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GENÉTICA Y GENÓMICA Herramientas para el desarrollo de nuevos alimentos

Daniel Ramón Vidal

Genética y genómica

1. El pasado: genética en alimentación

2. El presente: la genómica y los modelos

3. ¿Cómo usar estas técnicas?

Genética y genómica

1. El pasado: genética en alimentación

2. El presente: la genómica y los modelos

3. ¿Cómo usar estas técnicas?

Historia de la agricultura

¿Cómo se han mejorado las especies?

MUTACIÓN CRUCE SEXUAL

Brócolis, coles y coliflores

Col Coliflor

Col de Bruselas

Brócoli

Repollo

Yema terminal

Yema floral

Flores y tallos

Yema lateral

Coliflor

Cale

Hojas

Tallos

Colrabi

Coles de Bruselas Ancestro

Pomelos “naturales”

Pomelo Hudson

Naranja dulce

Pummelo

Pomelos ancestrales

Pomelo Star Ruby

Gallinas mejoradas genéticamente

Y también transgénicos

¿Va a ir a más?

El proyecto Genoma Humano

• Desde el año 2001 disponemos de la secuencia completa del genoma humano que está compuesta por unos 23000 genes; sólo conocemos la funcionalidad de la mitad

• Costó 3000 millones de dólares y casi diez años de trabajo de más de 1000 científicos

• En muchos casos ya conocemos que genes de nuestro genoma se relacionan con metabolopatías con posible prevención nutricional o con las sensaciones organolépticas

El uso indirecto de la genética y la genómica

• Los ratones mutantes ob/ob que no producen leptina son obesos; lo mismo pasa con los ratones mutantes db/db o las ratas mutantes fa/fa que son defectivas en el receptor de leptina

• En humanos hay genes equivalentes

• En humanos se han descrito defectos congénitos en la vía de leptina que se asocian a una obesidad mórbida temprana

• En el genoma humano ya se han identificado más de 300 genes relacionados con obesidad

Genética y genómica

1. El pasado: genética en alimentación

2. El presente: la genómica y los modelos

3. ¿Cómo usar estas técnicas?

¿Hacia donde va la secuenciación masiva?

• A fecha de hoy ya se han secuenciado completamente 7407 genomas de distintos animales, plantas y microorganismos

• Hay otros 25406 genomas en proceso de secuenciación

• Entre otros de interés agroalimentario se han secuenciado los genomas del arroz, el maíz, el trigo, la judía, la uva, el tomate, el cacao, la levadura panadera o algunas bacterias lácticas

Las plataformas de secuenciación masiva

10 años 3000 millones $ 1000 científicos

3 semanas 4000 €

1 técnico FP

2001

2013

El futuro genómico

9 minutos 100 $

Sin personal

2014 Q4

Las otras tecnologías “ómicas”

La genómica comparativa

12 Mb 5770 genes

100.2 Mb 21733 genes

3000 Mb 23000 genes

Organismos modelo: Caenorhabditis elegans

• Fácil de usar en el laboratorio, tamaño pequeño

• Ciclo de vida corto

• Disponibilidad de herramientas genéticas (clásicas y moleculares)

• Buena colección de mutantes

• Genoma secuenciado y bien anotado

• Alto porcentaje de homología con el genoma humano

La apuesta de Biopolis SL

Bioquímica

Microbiología

Biología molecular

Cultivos celulares

Organismos modelo

Escalado

Fermentación

Metabolómica

Modelos murinos

Genómica

Genética y genómica

1. El pasado: genética en alimentación

2. El presente: la genómica y los modelos

3. ¿Cómo usar estas técnicas?

Cacao y salud: ¿cómo demostrarlo?

• Hay muchas referencias bibliográficas sobre el efecto de los polifenoles del cacao en la prevención del riesgo cardiovascular

• Un polvo de cacao convencional tiene un 3-4% de polifenoles

• Un producto con mayor contenido en polifenoles sería muy interesante

CocoanOX 12%

E. Cienfuegos-Jovellanos, F.K. Jaisli, M.A. Pasamar, Y. Castilla, F.J. Arcos, D. Ramón. (2007). Method for obtaining polyphenol-rich cocoa powder with a low fat content and cocoa thus obtained. WO2007/096449

Selección de frutos Inactivación PPO Secado Aventado

Molienda Extracción de grasa Torta de cacao

Tamizado Extracción solventes

CocoanOX 12% CocoanOX 30-45-70%

Efecto antioxidante en C. elegans

C. elegans

Estrés oxidativo

5 hours

EXPERIMENTO % SUPERVIVENCIA SIN CCX-12 5

CON CCX-12 39

5 dÍas

+CCX-12

-CCX-12

Transcriptómica y mutantes

EXPERIMENTO % SUPERVIVENCIA SIN CCX-12 WT 5

CON CCX-12 WT 39

CON CCX-12 SIR 2.1 7

SIR2 SIR1

¿Cuál es la diana de los polifenoles de cacao?

DAF-2

AGE-1

Insulin-like peptides

AKT-2

AKT-1 SGK-1

DAF-16 SKN-1

SIR-2

DAF-16

PAR-5 FTT-2

Citoplasma

Núcleo Genes de longevidad

Aumento de la esperanza de vida

C. elegans

>21 días

EXPERIMENTO LIFESPAN (días)

SIN CCX-12 15.2

CON CCX-12 17.8

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22

days of adult

% worms

alive

P. Martorell, J. V. Forment, R. de Llanos, F. Montón, S. Llopis, N. González, S. Genovés, E. Cienfuegos, H. Monzó, D. Ramón. (2011). Cocoa polyphenols increase lifespan in Caenorhabditis elegans by a SIR-2.1 and DAF-16 dependent mechanism. Journal of Agricultural and Food Chemistry 59: 2077-2085

+CCX-12

-CCX-12

Probióticos y estrés oxidativo

Bifidobacterium (15 cepas)

Streptococcus (9 cepas)

Lactobacillus (75 cepas)

ESCRUTINIO MASIVO

Escrutinio en dos pasos

C. elegans BA17 fem-1

Placas NG

4 días

Huevos

(1mL Buffer M9)

1 día

L1 Larvae

M9 + Colesterol Probiótico

Inhibición E. coli

3 días

Estrés oxidativo

20°C 25°C

Viabilidad

5 horas

Sincronización Alimentación

25°C 25°C

Adultos

Ensayo

G. Grompone, M.C. Degivry, D. Ramón, P. Martorell, N. González, S. Genovés, S. Legrain-Raspaud, I. Chabaud, R, Bourdet-Siscard. (2011). Method for selecting bacteria with antioxidant activity. WO2011/083353A1

1

2

C. elegans wild –type (N2)

Estrés oxidativo

(3mM H2O2)

5 horas 5 días

NG-OP50

NG-probiótico

CNCM I-3690: una cepa antioxidante

• En general, las bacterias lácticas incrementan ligeramente la resistencia al estrés oxidativo; no se observó efecto en las bifidobacterias ensayadas

• Se detectó un fuerte efecto en once cepas pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Streptococcus; una de ellas, denominada Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690, funcionó de forma muy eficaz

Transcriptómica de la cepa I-3690

CNCM I-3690

Insulin like-pathway

Metabolismo de lípidos

Respuesta a estrés Sistema inmune innato

DAF-16

CNCM I-4317 E. coli OP50

Resultados en un modelo murino

• Se ensayó la administración intragástrica durante 5 días de 108 ufc de la cepa I-3690 en un modelo de rectocolitis inducida por TNBS en ratones Balb/c; como control positivo se utilizó prednisolona y como control negativo se usó el tampón de administración del probiótico

• Se realizó un análisis histopatológico

• El coeficiente de Wallace fue de 3.4 en el grupo control con el placebo y de 1.5 en el grupo de la prednisolona; el valor en el grupo tratado con la cepa L10C fue de 2.4

G. Grompone, P. Martorell, S. Llopis, N. González, S. Genovés, A.P. Mulet, T. Fernández-Calero, I. Tiscornia, M. Bollati-Fogolin, I. Chambaud, B. Foligné, A. Montserrat, D. Ramón. (2012). Anti-inflammatory Lactobacillus rhamnosus CNCM I-3690 strain protects against oxidative stress and increases lifespan in Caenorhabditis elegans. PLOS ONE 7: e52493

No colitis Vehicle + TNBS

CNCMI-3690 + TNBS Prednisolone + TNBS

La enfermedad de Alzheimer

Estrés oxidativo Inflamación

Degeneración neuronal Haces neurofibrilares

Péptidos desde CB

Hydrophobic Interaction chromatography (HIC)

HIDRÓLISIS PROTEÍCA

FRACCIONES HIC

FRACCIONES HIC POSITIVAS

Reverse Phase Chromatography (RPC)

FRACCIONES RPC

FRACCIONES RPC POSITIVAS

MALDI-TOF

“COCOA BARQUILLO”

IDENTIFICACIÓN DE LOS PÉPTIDOS

Identificación del péptido

Theobroma cacao 21 kDa seed protein (221 aas)

FRACCIONES RPC POSITIVAS

IDENTIFICACIÓN MALDI-TOF

SECUENCIAS PEPTÍDICAS (17 péptidos)

mktatavvlllfaftsksyffgvanaanspvldtdgdelqtgvqyyvlssisgagggglalgratgqscpeivvqrrsdldngtpvifsnadskddvvrvstdvniefvpirdrlcststvwrldnydnsagkwwvttdgvkgepgpntlcswfkiekagvlgykfrfcpsvcdscttlcsdigrhsdddgqirlalsdnewawmfkkasktikqvvnakh

B. Muguerza, H. Monzó, N. Alepuz, E. Bataller, S. Genovés, M. Enrique, P. Martorell, D. Ramón. (2010). Obtainment of cocoa extracts rich in bioactive peptides with inhibiting activity of ACE and PEP enzymes. EP2322041A1

E. Bataller, S. Genovés, P. Martorell, D. Ramón, A. Ibañez, S. Llopis, N. González, H. Monzó, B. Muguerza. (2011). Obtainment of bioactive products from cocoa having inhibitory activity against the PEP enzyme and antioxidant and/or anti-neurodegenerative activity. WO2011/076954A1

Resultados

0

10

20

30

40

50

60

70

80

NGM NGM+vitamin C 9L 11R 13L 13R

% W

orm

Su

rviv

al (

C. e

leg

an

s N

2)

Antioxidant Activity

24 41 43 45 47 49 51 530

25

50

75

100

125

NGM

ZPP

9L

11R

13L

13R

not induced

Time (h)

Percen

tag

e N

ot

paraly

zed • Paralysis

assay

IC50 PEP 13-mer(0.19 mg/ml)

[13-mer] mg/ml

0,0001 0,001 0,01 0,1 1

% Inhib

ition

-20

0

20

40

60

80

100

• El valor IC50 más bajo para la inhibición de PEP lo dió el péptido 13L-mer (0.19 mg/mL)

• Este péptido presentó la mayor actividad antioxidante in vivo

• También fue el más eficaz en la reducción de la parálisis

• Curiosamente, el péptido 13L-mer inhibe in vitro la enzima humana PLA2

• Hemos detectado trazas de este péptido en chocolates comerciales

Actividad antioxidante Parálisis Inhibición PEP

Transcriptómica

PÉPTIDO 13L-mer

Regulación Metabolismo del

piruvato

Regulación Proteasoma

Regulación Metabolismo del

triptófano

Acetil coA Turnover de proteínas Serotonina

Función sináptica Reducción del agregado amiloide

Locomoción Apetito

REDUCCIÓN DE LA TOXICIDAD DE Aβ

Inhibición de la agregación de Aβ

25

112

30

61

13

Tubulina

Placebo 13L R

atio

de

agre

gaci

ón

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Martorell P, Bataller E, Llopis S, González N, Álvarez B, Montón F, Ortíz P, Ramón D, Genovés S. A cocoa peptide protects Caenorhabditis elegans from oxidative stress and b-amyloid peptide toxicity. PLOS ONE 8: e63283

El modelo de C. elegans en Biopolis SL

Efecto antioxidante

Longevidad

Inflamación

Enfermedad de Alzheimer

Replicación de virus

Colonización de bacterias

Obesidad

Extractos vegetales

Probióticos

Moléculas aisladas

Refrescos carbonatados

Yogurt

Fracciones de purificación

Zumos de frutas

Café

Cerveza

Revalorización de resíduos

• Paja de trigo • Bagazo • Materiales

lignocelulósicos • Suero de quesería • Fases ricas en glicerol

de biodiesel • Restos grasos de

matadero • Aguas de producción

de mantequillas • Residuos de almazara • Aceites de fritura • Residuos urbanos • Residuos municipales

(RSU) • Gas de síntesis (CO +

H2) • Biogas (metano +

CO2)

• Metanol • Etanol • 1,3-propanodiol • 2,3-butanodiol • Ácido L-láctico • Butanol • Iso-butanol • Dihidroxiacetona • Poli-3-hidroxibutirato • Poli-3-hidroxibutirato-

co-valerato • mcl-PHA • Ácidos (R)-3-hidroxi

alcanoicos

El futuro: la biología de sistemas

• Hay que trabajar con modelos alternativos, el apoyo de las tecnologías “ómicas” y la ayuda de la bioinformática

• La biología de sistemas es la clave

• El ejemplo de los líderes: Nestlé Institute of Health Sciences

La reflexión final

A lo desconocido no hay que tenerle miedo, simplemente hay que entenderlo (Marie Curie, 1867-1934)

Daniel Ramón Vidal (daniel.ramon@biopolis.es)

http://www.linkedin.com/profile/view?id=64921252&trk=tab_pro

Biopolis SL

Parc Cientific Universitat de València

C/ Catedrático Agustín Escardino Benlloch 9; Edificio B; 469809-Paterna; Valencia