Acta Biol6gica Colombiana, Vol. 4 No.2, 1999 27

LOS CAMBIOS EN EL CONTENIDO DE POLIAMINAS ESTANRELACIONADOS CON LA RESISTENCIA A TEMPERATURAS BAJAS

EN PLANTAS DE PAPA

Changes in polyamine content are relatedto low temperature resistance in potato plants

Hernan Mauricio Romero, Jesus Norato Rodriguezy Catalina PosadaDepartamento de Biologia, Facultad de Ciencias,Universidad Nacional de Colombia,Apartado Aereo 14490, Bogota, Colombia.

RESUMEN

En plantas de Solanum acaule, Solanum phureja, Solanum tuberosum c.v. Desiree,transformada con un gen que codifica para proteinas anticongelantes del pezlenguado del Arrico, y el cion 88-35-7 de genealogfa (tbr-(atzimba) x (ad x phuccc81), genotipos de papa con diferente grado de tolerancia a las tempera-turas bajas, se determin6 la variaci6n en el contenido de poliaminas (PA)durante una helada simulada en fitorr6n. La especie tolerante (5. acaule) fuela unica que sobrevivi6 al tratamiento de temperaturas bajas (80% de tejidovivo), las dernas especies tuvieron mas de un 50% de muerte del tejido al finaldel experimento. EI cion 88-35-7 tuvo una muerte de los tejidos mas lenta queS. phureja y que Desiree.

La supervivencia de los tejidos estuvo relacionada con los incrementos de losniveles de putrescina (Put) y espermina (Spm) libres observados en S. acaule yen men or medida en el cion. Los valores de PA en las plantas susceptibles(S. phureja y Desire transgenica) permanecieron bajos y constantes durantetodo el tiempo de la condici6n extrema. La Fuente para el incremento enconcentraci6n de Put y Spm en S. acaule y en el cion 88-35-7 al parecer estuvoconstituida por las formas ligadas solubles de las dos fitohormonas, quedisminuyeron en la medida que avanzaba el tratamiento de frio.

Palabras claves: Bajas temperaturas, poliaminas, resistencia, papa, Solanum spp.

28 Los cambios en el contenido de poliaminas estdn relacionados con ia resistencia a temperaturasbajas en plantas de papa, Romero et al.

ABSTRACT

Polyamine content and variation within a 48 hour simulated freezing stresswere determined in plants with different low temperature resistance. GenotypesSolanum acaule, Solanum phureja, transgenic Solanum tuberosum c.v. Desiree withantifreezing trans-genes from Winter Flounder and the clone 88-35-7 (tbr-(atzimba) x (acl x phu ccc8l) were used for the experiment. Tolerant species 5.acaule was the only one that survived freezing stress (80% surviving tissue) theothers had more than 50% of dead tissue by the end of the experiment. Clone88-35-7 died slower than S. phureja and transgenic plants of Desiree.

This response was related to free putrescine and free spermidine titters of 5.acaule plants and in less extend in clone 88-35-7 plants. Polyamineconcentration was low and stable in sensitive plants (5. phureja and Desiree)within freezing condition. Soluble bound forms ofpolyamines were the sourcefor Put and Spm increase in 5. acaule and 88-35-7 plants. As a result, solublebound polyamine titer decreased with the freezing stress.

Keywords: Low temperatures, polyamines, resistance, potato, Solanum spp.

INTRODUCCION

Las temperaturas ambientales bajas, con vaJores iguales 0 menores a DOC,constituyen un factor que lirnita fa prcductividad y la distribuci6n geograficade las plantas. Adernas ocasionan disrninucion de la actividad biosintericayen el funcionamiento normal de los procesos fisiol6gicos y pueden causardafios permanentes de consideraci6n en los tejidos vegetales, que en muchoscasos Ilevan a fa rnuerte.

En las zonas andinas tropicales se presenta el fen6meno de las heladas, quetrae consigo la disminuci6n de la temperatura arnbienral a valores por debajode los O°c. La ocurrencia de esta condici6n en diferentes epocas del afio lirnitala siembra del cultivo de papa y de otras especies hortfcolas de importancia, aun 70% de la superficie potencial de siembra en el primer semestre y un 30%en el segundo semestre y ocasiona caidas en la producci6n que traen perdidasecon6micas de miles de millones de pesos (Estrada etal., 1994).

Uno de los cultivos mas afectados por las temperaturas bajas es la papa ydebido a su imporrancia como alimento en todos los pueblos y en especial delos parses en desarrollo, en el mundo se han emprendido numerosos estudios

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para tratar de conocer los mecanismos de tolerancia al frfo en especies silvestresy cultivadas (Alberdi & Corcuera, 1991; Chen & Li, 1980a; Chen & Li, 1980b;Estrada, 1982; Hetherington et al., 1983; Mendoza & Estrada, 1977; Smillieetal., 1983). Paralelamente se han hecho trabajos de mejoramiento con el finde obtener variedades de papa con tolerancia a las heladas (Estrada, 1982)y se ha investigado en la aclirnatacion como posible mecanismo de inducci6nde tolerancia a las heladas (Alberdi & Corcuera, 1991; Chen & Li, 1980a; Li,1985; Smillie et al., 1983). lncluso, por tecnicas de biologfa molecular, se haIlegado a la producci6n de variedades de papa transgenicas, a las cuales se lesha incorporado el gen de resistencia a la congelaci6n, provenience del pezlenguado del Artico (Estrada eta/., 1994). Sin embargo, hasta el momento nose conocen muy bien, cuales son los mecanismos bioqufmicos y fisiol6gicos pormedio de los cuales algunas plantas pueden resistir esta condici6n extrema.

Se han postulado varias hip6tesis acerca de los mecanismos de tolerancia depapa a las bajas temperaturas. La mas aceptada es que haya una interacci6n defactores y condiciones de desarrollo en el momento de sufrir la helada (Hodson,1973). Se ha visto que, para el caso de la papa, las especies rolerantes tienencaracterfsticas anat6micas y fisiol6gicas que las diferencian de las susceptibles ylas protegen del dafio causado por las bajas temperaturas (Estrada etal., 1994).

Entre los facto res fisiologicos mas irnportantes en la tolerancia de las plantas alas bajas ternperaturas se encuentra el balance en el contenido de fitohormonas(Gusta eta/., 1996; Morgan & Drew, 1997; Racz etal., 1996; Svenning etal.,1997). Dentro de estas fitohormonas se encuentran las poliaminas (PA) queson rnoleculas alifaticas con grupos amina que se protonizan, par 10 queadquieren condiciones policati6nicas. Esta condici6n constituye la base parasu accion a nivel molecular, ya que forman complejos can polianiones comoproteinas y acidos nucleicos, modificando 0 afectando la actividad celular(Norato & Romero, 1995). La naturaleza fisicoqufmica de las PA permiteestabilizar las celulas vegetales sometidas a condiciones ambientales extremas(Altman et al., 1977). La protecci6n de las celulas por parte de las PA se haevidenciado gracias a los incrementos en las PA cuando han sido sometidas aestres por temperaturas extremas (Norato & Romero, 1995; Racz et al., 1996;Romero & Norato, 1996), choques osm6ticos (Mengoli etal., 1989), pat6genos(Walters, 1986), ozona (Bors et al., 1989; Wellburn & Wellburn, 1996) y otros.

En maiz, se ha visto que en variedades sometidas a heladas, como MB 510,el rendimiento no supera las 3,67 Ton/ha y apenas si se forman 1,7 rna-zorcas/planta, mientras que si las plantas son tratadas con las diversas PA, losprocesos de crecimiento continuan de manera similar que si el cultivo no

30 Los cambios en el contenido de poliaminas estdn reiacionados con la resistenaa a temperaturasbajas en plantas de papa, Romero et al.

hubiera sufrido los rigores de la helada (Norato et al., 1990), y adernas seact iva el crecimiento de mazorcas que normalmente no se desarrollan y elrendimiento en grano se mantiene en niveles normales. De igual manera enpapa, Romero y Norato (1996) aplicando poliaminas en la especie sensibles. phureja, variedad yema de huevo, lograron mantener la produccion deplantas que habian sufrido los rigores de una helada, en cerca de 10 Ton/ha,mientras que los testigos no tratados produjeron apenas 5 Ton/ha,

Por 10 anterior, este trabajo se planteo para establecer la respuesta diferencialde genotipos tolerantes y susceptibles a temperaturas bajas y la presencia 0

no de mecanismos fisiologicos de regulacion hormonal a traves de poliarninasdurante el fenorneno de las heladas

MATERIAlES Y METODOS

MATERIAL VEGETAL

Se sembraron tuberculos seleccionados de S. acaule, S. phureja, del hibrido 88-35-7 (Tbr*(acl*Phu)) y de S. tuberosum c.v. Desiree transgenica con un gen deresistencia al congelamiento del pez lenguado del Artico, en materos de 10 cmde diametro, que contenian una mezcla de suelo esterilizado, formada pordos partes de suelo par una de arena. Las materos se colocaron en una casade malla del Departamento de Biologia de la Universidad Nacional deColombia.

25U 200

re 15-0~" 10-vc,E 5~

0-5 5 10 15 20 25

Horas del dla

Figura 1. Variaci6n en la temperatura durante la helada simulada.

Acta Biologica Cofombiana, Vol. 4 No.2, 1999 31

TRATAMIENTOS

A los dos meses de edad, las plantas fueron sometidas a una helada simu-lada, utilizando un fitotr6n de CORPOICA Tibaitata. Se program6 una curvade temperatura que segura las variaciones que ocurren en el campo cuando sepresentan las heladas (Fig. 1).

La temperatura diurna fue de 20°C y empez6 a disrninuir gradual mente du-rante la noche hasta alcanzar -3°C a las 4 a.m. Esta temperatura se mantuvodurante 2 horas. La velocidad de congelamiento fue de 1,2°C / hora y a las6 a.m. se inicio el descongelamiento a una velocidad de 1,5°C / hora. Se utili-zo un fotoperfodo de 12 horas, y la humedad relativa minima fue de 75%.

A diferentes momentos de la helada simulada, se tomaran muestras del follajede plantas, constituyendo cada uno de estos momentos de muestreo untratamiento diferente de helada (Tabla 1). Se utilizaran todas las hojas sanasy no senescentes de cuatro plantas diferentes de cada genotipo, escogidas alazar. Las hojas de las 4 plantas se mezclaron y procesaron inmediatamentesegun la variable que se iba a determinar.

TRATAMIENTO HORA TEMPERATURA TIEMPO DEDE HELADA (0C) EXPERIMENTO

1 16:00 15.0 o hrs.2 20:00 5.5 43 00:00 0.0 84 04:00 -30 125 06:00 -3.0 146 10:00 15.0 207 16:00 1SO 248 16:00 15.0 48

Tabla 1. Tratarnientos de helada dados a plantas de diferentes genotipos de papa. Lahora y temperatura corresponden al momento en que las plantas fueron sacadas delfitotron para los anatisis correspondientes. Se presentan tarnbien las horas desdeiniciada la helada simulada. EItratamiento 1 corresponde a plantas sin el tratarnientode helada, pero actimaradas en el firotron.

DETERMINACI6N DE LA sUPERVIVENCIA DE LOS TEJIDOS

Para evaluar el porcentaje de supervivencia de los tejidos a las bajas tempe-raturas, se utilize el rnetodo mejorado de Steponkus y Lanphear (1967). Se

32 Los cambics en el contenido de poliaminas estdn relacionados con la resistencia a temperaturasbajas en plantas de papa, Romero et al.

pesaron 100 mg de material vegetal de las plantas sometidas a los diferentestratarnientos de helada y se pusieron a incubar can cloruro de trifeniltetrazolium aI1%, durante 15 horas hasta la infiltracion del reactivo. Luego seextrajo el forrnazan que se habra formado como respuesta de la respiracionde los tejidos que habian quedado vivos, y se leyo la absorbancia a 570 nm.EI porcentaje de tejido vivo se midio como el porcentaje de disrninucion en laabsorbancia can respecto al tejido vegetal de plantas que no habfan sid asometidas a la helada.

EXTRACCIoNY ANALISISDEPOLIAMINAS

Las poliaminas Put, Spm y Espermidina (Spd) se extrajeron en acidotricloroacetico al 10%, agregando butilamina como estandar interno. Laspoliaminas ligadas solubles y las ligadas insolubles se liberaron par hidrolisisacida con acido clorhidrico 6 N, Y al igual que las poliaminas libres, fueronpurificadas mediante lavados can erer etflico (Romero et al., 1994). Las po-liaminas purificadas fueron dansiladas (Flores & Galston, 1982), purificadasy determinadas mediante Cromatografia Uquida de Alta Resolucion (HPLC),en un cromat6grafo Merck-Hitachi con detector de fluorescencia. Se utilizeuna columna Merck Lichrochart-Lichrospher RP-18. La fase movil estuvocompuesta par metanol-agua en gradiente segun metodologfa estandarizadapar Romero et al. (1994). La cantidad relativa de las dansil-poliaminas decada muestra fue determinada utilizando curvas de calibraci6n de solucionespatr6n de Dansil-PA. Las perdidas derivadas del proceso fueron corregidasutilizando el estandar interno.

ANALISISESTADfsTICO

Se us6 un disefio completamente al azar, bajo un arreglo factorial, can elgenotipo de papa y el tratamiento de helada como factores. La unidadexperimental estuvo compuesta por cuatro plantas, de las cuales se tomaronlas hojas para los diferentes anal isis bioquimicos y se hicieron 4 repeticiones.EI primer factor tenia 4 niveles, correspondientes a los genotipos S. acaule,S. phureja, S. tuberosum c.v. Desiree rransgenica y el hfbrido 88-35-7. EI se-gundo factor tenfa 8 niveles, correspondientes a los tratamientos de helada,cuyas horas y temperaturas se encuentran relacionadas en la Tabla 1. Lasdiferencias en la respuesta de los diferentes genotipos de papa a las bajastemperaturas y su evoluci6n can el tiempo desde el inicio de la condici6nestresante, se determinaron mediante un anal isis de varianza (ANDEVA), canp $ 0.05. Todos los anal isis se hicieron mediante el Proc GLM del programaStatistical Analysis System 6.0 (SAS).

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RESULTADOS Y DISCUSION

La figura 2 muestra el efecto de la helada simulada en la supervivencia detejidos de las plantas de los diferentes genotipos de papa analizados.Se presentaron diferencias altamente significativas en la supervivencia entrelos genotipos, entre los tratarnientos yen la interaccion. Durante los 4 pri-meros tratamientos de helada, cuando se observe el descenso gradual de latemperatura hasta los _3°C, no se observaron diferencias significativas entrelos tratamientos dentro de los diferentes genotipos (Tabla 2). Sin embargo,a partir de este momento, cuando las plantas habfan estado sornetidas atemperaturas por debajo de los O°C durante 4 horas y se habfa alcanzado laminima temperatura (-3°C), se presentaron diferentes grados de supervi-vencia entre los genotipos, obteniendose al final que las plantas de S. acaulefueron las que mejor resistieron la coridicion de helada con un nivel de danebajo (cerca de un 20% de tejido muerto al final del experimento), encornparacion con los otros genotipos tratados (62% de tejido muerto en5. phureja, 95% de tejido muerto en las plantas transgenicas de Desiree y70% de tejido muerto en el cion 88-35-7).

1000>

'ij 0 80" >~'>c 0 60.".;?::::...

40u.C u.-U • 20c"0Q.

00 2 3 4 5 6 7 8

Traramiento de helada

-e-Acaule

... Phureja

.... Desiree

... 88-35-7

Figura 2. Supervivencia de los tejidos de plantas de diferemes genotipos de papasomeridos a una helada simulada. La supervivencia es expresada como el porcenrajede rejido vivo relative a plantas sin el tratarnienro de helada. Los datos se presentancomo los promedios ± error estandar del prornedio (n=4).

EI mayor porcentaje de muerte de tejido de las plantas transgenicas de Desireese observe en el paso del tratamiento de helada 4 al 5 (de un 92% de tejidovivo en el 4 a tan solo un 49% en el 5), cuando las plantas estuvieron some-tidas a -3°C por 2 horas y Ilevaban un acumulado de 6 horas bajo tern-peraturas subcero. Mientras que para 5. phureja y para el cion 88-35-7, los

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mayo res porcentajes de muerte de tejido se produjeron en los tratarnien-tos de helada 5 y 6 (de 76% a 54% en 5. phureja y de 84% a 67% en el cion88-35-7), cuando estuvieron sometidas a un recalentamiento rapido, pasandode _3°C a 15°C en apenas 4 horas.

FUENTE GL 5UMA DE CUADRADO VALOR PCUADRAD05 MEDIO F

Modelo 31 82200.84 2651.64 62.82 0.0001Genot. 3 11256.49 3752.16 88.89 0.0001Trat. 7 58310.81 8330.11 19734 0.0001Genot. *Trat. 21 12633.54 601.59 14.25 0.0001Error 96 4052.29 42.21Total 127 86253.14

R'0.953019

CV8.4277967

Desviacion Estandar6.4970280

Media77.09046875

Tabla 2. Analisis de Varianza (ANDEVA)para la supervivencia de plantas de dife-rentes genotipos de papa sometidas a una helada simulada (n=4).

En el tratamiento de helada 5, las plantas transgenicas de Desiree presentaronmas del el 50% de tejido muerto, punto considerado como el limite para lasupervivencia de la planta (Rada etal., 1985). Este punto fue alcanzado porla plantas de 5. phureja en el tratamiento de helada 6 y por el cion 88-35-7despues del tratamiento de helada 7.

Estos resultados eran de esperarse, toda vez que S. acaule es una especie de papaque crece entre los 3.700 y 4.200 msnm, y algunas veces se encuentra a 4.650msnm en las zonas andinas, en donde la ocurrencia del fen6meno de heladascon temperaturas congelantes puede darse en cualquier dta del afio, raz6n porla cual la especie, que esta adaptada a las condiciones extremas de frio que sepresentan en estas regiones, debe desarrollar mecanismos que Ie permitan nos610 sobrevivir, sino mantener sus procesos de crecimiento y desarrollo atemperaturas muy bajas. Es asf como las plantas de 5. acaule son capaces desoponar temperaturas hasta de _7°C sin aclimatarse y temperaturas por debajode los -10°C cuando han sido sometidas a procesos de aclimataci6n (Chen &Li, 1980b). Por 10 anterior, no es extrafio que las plantas que mejor resisten lahelada simulada en el presente experimento hayan sido las de esta especie, conniveles de dafio de los tejidos por debajo del 20%.

Las plantas del cion 88-35-7 tuvieron tam bien algun grado de resistencia a lastemperaturas bajas, de tal manera que el 50% de muerte del tejido no se

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alcanz6 sino hasta despues del tratarniento 7, es decir, cuando las plantashabtan sufrido una helada de 6 horas, con temperaturas minimas de _3°C pordos horas. Por sus caracterfsticas de duraci6n y en parte par la minimatemperatura alcanzada, se puede considerar que las plantas fueron sometidasa una helada muy fuerte y sin embargo, las plantas lograron sobrevivir duranteun buen tiempo. Esta respuesta era de esperarse, si se tiene en cuenta que elcion 88-35-7 tiene en su genealogra as. acaule (Tbr*(ad*phu)), de tal maneraque una parte de los genes de resistencia de 5. acauie podnan estar en lasplantas del don, confiriendole talerancia.

10000 a. Put librew:- b. Put solublec, 14000co~ 8000"0 12000E0 6000 10000~,c, 8000~ 4000-c0 6000

-oC 2000 40001:00 2000u

0 02 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8

w:- e. Put insoluble 20000 d. Put totalc, 6000 18000ec:,. 160000 5000E 14000c~ 4000 12000,c, 10000~ 3000-o 80000:" 2000 6000c~ 4000~0 10000 2000u

0 01 2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8

Tratamiento de helada Tratamiento de helada

Figura 3. Variaci6n en e! contenido de Putrescina (Put) de hojas de plantas dediferentes genotipos de papa, sometidas a una helada simulada. Los datos sepresentan como los promedios ± el error estandar del promedio (n = 4).

-e-Acaule • Phureja -6- Desiree ... 88-35-7

Uno de los resultados menos esperados al inicio de esta investigaci6n fue la pocaresistencia de las plantas transgenicas de Desiree a las ternperaturas bajas. Sin

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embargo, los resultados obtenidos se pueden explicar plenamente si se tiene encuenta que estas plantas transgenicas de Desiree ten (an incorporado un gen deresistencia a las temperaturas bajas del pez lenguado del Artico. Este gen codificapara un tipo especial de protetnas denominadas AFPs (antifreeze proteins) queinicialrnenre fueron identificadas en peces polares y en algunos insectos (Parody-Morreale et al., 1988; Sicheri & Yang, 1995a; Yang et al., 1988). Con base en estoshallazgos, se produjeron las plantas transgenicas, esperando que sintetizaranprotemas anticongelantes que sirvieran para conferirles resistencia contra el frro,Sin embargo, los trabajos iniciales mostraron un bajo nivelde protecci6n de entre32% y 45% (Estrada etal, 1994).

10000 a. Sprn fibre 300 b. Spm solubleG::-c,0<) 250-c,

""6 8000E 200c

E0- 6000 150V)

•-o 1000~ 2000c~ 50c0U 0 0

2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8

c. Spm insoluble 20000 d. Spm totalG::- 120c,co 100c- 160000E 80c

~ 60 10000c,

•-c 400~ 6000c 20~c0U 0 0 ,

2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8

Tratamienro de helada Tratarniento de helada

Figura 4. Variacion en el contenido de Espermina (Spm) de hojas de plantas dediferentes genotipos de papa, sornetidas a una helada simulada. Los datos sepresentan como los promedios ± el error estandar del promedio (n = 4) .• Acaute .. Phureja ... Desire .. 88-35-7

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Posteriormente se demostr6 que las AFPs tam bien estan presentes en plantas deinvierno aclimatadas, con un mecanismo de acci6n similar al de las AFPs de pecese insectos, es decir, inhibicion de la formaci6n de cristales de hielo, disminuci6nde 10. recristalizaci6n e incrementos en 10. histeresis termal (Griffith & Antikainen,1996; Griffith et al., 1997; Griffith & Ewart, 1995). Sin embargo, rnientras en lospeces las AFPs estan presentes en el plasma sanguineo, en donde ejercen sufunci6n (Sicheri & Yang, 1995b), las AFPs de plantas se localizan en el apoplasto,en donde son importantes para evitar los dartos por congelamiento que seproducen en las celulas vegetales (Antikainen etal., 1996). Esto quiere decir queen las plantas, no es suficiente con la sfntesis de las AFPs, es necesario que estassean secretadas al apoplasto, para 10 cual se necesiran mecanismos muy finos deregulaci6n y de transporte. En las plantas utilizadas en este trabajo, es probableque la incorporaci6n del gen de AFPs del pez lenguado a las plantas de Desireehaya inducido 10. sfntesis de las protefnas, pero debido a la procedencia del genpudo haber ocurrido que las plantas no tenfan los mecanismos regulaci6n ysecreci6n para que las AFPs pudieran Ilegar al apoplasto, de esta manera, auncuando las AFPs se estuvieran expresando en las plantas de Desiree, noestarfan lIegando al sitio de acci6n y por 10 tanto, no esrarian confiriendoninguna resistencia contra las temperaturas bajas. Sin embargo, esta es unahip6tesis que requiere ser confirmada.

La supervivencia de las plantas de s. acaule a las temperaturas bajas estaexplicada por el contenido de algunas formas moleculares de las poliaminasanalizadas, (Put libre, Spd ligada soluble y Spm ligada soluble). La acci6nde las poliaminas en 10. protecci6n de las plantas contra diferentes formasde estres es bien conocida (Faust & Wang, 1992; Flores, 1991). Incrementosen 10. concentraci6n de Put libre ya habtan sido correlacionados con latolerancia de cftricos (Kushad & Yelenosky, 1987), frijol (Guye et al., 1986),calabaza (Kramer & Wang, 1989; Kramer & Wang, 1990) y arroz (Lee et al.,1995) a temperaturas bajas. Adernas, se ha observado que el grade detolerancia a temperaturas bajas de variedades de trigo esta determinado porsu capacidad de sintesis de Put libre durante el perfodo de aclirnatacionque se produce en el otofio, existiendo una correlaci6n positiva entre lainducci6n cuantitativa de Put y la tolerancia 0.1 congelamiento de las plantasde trigo (Racz et al., 1996).

Asf, las mayores variaciones en el contenido de Put libre se presentaron enplantas de S. acaule sometidas a la helada simulada (Figura 3a). En la medidaen que la temperatura se hizo mas baja, la concentraci6n de Put libre seincremento, correspondiendo los valores mas altos de 10. poliamina a lasplantas sometidas a temperaturas por debajo de los ODe. La concentraci6n

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maxima de Put libre se alcanz6 en el momento de temperatura mas baja(tratamiento de helada 4, temperatura ~ -3°C).

Simultanearnente, los valores mas altos de Put ligada soluble (Figura 3b), seregistraron en las plantas de S. acaule, antes de la helada simulada(tratamiento de helada 1), que fueron mas de 3 veces superiores a los valoresmedios registrados para los otros genotipos analizados. En la medida en queavanz6 la helada simulada, la concentraci6n de esta poliamina empez6 adisminuir, de manera inversa a 10 ocurrido con la Put libre en las plantas de lamisrna especie. Asr, los valores mas bajos se registraron cuando la tem-peratura baj6 de los DoC, alcanzandose la minima concentraci6n de Putligada soluble, cuando la temperatura fue mas baja (tratamiento de helada 4,temperatura ~ -3°C).

a. Spd libre 6000 b. Spd soluble

G:' 500c, 5000M~ 400"E 40005- 300Ec, 3000

en• 200-o 20000

-o0 100~ 1000c0U 0 0

2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8

c. Spd insoluble 12000 d. Spd totalG:' 120c,M 10000~" 100E 8000c~0 60 6000c,•-o0 4000

~

-o 40'0~ 2000c0U 0 0

2 3 4 5 6 7 8 2 3 4 5 6 7 8

Tratamiento de helada Tratamiento de helada

Figura 5. Variaci6n en el contenido de Espermidina (Spd) de hojas de plantas de dife-rentes genotipos de papa sometidas a una helada simulada. Los datos se presentan comolos promedios ± el error estandar (n = 4) .• Acaule • Phureja ... Desire .....88-35-7

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En el presente estudio se observe que la respuesta de las plantas de s. acaulees inrnediata, con cam bios la concentracion de Put libre en la medida en quela temperatura disminuye. Es decir que, a diferencia de 10 observado hastaahora en las especies que incrementan el contenido de Put durante el periodode aclirnatacion, (cambios drasticos en los niveles de la diamina despues dedfas a incluso semanas), 10 que se obtuvo en el presente estudio fue un cam-bio rapido (de 1843 nmoljg PF a 8447 nmol/g PF), en tan solo unas pocashoras. Esta respuesta resulta fundamental para la supervivencia de las plantascomo s. acaule que estan sometidas a la condicion congelante en cualquiermomento de su crecimiento y desarrollo y deben responder a cambios detemperatura diaries, a diferencia de las plantas que crecen en zonas canestaciones y que deben cambiar su maquinaria rnetabolica durante el otofiopara poder tolerar las bajas temperaturas del invierno. Por 10 anterior, es muyimportante la variacion observada en la coricentracion de la Put ligada solubleen las plantas sometidas a los diferentes tratamientos de helada (Figura 3b).Si bien la Put libre seria la responsable de la proteccion de las plantas contralas temperaturas bajas, la Put ligada soluble resulta fundamental como fuentepara la produccion de la forma libre.

En las plantas de zonas templadas, en las cuales el proceso de aclirnatacionpara responder a las temperaturas bajas es gradual, los cambios en laconcentracion de la Put libre se producen por un aumento en la sintesis denovo de la Put. Trabajos realizados en calabadn (Kramer & Wang, 1990),muestran incrementos en la actividad de la ornitina decarboxilasa y la argininadecarboxilasa, enzimas c1aves en la sintesis de Put, hacia los 5 dias de acli-rnatacion, observandose hasta 12 veces mas actividad de estas enzimas 12dias despues de iniciado el tratamiento de aclirnatacion, es decir, cuando lasplantas alcanzan el maximo de tolerancia a las temperaturas bajas y lasconcentraciones mas altas de Put (Kramer & Wang, 1989). Sin embargo, enlas plantas que necesitan responder en ritmos diarios a los cambios drasticosde temperatura, deben existir mecanismos que hagan disponibles las formaslibres, metabolicamente activas e importantes para la proteccion contra eldafio por las temperaturas bajas, de manera rapida y con el menor gastode energia posible. Este mecanismo es la cornpartimentalizacion de laspoliaminas. As], euando la temperatura es alta y los requerimientos delas form as rnetabolicarnente activas son bajos, la Put es almacenada enform as conjugadas, unidas ya sea a azucares u otros compuestos solubles.AI bajar la temperatura, cuando las plantas requieren de altas concen-traciones de la diamina libre, se hidrolizan las formas conjugadas, y seincrementa la concentraci6n de las formas libres, a expensas, par supuestode las formas ligadas solubles.

40 Los cambios en el con ten ida de poliaminas estdn relacionados can to resistencia a temperaturasbajas en plantas de papa, Romero et 01.

En la 5pm libre (Figura 4a) y ligada soluble (Figura 4b) en 5. acaule, se pre-sentaron variaciones similares a las registradas para sus farmas moleculareshornologas de Put. En el caso de 5pm libre (Figura 4), la concentraci6n seincrement6 en la medida en que [a temperatura disminufa, obteniendose elvalor maximo (157.58 nmoljg PF) cuando la temperatura habra alcanzado supunto mas bajo (en el tratamiento de helada 4, temperatura ~ -3°C), luegode 10 cual se produjo la disminuci6n de la concentraci6n de la poliaminahasta alcanzar niveles similares a los del tratarniento de helada 1.

AI igual que habra ocurrido con la Put ligada soluble, la concentraci6n de5pm ligada soluble (Figura 4b) disminuy6 con la temperatura, de manerainversa a 10 observado para las formas libres de la hormona, en 5. acauleobteniendose los valores mfnimas cuando la temperatura lIeg6 a su puntomas bajo, en el tratamiento de helada 4 (110.91 nrnol/g PF). Cuando se ini-cio el calentamiento, la concentraci6n de la poliarnina se increment6rapidamente.

Las anteriores variaciones en Put libre y ligada soluble y en 5pm libre y ligadasoluble, no se presentaron en los genotipas mas sensibles a las temperaturascongelantes (5. phureja y Desiree transgenica), mientras que el cion 88-35-1que mostr6 alga de tolerancia, present6 unicarnente variaciones en las con-centraciones de 5pm libre y ligada soluble similares a las de S. acaule.

La forma como podrfan estar actuando la Put y la 5pm en la resistencia de lasplantas a las temperaturas bajas tiene que ver con el sitio primario de dario enla celu!a cuando se produce este tipo de esrres. Diversas investigaciones hanmostrado que la membrana celular es el primer sitio afectado en las celulassometidas a temperaturas congelantes (5teponkus, 1990) y es allf dondeestarfan actuando las poliaminas. En efecto, se ha comprobado que laspoliaminas esrabilizan las membranas celulares en plantas sornetidas adiferentes tipos de estres (Altman et 01., 1977; Flores, 1991), espedficamente,para el caso del estres por bajas temperaturas, las poliaminas puedendisrninuir el efecto de cambio de fase (phase transition) de lfquido-cristalino asol-gel que se presenta como respuesta a las temperaturas bajas (Guye et 01.,1986), al igual que estabilizan los fosfollpidos para evitar cualquier cambioconfiguracional que pueda ocasionar perdidas de las caracterfsticas de per-meabilidad selectiva (Flores, 1991).

Otra forma de acci6n de las poliaminas, estana dada por su capacidad dedisminuir la perdida de proteinas de membrana, que se produce en respuestaa las temperaturas bajas (Guy, 1990a; Guy, 1990b; 5teponkus, 1990)

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mediante la formaci6n de puentes cationicos, entre las poliaminas y losresiduos cisteinajmetionina de las proteinas vecinas (Guye et al., 1986;Kaur-Sawhney & Galston, 1991). Asf mismo, ayudarian a mantener la ac-tividad enzi rnatica y a proteger proteinas contra la actividad de proteasas(Kramer & Wang, 1990), que en otros casos son muy activas en plantassometidas a temperaturas congelantes.

EI dafio por bajas temperaturas es causado en buena medida por la deshi-drataci6n de las celulas debido a la influencia quimica del incremento enla concentraci6n de sales yjo acidos en el protoplasma (Steponkus, 1984).De esta manera, la supervivencia de las plantas a las temperaturas bajas estarelacionada con la capacidad de retener agua (Steponkus, 1990). Las polia-minas son compuestos policati6nicos raz6n par la cual son osm6ticamentemuy activos. Asi, la acumulaci6n de las formas libres sirve para que la celularetenga agua al disminuir el potencial osm6tico dentro de la celula, haciendomas diflcilla salida del agua al espacio intercelular (Norato & Romero, 1995).

La tolerancia inicial a las temperaturas bajas de las plantas del cion 88-35-7 erade esperarse, si se tiene en cuenta que tiene en su genealogfa a 5. acaule(Tbr*(acl*phu)), de tal manera que una parte de los genes de resistencia deS. acaule deben estar en las plantas del cion, confiriendo tolerancia. Sinembargo, el que la resistencia no haya sido completa se puede explicar por elhecho de que en las plantas del cion no se present6 el incremento en Put libreen respuesta a la disminuci6n de la temperatura, como ocurri6 en 5. acaule. Dela misma manera, no se present6 disminuci6n en los niveles de Put ligadasoluble, ya que la planta no tiene el mecanismo de protecci6n dependiente dePut contra el estres por bajas temperaturas que se presenta en la especiesilvestre. Unicamente se present6 la variaci6n en el contenido de Spm libre ySpm ligada soluble en respuesta a la condici6n extrema, similar, aunque dernenor magnitud, al observado en S. acaule. De esta manera, 10 que se puedepensar es que si bien la Spm libre es importante en la protecci6n de las plantascontra las temperaturas bajas, es tarnbien muy importante la Put libre, y sialguno de estos dos mecanismos no funciona, la resistencia de las plantas a lacondici6n extrema se ve muy disminuida, lIegando incluso a no presentarse.

As!, como en las plantas de 5. phureja y de Desiree transgenica no se present6ni el mecanismo de Put ni el mecanismo de Spm, se podria explicar la bajatolerancia de estas plantas a las temperaturas bajas. AI no tener estos meca-nismos de protecci6n las plantas quedaron sin ninguna defensa contra lacondici6n extrema, 10 cual ocasion6 el altisimo porcentaje de muerte de tejidoobservado.

42 Los combios en el contenido de poliaminas estdn relocionodos con la resistencia 0 temperaturasbajas en plantas de papa, Romero et 01.

Las formas ligadas insolubles tanto de Put como de Spm, asf como la Spd entodas sus formas, no presentaron variaciones en la concentraci6n que sepudieran relacionar con la tolerancia de las plantas a las temperaturas bajas.En este caso, los resultados obtenidos sirven para reafirmar la hip6tesis deque la Spd cumple unicarnente una funci6n como puente metab61ico para labiosfntesis de la Spm en las relaciones de fuente demanda que se presentandurante los patrones biosinteticos de las poliaminas (Norato & Romero,1995; Romero & Norato, en prensa).

CONCLUSIONES

Se determin6 la presencia y variacion de las poliaminas Put, Spd y Spm enhojas de plantas de diferentes genotipos de papa, sometidas a estres porbajas temperaturas, durante una helada simulada.

Las plantas de S. acaule fueron completamente tolerantes a las temperaturasbajas. Las plantas del cion 88-35-7 que en su genealogfa tienen a 5. acaule,presentaron algun grado de tolerancia. Mientras que las plantas de 5. phurejay plantas transgenicas de Desiree no presentaron ningun grado de tolerancia.

La tolerancia de las plantas de 5. acaule se relacion6 con su capacidad paraincrementar la concentraci6n de Put y Spm libres durante los momentos demas baja temperatura. Este incremento se produjo a expensas de las formasligadas solubles de las dos poliaminas asegurandose una respuesta rapida ycon bajo gasto de energfa.

EI bajo grado de tolerancia de las plantas del cion 88-35-7 se produjo por queeste genotipo present6 el mecanismo de incremento de Spm libre a expensasde la Spm ligada soluble, pero no present6 el mecanismo de la Put, por 10cualse puede concluir que los dos mecanismos son indispensables para que hayauna tolerancia total.

La Spd (Figura 5) tuvo un papel unicarnente como puente metabolico y suvariaci6n no se relacion6 con la tolerancia a las bajas temperaturas. La Put ySpm ligadas insolubles (Figuras 3c y 4c) no jugaron ningun papel en la tole-rancia de papa a las temperaturas bajas.

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AGRADECIMIENTOS

A Carolina Mendoza y Alfonso Rey de Merck Colombia por su ayuda en lasdeterminaciones cromatograficas. A Clemencia G6mez y Margarita Rojas porsu colaboraci6n durante la helada simulada. AI Departamento de Biologfa,Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogota.

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