En parte debido a que va fuertemente ligada a la comprensin de la fisiopatologa de los trastornos, y esta es todava muy fragmentaria en la mayora de los casos. Adems, restablecer la homeostasis de todos los compartimentos implicados y en el perodo de desarrollo adecuado es muy difcil. No obstante, alrededor de un 12 % de las enfermedades metablicas hereditarias tiene un tratamiento completo, en un 54 % se obtienen beneficios de grado variable, a menudo en funcin de la precocidad del diagnstico, y en un 34 % no hay respuesta al tratamiento. Por todo ello, las opciones preventivas de nuevos casos son muy relevantes, el consejo gentico, apoyado en las posibilidades de diagnstico de heterozigotos y prenatal, da a las parejas la posibilidad de tener hijos sanos y evitar el nacimiento de nios afectados a pesar de su riesgo gentico. Los avances en las tcnicas de reproduccin asistida ofrecen adems nuevas alternativas, como la inseminacin con donante heterlogo, la donacin de vulos, la seleccin

preimplantatoria de sexo fetal (para las ligadas al cromosoma X), y el diagnstico preimplantatorio. Por otra parte, en el contexto de la reproduccin y el embarazo, han emergido otros importantes aspectos, derivados en parte de los logros alcanzados en cuanto al aumento de la supervivencia y calidad de vida de los pacientes con enfermedades metablicas hereditarias tratados precozmente, que conciernen a la fertilidad / infertilidad de los pacientes, el resultado del embarazo en pacientes y heterocigotas, la relacin entre la madre y el feto, y los riesgos potenciales para ambos. Bsicamente enfermedades metablicas hereditarias en la madre que pueden afectar al feto (embriofetopata en embarazadas fenilcetonuricas no tratadas), y en el feto que pueden afectar a la madre (fallo heptico agudo y sndrome HELLP -Hemolysis Elevated Liver Enzyimes Low Platelet - en algunos defectos de la -oxidacin mitocondrial de los cidos grasos), as como riesgos para la madre con una enfermedad metablica hereditaria derivados del estrs metablico del embarazo y el parto (coma en embarazadas con deficiencia de OCT - Ornitina carbamil transferasa- o accidentes

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tromboemblicos en embarazadas con homocistinuria), por citar algunos ejemplos. En 1960, la editorial McGraw-Hill Book Co. public la primera edicin de un libro que constituye un reservorio de todo el conocimiento acerca de los centenares de errores innatos del metabolismo que se conocen hoy en da. Su octava edicin, MMBID-8, es un compendio de lo que emerger como genmica funcional en la era post-genmica, en cuanto una mutacin afecte a la salud y contribuya a ser la causa de una enfermedad. RECONOCIMIENTO DE LAS ENFERMEDADES El diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias depende mayoritariamente de su reconocimiento por los clnicos y el acceso coordinado a los laboratorios de gentica bioqumica. En una pequea parte de las enfermedades metablicas hereditarias (menos del 5 %), la deteccin se basa en programas de cribado poblacional en individuos asintomticos, fundamentalmente en el periodo neonatal. El primer paso es pues la hiptesis clnica, y hay un gran nmero de factores que conspiran para hacer muy difcil a los mdicos el diagnstico clnico:

- Los signos y sntomas pueden ser inespecficos, especialmente en el perodo neonatal.

- Su presentacin como casos aislados (a pesar de ser hereditarias, debido al reducido tamao de las familias actuales), la consanguinidad no es un antecedente tan frecuente como se piensa (excepto en determinados grupos).

- Prejuicios sobre su rareza, lo que hace que muchas veces no se las tenga en cuenta en las situaciones crticas hasta que se han descartado muchas otras condiciones ms corrientes.

- Escaso conocimiento de signos o sntomas que pueden ser claves para su reconocimiento.

- Hay algunos trastornos que solo producen anomalas intermitentes y las muestras de sangre y orina pueden ser irrelevantes si no se han tomado en la fase aguda de la enfermedad.

- Las formas de debut adulto (un 20 %) son todava ms difciles de reconocer.

- Dificulta tambin el diagnstico, tanto por parte del mdico como del laboratorio, el fenmeno de la heterogeneidad gentica que

es una fuente de variabilidad de la expresin clnica y bioqumica.

La heterogeneidad gentica es un hecho frecuentemente observado en la poblacin normal, ya que no todas las mutaciones implican necesariamente un cambio funcional en la protena, sino que se trata de simples polimorfismos sin traduccin fenotpica. As por ejemplo, la glucosa-6-fosfato- deshidrogenasa, una enzima extensivamente estudiada en determinados grupos de poblacin debido a que su dficit se asocia a episodios de anemia hemoltica, tiene una forma denominada "Gal b" que es la ms frecuente, pero se han descrito alrededor de 150 variantes diferenciables basndose en sus propiedades cinticas, de termoestabilidad y de movilidad electrofortica. Un 96 % de estas variables son compatibles con un buen estado de salud, a pesar de que en algunas la actividad enzimtica es muy baja. Desde el punto de vista evolutivo, las mutaciones son esenciales para que se genere diversidad gentica suficiente para permitir a las especies adaptarse a su entorno mediante el mecanismo de seleccin natural. Otras veces en cambio, basta con el cambio de una sola base nucleotdica, por ejemplo en el centro cataltico de una enzima, para anular totalmente su actividad. La substitucin puede ser menos crtica y modificar nicamente el grado de unin, con lo cual la actividad cataltica disminuir solo parcialmente; otras substituciones pueden afectar al plegamiento de la cadena peptdica y por lo tanto a la conformacin espacial de la protena, variando sus propiedades cinticas. En otras ocasiones la modificacin no compromete la funcin de la protena, pero si su estabilidad, con lo cual la vida de la molcula se acorta y en determinadas situaciones fisiolgicas o ambientales se manifestar insuficientemente activa. Esto significa que mutaciones en un mismo locus pueden dar lugar a formas clnicas muy diferentes, es lo que se denomina heterogeneidad allica. Cuando la mutacin afecta severamente a la funcin de la protena o incluso esta no llega a sintetizarse (por ejemplo, una mutacin que afecte al inicio de la transcripcin o una delecin competa del gen), se produce un fenotipo severo clsico y el pronstico puede ser similar para todos los pacientes, pero a menudo hay un continuo de mutaciones que permiten una funcin residual de la protena, esta est adems sometida a eventos post-traduccin y factores celulares, as como a factores ambientales que estresen las vas metablicas (fiebre, dieta, estados de catabolismo aumentado) con lo que puede haber un dintel para que un paciente

T. Pmpols. Diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias 67

permanezca asintomtico o presente la enfermedad. En la expresin fenotpica tambin juegan un papel genes situados en otros loci, por lo que las enfermedades metablicas hereditarias se comportan a menudo como caracteres complejos. La heterogeneidad gentica es una parte de la frontera entre trastornos monognicos y enfermedades multifactoriales, y ni siquiera los pacientes con la misma mutacin son necesariamente idnticos. La heterogeneidad allica tambin tiene relacin con la presencia de sntomas en los heterocigotos, no siendo la excepcin sino la norma. Unos pocos alelos son prevalentes, la mayora son raros o incluso privados de cada familia. Una protena tambin puede verse afectada por mutaciones no allicas producidas en loci genticos diferentes: heterogeneidad no allica o heterogeneidad de locus. Ello ocurre, por ejemplo, cuando la protena se forma por asociacin post-traduccin de ms de un tipo de cadena polipeptdica, si adems el sistema necesita la cooperacin de un activador o cofactor, se puede tener el mismo fenotipo clnico y bioqumico con alteraciones en cada uno de los genes implicados. Ambos tipos de heterogeneidad, allica y no allica, pueden incidir en un mismo fenotipo. En las enfermedades metablicas hereditarias autosmico recesivas, es adems muy frecuente que la mutacin heredada del padre y la heredada de la madre sean diferentes, es decir muchos pacientes son compuestos genticos y producen una mezcla de dos especies distintas de protena anmala. DIAGNSTICO La gentica bioqumica clnica es la disciplina del laboratorio centrada en la evaluacin y diagnstico de pacientes y familias con enfermedades metablicas hereditarias, as como en la monitorizacin de tratamientos, los estudios de portadores y el diagnstico prenatal. El esquema de la Figura 1 es ilustrativo de cmo se puede abordar su estudio y diagnstico en el laboratorio: A) a nivel del genotipo, B) a nivel del producto gnico alterado, y C) al nivel de los metabolitos o desequilibrios qumicos. La primera aproximacin es la observacin de las caractersticas clnicas del paciente que describe

el mdico. Algunos laboratorios incluso facilitan un cuestionario sobre caractersticas clnicas que son relevantes para enfocar la investigacin. Sobre esta base se establece la estrategia bioqumica, incluyendo la seleccin de los especmenes ms idneos. La colaboracin con el clnico que aporta el paciente es fundamental, tanto para el curso y la amplitud de la investigacin, como para decidir su punto final cuando no se ha llegado a un diagnstico. En algunos trastornos del metabolismo intermediario son tambin muy relevantes algunos parmetros analticos de bioqumica general, en orina (acetona, cuerpos reductores, cetocidos, sulfitos, pH) y en sangre (recuento celular, electrolitos, amonio, gases, anin gap, glucosa, calcio, cidos lctico y pirvico). En la Figura 3 se indica un esquema genrico de trabajo. Lo habitual es moverse siguiendo diagramas de flujo en funcin de la clnica y la hiptesis diagnstica principal formulada por el clnico, emitiendo siempre en cada paso o ensayo, dictmenes interpretativos. En la Figura 4 puede verse como ejemplo de diagrama de flujo el que se aplica a los trastornos de la biognesis del peroxisoma (DBP). Los DBP son debidos a mutaciones en genes que codifican peroxinas, las protenas implicadas en la biognesis, ensamblaje e importacin de protenas del peroxisoma. Sus defectos se traducen en una ausencia o malformacin del orgnulo y la consiguiente alteracin de mltiples vas metablicas peroxisomales. Se carcterizan en el periodo neonatal por un sndrome polimalformativo y dismorfico (craneofacial, anomalas esquelticas) y severa disfuncin neurolgica (hipotona, convulsiones). A continuacin se manifiestan los problemas hepatodigestivos, de crecimiento, osteoporosis y afectacin ocular. Muchos de los DBP fallecen antes de los 6 meses. En los que sobreviven, el cuadro neurolgico, ocular y de crecimiento es manifiesto.Hay una gradacin de sntomas y supervivencia entre el Sndrome de Zellweger, la Adrenoleucodistrofia Neonatal y la Enfermedad de Refsum Infantil, que pueden sobrepasar la 1 dcada. Los defectos aislados en la -oxidacin peroxisomal (con excepcin de la Adrenoleucodistrofia ligada al X) tambin presentan clnica de DBP. La Condrodisplasia Punctata Rizomelica Autosmica Recesiva (CDPR AR) es tambin un DBP pero con caractersticas clnicas y bioqumicas y celulares especficas y si la clnica corresponde a esta entidad se sigue un diagrama de flujo distinto.

68 T. Pmpols. Diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias

Sospechaclnica de

EMH

Diseo de la estrategia bioqumicaen funcin de la clnica

Inicio de la Investigacin siguiendodiagramas de flujo especficos

Seleccin de los especmenes Instrucciones para lapreparacin y envo

Informes interpretativospara cada resultadodirigidos al clnico

Se ha alcanzado unaconclusin diagnostica? NOSI

Sugerir otras posibilidadesDe acuerdo con el clnicodetener la investigacin.

Enfermedad conTratamiento?SI NO

Monitorizacinde tratamiento

Informar de las posibilidades de Estudio de Portadores yDiagnstico Prenatal y de si para ello se requiere realizar

estudios complementarios en el paciente y/o en los padres

Figura 3. Esquema genrico que se sigue en los laboratorios de gentica bioqumica (EMH: enfermedad metablica

hereditaria). esquema T.Pmpols para la Red FIS INERGEN) El punto de partida de la investigacin raramente es el nivel A, ya que este es til solo para cuadros clnicos muy bien definidos y cuando se sabe con seguridad cual de los alrededor de 25.000 genes que tenemos se debe investigar. Conviene recordar adems que debido al fenmeno de la heterogeneidad gentica comentado anterior-mente, un diagnstico basado en el estudio mutacional tendra serias limitaciones, por lo menos hasta que existan mtodos exhaustivos para un anlisis mutacional total. Para la mayora de las enfermedades metablicas hereditarias, por lo tanto, la mejor aproximacin es a los niveles B y C, es decir de la funcin del gen, a menudo realizando perfiles extensivos de metabolitos en fluidos biolgicos. Para muchas de ellas, la primera aproximaciones es el nivel C, con un anlisis multicomponente de fluidos biolgicos (suero, plasma, orina o lquido cefalorraqudeo), empleando mtodos cromatogrficos, desde la capa fina (muy empleada para las mucopolisacaridosis, glucoproteinosis y algunas esfingolipidosis como paso previo para la seleccin de los enzimas lisosomales especficos)

a mtodos altamente resolutivos y sensibles, como la cromatografa de intercambio inico, la cromatografa lquida de alta eficacia (HPLC), la cromatografa de gases y la espectrometra de masas, en todas sus combinaciones y variantes. La espectrometra de masas es un mtodo definitivo en tanto que identifica estructuras moleculares, obtenindose perfiles metablicos extensos que pueden dar informacin del estado funcional de muchos genes, especialmente los implicados en las complejas vas del metabolismo intermediario (incluye al conjunto de molculas implicadas en actividades sintticas, catablicas y en procesos energticos, se trata de centenares de vas metablicas relacionadas entre si, por lo que los sntomas raramente son especficos, sino de grupo). A menudo, la identificacin y cuantificacin de un producto conduce directamente al diagnstico. En otros casos, el perfil metablico permite proponer una hiptesis que debe ser verificada mediante otras investigaciones de laboratorio, incluyendo algunas veces pruebas funcionales en el paciente, como ayuno, sobrecarga u otros.

T. Pmpols. Diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias 69

Clnica deDBP

*AGCML en suero o plasma

SINO

cidos fitnico y pristncio ycidos biliares intermedios

en suero o plasma

Resultados anmalos?

Resultados anmalos?

SINO

Plasmalgenos en eritrocitos, clulasmononucleares o fibroblastos

Resultados anmalos? SINO

Investigacin de otrasentidades en funcin de la clnica

y edad de presentacin

Oxidasa de loscidos ramificados

en suero

Investigar defectosaislados de la

-oxidacin peroxis.

CONCLUSIN:Defecto de la

biognesis delperoxisoma

Estudio de otras vas peroxisomalesEstudios de complementacin

intergnica (hay por lo menos 12peroxinas implicadas)

DNA

Figura 4. Ejemplo de un diagrama de flujo especfico, el que se aplica a los defectos de la biognesis del peroxisoma (DBP) Ver su descripcin en el apartado Diagnstico. Se inicia la investigacin cuantificando en suero

Mediante Cromatografa de gases los cidos grasos de cadena muy larga (*AGCML) que se oxidan especficamente en dicho orgnulo. Si son anmalos se miden los plasmalgenos en clulas porque su sntesis se inicia con

enzimas de la membrana peroxisomal y si el orgnulo no est bien formado la sntesis de estos compuestos es deficiente En funcin de los resultados se siguen explorando otras vias metablicas peroxisomales u otras

entidades. (Esquema: M Girs, T.Pmpols para la Red FIS INERGEN).

T. Pmpols. Diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias 70

El diagnstico a nivel del producto gnico (B) es esencial para muchas enfermedades metablicas hereditarias, y la enzimologa ocupa un lugar relevante (es esencial para las enfermedades lisosomales y mitocondriales). Generalmente requiere el empleo de clulas o tejidos, principalmente leucocitos y fibroblastos de piel cultivados, pero tambin eritrocitos y otros tejidos obtenidos mediante biopsia (msculo, duodeno, yeyuno, hgado). Se han desarrollado una gran cantidad de sustratos, cromognicos, fluorignicos y radioisotpicos, y las clulas cultivadas, principalmente fibroblastos de piel, posibilitan adems ensayos in vitro, incluyendo pruebas de sobrecarga, incorporacin de aminocidos a protenas, oxidacin de sustratos, y seguimiento del metabolismo de compuestos relevantes. Se emplean as mismo otras tcnicas para el estudio de protenas, como son la electroforesis, el isoelectroenfoque (sialotransferrinas para detectar sndromes CDG -defectos congnitos de la glicosilacin), transferencia de protenas, inmunohistoqumica (expresin de la protena ALDP en la adrenoleucodistrofia ligada al cromosoma X), citoqumica (tincin del colesterol libre intracelular con el antibitico fluorescente filipina para la enfermedad de Niemann-Pick tipo C), entre otras. En el nivel A, la tecnologa del DNA ofrece muchas posibilidades, pero como se ha mencionado anteriormente, en las enfermedades metablicas hereditarias la mejor aproximacin es la funcional. Por lo cual esta tecnologa se emplea cuando ya se ha alcanzado el diagnstico del caso ndice, siendo sus objetivos la bsqueda de correlaciones genotipo/fenotipo (correlaciones que, por cierto, son menos frecuentes de lo que se pensaba al principio), cuando hay alelos de pseudo-deficiencia, mayor fiabilidad en el establecimiento o exclusin del estado heterozigoto (especialmente en las ligadas al cromosoma X), en algunos casos especficos de diagnstico prenatal (el grueso del diagnstico prenatal se basa principalmente en ensayos al nivel de C o B), para obtener informacin sobre frecuencias de alelos y distribucin geogrfica o poblacional y, en general, con propsitos de investigacin. Los laboratorios de gentica bioqumica requieren infraestructura e instalaciones sofisticadas y costosas, incluyendo instalacin radioactiva, seccin de cultivos celulares, banco celular, banco de DNA, de clulas cultivadas y de diversos especmenes que constituyen valiosos materiales de referencia. Las facilidades para el transporte de muestras biolgicas permiten que las muestras viajen entre pases en 24 horas, 48 para largas distancias. Las condiciones de calidad preanaltica

son muy estrictas, en parte por la gran diversidad de especmenes que se usan: suero, plasma, eritrocitos, leucocitos y clulas mononucleares, sangre seca recogida sobre papel cromatogrfico, sangre total, orina, lquido cefalorraqudeo, humor vtreo (postmortem), biopsia de piel (para obtener fibroblastos cultivados), biopsia muscular, de duodeno, yeyuno y heptica, lquido amnitico, amniocitos cultivados o vellosidades coriales (para el diagnstico prenatal), tejidos postmortem como cerebro, hgado, bazo, rin, glndulas adrenales y msculo. Los tejidos formolizados o parafinados tienen pocas aplicaciones, pero todava permiten recuperar algunos componentes (determinados lpidos, como algunos esfinglipidos y cidos grasos de cadena muy larga), y permiten a veces hacer diagnsticos retrospectivos. El laboratorio suele proporcionar las instrucciones para la obtencin, conservacin y transporte de los especmenes, incluso facilita las pautas para la recogida de especmenes en el nio severamente enfermo o la necropsia en caso de exitus con sospecha de enfermedad metablica hereditaria. Las exigencias de calidad son muy elevadas, el empleo de estrategias incorrectas o de metodologas inadecuadas, el desconocimiento de las enfermedades metablicas hereditarias y los errores analticos, pueden tener consecuencias muy graves para el paciente, ya que la ausencia de diagnstico puede costarle la vida, o privarle de los beneficios de un tratamiento, pero adems inciden en las familias, en tanto que al desconocer su riesgo gentico, estn expuestas a tener mas hijos afectados. Del diagnstico a tiempo puede depender la vida del paciente o su calidad de vida, incluyendo la prevencin de un retraso mental severo. Pero incluso en las enfermedades metablicas hereditarias que carecen de tratamiento, el diagnstico es importante, no solo para evitar ingresos hospitalarios repetidos e intervenciones innecesarias o contraproducentes, as como la angustia de la familia ante un cuadro severo del cual no se le puede explicar la causa, sino porque es el camino para que la familia pueda acceder a los beneficios del consejo gentico, al diagnstico de portadores y prenatal y a las opciones reproductivas informadas. El diagnstico de heterozigotos es una parte importante del consejo gentico. Los mtodos ideales son los que permiten una discriminacin binaria, por ejemplo si se conoce la mutacin del caso ndice familiar, su presencia o ausencia. Pero en la prctica muchos ensayos dan una discriminacin estadstica con diferentes grados de eficacia predictiva. Cuando el ensayo para el estado heterozigoto es lo suficientemente preciso,

T. Pmpols. Diagnstico de las enfermedades metablicas hereditarias 71

se puede ofrecer el estudio familiar extensivo. Debe remarcarse la importancia de los estudios familiares, no solo para la identificacin de heterozigotos (que dadas las bajas prevalencias, tiene una importancia asistencial relativa en las autosmicas recesivas, pero muy notable en las ligadas al cromosoma X), sino para detectar individuos presintomticos que puedan beneficiarse de una intervencin medica precoz.. El proceso de toma de decisiones reproductivas requiere informacin sobre el diagnstico prenatal y las tecnologas de reproduccin asistida. Mas de un centenar de enfermedades metablicas hereditarias han sido diagnosticadas prenatalmente mediante la demostracin de un perfil anmalo de metabolitos en liquido amnitico y, en ocasiones, en clulas cultivadas; demostracin de la deficiencia de una enzima o una protena en clulas amniticas cultivadas o en biopsia de corion directa y/o cultivada; o tambin mediante demostracin de una mutacin especfica y, en casos muy especiales, de una morfologa inusual en biopsia fetal. Se han empleado una gran variedad de materiales fetales, adems de los citados, sangre fetal, hgado y piel (otras aproximaciones, de momento muy experimentales, son la separacin de clulas fetales en sangre materna y mucus transcervical). La seleccin del mtodo bioqumico y del tipo de muestra depende del caso especfico y de la enfermedad, en cualquier caso, el diagnstico previo del caso ndice y los estudios familiares son imprescindibles. Los resultados pueden obtenerse a las 12 semanas de gestacin si el ensayo se pudo llevar a cabo en la biopsia corial directa. Cuando se necesitan clulas cultivadas, es necesario estabilizar las condiciones celulares trabajando despus del primer subcultivo, por esta razn, los resultados a menudo se obtienen hacia las 19-21 semanas, muy cerca de las fechas lmite para la interrupcin legal del embarazo. En cuanto al seguimiento del tratamiento depende obviamente del tipo de terapia, pero la cuantificacin de metabolitos en fluidos biolgicos (trastornos del metabolismo de aminocidos y cidos orgnicos) o intracelular en casos concretos (cistina intraleucocitaria en la cistinosis), y las determinaciones enzimticas en suero o leucocitos (despus de un transplante de mdula sea o de una terapia enzimtica substitutiva) son los casos mas frecuentes. PROGRAMAS DE EVALUACIN EXTERNA DE LA CALIDAD Debido a estas necesidades, en 1988, el American College of Medical Genetics y el College

of American Pathologists pusieron en marcha en Estados Unidos el primer programa de evaluacin externa de la calidad para este tipo de laboratorios. En 1994 se cre la European Research Network for Evaluation and Improvement of Screening, Diagnosis and Treatment of Inherited Disorders of Metabolism (ERNDIM), que cont con el soporte de los programas Biomed I y Biomed II de la Comunidad Europea, para organizar programas especficos. La existencia de un programa de evaluacin externa de la calidad para enfermedades metablicas hereditarias es importante por muchas razones. Los anlisis suelen realizarse una sola vez, a menudo las muestras solo son informativas cuando el nio est severamente enfermo, a menudo es urgente y el volumen del espcimen es limitado, la expresin clnica y bioqumica es heterognea, el diagnstico depende de la identificacin correcta de cantidades muy pequeas de metabolitos clave, el laboratorio juega un papel fundamental en la interpretacin de los resultados, y el seguimiento puede requerir estudios multicntricos ya que se trata de enfermedades raras. En la actualidad, se puede participar en los siguientes esquemas: (1) cuantitativo de aminocidos, (2) cuantitativo de cidos orgnicos, (3) cuantitativo de purinas y pirimidinas, (4) ensayos especiales de metabolitos relevantes en suero (creatininio libre y total, fitnico, C22:0, C24:0, C26:0, cis-4-decenoico, homocisteina total, 7-dehidrocolesterol y fenilalanina) y en orina (carnitina libre y total, creatininio, succinilacetona, hidroxiprolina, cido ortico y mucopolisacridos), (5) acilcarnitinas, (6) cistina en leucocitos, (7) cualitativo de cidos orgnicos, y (8) Proficiency". Los dos ltimos se llevan a cabo con especmenes de casos reales de los que se recibe una cantidad muy limitada de muestra junto con un resumen de las caractersticas del paciente. La evaluacin externa tiene una parte de control de calidad de parmetros analticos y, dependiendo del programa, tambin se contempla la seleccin de la prueba, la interpretacin, los comentarios y el asesoramiento, y la manera de transmitir los resultados. Los resultados suelen poner en evidencia que algunas enfermedades metablicas hereditarias ofrecen mas dificultades que otras. Existe tambin un programa de evaluacin externa de la calidad para el diagnstico mediante la tecnologa del DNA, l de la European Molecular Genetics Quality Network (EMQN), que ha incluido un esquema piloto para secuenciacin de DNA. Sin embargo, el nmero de genes para los que se realiza el control es limitado, y dado

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que la mayora de las enfermedades metablicas hereditarias tienen prevalencias tan bajas, muchos de los genes implicados difcilmente sern nunca objeto de este tipo de control. DETECCIN MEDIANTE PROGRAMAS DE CRIBADO POBLACIONAL El cribado neonatal es una actividad de salud pblica, desde el punto de vista de prevencin secundaria, dirigido a la identificacin precoz de nios afectados por determinadas condiciones genticas, metablicas o infecciosas, que amenazan su vida y su salud, para las cuales una intervencin a tiempo, puede conducir a una reduccin significativa de la morbilidad, mortalidad y discapacidades asociadas. El cribado neonatal se inici hace tres dcadas en el contexto de la prevencin del retraso mental, contribuyendo decisivamente el descubrimiento de la fenilcetonuria por Flling, el del mtodo para tratarla con xito por Bickel, y la idea de Guthrie de que las muestras de sangre seca recogida sobre papel cromatogrfico eran adecuadas para su deteccin. Hoy en da millones de recin nacidos acceden a estos programas, y las muestras de sangre seca permiten la determinacin de un gran nmero de analitos (al menos 150), pero no llegan ni al 5 % de las enfermedades metablicas hereditarias las que son objeto de estos programas. Hay un consenso universal para la fenilcetonuria y el hipotiroidismo congnito, y un consenso ms variable para la anemia falciforme, la galactosemia, la hiperplasia adrenal congnita, la deficiencia de biotinidasa, la enfermedad del jarabe de arce, la homocistinuria, la fibrosis qustica, la deficiencia de acil-CoA-deshidrogenasa de cadena media, la tirosinemia y la deficiencia de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Los criterios de decisin son diversos y para algunas enfermedades, como la fibrosis qustica, el grado de controversia es remarcable. En la toma de decisiones tienen un peso importante los principios subrayados por Wilson y Young y la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) en 1968:

- Severa morbilidad y mortalidad en el perodo neonatal si la enfermedad no se diagnostica en el perodo neonatal.

- Una intervencin mdica a tiempo reduce significativamente la morbilidad, mortalidad y discapacidades asociadas.

- La prevalencia de la enfermedad es relativamente alta (> 1 en 10.000 - 15.000 recin nacidos).

- Existe un ensayo analtico sensible especfico y de costo apropiado.

Dado que el ensayo es del tipo de una vez en la vida, las exigencias de calidad son muy elevadas, y el CLIA de Estados Unidos las incluye en las de mxima complejidad. En Espaa, la Sociedad Espaola de Bioqumica Clnica y Patologa Molecular (SEQC) ha desarrollado un control de calidad especfico para estos programas. El futuro de los programas est estrechamente ligado a los progresos teraputicos y los resultados mdicos de los programas ya implantados y, por supuesto, a las direcciones y objetivos que plantee la sociedad en materia de salud. Desde el punto de vista analtico, la perspectiva ms interesante la ofrece la espectrometra de masas en tandem (TMS) que permite detectar varios trastornos del metabolismo de los aminocidos, cidos orgnicos y cidos grasos, a la vez. Por otra parte, se empieza a tener evidencia cientfica de que en enfermedades cuyo tratamiento era poco exitoso, los pacientes detectados muy precozmente estn mucho mejor que los diagnosticados despus de varias crisis metablicas que no supieron interpretarse a su debido tiempo. No obstante, entre los trastornos que detecta la espectrometra de masas en tandem, los hay con prevalencias muy bajas, de pronstico clnico variable, siendo el valor predictivo positivo desigual, as como los resultados teraputicos. Por lo cual el uso y la implantacin de esta y otras tecnologas en programas de salud pblica debe supeditarse siempre a la definicin y seleccin previa de unas enfermedades concretas de acuerdo con la medicina basada en pruebas.

EDUCACIN CONTINUADA EN EL LABORATORIO CLNICO COMIT DE EDUCACIN D. Balsells (presidenta), F. Canalias, R. Ferragut, P. Munujos, M. Rodriguez, MC. Vill

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INTRODUCCIN