6. Analisis de Agua y Alimentos

I

3 Anaacutelisis de aguas d consumo y de recreo

1 Aguas de consumo puacuteblico yaguas de recreo Teacutecnicas de deteccioacuten recuento e Identificacioacuten d mcro rganlsmos Indicadores e iacutendices

1 1 Introduccioacuten

Las aguas naturales pueden ser objeto de importantes modificaciones en su calidad microbioloacutegica debido a descargas ocasionales de aguas residuales como resultado de la acllvidad humana o de fenoacutemenos naturales (lluvias toshyrrenciales tifones ) Los efluentes residuales contienen un amplio rango de mIcroorganismos patoacutegenos que pueden ser un riesgo para la salud humana cuando son vertidosen aguas de consumo puacuteblico o de uso recreativo Entre los posibles habitantes del agua la fiora sanItariamente maacutes Importante es siempre la proveniente del medio terrestre en ella se incluyen muchos microorganismos que pueden ser patoacutegenos para el hombre entre los que destacan aquellos que fOnDan parte de la nora Inlestinal del ser humano y animales de sangre caliente la llamada flora fecal

La fuente de contaminacioacuten reall hacia las aguas marinas y continentales suelen ser los vertidos uas residuales sin tratar o Insuficientemente tratashydas El agua residual urbctna es sin ninguacuten lugar a dudas la de maacutes elevado iacutenshydice de contaminacioacuten microbiana pudiendo albergar cualquier tipo de microshyorganismo patoacutegeno para el hombre Contiene necesariamente flora de aparato digestivo de todos los Individuos de la comunidad e incluye numerosas especies bacterianas aJgunos hongos viru y protozoos La ingesta y el contacto direclo con estos microorganismos pueden producir patologiacutea en el ser humano

Asiacute pues la contaminadoacuten del agua de consumo o de recreo por parte de aguas residuales conlleva un Importante aumento del riesgo de adquirir enshyfermedad siendo eacuteste maacutexlmo en el caso del agua de bebida lo que obliga a hacer un tratamiento adecuado de la misma para garantizarla como potable ademaacutes de controlarla perioacutedicamente para detectar cualquier aumento en la carga microbioloacutegica permitida En el caso de las aguas de recreo la trascenshydencia es menor debido al lipo de contacto No obstante la flora presente en aguas residualM si se encuentra en elevada concentracioacuten puede crear probleshymas de importancia en piel y mucosas de los bantildeistas e incluso gastroenleritis y enterocolitis por ingestioacuten accidental de pequentildea cantidades de la misma

84 Auxiliar de Laboratorio Ouiacutemico Anaacutelisis cliacutenicos

12 Microorganismos indicadores

Son aquellos cuya presencia Indica una posible contaminacioacuten o la exIstenshycia de patoacutegenos poLenciales Muchos microorganismos o grupos de microorshyganismos han sido propuestos como indicadores y siguen buscaacutendose indicashydores ideales para disUnlas muestras de agua En cualquier caso un indicador de contaminacioacuten debe reunir los siguientes requisitos

lt1 estar presentes en heces aguas de desecho aguas residuales (cualshyquier medio en que los patoacutegenos esteacuten presentes) y ausentes en aguas sin polucioacuten fecal

Los niveles de indicadores deben tener una relacioacuten con la densidad de patoacutegenos en el medio acuaacutetico y ser proporcionales a la magnitud de la contaminacioacuten

3 La s ervlvencla de los indIcadores en agua debe ser al menos simishylar a la de los patoacutegenos Ademaacutes la resIstencia de lo indicadores a los factores de depuracioacuten y desinfectantes debe ser similar a ta de los patoacutegenos

4 Los Indicadores deben ser detectables r meacutetodos simples baratos eguros y raacutepidos

5 Los indicadores pueden no ser patoacutegenos y aplicables a todo tipo de muestras de aguas que requieran un programa de monitorizacioacuten

6 Las caracteriacutesticas de los indicadores deben ser coW~oWI_

7 Deben ser capaces de CreceT mulUplkarse en el agua

La calidad microbioloacutegica ysanitaria de las aguas se ha medido durante casi un siglo por anaacutelisis de microorganismos indicadores Los grupos de microorshyganismos maacutes ampliamente utilizados son

- Coliformes totales

Coliformes fecales y Escherichia eolio

) - Estreptococos fecales y Bnterococos

Eacutestos pueden considerarse los indicadores tradicionales aunque existen otros alternativos que cobran especial Intereacutes para determinadas muestras de agua

- Oostridios sulfito-reductores

Staphylococcus aureus

Pseudomonas aeruginosa =

84 Auxiliar de Laboratorio Quiacutemico Anaacutelisis clfnicos


Son aquellos cuya presencia Indica una posible contaminacioacuten o la exIstenshycia de patoacutegenos poLenclales Muchos microorgani mos o grupos de microorshyganismos han sido propueslos como indicadores y siguen buscaacutendose indicashydores ideales para distintas muestras de agua En cualquier caso un indicador de contaminacioacuten debe reunir los siguientes requisitos

ltp rstar presentes en heces aguas de desecho aguas residuales (cualshyquier medio en que los patoacutegenos esteacuten presentes) y ausentes en aguas sin polucioacuten fecal

(j) Los niveles de indicadores deben tener una relacioacuten con la densidad de patoacutegenos en el medio acuaacutetico y ser proporcionales a la magnitud de la contaminacioacuten

3 La su ervIvenc1a de los indIcadores en agua debe ser al menos simishylar a la de los paloacutegenos Ademaacutes la resistencia de lo indicadores a los factores de depuracioacuten y desinfectantes debe seT similar a la de los patoacutegenos

4 Los Indicadores deben ser detectables T meacutetodos simples baratos seguros y raacutepidos

5 Lo indicadores pueden no ser patoacutegenos y aplicables a todo tipo de muestras de aguas que requieran un programa de monitorizacioacuten

La camcteriacutesUcas de los indicadores deben ser co~jjjiexcl_

Deben seT capaces de crecer mnlUpUcarse en el agua

La calidad microbioloacutegica y sanitaria de las aguas se ha medldo durante casi un siglo por anaacutelisis de microorganismos indicadores Los grupos de microorshyganismos maacutes ampliamente utilizados son

)

- Colirormes totales

Coliformes fecales y EscherlchIa coU

- Estreptococos fecales y Enterococos


1--- C1ostridios sulfito-reductores


Pseudomonas aeruginosa

Anaacutelisis de aguas de consumo y de recreo as

121 Microorganismos indicadores tradicionales

1211 Ba er collformes totales

Son bacterias de montildeologiacutea bacilar gramnegativas aerobias o anaerobias facultativas no fonnadoras de endospoms oxidasa negativas y que fennentan la lactosa con produccioacuten de aacutecido y gas en 24-48 horas a 36 oc

La definicioacuten de coliformes totales no estaacute basada en criterios taxonoacutemicos estrictos sino en reacciones bioquiacutemicas especiacuteficas o en la apariencia de coloshynias caracteriacutesticas en medios selectivos o diferenciales

La presencia de estas bacterias en Instalaciones de agua puede compashyrarse con la de algunos patoacutegenos acuaacuteticos sin embargo son mucho menos persistentes que virus y protozoos En el caso de mernos acuaacuteticos naturales especialmente aguas marinas los colironnes totales presentan una tasa de sushypervivencia inferior a la de los microorganismos patoacutegenos

1212 Collfonnes fecales y Escherichla coll

Son los colifonnes totales maacutes proacuteximamente relacionados con la contamishynacioacuten fecal Estas bacterias cumplen todas las caracteriacutesticas definidas para los coliformes totales pero ademaacutes

Crecen con lactosa y la fermentan a 445 OC plusmn 02 oC produciendo aacutecido y gas en las primeras 48 horas de incubacioacuten

Son -coIlfonnes terrnotolerantes Incluyen cepas de los geacuteneros KJebmiddot siacuteela y Escherichia de los que se conoce que estaacuten reladonados con contaminacioacuten fecal procedente de animales de sangre caliente La teTshymotolerancia se considera un mecanismo de adaptacioacuten a las elevadas temperaturas que se encuentran en el tracto enteacuterico de los animales lo que se basa en una superior estabilidad de las proteiacutenas al calor

Escherichia coll es el maacutes uacutetil indicador de calidad del agua siendo el maacutes especiacutefico de la presencia de contaminacioacuten fecal de todo el grupo de los coll shyformes fecaJes

Problemas del uso de E coll como indicador

Puede detectarse en medios sin contaminacioacuten fecal

Tiene baja capacidad de supervivencia en medios acuaacuteticos

1213 lslreptococos fe ales y ertterococos

80n bacterias cocaacuteceas grampositivas aeToblas o anaerobias facullativas catalasa negativas que fennentan la glucosa con produccioacuten de aacutecido en meshynos de 48 horas a 37 OC

Son Indicadores muy uacutetiles de polucioacuten fecal en ecosistemas acuaacuteticos nashyturales por

Elewda y proacutexima relacioacuten con riesgo sanitario asociado con bantildeo en medios marinos y de aguas dulces fundamentalmente por siacutenlomas gastrointestinales

No son tan ubicuos como los coUformes

Estaacuten siempre presentes en heces de animales de sangre caliente

Anaacutelisis de aguas de consumo y de recreo 85


1211 Ba er califa es totales

Son bacterias de montildeologiacutea bacilar gramnegaUvas aerobias o anaerobias facultativas no fonnadoras de endosporas oxidasa negativas y que fennentan la lactosa con produccioacuten de aado y gas en 24-48 horas a 36 oc

La definicioacuten de colifonnes totales no estaacute basada en crllerios taxonoacutemicos estrictos sino en reacciones bioquiacutemicas especiacuteficas o en la apariencia de coloshynias caracteriacutesticas en medios selectivos o diferenciales

La presencia de estas bacterias en Instalaciones de agua puede compashyrarse con la de algunos patoacutegenos acuaacuteticos sin embargo son mucho menos persistentes que virus y protozoos en el caso de medios acuaacuteticos naturales especialmente aguas marinas los colifonnes totales presentan una tasa de sushypervivencia inferior a la de los microorganismos patoacutegenos

1212 Colifonnes fecales IJ Escherichla coll

Son [os coliformes totales maacutes proacuteximamente relacionados con la contamishynacioacuten fecal Estas bacterias cumplen todas las caracteriacutesticas definidas para los coliformes totales pero ademaacutes

Crecen con lactosa y la rennentan a 44S OC plusmn 02 oC produciendo aacutecido y gas en las primeras 48 horas de incubacioacuten

Son laquocollfonnes termotolerantes Incluyen cepas de los geacuteneros Klebshysiacuteela y Escherichia de los que se conoce que estaacuten relacionados con contaminacioacuten fecal procedente de animales de sangre caliente La leTshymololerancia se considera un mecanismo de adaptacioacuten a las elevadas temperaturas que se encuentran en el tracto enteacuterlco de los animales lo que se basa en una superior estabilidad de las proteiacutenas al calor

Escherlchia coll es el maacutes uacutetil indicador de calidad del agua siendo el maacutes especiacutefico de la presencia de contaminacioacuten fecal de todo el grupo de los collshyfonnes fecales

Problemas del uso de e coll como Indicador

Puede detectarse en medios sin contaminadoacuten fecal

Tiene biexcliexclja capacidad de supervivencia en medios acuaacuteticos

1213 amplreptococos fecales y tnterococos

Son bacterias cocaacuteceas grampositivas aerobias o anaerobias facullativas catalasa negativas Que fermentan la glucosa con produccioacuten de aacutecido en meshynos de 48 horas a 37 OC

Son Indicadores muy uacutetiles de polucioacuten fecal en ecosistemas acuaacuteticos na-turales por

Elevada y proacutexima relacioacuten con riesgo sanitario asociado con bantildeo en medios marinos y de aguas dulces fundamentalmente por siacutentomas gastrointestinales


estaacuten siempre presentes en heces de animales de sangre caliente

ea Auxiliar de Laboratorio Ouiacutemico Anaacutelisis ernicos

Son incapaces de multiplicarse en aguas residuales

Su peacuterdida de viabilidad es menos raacutepida que la de coliformes en aguas marinas y su persistencia es similar a aquella de las bacterias patoacutegeshynas de origen acuaacutetico

Problemas

falta de una teacutecnica de deteccioacuten estandarizada para su enumeracioacuten selectiva a partir de aguas de medlos naturales

Heterogeneidad taxonoacutemjca -estreptococos fecalesraquo incluye especies con diferente significado sanitario y caracteriacutesLicas de supervivencia

122 Microorganismos indicadores alternativos

Ninguno de los tradicionales cumple con Lodos los requisitos del indicador ideal por tanto se evaJuacutean otros posibles indJcadores

1221 Clo dlossulflto-reductores

Pertenecen al geacutenero Clostrldlum especialmente la especie C perfringens Constantemente presente en heces de animales de sangre caliente y en aguas residuales es maacutes estable en medios acuaacuteticos naturales que la mayoriacutea de los patoacutegenos Ha sido usado con eacutexito para monitorizar aguas contaminadas con residuos

Problemas

Ubicuos en sedimentos acuaacuteticos

Existen problemas de metodologiacutea para la deteccioacuten lo que limita su valor potencial como indicadores

Debido a la gran resistencia y longevidad de las esporas pueden ser Indicashydores muy uacutetiles de polucioacuten remota

1222 Staphylococcus aureus

Se relaciona con enrermedades no asociadas a diarrea especialmente afecshyciones de mucosas muy relacionadas con el bantildeo conjuntivitis otitis y probleshymas cutaacuteneos

Es estable y tiene gran resistencia a condiciones medioambientales (espeshycialmente en aguas marinas) Su concentracioacuten en agua ha mostrado ser represhysentativa de la carga microbiana aportada al agua por los bantildeistas Los meacutetodos para su aislamiento a partir de aguas marinas son asequibles

1223 Pseudomonas aeruglnosas

Miembros del geacutenero Pseudomonas se aiacuteslan con frecuencia de medios acuaacuteshyticos pero su presencia no implica necesariamente un posible riesgo de sanishydad puacuteblica Ha sido asociada a Infecclones relacionadas con el uso recreativo de las aguas y por lo tanto se propone como Indicador de calidad en aguas de uso recreativo es maacutes resistente que otros indicadores y microorganismos patoacutegenos a los procesos de tratamiento del agua y a factores ambientales es idoacutenea para control de calidad de aguas de piscina y Jacuzzi

Anaacutelisis de aguas de consumo y de reaeo 87

1224 Bacterloacutefagos

Los bacterloacutefagos son virus que parasltan bacterias Los propuestos como Indicadores son colifagos somaacuteticos y F-espedficos RNA bacterioacutefagos

Colifagos somaacutetIcos especiacuteficos de Escherichla eoll en correlacioacuten directa con la presencia de virus enteacutericos en aguas marinas ecosistemas de agua dulshyce y efluentes residuales

f-RJIIA bacterioacuteragos maacutes adecuados para estudiar el comportamIento de los viras enteacutericos en agua que como indicadores

13 TeacutecnIcas de deteccioacuten recuento e identificacioacuten de microorganismos Indicadores

131 Teacutecnicas de procesado de las muestras

Ji 31JilTeacuteCnlca del YIacutemerg MAs Probable (lt1fP)

Meacutetpdo estadiacutestico basado en la dispersioacuten aleatoria de los microorganismos en un liolumen de agua determioado es decir muestras repetidas del mismo tamallo de un mismo producto por lo que cabe esperar que contengan el mismo nuacutemero de microorganismos como promedio tsta cifia media estimada es el Nuacutemero Maacutes Probable Asiacute si un liacutequido tiene 100 microorganismos en 100 mI cada muestra de 10 mi debe contener 10 microorganismos la de 1 mi microshyorganismo y la d 01 mi soacutelo 1 microorganismo cada 10 muestras todo ello obviamente como promedio

Si se siembran varlos tubos de medio con muestras de distinto volumen es posible calcular el NMP de microorganismos en 100 mi de medio con cualquier c-omblnacioacuten de resultados obtenidos de tales muestras La siembra se realiza por triplicado o guintuplicado Tras incubar se observa turbidez cambio de coshylor o produccioacuten de gas seguacuten los casos obteniendo un valor numeacuterico Que a traveacutes de las tablas indica la cifra maacutes probable de microorganismos en la mueslra sobre la base del nuacutemero de tubos que manifiestan resultado positivo Existen tablas para muestras de 10 mI 1 mI y 01 mi - -~-

En la determinacioacuten existen tres fases presuntiva confirmativa y de anaacutelisis completomiddot

Pueden procesarse [ndi5tinlamente muestras claras o turbias

Inconvenientes

No proporciona Wl recuento preclso sino una estimacioacuten estadiacutestica de la presenda de un determinado microorganismo a valorar

- Se precisan muacuteltiples tubos de fermentacioacuten _ Iflrda de 5 a 7 diacuteas

U312Viltracioacuten por Membrana

Consiste en la concentracioacuten de Jos microorganismos del liacutequido hacieacutendolo pasar por un filtro de membrana con poro de 02-045 Iiacute quedando los microshyorganismos retenidos en la superficie del mismo A continuacioacuten el filtro se coloca sobre una placa de Petrl con un medio de cultivo adecuado y se incuba a


1224 Baclerloacutefagos

Los bacterloacutefagos son virus que parasitan bacterias Los propuestos como indIcadores son coliacutefagos somaacuteticos y F-espedficos RNA bacteri6fagos

Coliacutefagos somaacuteUcos especificos de Escherichla eoli en correlacioacuten directa con la presencia de viTU5 enteacutericos en aguas marinas ecosistemas de agua dulshyce y efluentes residuales

f-RM bacterloacutefagos maacutes adecuados para estudiar el comportamIento de los virus enteacutericos en agua que como indicadores

13 TeacutecnIcas de deteccioacuten recuento e identificacioacuten de microorganismos indicadores


JJ 3 Ll1TeacuteCnlca del OIIacutewero Maacutes Probable (lfMP)

Meacutetodo estadiacutestico basado en la dispersioacuten aleatoria de los microorganismos en un volumen de agua determinado es decir muestras repetidas del mismo tamantildeo de un mismo producto por lo que cabe esperar que contengan el mismo nuacutemero de microorganismos como promedio ~ cifra media estimada es el Nuacutemero Maacutes Probable Asiacute si un liacutequido tiene 100 microorganismos en 100 mI cada muestra de 10 mi debe coruener 10 microorganismos la de 1 mi 1 microshyorgan1smo y la d 01 mi soacutelo 1 microorganismo cada 10 muestras todo eUo obviamente como promedio

Si se siembran varios tubos de medio con muestras de distinto volumen es posible calcular el NMP de microorganismos en 100 mI de medio con cualquier combinacioacuten de resultados obtenidos de tales muestras La siembra se realiza por triplicado o quinLuplicado Tras incubar se observa turbidez cambio de coshylor O prOduccioacuten de gas seguacuten los casos obteniendo un valor numeacuterico que a lraveacutes de las tabJas Indica la cifra maacutes probable de microorganismos en la muestra sobre la base del nuacutemero de tubos que manifiestan resultado positivo Existen tablas para muestras de 10 mI 1 rnJ Y 01 mI - ---~-En la determinacioacuten existen tres fases presuntiva confirmativa y de anaacutelisis comp1sLomiddot

Pueden procesarse indistintamente muestras claras o turbias

lnconvenientes

No proporciona Wl recuento preciso sino una estimacioacuten estadiacutestica de la presencia de un determinado mIcroorganismo a valorar

- Se precisan muacuteltiples tubos de fermentacioacuten _ 1Qrda de 5 a 7 diacuteas

p 312VUlTacioacuten por Membrana

Consiste en la concentracioacuten de Jos microorganismos dellrquido hac1eacutendolo pasar por un fillro de membrnna con poro de 02-045 Iiacute quedando los microshyorganismos retenidos en la superficie del mJsmo A continuacioacuten el ftItro se coloca sobre una placa dePetri con un medio de cultivo adecuado y se incuba a

ea Auxiliar de Laboratorio Oulmiacuteco Anaacutelisis clfnlcos

la temperatura y el tiempo convenientes Las sustancias nutritivas indicadores etc difunden por capilaridad a traveacutes del filtro permitiendo que las bacterias presentes en la superficie se desarrollen durante la incubacioacuten y formen coloshynias visibles efectuaacutendose el resuent0 directamepte sobre la membrana

Si se busca presepda O a iexcleneja se puede enrollar e incluir la membrana en un medio de cultivo liacutequido y observar la aparicioacuten o no de turbidez

Permite el examen de grandes voluacutemenes de liacutequido con poblaciones bcias de mIcroorganismos la separacioacuten de eacutestos del medio de cultivo e incluso el cambio de los mismos de un medio de cultivo a otro sin interrumpir su ciclo de crecimiento Es maacutes precisa que el NMP

Inconvenientes

- No deben procesarse muestras de agua con turbidez o con partiacuteculas en suspensioacuten

Metales y renales pueden ser absorbidos en el filtro y limHar el creltishymiento de los microorganismos

132 TeacutecnIcas de anaacutelisis de Indicadores

1321 Determinacioacuten de bacterias eOIlormes totales y fecales

Podemos estudIar su presencia y cuantlficar su concentracioacuten medlante las dos teacuteOlicas de procesado que hemos comentado (NMP y fM) por otra parte existen teacutecnicas maacutes simples que no miden concentracioacuten pero que permiten evaluar de forma raacutepida la presenciaausencia (PA) de un determinado microshyorganismo

~ DetermInacioacuten mediante el mIr La teacutecnica se desarrolla en tres fdses

Prueba presuntiva en la que se manifiesta la fermentacioacuten de la lactosa con Qroducdoacuten de S Consiste en inocular con el agua tres series ( O 1 Y 01 mi) de oacute 5 tubos cada una que contengan un medio de cyltivo con lactosa un inhibidor del crecimiento de mishycroorgarusmos Grampositivos un indicador de pH Y una tipana Durham 1as la incubacioacuten a 36 OC plusmn 1 OC los tubos posi vos (fershymentacioacuten y producdoacuten de gas) se cuentan y se calcula el NMP de bacterias coUforrnes totales por 100 mI utilizando las tablas estadiacutesshyticas correspondienles (lIer esquema de paacutegina siguiente)

- toaeba confirmativa consiste en sembrar de nuevo una muestra de los tubos positivos en caldo lactosado e incubar para observashycioacuten de acldiflCacioacuten del medio y produccioacuten de gas Los tubos poshysitivos se cuentan para caacutelculo del nuacutemero maacutes probable acudiendo a las tablas correspondientes

- bull se siembran muestras de los tubos positivos de la prueba anterior en medio soacutelido selectivo para coliformes (agar fNDO o Levine fMB) Las colonias tiacutepicas de collformes apareceraacuten redonshydas oscuras y con brillo verde-metaacutelico Estas colonias se siembran de nuevo en caldo tactosado y se observan a microscopiacutea oacuteptica con tind n de Gram para comprobar que se trata de bacilos gramnegatishyvos fermentadores de lactosa con produccioacuten de aacutecido y gas

Auxiliar de Laboratorio Oulmfco Anaacutelisis cJnlcos

la temperatura y el tiempo convenientes Las sustancias nutritivas indicadores etc difunden por capilaridad a traveacutes del filtro permitiendo que las bacterias presentes en la superficie se desarronen durante la incubacioacuten y formen coloshynias visibles efectuaacutendose el recuento directamente sobre la membrana

Si se busca prgepcia O ordf senda se puede enrollar e incluir la membrana en un medio de cultivo liquido y observar la aparicioacuten o no de turbidez

Permite el examen de grandes voluacutemenes de liacutequido con poblaciones Ixtias de microorganismos la separacioacuten de eacutestos del medio de cultivo e incluso el cambio de los mismos de un medio de cultivo a otro sin interrumpir su ciclo de crecimiento Es maacutes precisa que el NMP

Inconvenientes

- No deben procesarse muestras de agua con turbidez o con partiacuteculas en suspensIoacuten

Metales y fenoles pueden ser absorbidos en el filtro y limitar el crecishymiento de los microorganismos

132 Teacutecnicas de anaacutelisis de Indicadores

L321 Determinacioacuten de bacterias collformes totales y fecales

Podemos ludiar su presencia y cuantlflsar su concentracioacuten mediante las dos teacute01icas de procesado que hemos comentado (NMP y fM) por otra parte existen teacutecnicas maacutes simples que no miden concentracioacuten pero que permiten evaJuar de forma raacutepida la presenciaausencia (PA) de un determinado microshyorganismo

(3) Determlnadoacuten mediante el -P La teacutecnica se desarrolla en tres fdses

- Prueba presuntiva en la que se manifiesta la fermentacioacuten de la lactosa con lroduccioacuten de rs COnsiste en inocular con el agua tres series (10 1 Y 01 [ntildel) de oacute 5 tubos cada una que contengan un medio de cuUivo con lactosa un lnhibidor del crecimiento de mishycroorganismos Gramposiacutetivos un Indicador de pN Y una ~ Durham Tras la Incubacoacuten a ~ OC plusmn 1 OC los tubos posit1VOS(fershymentacioacuten y produccioacuten de gas) se cuentan y se calcula el NMP de bacterias coliformes totales por 100 mJ utilizando las tablas estadiacutesshyticas correspondientes (ver esquema de paacutegina siguiente)

- trueba conflnnatlva consiste en sembrar de nuevo una muestra de lo tubos postUVOS en caldo lactosado e incubar para observashycioacuten de acidifteacioacuten del medio y produccioacuten de gas Los tubos poshysitivos se cuentan para caacutelculo del nuacutemero maacutes probable acudiendo a las tablas correspondientes

_ bull se siembran muestras de los tubos positivos de la prueba anterioT en medio soacutelido selectivo para coliformes (agar errno o Levine EMB) Las colonias tiacutepicas de collformes apareceraacuten redonshydas oscuras y con brillo verde-metaacutelico Estas colonias se siembran de nuevo en caldo lactosado y se observan a microscopiacutea oacuteptica con tind n de Gram para comprobar que se trata de bacilos grarnnegatishyOs fermentadorec de lactosa con producdoacuten de aacutecido y gas

Anaacutelisis de aguas de collSumo y de recreo 8e

1Odamp~ 1 m1 ele mlJlSlJa 01 mi de muostrn

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Siembra en plaCII con Ler1fne IMB o ENDO alM ji patflr de lo tubos po5ltIWM Incubar 240 2h a M oC t ~ oC

7fncloacuten de Oram badlos gramnegaiuos

Para la determinacioacuten de ooliformes fecales se sigue el mismo procedishymiento pero los tubo positivos en la prueba presuntiva se inoculan de nuevo en caldo tactosado y se incuban a 445 OC plusmn 02 OC durante 48 horas Asimismo la prueba completa incluye la siembra en medio soacutelldo selectivo para cotiformes (agar eNDO o eMB) o en medio para coliformes fecales (mfC) con Incubacioacuten a 445 OC ~ 02 OC

70 Auxiliar de Laboratorio Oulmlco Anaacutelisis cliacutenicos

Determinacioacuten mediante filtracioacuten por Membrana La teacutecnica conshysiste en la filtracioacuten de un volumen conocido de agua (normalmente 100 mi) a traveacutes de una membrana de 045 OC plusmn ] m de poro y la posterior siembra de dicho filtro en medio soacutelido selectivo para coIifonnes (Levine EMB o ENDO) Tras la incubacioacuten a 36 OC plusmn 1 OC durante 24-48 horas se realiza el recuento de las colonias caracteriacutesticas que aparecen soshybre el nitro Eacutestas corresponden a colifonnes totales ruede hacerse una confirmacioacuten por siembra en caldo Iactosado y Uncioacuten de Gram Para la determinacioacuten de conrormes fecales se procede del mismo modo pero cambiando la temperatura de incubacioacuten como en el caso del NMP El medio selectivo para siembra del ftltro puede ser mFC

1322 Determinacioacuten de 1streptococos y Enterococos

Como se ha comentado anteriormente uno de los problemas acl Jales para la determinacioacuten de este tipo de microorganismos es la gran heterogeniacutecidad del grupo por lo que las teacutecnicas a emplear estaacuten en revisioacuten No obstante inshycluimos aquiacute dos meacutetodos estandarizados para su deteccioacuten y recuento o Detenninacloacuten mediante la teacutecnica del Nuacutemero Maacutes Frobable

COmo en el caso de los colifonnes se realiza una prueba presuntiva con una baleriacutea de tubos y tres voluacutemenes de muestra diferentes El medio de cultivo empleado es el de Rothe o el KM (Kanamicina Aesculina Azlda) que se Incuba a 37 OC durante 24-48 horas Los tubos positivos se detectan por cambio de color (eijnesresiwiepto en el caso del KM) La prueba confirmativa se realiza mediante siembra de una muestra de los tubos positivos en la superficie del medio soacuteUdo (KM o Listky) Se incuba a 37 OC durante 24-48 horas y se considera positivo el desarrollo de colonias caracteriacutesticas (con halo negro enfiAA) Una vez confirmashydos los Lubos positivos se realiza la estimacioacuten del NMP consultando las tablas correspondientes

Determinacioacuten mediante Mltradoacuten por Membrana Se sigue el mismo pTocedimiento de nitrado de la muestra de agua Que se ha coshymentado en el caso de los coliformes La membrana se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo soacuteUdo selectivo (agar KP u otros) 1hIs una incubacioacuten de 24-48 horas a 37 oC se cuentan las colonias de aspecto caracteriacutestico (rojo ladrllJo en agar Kf)

1323 DetermLnacioacuten de esporas de clostrtdios sulfito-reductores

Para la determinacioacuten de esporas en muestras de aguas se procederaacute de forma que se destruyan todas as posibles rormas vegetativas antes de la incushybacioacuten de la muestra con el medio de cultlvo No podemos olvidar que las bacteshyrias del geacutenero Clostridlum son anaerobias estrictas y por lo tanto la incubacioacuten se debe realizar en una atmoacutesrera carenle de oxiacutegeno

Existen diversas teacutecnicas para determinar la presencia y cuantificar las esposhyras de esto microorganismos La que se expone a continuacioacuten es una teacutecnica estandarizada para anaacutelisis de aguas potables

Pueden procesarse de 20 a 100 mi de agua dependiendo de los requisitos del anaacutelisis En caso de que se estudien 100 mi se realizaraacute el procedimiento por Quinluplicado

70 Auxiliar de Laboratorio Qumico Anaacutelisis cliacutenicos

Detennlnacloacute mediante filtracioacuten por Membrana La teacutecnica conshysiste en la filtracioacuten de un volumen conocido de agua (noTmalmente 100 mI) a traveacutes de una membrana de OA5 OC plusmn 1 m de poro y la postentildeor siembra de dicho ftltro en medio soacutelido selectivo para coliformes (Levine EMB o ENDO) nas la incubacioacuten a 36 OC plusmn 1 OC durante 24-48 horas se realiza el recuento de las colonias caracteriacutesticas que aparecen soshybre el Hltra Eacutestas corresponden a coliformes totales PUede hacerse una confirmacioacuten por siembra en caldo lactosado y tincioacuten de Gram Para la determinacioacuten de coliformes feltales se procede del mismo modo pero cambiando la temperatura de incubacioacuten como en el caso del NMP El medio selectivo para siembra del rotro puede ser mfC

1322 Determinacioacuten de Istreptococos y Enterococos

Como se ha comentado anteriormente uno de los problemas acl Jales para la determinacioacuten de este tipo de microorganismos es la gran heterogenicidad del grupo por lo que las teacutecnicas a emplear estaacuten en revisioacuten No obstante inshycluimos aquiacute dos meacutetodos estandarizados para su deteccioacuten y recuento o Determlnadoacuten mediante la teacutecnica del Nuacutemero Maacutes Frobable

Como en el caso de los coliformes se realiza UDa prueba presuntiva con una bateriacutea de tubos y tres voluacutemenes de muestra diferentes El medio de cultivo empleado es el de Rothe o el KAA (Kanamicina Aesculina A2lda) que se incuba a 37 OC durante 24--48 horas Ws tubos positivos se detectan por cambio de color (eunoorZiwiepto en el caso del KM) La prueba conflnnativa se realiza mediante siembra de una muestra de los tubos posltivos en la superficie del medio soacutelido (KM o Listky) Se incuba a 37 OC durante 24-48 horas y se considera positivo el desarrollo de colonias caracteriacutesticas (con halo negro enfiAA) Una vez confirmashydos los tubos positivos se realiza la estimacioacuten del NMP consultando las tablas correspondientes

reg Determinacioacuten medJante fllbacloacuten por Membrana Se sigue el mismo procedimiento de nitrado de la muestra de agua que se ha coshymentado en el caso de los conformes La membrana se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo soacutelido selectivo (agar KF u otros) llas una incubacioacuten de 24--48 horas a 37 oC se cuentan las colonias de aspecto caracteriacutestico (rojo ladrillo en agar KF)

1323 DetermLtladoacuten de esporas de cLosbidios sulfito-reductores

Para la determinacioacuten de esporas en muestras de aguas se procederaacute de forma que se destruyan todas las posibles rorroas vegetatlvas antes de la Incushybacioacuten de la mu tra con el medio de culUvo No podemos olvidar que las bacteshyrias del geacutenero Clostridlum son anaerobias estrictas y por lo tanto la incubacioacuten se debe reaH2ar en una atmoacutesfera carenLe de oxiacutegeno

Existen diversas teacutecnicas para determinar la presenCia y cuantificar las esposhyras de esto microorganismos La que se expone a continuacioacuten es una teacutecnica estandarizada para anaacutelisis de aguas potables

PUeden procesarse de 20 a 100 mI de agua dependiendo de los requisitos del anaacutelisis en caso de que se estudien 100 mi se realizaraacute el procedImiento por quintuplicado

Anaacutelisis de aguas de consumo y de recreo 7 1

~n primer lugar se calienta el agua problema a 80 OC durante 5 minutos (elishyminacioacuten de fonnas vegetativas) POsteriormente se e a y se moculan 30 mi de medio de cultivo fundido (45 OC) con 20 mi del agua problema en un tubo esteacuteril de 50 ml de capacidad) se homogeniza la mezcla evitando que se incorporen burbujas de aire El tubo debe edar lleno hasta el borde ce do hermeacuteticamente o La incubadoacuten se realiza a 31 oacuteurante 24-48 horas transcurrido este tiempo se observa la presenda de colonias redondas y negras (como bolas de pimienta) que corresponden al desashyrrollo de colonias por parte de las esporas de costrldios presentes en la muestra de agua El nuacutemero de colonias de cada tubo corresponde a la cifra de esporas por cada 20 mi de agua El medio de cultivo empleado (TSC u otros) contiene sulfitos que al reducirse dan el color negro a las colonias

1324 Determinacioacuten de Staphylococcus aUTeUS

Su presencia y recuento puede estudiarse por la teacutecnica del Nuacutemero Maacutes Probable y por filtracioacuten Los medios selectivos utilizados pueden ser varios como el caldo Gioliti Cantoni el agar Chapman para estafilococos o el MSA (Mashynitol sal Agar) Es convenienleconfirmar la determinacioacuten mediante siembra en medio de Baird Parker con yema de huevo

1325 Determinacioacuten de Pseudomonas aeroginosa

Su presencia uele analizarse por la teacutecnica de la filtracioacuten por membrana utilizando como medio selectivo de cultivo el agar Cetrimid44 Puumlede con Irmarse la determinacioacuten por demostracioacuten de la formacioacuten de pigmentos caractentildestishycos de esta bacteria Para eUo se siembran las colonias desarrolladas en agar Cetrirnlde en los medios agar Ay B de Klng El agar A permite demostrar la presencia de piocianina y el agar B la de pioverdina

2 Microorganismos patoacutegenos transmlt por agu CaracteriacutesUcas y patologiacutea

21 Introduccioacuten el agua en la transmisIoacuten de enfermedad Infecciosa

De los diferentes factores que se han asociado con el riesgo de enfermar en cualquier eacutepoca de la historia el agua ha sido uno de los que ha despertado mayor InLereacutes Algunas de las epidemias maacutes devastadoras de la hisloria han sido transmitidas por el agua y actualmente son muchas las enfermedades inshyfecciosas transmisibles por este elemento aunque as de mayor trascendencia son las denominadas gastrointestinales o de transmJsl6n feco-bidrlca en las que el agua es el prmdpal mecanismo responsable Como eLagua no es un buen medio de cultivo y ademaacutes operan mecanismos de autodepuracloacuten las posibishylidades de supervivencia y multiplicacioacuten de los microorganismos son escasas lo que explica que por 10 general las Infecciones de origen hiacutedrico se producen cuando la transmisioacuten es raacutepida es decir cuando no media mucho tiempo entre el momento de la contaminadoacuten del agua y su consumo lo que hace Que las enfermedades transmitidas POT el agua adquieran una gran importancia cuando se producen por contaminadoacuten de una red de abastecimiento puacuteblico

72 Auxiliar de LabOratorio Qufmico Anaacutelisis clfnicos

La mayoriacutea de las enfermedades humanas asociadas con aguas microbioshyloacutegicamente contaminadas estaacuten producidas por microorganismos patoacutegenos que son aportados al agua mediante contaminacioacuten fecal procedente de persashynas yo animales

La Importancia del agua como elemento de transmisioacuten de enfermedades Infecciosas se basa fundamentalmente en dos factores

Es susceptible de ser contaminada por agentes patoacutegenos 2 El consumo del agua es universal El uso de mayor riesgo es el consumo de agua por ingesta pero tambieacuten

hay que contemplar como posible mecanismo de adquisicioacuten de enfermedades infecciosas el uso con fines deportivos o recreativos y terapeacuteuticos tanto de las aguas marinas como las continentales Asimjsmo otros usos del agua como la preparacioacuten de compuestos farmacoloacutegicos e induso como eJemento de refri shygeracioacuten en instalaciones de aire acondicionado tiene cierto Intereacutes sanitario como veremos maacutes adelante

Epidemioloacutegicamente el agua PUede ser la fuente de infeccioacuten cuando se transmiten microorganisshymos que tienen el agua como haacutebitat naturaJ Puede ser la viacutea de dlsemlnacloacuten desde la fuente pasa al agua y a partir de ella se adquiere la lnfeccioacuten Las viacuteas de enbada para microorganismos transmitidos por el agua pueden ser varias destacando como maacutes importante la viacutea oraJ seguishyda de la cutaacuteneo-mucosa

Hay que tener en cuenta que el agua participa tambieacuten de forma importante en la transmisioacuten de enfermedad Infecciosa por vectores ya que con frecuencia eacutestos se asocian a los medios acuaacuteticos especialmente los mosquitos

22 Mecanismos de transmisioacuten de enfermedades Infecciosas por el agua

En cuanto a los mecanismos de transmisioacuten de enfermedad infecciosa por el agua podemos distinguir dos grandes grupos

Dmctos

bull lngesta de agua contaminada Contacto directo con piel y mucosas

Jndlrectos Ingesta de productos acuaacuteticos (animales y vegetales) ltansmisioacuten por vectores

a) Mecanismos cUreclos los mecanismos de tJansmisioacuten directa suposhynen que el hombre contacta con el medio acuaacutetico y adquiere la enfershymedad por colonizacioacuten de uno o maacutes de sus tejidos por parte de la flora presente en el agua Dependiendo de la viacutea de entrada del microshyorganismo en el cuerpo humano se distinguen dos grupos de enfermeshydades que a su vez se subdividen en otros dos seguacuten el t~ido diana en el que se manifiesta la patologiacutea Asiacute tenemos

Adquisicioacuten de microorganismos patoacutegenos por iexclngesta de agua Es el mecanismo maacutes frecuente e importante Las enfermedades

ut+nMII

72 Auxiliar de Laboratorio Quiacutemico Anaacutelisis olfnicos

La mayoriacutea de las enfermedades humanas asociadas con aguas microbioshyloacutegicamente contaminadas estaacuten producidas por microorganismos patoacutegenos que son aportados al agua mediante contaminacioacuten fetal proceden Le de persoshynas yo animales


1 es susceptrble de ser contaminada por agentes patoacutegenos 2 El consumo del agua es universal El uso de mayor riesgo es el consumo de agua por ingesta pero tambieacuten

hay que contemplar como posible mecanismo de adquisicioacuten de enfermedades infecciosas el uso con fines deportivos o recreativos y terapeacuteuticos tanto de las aguas marinas camo las continentales Asimjsmo otros usos del agua como la preparacioacuten de compuestos farmacoloacutegicos e incluso como elemento de refrishygeracioacuten en instalaciones de aire acondicionado tiene cierto Intereacutes sanitario como veremos maacutes adelante

Epiderniacuteoloacuteglcamente el agua PUede ser la fuente de infeccioacuten cuando se transmiten microorganisshymos que tienen el agua como haacutebitat natural PUede ser la viacutea de diseminacioacuten desde la fuente pasa al agua y a partir de ella se adquiere la infeccioacuten Las viacuteas de enbada para microorganismos Lransmft1dos por el agua pueden ser varias destacando como maacutes importante la viacutea oral seguishyda de la cutaacuteneo-mucosa


22 Mecanismos de transmIsioacuten de enfermedades Infecciosas por el agua

En cuanlo a los mecanismos de transmisioacuten de enfermedad infecciosa por el agua podemos distinguir dos grandes grupos

Directos

bull Ingesta de agua contaminada Contacto directo con piel y mucosas

indirectos Ingesta de productos acuaacuteticos (animales y vegetales) 1lansmisioacuten por vectores

a) Mecanismos directos los mecarusmos de transmisioacuten directa suposhynen que el hombre contacta con el medio acuaacutetico y adquiere la enfershymedad por colonlzadoacuten de uno o maacutes de sus t~ldos por parte de la flora presente en el agua Dependiendo de la viacutea de entrada del microshyorganismo en el cuerpo humano se distinguen dos grupos de enfermeshydades que a su vez se subdividen en olros dos seguacuten el t~ido diana en el que se manifiesta la patologiacutea Asiacute tenemos

Adquisicioacuten de microorganismos patoacutegenos por ingesta de agua Es el mecanismo maacutes frecuente e importante Las enfermedades

ut+YH1II


intermediarios La enfennedad que producen se de Ina fasclollasJs y se caracteriza por la afectacioacuten hepaacutetica y del sistema biliar

Los trematodes del geacutenero Schlstosoma producen la enfermedad denomi shynada esquistosomiacuteasis bilharzfasis o fiebre de los caracoles estos organIsmos tienen sexos diferenciados Una de las fases de su ddo bioloacutegico tiene lugar en el caracol del que se eliminan las cercarias infectantes para el hombre La inshyfeccioacuten se adquiere por penetracioacuten de estas cercarlas a traveacutes de la pIel intacta cuando eacutestas nadan en un medjo acuaacuteUco Ona vez en ellnterlor del organismo van a localizarse en el aparato circulatoria desarrollaacutendose en el sistema portaJ Intrahepaacutetico La hembra tiene un cuerpo largo y ciliacutendrico y el macho es maacutes corto y plano con el cuerpo dividido longitudinalmente en dos partes que pueshyden plegarse constituyendo el canal ginecoacuteroro en el que la hembra se acopla para ser rtiLlzada Unidos recorren el torrente circulatorio hasta los plexos meshysenteacuter donde la hembra se libera para pasar a vasos maacutes estrechos en los que deposita sus huevos que van a atravesar la pared Intestinal o vesical (seguacuten la especie) eliminaacutendose al intestino o v~iga de la orina (esquistosomiasis inshytestinal o vesical) En esta situacioacuten los gusanos ingieren eritrocItos (hematiacutees) y la hembra se acopla y desacopla constantemente en el canal ginecoacuteforo siendo fertiliacutezada de nera conHnua y liberando huevos en heces u orina sin cesar La infeccioacuten puede cronificarse y durar 20 o 30 antildeos

2352 Nemalodes

Dentro de este grupo existen diversos gusanos redondos con sexos diferenciashydos que pueden reiadonarse con una enfermedad adquirida a traveacutes del agua por desarrollarse alguna de sus lBses de vida en medios huacutemedos El contacto directo de la piel con el agua contaminada puede permitir la penetracioacuten de los gusanos y su desarrollo fundamentalmente en el sistema Ilnfaacutetico donde pueden producir bloqueos importantes de clnuladoacuten de Ilnfa con el consiguiente engrosamiento y falla de fundoacute] de la zona afectada Lo maacutes frecuente es quese Instauren en rnlemshybros inferiores y el cuadro cliacutenico que generan se denomina elefantiasis

3 Aguas de consumo puacuteolico yaguas de recreo Teacutecnicas de deteccioacuten recuento e identificacioacuten de mlcroorgani mos patoacutegenos

31 Aguas de consumo puacuteblico y de uso recreativo

Desde el punto de vista sanitario se distinguen varios tipos de agua que tienen diferentes requerimientos de caLidad fundamentalmente definidos por el uso a que van destinadas En este sentido existen dos grandes grupos

a) Aguas de CODSU puacuteblico Incluyen las aguas de la red puacuteblica de abastecimiento de pozos y depoacutesitos de manantiales las utilizadas como materia prima en la industria alimenticia cosmeacutetica farmaceacuteutica Dentro de este grupo el estudio microbioloacutegico del agua tiene el primorshydial intereacutes de permitir declarar el agua como potable o no potable

b) Aguas de liSO recreativo Incluyen las de sistemas artificiales como piscinas yacuzzi o instalaciones de parques de agua y las aguas marishynas de las zonas costeras fundamentalmente las de las playas

114 Auxiliar de Laboratorio Ou(mico Anaacutelisis clfrricos

311 Calidad del agua para consumo puacuteblico

El agua puede tener sustancias u organismos que hacen que se convierta en causa de enfermedad cuando se utiliza para satisfacer necesidades bioloacutegicas esta realidad acompantildeada de la importancia del agua en la vida del hombre lleva a las distintas adminlstradones a plantear la necesidad de garantizar a la poblacioacuten un abastecimiento adecuado de agua Para ello se establecen criteshyrios de calidad del agua Por Ejemplo la Unioacuten Europea plantea estos criterios con un sentido orientativo pennitiendo que cada paiacutes establezca los propios que vendraacuten recogidos en las correspondientes legislaciones Asiacute el desarrollo de una normativa sanitaria para control de calidad del agea se basa

1 Conocimientos sobre riesgos toxicoloacutegicos e infecciosos de las sustanshycias y microorganismos que se suelen encontrar en el agua

2 Calldad de los recursos hiacutedricos disponjbles

3 Grado de desarrolto econoacutemico y social en el aacutembito de aplicacioacuten de la normativa

La reglamentacioacuten debe ser realista que intente garantizar una calidad adeshycuada pero de posible cumplimiento teniendo en cuenta los recursos del paiacutes

Siguiendo con el ~empLo la ComunIdad Econoacutemica Europea manifiesta los criterios de calidad a seguir para las aguas destinadas a consumo humano fn esta reglamentacioacuten se establecen las CMAs (Concentraciones Maacuteximas Adshymisibles) para cada uno de los indicadores microbioloacutegicos y fiacutesico-quiacutemicos a detectar y cuantificar Las aguas que superan estos liacutemites se consideran No Potables

Exi ten tambieacuten normativas para la cualificacioacuten sanitaria de las aguas desshytinadas a uso recreativo ln este sentido la CEE establecioacute unos limites microshybioloacutegicos para las aguas marinas de zonas de bantildeo que son los que deben cumplir las playas para su calificacioacuten como -Playas azules En cuanto a las piscinas yacuzzis y parques de agua la normaliva a seguir suele venir estableshycida en nuestro paiacutes por cada una de las comunidades autoacutenomas

312 Calidad de aguas potables

La Comisioacuten Econoacutemica de las Naciones Unidas habla de la conlaminacioacuten de las aguas como cualquier a1teracioacuten en la composicioacuten o estado del agua consecuencia directa o indirecta de las actividades humanas hacieacutendola menos conveniente para su uso

Los criterios bioloacutegicos para calificar un a dependen de la legislacioacuten de cada paiacutes por ejemplo en Espana son los siguientes

DetcrmlliKl6n NI~CI gUia cm BacLerias aeroblas a S7 OC 10 UFCJml -

Bacterias aeroblas a 22 OC lOO UfCJtnl -

CoUformes totales - lt1 (NMP) O (fM)lOO mI

Collformes fecales - lt l(NMP) O (fMII IOO mi

Estreptocoms fecales - ltl(NMP) O (fM)Il00 mi

Anaacutelisis de aguas de consumo y de recreo 8a

bullbull f

Clostlidios sulf-reductores - lt1(NMP10 (IM)n O mi

Paraacutesitos No

Microorganismos patoacutegenos No

Anlmaacuteculos No

Algas No

Dentro de las aguas consideradas potables hay diferentes tipos y eAige un deshytennlnado nivel de calidad para cada una de ellas Concretamente se dlstinguen

Aguas de la red puacuteblica de abasteclmiento

Aguas de bebida envasadas

MIneromedicinales emergen espontaacuteneamente o se captan Deshyben ser uacutetiles para terapia en el lugar donde emergen y conservar los efectos despueacutes de envasadas

Minerales naturales deben tener una accioacuten favorable fisioloacutegicashymente sin llegar a ser terapeacuteuticas fuera del lugar donde emergen

De manantial aguas que emergen espontaacuteneamente o se captan y que cumplen los requisitos de potabilidad

Potables preparadas aguas que previa autorizacioacuten se tratan para que cumplan las normas de potabilidad y se envasan

Los criterios de calidad para las aguas de la red puacuteblica son los expuestos para aguas potables En el caso de aguas de bebida envasadas ademaacutes de eacutesshytos deben cumplir otros requisitos microbIoloacutegicos en el punto donde emergen y una vez envasadas

hato ck emergencia Ea el eftllUC

Ausencia en 100 mI de Ausencia en 100 mi de

- Paraacutesitos Los anteriores y ademaacutes

- Microorganismo patoacutegenos - Pseudomonas aeruginosa

tntuobacteJias 1 coU Salmonella - Staphylococcus aureus

esporas de closlTldlos sulflto-reductores

313 Calidad de aguas de recreo

Se ha ido considerando la nec~iexcldad de establecer criterios de calidad para otras aguas utilizadas con fines recreativos como son las Instalaciones artificIashyles (piscinas etc) que dependen de la legislacioacuten de cada paiacutes por ejemplo en Espantildea son los siguientes

313 bullAguas marinas

DetCT1l1lr~~

01110 aceptable alto Peligroso

Collformes totales 100 mi lt500 500-10shy gt100000

Collformes fecales 100 mi 0-10 lt100 gt100 gt2000

fnlerococos 100 mi 010 lt100 gt100 gt2000

ea Auxiliar de Laboratorio Qulmico Anaacutelisis clfnicos

3132 Aguas de Instalaciones artificiales

Existen diversa normativas seguacuten las comunidades autoacutenomas pero en el aspecto microbioloacutegico en general se exige

DdeI1llIaacJ6n VoIumeo IIIJleaba CIllA

Coliformes totales loomJ o Coliformes recales 100 mi o Baclertaspatoacutegenas

- UumllterocOCOS

- FSeudamonas aertlginosa 100 mJ o

o PaTaacutesitos no se especifica Ausencla

Algas no se espedflca Ausencia

32 Anaacutelisis microbioloacutegico de las aguas de consumo

321 Toma de muestras de agua

La toma de muestras debe siempre respetar la composicioacuten microbioloacutegica del agua captada El mateTial utilizado debe ser esteacuteril y la muestra de un voshylumen adecuado seguacuten el meacutetodo de anaacutelisis a empLear pero nunca inferior a 250 mi La teacutecnjca para tomar la muestra dependeraacute del sistema de extraccioacuten del agua

Agua de grifo Retirar filtros u otros aaesorios limpiar cuidadosamente el grifo con agua o alcohol flamear el extremo con un aJgcxloacuten empapado en alcohol Abrir el grifo d~ando que el agua Huya abundantemente DesshyIapar eIliacuteasco esterilizado sin tocar la boca ni el interior del tapoacuten y llenarshylo con la muesLra de agua Volver a cerrar inmediatamente el frasco

Agua de pozos y depoacutesltos Si disponen de bomba de captacioacuten se procede igual que en el caso del grifo Si no pueden utilizarse aparashytos especiales lastrados que permiten introducir el rrasco esterilizado y destaparlo a la profundIdad deseada para llenarlo con la muestra Si no se dispone de estos no es posible obtener una buena muestra represhysentativa pero se puede proceder de la siguiente forma Introducir en la masa de agua el frasco de muestreo lo maacutes Limpio posible sostenieacutendoshylo con una cuerda remover con el frasco la superficie del agua antes de llenarlo con la muestra

Agua de lagos y riacuteos Hay que considerar factores como la profundishydad del caudal dlstanda a la orilla etc La muestra debe tomarse lo maacutes IEios posible de la orilla procurando nO remover el fondo y evitanshydo los remansos y zonas de estancamiento de agua SqjetaT el frasco por el fondo en posicioacuten invertida sumergirlo completamente y darle la vuelta en sentido contrario a la corriente (riacuteo) o desplazaacutendolo horizonshytalmente en la wreccioacuten de la boca del frasco (lagos)

Agua de manantiales En manantiales naturales o fuentes de caudal continuo sin dispositivos de Intermitencia se tomaraacute la muestra dlrecshytamente sin adoptar medidas especiales de drenaje

7 Anaacutelisis de aguas de consumo y de recreo

Agua de bocas de riego Se utlllzaraacuten acoplamientos especiales que permitan tomar la muestra como en el caso de los grifos

Agua de mar (playas) Preferiblemente tres zonas de toma de muestra en una misma playa y en tres momentos diferentes a lo largo del diacutea Debe tomarse una muestra de la masa de agua Que entra en contacto con la mayoriacutea de los bantildeistas introducieacutendose en el mar hasta la cin shytura e Introduciendo el frasco hasta unos 10-15 cm de la superHcIe

Agua de Isdnasl c es a bull La teacutecrtica es similar a a e los agos y a una profundidad de unos 15middot30 cm de la superficie es necesario neutralizar el efecto de los desinfectantes (cloro) utilizad05 en el mantenimiento de estas instalaciones Para ello se aco~a introshyducir 075 mVI de solucioacuten de liosulfato soacutedico al 3 en el envase de recogida de muestra

Transporte conservacioacuten y rotuladoacuten- El tiempo transcurrido entre la toma de muestras y el procesado de las mjsmas en el laboratorio debe ser miacutenimo En cualquier caso se mantendraacuten rehigeradas (4 OC) hasta la realIzacioacuten del anaacutelisis es imprescindible Identificar adecuadamente cada una de las muestras mediante rotulacioacuten del envase

322 Teacutecnicas de deteccioacuten recuento e identificacioacuten de microorganismos en agua

Para detectar microorganismos en agua podemos valemos de sistemas de medida cuantitativos cualitativos o combinaciones de ambos dependiendo de las necesidade que nos plantee el tipo de agua y el uso a que se va a destinar

La eccJoacuten de microorganismos puede considerarse un procedirnlento altamente ines implemente se pretende estimar la masa microshybiana que se encuentra en un volumen determinado de agua o un procedimJenshylo Ill se desUna a conocer la presencia e incluso la concenshytracioacuten de una determInada especie en el mismo medio En este uacuteltimo caso las teacutecnicas empleadas se denominan teacutecnicas de Identl eoacuten icrobiana estas detectan la presencia de una especie o geacutenero concreto Cualquier proceshydimiento que permita hacer un contqje de microorganismos es una teacutecruca de recuento aunque se restringe el uso de este teacutermino a los sistemas que permiacutemiddot ten contar ceacutelulas de un grupo microbiano familia geacutenero o especie concretos

3 22L Medidas cuantftatluas

Van a informaT con mayor o menor precisioacuten de la concentracioacuten de microorshyganismos que tenemos en una muestra determinada estas pueden ser a su vez

Medidas indirectas

Cuando na se basan en contar microorganismos propiamente dichos sino en medir sustancias o paraacutemetros que estaacuten directamente relacionados con la microHora de un ambiente Algunas de estas teacutecnicas no diferencian la viabilishydad de los componentes bioloacutegicos y otras siacute Las maacutes Importantes son

a) Medida de las proteinas totales La estimacioacuten del nuacutemero de mishycroorganismos presentes en un medjo se realiza en base a la concenmiddot tradoacuten global de proteiacutenas como componente orgaacutenico principal


Agua de bocas de riego Se utlUzaraacuten acopiamientos especiales que permitan tomar la muestra como en el caso de los grifos

Agua de mar (playas) Preferiblemente tres zonas de toma de muestra en una misma playa y en tres momentos diferentes a lo largo del diacutea Debe tomarse una muestra de la masa de agua que entra en contacto con la mayoriacutea de los bantildeJstas introducieacutendose en el mar hasta la cinshytura e Introduciendo el frasco hasta unos 0-15 cm de la supert1cle

A ua de Isclnas c es de a bull La teacutecnica es similar a a e los agos y a una profundidad de unos 15-30 cm de la superficie Es necesario neutralizar el efecto de los desinfectantes (cloro) utilizados en el mantenimiento de estas instalaciones Para ello se aconSE1fa introshyducir 075 mVI de solucioacuten de Uosulfato soacutedico al 3 en el envase de recogida de muestra

1hmsporte conservacioacuten y rolulacloacuten- El tiempo transcurrido entre la toma de muestras y el procesado de las mismas en el laboratorio debe ser miacutenimo En cualquier caso se mantendraacuten refrigeradas (4 oC) hasta la reaUzacioacuten del anaacutelisis es imprescindible Identificar adecuadamente cada una de las muestras mediante rotulacioacuten del envase


Para detectar microorganismos en agua podemos valemos de sistemas de medIda cuantitativos cualitativos o combinadones de ambos dependiendo de las necesidade que nos plantee el tipo de agua y el uso a que se va a destinar

La ecdoacuten de microorganismos puede considerarse un procedimiento altamente tnes implemente se pretende estimar la masa microshybiana que se encuentra en un volumen determinado de agua o un procedimienshyto niexcl se desUna a conocer la presenda e incluso la concenshytracioacuten de una determinada especie en el mismo medio En este uacutelUmo caso las teacutecnicas empleadas se denominan teacutecnicas de Ideolaquo cloacuten icrobiana estas detectan la presencia de una especie o geacutenero concreto Cualquier proceshydimiento que permita hacer un contqje de microorganismos es una teacutecnica de recuento aunque se restringe el uso de este teacutermino a Jos sistemas que permishyten contar ceacutelulas de un grupo microbiano familia geacutenero o especie concretos

3221 MedIdas cuantftatlvas

Van a informar con mayor o menor precisioacuten de la concentracioacuten de microorshyganismos que tenemos en una muestra determinada Estas pueden ser a su vez

Medidas indirectas

Cuando na se basan en contar microorganismos propiamente dichos sino en medir sustancias o paraacutemetros que estaacuten directamente relacionados con la microflora de un ambiente Algunas de estas teacutecnicas no diferencian la viabilishydad de los componentes bioloacutegicos y otras si Las maacutes lmportantes son

a) Medida de las proteiacutenas totales La estimacioacuten del nuacutemero de mishycroorganismos presentes en un medio se realiza en base a la concenshytracioacuten global de proteiacutenas como componente orgaacutenico principal

ea Auxiliar de Laboratorio Oufmleo Anaacutelisis elmeas

b) Medida de la cantidad total de materia OTgaacutenlca Esta se puede realizar en base a la medida de la concentracioacuten global de carbono nitroacutegeno o foacutesforo a partir de las cuales se extrapola el contenido total de materia orgaacutenica mediante una foacutennula diferente seguacuten el paraacutemeshytro elegido

c Jtledlda de la Demanda BJoloacuteglca de Oxiacutegeno (D80) Mide el conshysumo de 0

1 que se produce en un medio en un tiempo detenninado

como consecuencia de la actividad bioloacutegica de los seres vivos que se encuentran en eacutel ~vldentemente esta medida ya discJerne entre los orshyganismos vivos y las posibLes ceacutelulas muertas que puedan encontrarse en el medio

d) MedJda de la concentracioacuten de nitritos Los nitritos aparecen en un medio fundamentalmente como consecuencia directa del metabolismo microbiano por reduccioacuten de los nitratos presentes en el ambiente Los microorganismos mas directamente implicados en este proceso son las bacterias

e) Medida del pH La presentiacutea de microorganismos vivos con una eleshyvada actividad metaboacutelica puede manifestarse por modificaciones del ptl del medio Fundamentalmente hay que tener en cuenta en este sentido los procesos de fennentacloacuten de azuacutecares que suponen una importante acidificacioacuten del entorno

n lIIed1da de la masa celular por deJllllldad oacuteptica Este sistema se basa en relacionar la turbidez de un medio con el nuacutemero de micToorshyganismos en suspensioacuten Obviamente el sistema seraacute inefectivo cuando en dicho medio se encuentren agentes floculantes o cualquier sustancia que produzca claras alteraciones de la trnsparencia Este sistema no discierne entre ceacutelulas viables y no viables

Medidas directas

Encaminadas a contar el nuacutemero de ceacutelulas o propaacutegulos de uno o varios tipos de microorganiSmos presentes en un medio Estas se denominan tambieacuten teacutecnicas de recuento de microorganismos

a) Teacutecnicas de recuento celular dlrecto- Suponen el contltje del nuacuteshymero de ceacutelulas presentes en un volumen determinado de muestra por visualizacioacuten microscoacutepica dIrecta de las mismas (sistemas de reshycuento en caacutemara) o mediante sensores tipo coulter No son muyemshypleadas en mlcrobiologfa dado el pequentildeo tamantildeo de la mayoria de los microorganismos su diStribucioacuten no siempre homogeacutenea en una suspensioacuten la elevada concentradoacuten en que se encuentran en mumos casos y que no permiten diferencIar entre ceacutelulas viabLes y no viables ademaacutes de que no permiten discernir entre distintos tipos de microorshyganismos con claridad

b) Teacutecnicas de recuento de vlables- Mediante estas teacutecnicas se cuentan uacutenicamente microorganismos vivos y capaces de reproducirse La mashyyoriacutea de ellas se ulilizan en combinacioacuten con los sistemas cuaUlativos de deteccioacuten de microorganismos en agua para poder valorar al mismo tiempo presenciaausencia de un determinado individuo asiacute como la concentracioacuten del mismo Un requisito impresclndJble para aplicar esta


teacutecnica es que el microorganismo que vamos a detectar sea cultivable en medios artificiales En este caso se tendraacuten en cuenta las condicioshynes idoacuteneas para su crecimiento (Upo de nutrientes que le son 1ndispenshysables temperatura oacuteptima de crecimiento pH oacuteptimo y atmoacutesfera que requiere ) Thmbleacuten hay que tener en cuenta quieacutenes pueden competir con eacutel en condiciones similares para tratar de Inhibirlos o eliminarlos sin afectar al que DOS Interesa todo ello lo conseguimos con el uso de medios selectivos y medios de enriquecimiento

Disponernos deacute jeas fundamentaJes paTa recuento mediante aJltivo Banco de dUuclones y sle bra en placa para muestras con alto contenido en mJcroorganismos se realizan diluciones seriadas de la misma selecdonando al menos tres de ellas de las que se siembra un volumen conocido (01 oacute 1 mI) en medio soacutelido en placa Basaacutendonos en la inmovilidad de las ceacuteluJas sobre el agar tras la incubacioacuten obsershyvaremos el desarrollo de colonias cada una de las cuales correspondeshyraacute a un solo elemento reproductor inicial (Unidad torrnadora de Coloshynia-UrC-) por lo que con su recuento podremos extrapolar el nuacutemero de ceacutelulas que Lemamos por mililitro de muestra

filtracioacuten Basada en retener microorganismos en la superficie de una membrana cuyo tamantildeo de poro es Inferior en tamantildeo a los de las ceacuteshylulas que queremos cuantificar E8ta teacutecnica es idoacutenea para muestras poco concentradas pudiendo procesar grandes voluacutemenes de agua en busca de microorganismos Que se encuentren en baja concentracioacuten en la misma 1rns la ffitracioacuten las membranas se cultivan en medio soacutelido o liacutequido desarrollaacutendose en ella las ceacutelulas retenidas

Teacutecnica del Uacutelnero Maacutes Probable Teacutecnica estimativa del nuacutemero de microorganismos de una especie o grupo concreto basada en extrashypolaciones estadiacutesticas tras la siembra de voluacutemenes conocidos de la muestra en diferentes lubos en los que se aprecia cambio de color de pH o produccioacuten de gas seguacuten los casos

3222 Medidas cualitativas

COn ellas soacutelo pretendemos detectar la presenciaausencia de un determishynado microorganismo en la muestra correspondiente Ello conlleva el planteashymiento de un tipo de agua concreto a analizar y un uso muy especiacutefico al que se destina Habitualmente este es el enfoque para anaacutelisis sanitario de aguas con distintos microorganismos a detectar y distintos niveles de tolerancia seguacuten el uso a que va a destinarse el agua

Para este tipo de anaacutelisis distinguimos

Tipo de microorganismo a detectar- Por supuesto hay que direrenshyciar claramenle entre los grandes grupos (Virus Bacterias Hongos Proshytozoos Algas) pero tambieacuten dentro de cada uno suelen haber teacutecnicas o medios muy especiacuteficos para los distintos geacuteneros o especies

MIcroorganismo cultivableno cultivable- La baleriacutea de teacutecnicas a emplear seraacute completamente distinta seguacuten este aspecto siendo geshyneralmente maacutes sencillo cuando el microorganismo es cultivable En estos casos se dJsentildea un sistema dependiente de los requerimientos

Aneacutelisis de aguas de consumo y de recreo as

teacutecnica es que el mlcroor~anlsmo que vamos a detectar sea cultivable en medios artificiales En este caso se tendraacuten en cuenta las condicioshynes idoacuteneas para su credmiento (Upo de nutrientes que le son indispenshysables temperatura oacuteptima de crecimiento pH oacuteptimo y atmoacutesfera que requiere ) 1ambleacuten hay que tener en cuenta quieacutenes pueden competir con eacutel en condiciones similares para tratar de Inhibirlos o eliminarlos sin afectar al que nos interesa todo ello lo conseguimos con el uso de medios selectivos y medios de enriquecimiento

Disponemos de fundamentales paTa recuento mediante cuftivo Banco de dUuclones y sle bra en placa para muestras con alto contenido en mJcroorganismos Se realizan diluciones seriadas de la misma seleccionando al menos tres de ellas de las que se siembra un volumen conocido (0 L Oacute 1 mI) en medio soacutelido en placa Basaacutendonos en la inmovilidad de las ceacutelulas sobre el agar tras la incubacioacuten obsershyvaremos el desarrollo de colonias cada una de las cuales correspondeshyraacute a un solo elemento reproductor inlelal (Unidad rormadora de Coloshynia-UfC-) por lo que con su recuento podremos extrapolar el nuacutemero de ceacutelulas que temamOS por mililitro de muestra

fi ltracioacuten Basada en retener microorganismos en la superficie de una membrana cuyo tamantildeo de poro es tnreriacuteor en tamantildeo a los de las ceacuteshylulas que queremos cuantificar Esta teacutecnica es idoacutenea para muestras poco concentradas pudiendo procesar grandes voluacutemenes de agua en busca de microorganismos que se encuentren en bltja concentracioacuten en la misma 1rns la rutracioacuten las membranas se cultivan en medio soacutelido o liquido desarrollaacutendose en ellas las ceacutelulas retenidas

Teacutecnica del JIIUacuteDlero Maacutes Frobable Teacutecnica estimativa del nuacutemero de microorganismos de una especie o wupo concreto basada en extrashypolaciones estadiacutesticas tras la siembra de voluacutemenes conocidos de la muestra en diferentes lubos en los que se apTecia cambio de color de pH o produccioacuten de gas seguacuten Los casos


COn ellas soacutelo pretendemos detectar la pTesenciaausencia de un determishynado microorganismo en la muestra correspondiente Ello conlleva el planteashymiento de un tipo de agua concreto a analizar y un uso muy especiacutefico al que se destina Habitualmente este es el enfoque para anaacutelisis sanitario de aguas con distintos microo~nismos a detectar y distintos niveles de tolerancia seguacuten el uso a que va a destinarse el agua


Tipo de microorganismo a detectar- Por supuesto hay que diferenshyciar claramente entre los grandes grupos (Virus Bacterias Hongos Proshytozoos Algas) pero tambieacuten dentro de cada uno suelen haber teacutecnicas o medios muy especificos para los distintos geacuteneros o especies

MIcroorganismo cultivableno cultivable - La bateriacutea de teacutecnicas a emplear seraacute completamente distinta seguacuten este aspecto siendo geshyneralmente maacutes sencillo cuando el microorganismo es cultivable En estos casos se disentildea un sistema dependiente de los requerlmlentos

IK) Auxiliar de Laboratorio Oufmlco Anaacutelisis cllnfcos

del microorganismo a detectar y de los competidores a inhIDir Cuando se trata de organismos no cultivables las teacutecnicas de deteccioacuten de los mismos pueden ser fundamentalmente tres

] Visualizacioacuten directa por microscopia

2 Deteccioacuten de antiacutegenos especiacuteficos (teacutecnicas Inmunoloacutegicas)

5 Deteccioacuten de fragmentos especiacuteficos de su genoma (teacutecnica de la reaccioacuten en cadena de la Polimerasa-PCR-)

En muchos casos se exige el anaacutelisis cuantitativo de una especie geacutenero o grupo microbiano concreto con lo que debemos aplicar teacutecnicas cualltativas y cuantitativas aJ mismo tiempo obteniendo contajes maacutes o menos precisos de un microorganismo concreto

Deteccioacuten de mkroorganIsmos patoacutegmos en agDiacuteiacuteS de consumo y recreo

En las distintas normativas comentadas para control de calidad de aguas se contempla la determinacioacuten ~ microorganismos patoacutegenos no precisando en la mayoriacutea de los casos a queacute geacuteneros ni grupos microbianos se refieren En principio se consideran como maacutes importantes a todos los incluidos entre los Indicadores de contaminacioacuten fecal pero tambieacuten a aJgunos otros cuya presencia en aguas puede suponer un riesgo para la salud de la poblacioacuten En concreto para la deteccioacuten recuenlo e identificacioacuten de los estos microorganisshymos se utilizan los siguientes meacutetodos

en el capiacutelulo correspondiente a microorganismos indicadores se exponen las teacutecnicas para determinacioacuten de cgJifOWlWwaatY feshycalif estreptococos fecales esporas de clostridios sulfito-reductores Stap ryJOrRCCUS BU S Y do onas aeru

Determinacioacuten de bacterias aeroblas me5OacutefIlas Se denominan asiacute las bacterias heteroacutetroras aeroblas y anaerobias facultativas mesoacutefilas y psicotroacuteficas capaces de crecer en un medio de agar nutritivo La determinacioacuten se realiza por siembra directa de la muestras de agua para ello se procesan dos voluacutemenes distintos de muestra (1 mi y 01 mi) El medio de cultivo empleado es el agar nutritivo en placa Para procesar 1 mi se inocula la placa de ~tri vada y se antildeade posteriormenshyte el medio licuado y enfriado a 45 OC Se agita suavemente para homoshygeneizar la muestra con el medio y se deja solidificar en reposo Para las muestras de 01 mI la siembra se realiza extendiendo este volumen de agua por la superficie del agar mediante un asa de vidrio esteacuteril

La determinacioacuten de bacterias aeroblas mes6fl1as incluye dos grupos dependiendo de la temperatura de desarroLlo Asiacute pues se sembraraacuten siempre dos muestras de 1 mi y dos de OJ mi y se incubaraacute una de cada a 22 OC Y las otras a 37 OC La Incubacioacuten a 57 OC se mantiene durante 48 horas y la de 22 OC durante 72 horas Se determina la conshycentracioacuten de bacterias para cada temperatura por recuento de las cashylonias que se desarrollan en la superficie del agar expresando el resulshytado en Unidades formadoras de Colonias (Ufq por mililitro de agua

Determinacioacuten de Salmooella Su deteccioacuten precisa varias fases que incluyen la preconcentracioacuten en caJdo concentracioacuten y deteccioacuten en medios de cultivo selectivos y posterior identificacioacuten de las colonias

80 Auxiliar de Laboratorio Oulmlco Anaacutelisis cllnicos

del microorganismo a detectar y de los competidores a inhibir Cuando se trata de organismos no cultivables las teacutecnicas de deteccioacuten de los mismos pueden ser fundamentalmenle tres

] VisuaJizacioacuten directa por microscopia


3 Deteccioacuten de fragmentos especiacuteficos de su genoma (teacutecnica de la reaccioacuten en cadena de la PoUmerasa~PCR-

en muchos casos se exige el anaacutelisis cuantitativo de ulla especie geacutenero o grupo microbiano concreto con lo que debemos aplicar teacutecnicas cualitativas y cuantitativas al mismo tiempo obteniendo con tajes maacutes o menos precisos de un microorganismo concreto

Detecdoacuteo de mkroorganIsmos patoacutegenos en aguas de consumo y recreo

En las distintas normativas comentadas para control de calidad de aguas se contempla la determinacioacuten de microorganismos patoacutegenos no precisando en la mayoriacutea de los casos a queacute geacuteneros ni grupos microbianos se refieren en principio se consideran como maacutes importantes a todos los incluidos entre los Indicadores de contaminacioacuten fecal pero tambieacuten a aJgunos otros cuya presencia en aguas puede suponer un riesgo para la salud de la poblacioacuten En concreto para la deteccioacuten recuento e identificacioacuten de los estos microorganisshymos se utilizan los siguientes meacutetodos

en el capitulo correspondiente a microorganismos indicadores se exponen las teacutecnicas para determinacioacuten de col feshycales estre toc9Cos fecales esporas de clostridios sulfito-reductores StaphyJo~ocUS au s y o onas aeru

Determinacioacuten de bacterias aeroblas me5OacutenJas Se denominan asiacute las bacterias heteroacutetrofas aeroblas y anaerobias facultativas mes6fflas y psicotroacuteficas capaces de crecer en un medio de agar nutritivo La determinacioacuten se realiza por siembra directa de las muestras de agua para eJlo se procesan dos voluacutemenes distintos de muestra (1 mi y 01 mi) el medio de cultivo empleado es el agar nutritivo en placa Para procesar 1 mi se inocula la placa de Ietri vada y se antildeade posteriormenshyte el medio licuado y enrriado a 45 OC Se agita suavemente para homoshygeneizar la muestra con el medio y se deja solidificar en reposo Para as muestras de 01 mI la siembra se realiza extendiendo este volumen de agua por la superficie del agar mediante un asa de vidrio esteacuteril

La determinacioacuten de bacterias aerobias mesoacuteftlas incluye dos grupos dependiendo de la temperatura de desarrollo Asiacute pues se sembraraacuten siempre dos muestras de 1 mi y dos de 01 mi y se incubaraacute una de cada a 22 OC Y las otras a 37 OC La Incubacioacuten a 37 OC se mantiene durante 48 horas y la de 22 OC durante 72 horas Se determina la conshycentracioacuten de bacterias para cada temperatura por recuento de las cashylonias que se desarrollan en la superficie del agar expresando el resulshytado en Unidades formadoras de Colonias (UfC) por mililitro de agua

Determinacioacuten de Salmonella Su deteccioacuten precisa varias fases que incluyen la preconcenlracioacuten en caldo concentracioacuten y deteccioacuten en medios de cultivo selectivos y posterior identificacIoacuten de las colonias


La preconcentradoacuten se realiza por Incubacioacuten de la muestra (membrashyna de filtracioacuten) en caldo selenito o caldo de Rappaport durante 18-24 horas a 37 oc Posteriormente se realiza siembra en placa a partir del caldo de enriquecimiento Los medios utilizados para siembra en plashyca son selectivos y existen varios (Agar verde brillante a9ar sulfito de bismuto agar XLD agar de Hektoen) Las colonias desarrolladas en el medio soacutelido que presenten caracteriacutesUcas sugestivas de ser SalmoneshylIa se procesan mediante pruebas bioquiacutemicas para la identificacioacuten asiacute como puede realizarse el serotlpado por anaacutelisis inmunoloacutegico

Determinacioacuten de Vlbrlo cholerae Se utiliza la filtracioacuten por membrashyna y se siembran los filtros en medio de enriquecimiento Posteriormenshyte se transfiere una muestra de eacutestos a medio soacutelido selectivo en placa (aWJr TCBS)

Determinacioacuten de Campylobacter Se utilizan medios selectivos (Cary Blair) y se incuban en atmoacutesrera mjcroaeroacutefTIa (con baja tensioacuten de OJOacuteshy

geno)

Determinacioacuten de Paraacutesitos Para la determinacioacuten de paraacutesitos no existe una teacutecnica estandarizada No obstante se propone como vaacutelida la observacioacuten microscoacutepica del cenbifugado de 50 mi de agua Para su realizacioacuten se introducen 50 mI de muestra en un tubo esteacuteril Se centriruga a 3000-5000 rpm durante 5 minutos Se desecha el sobreshynadante y se estudia una muestra del precipitado a microscopia oacuteptica ~n la observacioacuten se buscan quistes huevos o larvas correspondientes a paraacutesitos

AnaacutelIsis de aguas de consumo y de recreo 91

La preconcentracioacuten se realiza por incubacioacuten de la muestra (membrashyna de filtracioacuten) en caldo selenito o caldo de Rappaport durante 18-24 horas a 57 oC Posteriormente se realiza siembra en placa a partir del caldo de enriquecimiento Los medios utilizados para siembra en plashyca 50n selectivos y eJdsten varios (Agar verde brillante agar sulfito de bismuto agar XLD agar de Hektoen) Las colonias desarrolladas en el medio soacutelido que presenten caracteriacutesticas sugestivas de ser Salmoneshyla se procesan mediante pruebas bioquiacutemicas para la identificacioacuten asiacute como puede realizarse el serotlpado por anaacutelisis inmunoloacutegico

Determinacioacuten de lbJlo cholerae Se utltiza la filtracioacuten por membrashyna y se siembran los filtros en medio de enriquedmiento Posteriormenshyte se transfiere una muestra de eacutestas a medio soacutelido selectivo en placa (a~rTCBS)

Determinacioacuten de Campylobacter Se utilizan medios selectivos (Cary Blalr) y se iacutencuban en almoacutesfera microaeroacutefila (con baja tensioacuten de oxiacuteshygeno)

Determinacioacuten de Paraacutesitos Para la determinacioacuten de paraacutesitos no existe una teacutecnica estandarizada No obstante se propone como vaacutelida la observacioacuten microscoacutepica del cenbifugado de 50 mi de agua Para su realizacioacuten se introducen 50 mI de muestra en un tubo esteacuteril Se centriruga a 5000-5000 rpm dumnte 5 minutos Se desecha el 5Obreshynadante y se estudia una muestra del precipitado a microscopia oacuteptica en Ia observacioacuten se buscan quistes huevos o larvas correspondientes a paraacutesitos

I

4 Anaacutelisis de alimento

1 Alimentos Teacutecnicas de deteccioacuten recuento e identificacioacuten de microorganismos Indicadores e iacutendice

11 Indicadores enteacutericos en alimentos

Para el control microbioloacutegico de alimentos el microbioacutelogo necesita demiddot tectar por una parte aquellos que han sido mal manipuladgs y por otra los contaminados con bacterias patoacutegenas generalmente de origen enteacuterico tales como Saacuteiiacutentildeonella Shigella espedes patoacutegenas del geacutenero Vlbno y otiBs -as Industrias elaboradoras de alimentos necesitan controlar la calidad mishycrobioloacutegica de las materias primas destinadas a la preparacioacuten de determishynados productos y comprobar la eIicacia de los sistemas de fabricadoacuten de los mismos para conseguir un alimento de buena calidad microbioloacutegica

Estas son las causas por las cuales se hace necesario recurrir a teacutecnicas que descubran faacutedlmente determinados grupos o especies bacterianas que ~o concurren en cifras excesivas indican defidenclas en el producto como materia pnma y en JaS faacuteSeS de su ~rocesado manipulacioacuten o almacenamiento Estos grupos o especies bacterianas indican bien una contaminaCioacuten deI alimento con geacutermenes patoacutegenos bien la presencia de otros indeseables que probashyblemente terminen por alterar el producto En su col1lunlo se conocen como microorganismos Indicadores enteacutericos y se utilizan para regular y controlar la calidad microbioloacutegica de los alimentos

1 1 1 Indices O Indicadores de contaminacioacuten fecal

La utilizacioacuten de microorganismos indIcadores tiene su fundamento en que cada medio (ambiental orgaacutenico allmentarjo) se caracteriza por albergar deshytermmadas asociadOntildees microbianas Estas asociaciones pueden contener esshypecles patoacutegenas que se podraacuten detectar directamente o bien buscando otras especies o grupos pertenecientes a la misma asociacioacuten estos son los iacutendiCes o IndJcadores

Se denominan IadJces de contaminacioacuten fecal aquellos microorganismos que viven normalmente en el intestino del hombre y de los animales Su pre~ sencia en un alimento Indica contaminacioacuten fecal del mismo y por tanto riesgo

93

94 Auxiliar de Laboratorio Qulmico Anaacutelisis cliacutenioos

de presencia de geacutermenes patoacutegenos cuyo haacutebUat es tambieacuten el Intestino En microbiologiacutea alimentaria se consideran indicadores de contaminacioacuten fecaJ

- Familia Enterobacteriaceae

bull Grupo coliforme

Grupo coliformes fecales _ Escherichla eoll

Estreptococos fecaJes y Enterococos

Clostridios sulfitD-reductores -Existen otros microorganismos indicadores de origen no fecal cuya presenshy

cia tiene diferente significado para cada uno

Flora aerobia mes6ma

flora anaerobia

Plora psicotroacutefica

- Estafilococos Los indlcadores de contaminacioacuten fec3l se usaron primeramente para el

anaacutelisis bacterioloacutegico del agua Estos iacutendices se siguen aplicando para el conshytrol del agua y actualmente tambieacuten para el control de alimentos como posishybles vehiacuteculos de transmjsioacuten de infecciones o intoxicaciones

En el intestino sobre todo en el dego predominan geacutermenes anaerobios y microaeroacutefilos que no se usan como indicadores de contaminacioacuten fecal por la compltfiidad teacutecnjca de su deteccioacuten Ademaacutes es flora propia del intestino la integrante de la famllia ~terobacteriaceae los estreptococos fecales y e~oshyc~ los dostridios y ~ entre otros

112 Caracteriacutesticas que deben reunir los microorganismos indicadores de contaminacioacuten fecal

- ~speclftcldad en cuanto a su origen es decir que el microorganismo o grupo de rnlcroorganismos procederaacuten exclusivamente del Intestino humano o animal

- Senstbllldad de deteccioacuten para lo cual el microorganismo o microorshyganismos elegidos representaran una parte importante dentro de la poshybladoacuten de la flora intestinaL La sensibilidad del indlcador fecal depende de la abundancia del germen en el intestino es decir estaacute en funcioacuten de su nuacutemero en la materia rceal

ero suficiente para que el germen o grupo indlcador se pueda deshytectar Incluso en diluciones muy elevadas

Resistencia en cuanto a supervivencia en el ambiente externo y pershymanencia duradera en eJ alimento La resistencia del indicador seraacute sushyperior a la de los geacutermenes patoacutegenos correspondientes a la asociacioacuten microbiana comuacuten

fadlldad rapidez y fiibQldad de las teacutecnicas utilizadas en la investishygacioacuten de cada Uacuteldice o indlcador de contaminacioacuten fecal para detectar induso un pequentildeo nuacutemero de geacutermenes

94 Auxiliar de Laboratorio Qulmico Anaacutelisis clfnicos

de presencia de geacutermenes patoacutegenos cuyo haacutebitat es tambieacuten el Intestino En microbiologiacutea alimentaria se consideran indicadores de contaminacioacuten fecal

- Familia Enterobacteriaceae Grupo coliforme

Grupo coliformes recales

Escherichla eoll

~streptococos fecales y Enterococos

_ Clostridios sulfito-reductores

Existen otros microorganismos indicadores de origen no fecaJ cuya presen-cia tiene diferente significado para cada uno

Flora aerobia mes6fiJa

Flora anaerobia


- Estafilococos Los indicadores de contaminacioacuten fecal se usaron primeramente para el

anaacutelisIs bacterioloacutegico del agua Estos fndices se siguen aplicando para el conshytrol del agua y actualmente tambieacuten para el control de alimentos como posishybles vehkulos de transmisioacuten de infecdones o intoxicaciones

En el intestino sobre todo en el dego predomjnan geacutermenes anaerobios y microaeroacutefilos que no se usan como indicadores de contaminacioacuten fecal por la compltjidad teacutecnica de su deteccioacuten Ademaacutes es flora propia del intestino la integrante de la familia Enterobacteriaceae los estreptococos fecales y e~oshyc~ los clostridlos y ~ entre otros


_ Especlftcldad en cuanto a su origen es decir que el microorganismo o grupo de microorganismos procederaacuten exclusivamente del intestino humano o animal

- Sensfbilldad de deteccioacuten para lo cual el microorganismo o microorshyganismos elegidos representaran una parte importante dentro de la poshyblacioacuten de la flora intestinal La sensibilidad del indicador fecal depende de la abundancia del germen en el intestino es decir estaacute en funcioacuten de su nuacutemero en la materia Cecal

ero suficiente para que el germen o grupo indicador se pueda deshytectar incluso en diluciones muy elevadas

Resistencia en cuanto a supervivencia en el ambiente externo y pershymanencia duradera en el alimento La resistencia del indicador seraacute sushyperior a la de los geacutermenes patoacutegenos correspondientes a la asociacioacuten microbiana comuacuten

rw~~~~~JIi~~IJd de las teacutecnicas utilizadas en la investishygacioacuten de cada iexclndice o indicador de contaminacioacuten fecal para detectar incluso un pequentildeo nuacutemero de geacutermenes

Anaacutelisis de alimentos 815

12 Deteccioacuten recuento e identificacioacuten en alimentos de microorganismos indicadores de contaminacioacuten fecal

121 Coliformes coliformes fecales y Escherichia coll

La investigacioacuten y recuento de estos microorganismos son operaciones baacutesicas en microbiologiacutea alimentaria Como ya se ha expuesto los collformes constituyen un grupo de bacterias que se definen maacutes por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonoacutemicos ~rtenecen a la familia ~ terobacterlaceae y se caracterizan por su capacidad para feqngntaf la lactosa (ver tema 43) el meacutetodo de deteccioacuten es el mismo que en aguas (Nuacutemef M Probable) los aUmentos soacutelidos se prepara un triturado de una cantidad conocida del aUmen o gramo en soludoacuten salina fisioloacutegica Nacbo9)o agua esteacuterU A partir de este lriturado se trabaja con diluciones (11 1100 11(00) procesaacutendose del mismo modo que las muestras de agua El resultado se expresa en nuacutemero de microorganismos por mililitro o gramo de alimento

(la teacutecnica detallada viene en el capitulo correspondiente a aguas de conshysumo tema 43)

Los coliforrnes se pueden encontrar en el intestino del hombre y de los anIshymales pero tambieacuten en otros ambientes como suelo plantas caacutescara de hueshyva por lo que como mIcroorganismos indicadores no presentan buena espeshycificidad A pesar de ello se utilizan como fndices de contaminacioacuten fecal por

- Su frecuencia en heces

- Porque se detectan faacutedJmente

- Porque poseen unas caracteriacutesticas muy semejantes a las de los miemshybros patoacutegenos de las Uumlilerobacterlaceae en ciertos aspectos

AJ ser necesario hacer una dislincioacuten entre collformes y t coU en cuanto a su significado sanitario se ponen en marcha teacutecnicas de Identlficacfoacuten para esta especie basadas en caracteriacutesticas propias de la misma como el desarrollo y fermentacioacuten de la lactosa a 445 OC la capacidad para crecer en presenda de sales 61ltares y ta prOducaoacuten de indol en agua de peptona o caldo Lriploacutefano

Estas pruebas se realizan a partir de tubos positivos del ensayo del NMr para coliformes De esLos se siembra una muestra sobre medio soacutelido (1SY L$Yine ~osjna azul de metileno-) de forma que se obtengan colonias aisladas Dlchas colonias cuando corresponden a fi coY presentan un centro azul-negro con brillo metaacutelico verdoso Las colonias que muestran estas caracteriacutesticas se subcuJUvan en medio liacutequido con lriptoacutefano y se incuban durante 24 horas Pashysado este tiempo se antildeade al tubo unas gotas de reactivo de KovaSS para lndol La presencia de esle compuesto metabol lo de la hidroacutelisis del trlptoacutefano se manifiesta por la formacioacuten de un anjll2 de cglgiexcl mjo bermelloacuten en la superficie del caldo Otras pruebas que ayudan a la Identificacioacuten de Escherlchia coll son el Rojo meUlo el Yoges-Proskauer y el citrato Las dos uacuteltimas caracLeTfsticashymente negativas para esta bacteria mientras que el Rojo Metilo es positivo

122 Estreptococos fecales y Enterococos

Son bacterias que habitan el IntesUno humano y el de animales de sangre caliente Su utilidad como indicadores de contamlnadoacuten fecal ha sido comentashy

Anaacutelisis de affmentos 8amp


121 Coliformes coJiformes fecales y Escheriehia eoll

La investigacioacuten y recuento de estos microorganismos son operaciones baacutesicas en microbiologiacutea alimentaria Como ya se ha expuesto los collCormes constituyen un grupo de bacterias que se definen maacutes por las pruebas usadas para su aislamiento que por criterios taxonoacutemicos ~rtenecen a la familla ~ lerobacterlaceae y se caracterizan por su capacidad para fennentaf la Jordfctosa (ver tema 45) el meacutetodo de deteccioacuten es el mismo que en aguas (Nuacutemer Maacute Probable) Para los alimentos soacutelidos se prepara un triturado de una cantidad conocida del alimento tl gramo) en solucioacuten salina fisioloacutegica Na 09)0 agua esteacuteril A partir de esLe Lriturado se Lrabaja con diluclones ([ O ] 100 11000) procesaacutendose del mismo modo que las muestras de agua El resultado se expresa en nuacutemero de microorganismos por mililitro o gramo de alimento

(La teacuteltnica detallada viene en el capitulo correspondiente a aguas de conshysumo tema 43)

Los coliCormes se pueden encontrar en el intestino del hombre y de los anishymales pero tambieacuten en otros ambientes como suelo plantas caacutescara de hueshyva por lo que como microorganismos indicadores no presentan buena espeshyclficidad A pesar de ella se utilizan como iacutendices de contaminacioacuten fecal por

Su frecuencia en heces

- Porque se detectan faacutecilmente

- Porque poseen unas caracteriacutesticas muy semejantes a las de los miem-bros patoacutegenos de las EnterobacterIaceae en ciertos aspectos

Al ser necesarjo hacer una distincioacuten entre collfonpes y E coU en cuanto a su significado sanitario se ponen en marcha teacutecnicas de Identiacuteficacfoacuten para esta especie basadas en caracteriacutesticas propias de la misma como el desarrollo y fermentacioacuten de la lactosa a 445 OC la capacidad para crecer en presencia de sales biliares y ta proouccJoacuten de indol en agua de pepLgna o caldo triploacuterano

Estas pruebas se realizan a partir de tubos positivos del ensayo del NMP para coliformes De estos se siembra una muestra sobre medio soacutelido (~ L$Xine -eoslna azul de metileno-) de forma que se obtengan colonias aisladas Dichas colonias cuando corresponden a E cpU presentan un centro azul-negro con brillo metaacutelico verdoso Las colonias que muestran estas caracteriacutesticas se subculUvan en medio liquido con lriptoacutefano y se incuban durante 24 horas Pashysado este tiempo se antildeade al tubo unas gotas de reactivo de KovaSS para Indol La presencia de este compuesto metabol lo de la hidroacutelisis del trlptoacutefano se manifiesta por la formacioacuten de un aujllo de Sglgiexcl mio bermelloacuten en la superficie de] caldo Otras pruebas que ayudan a la identificacioacuten de Escherlchia eoll son el Rojo metilo el Voges-PToskauer y el citrato Las dos uacuteltimas caracLerfsLicashymente negativa para esta bacteria mientras que el Rojo Metilo es positivo


Son bacterias que habitan el intestino humano y el de animales de sangre caliente Su utilidad como indicadores de contaminacioacuten fecal ha sido comenta-

seAUXiliar de Laboratorio Qumico Anaacutelisis clinicos

da en el tema 43 Hay Que antildeadir aquiacute que al ser mucho maacutes resistentes a las condicJones ambientales y tratamientos industrlaJes que E eoil su uso estariacutea especialmente indicado en aHmentos congelados deshidratados o desecados Por otra parte no es un buen Indicador de riesgo sanItario POT poseer una resisshytencia muy superior a la de microorganismos patoacutegenos como SalmoneUa

Su presencia en nUmero elevado significa falta de higieneen la elaboracioacuten de ciertos alimentos o condiciones de conservacioacuten defectuosas excepto en aqueshyllos en los que Intervienen en los procesos de fermenlacioacuten de forma habitual

Para su deteccioacuten y recuento se procede de forma similar al anaacutelisis de aguas Se puede realizar un estudio de Pr cia (P-A) o una cuantifi shycacioacuten por la teacutecnica deJ NMP

5n cualquier caso se realiza en varias etapas

- Prueba presuntiwa en medio Kanamleina Aescu1ina Azida (MA) incushybando a 37 OC durante 24 horas ~J ennegrecimiento del tubo se consishydera positivo

_ Frueba 9pftgpatly se uULlza eJ mismo medio pero soacutelido (con agar) Se consjdera positiva la aparicioacuten de colonias rodeadas de halos negros

_ Pruebas OOIIflrmatllas adicionales Se Investigan diversos aspectos cashyracteriacutesticos en las ltolonias desarrolladas en el medio de ltonfirmacioacuten

bull Morfologia cocos gram positivos agrupados en cadenas cortas

bull Catalasa es negativa para estos microorganismos

bull Crecimiento en medios con bilis (Agar esculina bUis) toleran la bilis e hidrolizan la esculina

Crecimiento en presencia de NaO al 65 son tolerantes a la sal Ycashypaces de desarronarse en mecuos con Campl1entraciones moderadas de la misma

bull Crecimientg a 45 oe son capaces de desarrollarse a esta temperashytura en caldo BHI

123 Clostridios sulfito-reductores

La deteccioacuten y recuento de Qoslricllos suLfito-reductores se realiza mediante la numeracioacuten de formas vegetativas y esporuladas coqIuntamente o soacutelo de esposhyruladas

Como en las muestras de agua la deteccioacuten se basa en su crecimiento en medios que contienen suLfito de sodio y en su capacidad para reducir este sulfito dando lugar en presencia de hierro a sulfuro de hierro que presenta coloradoacuten negra

Hay que recordar que se trata de bacterias anerobias estrictas y por tanto exigen una atmoacutesfera carente de oxiacutegeno I5to se logra mediante

Siembra de las muestras en elwesilg SOacuteido icuado y mantenido a 45shy50 oC (ver tema 45)

- Cultivo en anaerobiosis mediante Jarra de anaerobiOS vertido de una capa de parafina en lB superficie del medio o siembra en profundidad en agar contenido en tubos

S8 Auxiliar de Laboratorio Qumico Anaacutelisis oliniacutecos

da en el tema 43 Hay Que antildeadir aquiacute que al ser mucho maacutes resistentes a las condlcJones ambientaJes y tratamientos industriales que E coU su uso estariacutea especialmente indicado en altmentos congelados deshidratados o desecados Por otra parte no es un buen Indicador de riesgo sanitario por poseer una resisshytencia muy superior a la de microorganismos patoacutegenos como SalmoneUa

Su presencia en nuacutemero elevado igniacutefica falta de higiene en la elaboradoacuten de ciertos alimentos o condiciones de conservacioacuten defectuosas eJtcepto en aqueshyUos en los que Intervienen en los procesos de fermentadoacuten de forma habituaJ

Para su deteccioacuten y recuento se procede de forma similar al anaacutelisis de aguas Se puede realizar un estudio de Pr n ia-A ncia (P-A) o una cuantifi-cacioacuten por la teacutecnica del NMP

Ein cualquier caso se realiza en varias etapas

- Prueba presuntiwa en medio Kanamiclna Aescu1Jna Azida (KAA) incushybando a 37 OC durante 24 horas ti ennegrecimiento del tubo se consishydera positivo

_ Fmeba guQngatbiexcll se utilIza el mjsmo medio pero soacutelido (con agar) Se consjdera positiva la aparicioacuten de colonias rodeadas de halos negros

_ Pruebas confinnaUIaS acUdonales Se investigan diversos aspectos cashyracteriacutesticos en las colonias desarrolladas en el medio de confirmacioacuten

bull bull bull

bull

Morfologiacutea cocos gram positivos agnlpados en cadenas cortas

CataJasa es negativa para estos microorganismos

Crecimiento en medios con bilis (Agar esculina bilis) toleran la bilis e hlarohzan la esculina crecimiento en presencia de NaCl al 65 son tolerantes a la sal y cashypaces de desarrouarse en mechas con COiitentraciones moderadas de la misma

Crectmiepto a 45 OC son capaces de desarrollarse a esta temperashytura en caldo BHI

123 Costridios sulfito-reductores

La deteccioacuten y recuento de Qostriclios suLlito-reductores se realiza mediante la numeracioacuten de formas vegetativas y esporuladas coriexcljuntamente o soacutelo de esposhyruladas


Hay que recordar Que se trata de bacterias anerobias estrlrlas y por tanto exigen una atmoacutesfera carente de oxigeno Bsto se logra mediante

Siembra de las muestras en elJlledlo SOacuteHdo iacutecuado y mantenido a 45-50 oC (ver tema 43)

- Cultivo en anaerobiosis mediante jarra de anaerObios vertido de una capa de parafina en la superflcie del medio o siembra en profundidad en agar contenido en tubos


Cuando la deteccioacuten y recuento es soacutelo de formas espoTuladas es necesario tratar previamente la muestra calentando la suspensioacuten del alimento hasta 80 OC lo que permite destruir las formas vegeta Uvas

Los medios utllizados son similares o iguales a los empleados para la detecshycioacuten de estas bacterias en aguas de consumo puacuteblico

13 Deteccioacuten recuento e identificacioacuten en alimentos de microorganismos Indicadores de origen no fecal

13 1 Flora aerobia mesoacutefila

SOn un coruacuteunlo de microorganismos capacitados para multiplicarse en aeshyrobios a temperaturas medias comprendidas entre 25 OC Y40 oc Es un meacutetQ do que permite conocer en coliunlo la calidad microbIoloacutegica de los alimentos sin relacionarla con la posible presencia de geacutermenes patoacutegenos ya que estos se deben buscar de forma directa por procedimientos especiales Que permitan conocer la peligrosidad o inocuidad de dichos alimentos

bull Se puede concluir que un alimento cuya nora total es elevada debe ser conshysiderado Impropio para el consumo humano

El estudio de nora mesoacutefila es Improcedente en determinados casos

_ Cuando se trata de productos fermentados ya que estos contienen norshymalmente cifras elevadas de geacutermenes imprescindibles en la fermenshytacioacuten y que forman parte de ella (quesos vinos cervezas yogures )

_ En los productos esterilizados hay que tener en cuenta Que la ausencia de geacutermenes viables no avala la calidad bacterioloacutegica de la materia prima con la Que se ha elaborado el producto

Para la determinacioacuten de nora aerobla me8Oacutefila se homogeneiza la muestro de alimento y se preparan diluciones decimales sucesivas de la misma Para obtener la dilucioacuten 110 se pesa la porcioacuten del producto a procesar y Su peso se multiplica por 9 BI resultado son los mililitros de diluyente que hay Que antildeadir Esta seraacute la suspensioacuten madre con la que trabajar En productos liacutequidos no es necesario realizarla la suspensioacuten madre es el propio producto

TraosfLrlendo 1 mi de suspensioacuten madre a 9 mi de dlluyente se conslgue la siguiente dilucioacuten Esto se repite sucesIvamente en 5-6 tubos para obtener la serie de diluciones decimales

El recuento propiamente dicho se realiza mediante siembra en superficie en medio de culUvo soacutelido (agar putriyo O PIafe muo ordf~r) Se reaUza una siemshybra para cada dilucioacuten Tambieacuten puede realizarse la teacutecnica del NMP mediante siembra en caldo nutritivo

StilphylDcoccus aureus

Existen numerosos medios propuestos para la deteccioacuten y recuento de esshytas bacterias en alimentos 1bdos ellos llevan incorporados agentes selecrtivos y diferenciales para Inhibir la flora distinta a Staphulococcus aurs Se emplean como en otros casos medios de enriquecimiento y medIos soacutelidos selectivos Ademaacutes se pueden aplicar pruebas de confirmacioacuten cuando se djspone de coshyLonias sospechosas de la presencia de esla bacteria

ulwEqnMII


Cuando la deteccioacuten y recuento es soacutelo de formas esporuladas es necesario tratar previamente la muestra calentando la suspensioacuten del alimento hasta 80 OC lo que permite destruir las formas vegetativas

Los medios utilizados son similares o jguales a los empleados para la detecshycioacuten de estas bacterias en aguas de consumo puacuteblico

f 3 Deteccioacuten recuento e identificacioacuten en alimentos de microorganismos Indicadores de origen no fecal

131 Flora aerobia mesoacutefila

Son un coliunto de microorganismos capacitados para multiplicarse en aeshyrobiosis a temperaturas medias comprendidas entre 25 OC Y 40 oc ~ un meacutetoshydo que permite conocer en corijuoto la calidad microbioloacutegica de los alimentos sin relacionarla con la posible presencia de geacutermenes patoacutegenos ya que estos se deben buscar de forma directa por procedimientos especiales que permitan conocer la peligrosidad o inocuidad de dichos alimentos

bull Se puede concluir que un allmento cuya nora total es elevada debe ser conshysiderado Impropio para el consumo humano

El estudio de flora mcsoacutefila es lmprocedente en determinados casos

_ Cuando se trata de productos ermentados ya que estos contienen norshymalmente cifras elevadas de geacuterm nes imprescindibles en la fermenshytacioacuten y que forman parte de ella (quesos vinos cervezas yogures )

_ En los productos esterilizados hay que tener en cuenta que la ausencia de geacutermenes viables no avala la calIdad bacterioloacutegica de la materia prima con la que se ha elaborado el producto

Para la determinacioacuten de flora aerobla mes6fl1a se homogeneiza la muestra de aUmento y se preparan diluciones decimales sucesivas de la misma Para obtener la dilucioacuten 110 se pesa la porcioacuten del producto a procesar y su peso se muJUpUca por 9 El resultado son los milllilros de diluyente que hay que antildeadir Esta seraacute la suspensioacuten madre con la que trabajar En productos Iiquidos no es necesario realizarla la suspensioacuten madre es el propio producto

Transflriendo 1 mI de suspensioacuten madre a 9 ml de diluyente se consIgue la siguiente dilucioacuten Esto se repite sucesIvamente en 5-6 tubos para obtener la serie de diLuciones decimales

El recuento propiamente dicho se realiza mediante siembra en superficie en medIo de culUvo soacuteHdo (agar putrliyO O PlitCe roBgt ordfgeacuteJr) Se real1za una siemshybra para cada diluaacuteoacuten Tambieacuten puede realizarse la teacutecnica del NMP mediante siembra en caldo nutritivo


Existen numerosos medios propuestos para la de leccioacuten y recuento de esshytas bacterias en alimentos 1bdos eUos llevan incorporados anentes selectivos y diferenciales para Inhibir la flora distinta a Staphulococcus aureus Se emplean como en otros casos medios de enriquecimiento y medIos soacutelidos selectivos Ademaacutes se pueden aplicar pruebas de confirmacioacuten cuando se djspone de coshylonias sospechosas de la presenda de esta bacteria

t-JlwE9~

Auxiliar de Laboratorio QuFmico Anaacutelisis cllnicos

Puede plantearse eL detectar Presencia-Ausencia en una cantidad o dIlucioacuten determinada del alimento Para ello se emplea un meacutetodo de enriquecimiento en tubo en eJ que se inocula una muestra de la suspensioacuten madre del alimento Generalmente se emplea cuando se sospecha una cifra pequentildea de este microshyorganismo

Puede realizarse deteccioacuten y recuento mediante la teacutecnica del NMP cuando se sospecha que el alimento contiene una cifra de estafilococos inferior a 100 por gramo o mililitro de alimento

Se reaHza el meacutetodo de diseminacioacuten en medio soacutelido para alsiaJnjento identificacioacuten y recuento cuando se sospecha que la presencia de S aureus es superior a ] 00 por gramo o mililitro

2 Microorganismos transmitido por los anmentos Caracterfstlcas y patologfa

21 Introduccioacuten ~I consumo de alimentos o de aguas contaminadas por ciertos microorgashy

nismos puede dar lugar a dlferentes enfermedades en el hombre por constituir estos productos un medio nutritivo favorable para la vida Y reproduccioacuten de los microorganismos

estas enfermedades pueden englobarse en dos grupos

Inloxicaciones

Infecciones alimentarias

Se entiende por intoxicacioacuten cuando el agente que produce la enfermedad es una toxina elaborada por el microorganismo que ha invadido el alimento en las infecciones el agente causal es la Ingestioacuten de microorganismos que se han multiplicado en el propio alimento

Las enfermedades transmitidas por las alimentos que se presentan con mashyyor frecuencia son las de origen bacteriano causadas por el consumo de alishymentos o de agua contaminados por bacterias patoacutegenas es decir productoras de enfemledades o de sus toxinas Implearemos el teacutermino toxiinfecd6n para designaT de forma cOlIacuteunta tanto las infecciones como las Intoxicaciones alimentarias

La caracteriacutestica comuacuten de estas enfermedades es que se producen poco tIempo despueacutes desde una hora a pocos diacuteas de haber ingerido un alimento o una bebida en condiciones no adecuadas para su cOllSumo dando lugar a trastornos generalmente de tipo gastrointestinal (voacutemitos diarreas dolor abshydominal ) aunque no necesariamente pues en otros caso el cuadro cliacutenico es extraintestlnal por ejemplo brucelosis fiebre tlfoidea y botulismo

Las bacterias patoacutegenas que suelen provocar estas enfermedades pueden no modificar el aspecto ni otras caracteriacutesticas del alimento (otor sabor coshylor ) por lo que su presencia y multiplicacioacuten no se observa a simple vIsta en los alimentos crudos ni en los ya elaborados

Para que se produzca una toxijnfecloacuten alimentaria es necesario que existan tres elementos baacutesicos agente causal normalmente bacteriano aUmentos

Auxiliar de Laboratorio Ou(mico Anaacutelisis cllnicos

Puede plantearse el detectar fresenda-Ausencia en una cantidad o dlludoacuten detenninada del alimento Para ello se emplea un meacutetodo de enriquecimiento en lubo en el que se inocula una muestra de la suspensioacuten madre del alimento Generalmente se emplea cuando se sospecha una cifra pequentildea de este microshyorganismo

Puede realizarse deteccioacuten y recuento mediante La teacutecnica del NMP cuando se sospecha que el aUmento contiene una cifra de estafiJococos inferior a 100 por gramo o mililitro de alimento

Se realiza el meacutetodo de disemLnacioacuten en medio soacutelido paTa ajslamiento identificacioacuten y recuento cuando se sospecha que la presencia de S aureus es superioT a 100 por gramo o mililitro

2 Microorganismos transmlti Caracteriacutesticas y pato logia

21 Introduccioacuten

por los anmen o

El consumo de alimentos o de aguas contamInadas por ciertos microorgashynismos puede dar lugar a diferentes enfermedades en el hombre por constituir estos productos un medio nutritivo favorable para la vida y reproduccioacuten de los microorganismos


Intoxicaciones


se entiende por intoxicacioacuten cuando el agente que produce la enfermedad es una toxina elaborada por el microorganismo que ha invadido el alimento En las infecciones el agente causal es la ingestioacuten de microorganismos que se han multiplicado en el propio alimento

Las enfermedades transmitidas por las alimentos que se presentan con mashyyor frecuencia son las de origen bacteriano causadas por el consumo de alishymenlos o de agua contaminados por bacterias patoacutegenas es decir productoras de enfermedades o de sus toxinas Emplearemos el teacutermino -toxilnfecdoacutenshypara designar de forma colIIacuteunta tanto las infecciones como las Intoxicaciones alimentarias

La caracteriacutestica comuacuten de estas enfermedades es que se producen poco tiempo despueacutes desde una hora a pocos diacuteas de haber ingerido un alimento o una bebida en condiciones no adecuadas para su consumo dando lugar a trastorno generalmente de tipo gastrointestinal (voacutemitos diarreas dolor abshydominal ) aunque no necesariamen~ pues en otros caso el cuadro cliacutenico extraintestInal por ejemplo brucelosis fiebre tlfoidea y botulismo

las bacterias patoacutegenas que suelen provocar estas enfermedades pueden no modificar el aspecto ni otras caracteriacutesticas del alimento (olor sabor coshylor ) por lo que su presencia y multiplicacioacuten no se observa a simple vIsta en los alimentos crudos ni en los ya elaborados

Para que se produzca una toxiinfedoacuten alimentaria es necesario que existan tres elementos baacutesicos agente causal normalmente bacteriano aUmentos

t t 2 Auxiliar de Laboratorio Quiacutemico Anaacutelisis clfnicos

3 AlImentos Teacutecnicas de deblCCl6n recuento e ldenllflcacloacuten de mlcroornar Dattlatlft(llS

31 Introduccioacuten El mayor problema de seguridad sanitaria en alimentos es la necesIdad de

detectar raacutepidamente los microorganismos para poder evitar la transmisioacuten de enfermedad en un nuacutemero amplio de poblacioacuten Esto es especialmente imporshytante debido a la distribucioacuten en gran escala de alimentos perecederos

bull Las teacutecnicas estandarizadas de cultivo de las que hablaremos abundanteshymente a continuacioacuten necesjtan diacuteas e induso semanas para una identificacioacuten positiva de un patoacutegeno Ademaacutes es frecuente que se compliquen por el bajo nuacutemero de patoacutegenos en el alimento en comparacioacuten con una abundante mishycrobiota acompantildeante Por otro lado la composicioacuten qu[mica y flSica de los alishymentos puede hacer que el aislamiento de microorganismos sea dificultoso

bull Para evitar estos problemas se han ido Incorpomndo nuevas teacutecnicas basashydas en la inmunologiacutea y biologfa molecular que estaacuten ofreciendo interesantes expectativas para una deteccioacuten raacutepida incluso presencia de un beacuteUo nuacutemero de microorganismos No obstante en el siguiente tema se exponen fundamentalshymente las teacutecnicas de microbiologiacutea tradicionales que siguen vigentes por estar maacutes consolidadas y estandarizadas

32 Salmonella

Geacutenero perteneciente a la familia de las enter0bacterjas Son bacilos no esporulados moacuteviles mediante flagelos (la mayoTfa) grnm nesatilos aerobios y anaerobios facultaU~os Su reservorio primario es el tracto inlestinal de verteshybrados e Insectos

Su transmisIoacuten es fundamentalmente por contaminacioacuten fecal de alimenshy~ Las fuentes maacutes importantes de SaJmonelTa son los alimentos proteicos de origen animal aunque tambieacuten es posible la contaminacioacuten a partir de agua vegetales crudos coco aditivos y otros productos Para que se desarroUe enshyfermedad con sintomatoJogiacutea diacutenica se requiere la insesta de UD pron inOClllo (l()8- lOIO ceacutelulas) Cualquiera que sea la fuente los alimentos causantes de broshytes de salmonelosis han estado en contacto con heces directa o lndjrectamenshyte conteniendo una cantidad suficiente de Salmonella para poder desencadeshynar la enfermedad Otras veces aunque el nuacutemero de bacterias sea escaso si el alimento reuacutene las condiciones oacuteptimas para su desarrollo puede conseguirse la dosis infectante adecuada

Las enfermedades producidas por las distintas espedes 5almonella se coshymentan ampliamente en otros capiacuteLulos (Temas 44 y 47) Aquellas corresponshydientes a especies no tifoideas se denominan salmonellosis y afectan tanto al hombre como a los animales La saJmonelosis humana crea un importante problema de salud puacuteblica en todo el mundo

AIslamiento e ldenUficad6n de Salmonena en alimentos

Existen numerosas teacutecnicas propuestas a lo largo de varios antildeos para el aislamiento e identificacioacuten de este microorganismo La mayoriacutea de ellas son

t-JlwfrYU1fl

- -

Anaacutelisis de alimentos 1 t 3

teacutecnicas complEjas y ninguna es oacuteptima para toda clase de alimentos El prinshycipal problema es el hecho de que las ceacutelulas de Salmonella se encuentran mezcladas en aljmentos contaminados COn numerosos microorganismos que en general soportan mejor Que eacutestas las condiciones ambientales desarroshyllaacutendose maacutes Que ellas Por ello las teacutecnicas paTa la deteccioacuten de la Salmonella se disenan para Favorecer su crecimiento y retardar o suprimir el de la biota contamjnante que les puede acompantildear Para obtener buenos resultados es necesario tener en cuenta ciertos detaJles de metodolosiacutea

_ maacutes de muestra deutilizar altos inoacuteculos se procesan 25 gramos o ahmento

_ Neutralizar Los productos aacutecidos para que el pH se mantenga por endshymade6

- utilizar medios liacutequidos de enriquecimiento selectivos que inhiban el desarrollo de biota competitiva

Existe un acuerdo unaacutenime en cuanto al establecimiento de unas etapas dentro de la sistemaacutetica de anaacutelisis para el aislamiento e Identificacioacuten de Salshymonella

- PreepdguectmJento en medios liacutequidos DO selectivos Sirve para revivificar ras C1fuuml]as de Salmonella lesionadas y permitir su recuperashycioacuten Especialmente importante en alimentos que en su preparacioacuten o conservacioacuten han sufrido tratamientos que comprometen la fisioloshygiacutea bacteriana normal (tratamiento teacutermico desecacIoacuten conservantes etc) el medlo maacutes frecuente es caldo peptona amponado En este medio se resuspende o se tritura la muestra de alimento consiguiendo una concentracioacuten 1 10 5e Incuba a 37 oc durante 16-20 horas-- en medios liacutequidos selectivos Facilitan la multi shyplicacioacuten de saImonella e Lnhiben el crecimiento de biota competidora Estos medios deben ser lo suficientemente selectivos como para preveshynir el crecimiento excesivo de competidores mantener constante su seshylectividad y ser capaces de recuperar todos los serotipos Existen caldos con tetratioDato caldo selenita y selenjto-dstjoa y caldo de RappaportshyVassilladls Se aconsEja ullUzar dos de ellas por cada muestra Se transshyfieren ID mi del caldo de preenriquecimiento a cada 100 mi de estos excepto para el Rappaport-Vasslllsdls que se transfiere 01 mi a ID de medio Se Incubin uno a 43OC Y el otro a 37 OC durante~ horas

- AIslamiento diferencial sobre medio $OacuteUdo selectivo Son medios soacutelidos con colorantes sales biliares antibioacuteticos yo ustanda quiacutemishycas que inhiben el crecimiento de flora competitiva Llevan un sistema Indicador para diferenciar Salmonella basaacutendose en la produccioacuten de 5th sulfidrico Yo la feqnWliIfoacuten de rarhpbjdpkgtS (I~ sacwpsa O xllosa) Los hay desde poco selectivos (Asar Mac Conkey) moderashydamente selectivos ~9ar salmonela-shiselaiexcl agar Hektoen) hasta alshytamente selectivos (Aqar verde brillante rolo rrgO - RGA) Se siembran por duplicado a partir del medio de enriquecimiento La temperatura de Incubacioacuten son SiexclOC y el tiempo 24-48 horas

Las colonias ca~cteriacutestlcas de Salmonella son de color rojo-rosado transparentes con un halo rojo brillante en BOA y verde azuladas con o sin centro negro en Hektoen

Anaacutelisis de aiacutementos 1 1 3

teacutecnicas compl~as y ninguna es oacuteptima para toda clase de alimentos El prinshycipal problema es el hecho de que las ceacutelulas de Salmonella se encuentran mezcladas en a1imentos contaminados con numerosos microorganismos que en general soportan m~or que eacutestas las condiciones ambientales desarroshyllaacutendose maacutes que ellas Por ello las teacutecnicas para la deteccioacuten de la SalmoneUa se diseiiacutean para favorecer su crecimIento y retardar o suprimir el de la biota contaminante que les puede acompantildear PaJa obtener buenos resultados es necesario tener en cuenta ciertos detalles de metodologiacutea

_ utilizar altos InoacutecuJos se procesan 25 gramos o maacutes de muestra de ahmento


- utlllzar medios liacutequldos de enriquecimiento selectivos que inhiban el desarrollo de biota competitiva

Existe un acuerdo unaacutenime en cuanto al establecimiento de unas etapas dentro de la sislemaacuteUca de anaacutelisis para el aislamiento e Identificacioacuten de SalshymoneUa

- PreeprlguedmJento en medios liacutequidos no selectivos Sirve para revivificar las mas de salmonella lesionadas y permil ir su recuperashycioacuten Especialmente importante en alimentos que en su preparacioacuten o conservacioacuten han sufrido mitamienlos que comprometen la fisioloshygiacutea bacteriana normal (tratamiento teacutermico desecacioacuten conservantes etc) el medio maacutes frecuente es caldo peptona aIDpgnado en este medio se resuspende o se tritura la muestra de alimento consiguiendo una concentracioacuten] 10 Se Incuba a 37 OC durante 16-20 horas -- en medios liacutequidos selectivos faciJltan la multi-plicacioacuten de SaJmonella e inhiben el crecimiento de biola compelidora Estos medios deben ser lo suficientemente selectivos como para preveshynir el credmiento excesivo de compeUdores mantener constante su seshylectividad y ser capaces de recuperar todos los serotipos existen caldos con tetralioDato caldo selenito y selenjt9=dstina y caldo de RappaportshyVassUladls Se aconseja uUUzar dos de ellos por cada muestra Se transshyfieren 10 mi del caldo de preenrfquecimiento a cada 100 mi de estos excepto para el Rappaport-Vassillsdls que se transfiere 01 mi a 10 de medio Se Incu~n uno a 43 OC Y el otro a 37 OC durante24-48 horas - -- tamlento diferencial sobre medio $OacuteUdo selectivo Son medios soacutelidos con colorantes sajes biliares antibioacuteticos yo ustancia quiacuternjshycas que inhiben el crecimiento de llora competitiva Llevan un sistema Indicador para diferenciar SalmonelLa basaacutendose en la Rroduccioacuten de SM suLfidrioo Yo la fermeptadoacuten de rarhpbidRtns (I~ sacwpsa O xIlosa) Los hay desde poco selectivos (Asar Hae Conkey) moderashydamente selectivos (Agar salmonela-shiselaiexcl agar Hektoen) hasta alshytamente selectivos (Agar verde brillante mio fimo - BOA) Se siembran por duplicado a partir del medio de enriquecimiento La temperatura de incubacioacuten son 3JOC y el tiempo 24-48 horas -Las colonias caracteriacutesticas de Salmonella son de color roJo-rosado transparentes con un halo rojo brillante en BOA y verde azuladas con o sin centro negro en Hektoen

1 4 Auxiliar de Laboratorio Qufmico Anaacutelisis cl(nicos

- Conftnnacloacuten bloquimica de las colonJas sospechosas- esta conshyfirmacioacuten se realiza con las colonias sospechosas de los medios selecshytivos fmdamentalmente se estudian dos aspectos bull Producci6n de lisina-descarboxtlasa en caldo lisina descarboxllashy

sao foacuteStivo para salmonella bull Degradacioacuten de la lactosa En ONPG investigacioacuten de la presencia

de (--galactosidasa Negativo para Salmonella

- SionnrmaclOn serol6sampsa de I colonias sospecbosas- Los subshycultivos que han dado reacciones bioquiacutemicas tiacutepicas de Salmonella se someten a pruebas seroloacutegicas confirmalivas Se utilizan antisueros comerciales y se enfrentan a las ceacutelulas aisladas de la posible SalmoneshylIa La aparicioacuten de aglutinacioacuten con un antisuero determinado muestra una prueba positiva Se detectan antiacutegenos somaacuteticos (O) el antiacutegeno Vi y antiacutegenos flagelares (TI)

en ocasiones es necesario conocer el nuacutemero de ceacutelulas de Salmonella que contiene el alimento sospechoso en estos casos hay que adaptar la teacutecnica para hacer un recuento

33 Shigella

Tambieacuten pertenece a la familia de las enterobacterlas Son ~ no esporulados inmoacuteviles 9raIn negativos aerobios y anaerobios rnCUaUyps El reservorio primario es el Intestino del hombre enfenno o portador y de primates no humanos Su difusjoacuten se realiza directamente a partir de las heces de persoshynas enfermas o portadoras e indirectamente veruculadas por aiintildeientildetos agua y moscas Los alimentos soacutelo son vectores no especiacuteficos Que se contaminan a partir del hombre Cualquier alimento no ~esivamente aacuteddo ni deshidratado puede transportar Shigella

Las shigelosis suelen ser siacutendromes gastroenteacutericos de mayor o menor grashyvedad (disenteriacutea bacilar) y se comentan en capiacutetuJos anleriores

Aislamiento e Idenliflcaci6n de Shigella

Como en el caso de Salmonella para la deteccioacuten de ShigeUa es necesario hacer enriqueclmiento en medio Ifquido y posterior siembra en medios soacutelidos selectivos El procedimiento es similar por lo que comentaremos uacutenicamente aquellos aspectos que sean especiales para esta bacteria

Se procesan 25 g de muestra de alimento que se homogeneizan-trituran con caldo de enriquecimiento (caldo QN o caldo MosseJ) Se lncuba a 37 OC durante 16-18 horas - shy

- Aislamiento sobre medios seJecUvos Partiendo de los caldos de enrishyquecimiento se siembra en la superficie de agar Mac Conkey agar )(LO (xlIosashylisina-descarboxilasa) y agar Nektoen Se incuban las placas a21OC (Jurante 24-48 horas

Las colonias caracteriacutesticas de Shigella en cada uno de los medios son

- Asar Mac Conkey transluacuteddas siacuten coloraciacuteoacuten _ Agar XLD coJor rosa rodeadas por un halo del mismo color

_ Agar hektoen color verde -

Anaacutelisis de alimentos t t 5

- Conflrmacmiddotloacuten blOCJl1IacuteDl1Ca de las colonias sospechosas- Se reatizan fundamentalmente las siguientes pruebas

Siembra en medio glucosa-lactasa-Stt2 (Kliger lron Agar KIA) En eacutel se estudia la fermentadoacuten de la glucosa con o sin produccioacuten de gas fermentacioacuten de la lactosa y produccioacuten de S~ por degradacioacuten de aminoaacutecidos con azufre Para Shigella el resultado caracteriacutestico es

bull fermentacioacuten de glucosa sin produccioacuten de gas

Lactosa negativa

S~ negativo

- Siembra en medios para uacutewesUgacloacuten de presencia de determinados enzimas 50n caracteriacutesticamente negativos para Shigella ureasa dshytocromo-oxidasa trlptoacutefano desaminasa (Indo) y capacidad de crecishymiento con citrato como uacutenica fuente de carbono

Existen pruebas adicionales que permiten la Identificacioacuten del subgrupo

Confirmacioacuten seroloacuteglca- Se reaUza como en el caso de Saimonella con las ceacutelulas desarrolladas en un cultivo redente y enfrentaacutendolas a antisueros comerdales

34 Escheriacutechla colJ patoacutegeno

Ademaacutes de ser un indicador de contaminacioacuten fecal algunas cepas de este microorganismo son patoacutegenas para el ser humano y transmisibles por alimentos En este sentido se distinguen cuatro tipos de E eoll dependienshydo del problema patoloacutegico que desencadenan lo cual a su vez estaacute muy ligado a la produccioacuten de determinadas toxinas Los cuatro tipos de B eoU se denominan

E eoil enteropatogeacutenica

B eoll enteroinvasiva

E eoll enterotoxigeacutenlca

_ B eoll enterohemorraacutegica

La detecdoacuten de cualquiera de ellos sigue previamente el manejo establecishydo para detectar la bacteria en alimentos pero una vez aislada e identificada a nivel de especie se puede testar s es de uno de estos grupos mediante teacutecnishycas seroloacutegicas (similares a las de otras entero bacterias) o maacutes recientemente mediante teacutecnicas de biologiacutea molecular que buscan y detectan la presenda del gen responsable de la produccioacuten de la toxina

35~ Clostridium

Dentro de este geacutenero ademaacutes de la consideracioacuten de indicadores o iacutendices de contaminacioacuten para todos los capaces de reducir sulfito existen especies patoacutegenas transmisibles por alimentos (Clostridium perfrlngens y Clostrldium botultnum son las maacutes importantes) Las enfermedades que producen son toxishyinrecciones y han sido comentadas en el tema anterior

Anaacutelisis de alImentos t t 5

- Confirmacioacuten bJ~ca de las colonias sospecbosas- Se realizan fundamentalmente las siguientes pruebas

Siembra en medio glucosa-lactosa-S1l

(Ifllger lron Agar fflA) En eacutel se estudia la fermentacioacuten de la glucosa con o sin produccioacuten de gas fermentacioacuten de la lactosa y produccioacuten de SH por degradacioacuten de aminoaacutecidos con azufre Para Shlgefla el resultado caracteriacutestico es

fermentacioacuten de glucosa sin produccioacuten de gas

Lactosa negativa

Sf negativo

- Siembra en medios para investigacioacuten de presencia de determinados enzimas 50n caracteriacutesticamente negativos para Shigella ureasa dshytocromo-oxidasa lrlptoacutefano desamlnasa (Indol) y capacidad de crecishymiento con citrato como uacutenica fuente de carbono


ConflJmadoacuten seroloacuteglca- Se realiza como en el caso de Salmonella con las ceacutelulas desarrolladas en un cultivo reciente y enfrentaacutendoJas a anUsueros comerciales

34 Escherichla coll patoacutegeno

Ademaacutes de ser un IndlcadOT de contaminacioacuten fecal algunas cepas de este microorganismo son patoacutegenas para el ser humano y transmisiacutebfes por aUmentos En esle sentido se distinguen cuatro tipos de E eoll dependienshydo del problema patoloacutegico que desencadenan lo cual a su vez estaacute muy ligado a la produccioacuten de determinadas toxinas Los cuatro tipos de e eoll se denomjnan

E eoll enteropatogeacutenica

E coll enteroinvasiva

E coll enterotoxigeacutenlca

_ B coU enterohemorraacutegica

La deteccioacuten de cualquiera de ellos sigue previamente el manejo establecishydo para detectar la bacteria en alimentos pero una vez aislada e identificada a nivel de especIe se puede testar s es de uno de estos grupos mediante teacutecnishycas seroloacutegicas (similares a las de otras enterobacterias) o maacutes recientemente mediante teacutecnIcas de bioJogiacutea molecular que buscan y detectan la presencia del gen responsable de la produccioacuten de la toxIna

35 Costridium

Dentro de este geacutenero ademaacutes de la consideracioacuten de indicadores o iacutendices de contaminacioacuten para todos los capaces de reducir sulfito existen especies patoacutegenas transmisibles por alimentos Clostridium perfriacutengens y Clostrldium botulinum son las maacutes importantes) Las enfermedades que producen son toxishyinfecciones y han sido comentadas en el tema anterior

e Auxiliar de Laboratorio Qufmico Anaacutelisis cllnlcos

La deteccioacuten especiacutefica de Oostrldlum perfrngens en aJlmentos puede ser necesaria en algunos casos y la teacutecnica a seguir dependeraacute de la finalidad del anaacutelisis Asiacute

Casos de presunta Intoxlcacloacuten determinacioacuten cualitativa y cuantitashytiva del germen

Otros casos determinacioacuten de la Presencia-Ausencia Nuacutemero Maacutes Probable o recuento en placas

En general para lograr el aislamiento numeracioacuten e identificacioacuten se re-Quiere

Anaerobiosis

Medios de enriquecimiento (selectivos o no)

Medjo de aislamiento en placa para determinar caracteriacutesticas metaboacuteshylicas idenUficatlvas como hemoacutellsis produccioacuten de lecitinasas y reducshyci6n del sulfito

Medios para confirmacioacuten de la IdenUficacioacuten mediante estudio de reshyduccioacuten de nitritos movilidad fermentacioacuten de la lactosa

Para la deteccioacuten de Clostridium botullnum de todas las teacutecnicas que se han propuesto para alimentos la inoculacioacuten intraperitoneal al rat6n es la maacutes fidedigna y sensible Lo Que se persigue es detectar Presencia-Ausenshycia de la bacteria y sus toxinas siendo de especial intereacutes la deteccioacuten de la toxina bolulUacutelica en los restos de alimentos consumidos por los enfermos Detectarla en heces o suero de pacientes no siempre es posible ya que su preshysencia depende de la rase de la enfermedad y el momento en que se loman las muestras En ocasiones se dispone del alimento sospechoso u otros del mismo lote y se puede investigar la presencia de esporas toxigeacutenicas yo de rormas vegetativas Para ello hay que recurrir a medios de enriquecimiento y subcultiacutevo en medio soacutelido con aislamiento selectivo y posterior inoculacioacuten al ratoacuten de las ceacutelulas aisladas

36 Vibro

IWsten varias especies de intereacutes en infecciones alimentarias pero sin duda la maacutes importante es V cholerae El al lamienlo e identificacioacuten de esta especie se basa principalmenle en el raacutepido crecimiento de este microorganismo sobre agua de peptona alcalina en coomdones de aerobiosis El crecimJento se mashynifiesta con la fonnacloacuten de una peliacutecula en la superficie del memo a las pocas horas de incubacioacuten La identlficacloacuten se realiza partiendo de este creclrnlento caracteriacutestico desde donde se aiacutesla en medio soacutelido selectivo (agar TCBS)

Las colonias desarrolladas sobre TCBS tras 18-24 horas de incubacioacuten son de 5-4 mm de diaacutemetro planas opacas lisas redondas y de color amarillo

37 Campylobacter

Concretamente la especie CjfUacuteW11 se considera la que maacutes gastroenteritis bacteriana causa en humanos Puede afectar a todas las edades y muy frecuenshylemenle se transmile mediante alimenlos crudos o poco cocinados Un bqjo inoculo (10 ceacutelulas) es suficiente para desencadenar la enfermedad

1 1 e Auxiliar de Laboratorlo Qufmico Anaacutelisis cllnlcos

La deteccioacuten especifica de Closbidium perfringens en alimentos puede ser necesaria en algunos casos y la teacutecnica a seguir dependeraacute de la finalidad del anaacutelisis Asiacute

Casos de presunta lntoldcacloacuten determinacioacuten cualitativa y cuantitashytiva del germen


En general para lograr el aislamiento numeracioacuten e identificacioacuten se reshyQuiere

Anaerobiosis


Medio de aislamiento en placa para determinar caracteristlcas metaboacuteshylicas idenUflcatlvas como hemoacutellsls produccioacuten de lecitinasas y reducshycioacuten del sulfito

Medios pafa confirmacioacuten de la identificacioacuten mediante estudio de reshyduccioacuten de nitritos movilidad fermentacioacuten de la lactosa

Para la deteccioacuten de Clostridium botuilnum de todas las teacutecnicas que se han propuesto para alimentos la inoculacioacuten In traperitonea I al ratoacuten es la maacutes fidedigna y sensible Lo que se persigue es delectar Presencia-Ausenshycia de la bacteria y sus toxinas siendo de especial intereacutes la deteccioacuten de la toxina botuliacutenica en los restos de alimentos consumidos por los enfermos Detectarla en heces o suero de pacientes no siempre es posible ya que su preshysencia depende de la Fase de la enfermedad y el momento en que se loman las muestras En ocasiones se dispone del alimento sospechoso u otros del mismo lote y se puede investigar la presencia de esporas toxigeacutenicas yo de formas vegetativas Para ello hay que recurrir a medios de enriquecimiento y subcullivo en medio soacutelido con aislamiento selectivo y posterior inoculacioacuten al ratoacuten de las ceacutelulas aisladas

36 Vibrio

existen varias especies de intereacutes en infecciones alimentarias pero sin duda la maacutes importante es V cholerae El ai lamlento e idenUficacloacuten de esta especie se basa principalmenle en el raacutepido crecimiento de este microorganismo sobre agua de peptona alcalina en condiciones de aerobiosis el creclmjento se mashynUiesta con la formacioacuten de una peliacutecula en la superficie del medio a las pocas horas de incubacioacuten La identificacioacuten se realiza partiendO de este crecimiento caracteriacutestico desde donde se aiacutesla en medio soacutelldo selectivo (agar TCBS)

Las colonIas desarrolladas sobre TCBS tras 18middot24 horas de Incubacioacuten son de 3-4 mm de diaacutemetro planas opacas lisas redondas y de color amarillo

37 Campylobacter

Concretamente la especie CjfUacuteUTll se considera la Que maacutes gastroenteritis bacteriana causa en humanos Puede afectar a todas las eelades y muy frecuenshytemenle se transmile mediante alimenlos crudos o poco cocinados Un lxUo Inoculo (10 ceacutelulas) es suficiente para desencadenar la enfermedad

Anaacutelisis de alimentos 1 1 7

La investigacioacuten de campylobacter (CJ~WlI y C coli) en alimentos precisa de medios de enriquecimiento para conseguir su rehabilitacioacuten y asegurar su deteccioacuten Para ello se utiliza un caldo base al que se incorporan anUbioacutetlcos y suplementos que inhiben el crecimiento de los microorganismos contaminanshytes que puedan acompantildear al aUmento Los caldos de enriquecimiento se deshyben incubar siempre en una atmoacutesfera microaeroacuteblca (5 de oxiacutegeno J 0 de CO~ y 85 de nitroacutegeno) a 42 OC durante 48 horas nas el enriquecimiento se realiza el aislamiento en medios selectivos como el cary-Blair o agar selectivo de Skirrow que se Incuban en la misma atmoacutesfera y temperatura durante 24 horas Se estudia enlonces el desarrollo de colonias caracteriacutesticas (dependeTaacute de la especie) y se procede a la identificacioacuten por caracteriacutesticas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas como son

1Iodolog(a mediante Uncioacuten de gram se observan bacilos en forma de S con los extremos afilados

Citooromo-oxJdasa ambas especies son citocromo-oxiacutedasa positivas Catalala ambas especies poseen este enzima que desdobJa el agua oxiacutegenada en agua y oxigeno libre

Anaacuteliacutesiacutes de alimentos 1 1 7

La investigacioacuten de campylobacter (CJ~wli y C eoll) en alimentos precisa de medios de enriquecimiento para conseguir su rehabilitacioacuten y asegurar su deteccioacuten Para ello se utiliza un caldo base al que se incorporan anUbioacuteticos y suplementos que inhiben el crecimienLo de los microorganismos contaminanmiddot tes que puedan acompantildear al al1mento Los caldos de enriqueclmlenLo se deshyben incubar siempre en una aLmoacutesfera microaeroacutebica (5 de oxiacutegeno 10 de Coz y 85 de nitroacutegeno) a 42 OC durante 48 horas nas el enriquecimiento se realiza el aislamiento en medios selectivos como el C3ry-Blair o agar selectivo de Skirrow que se Incuban en la misma atmoacutesfera y temperatura durante 24 horas Se estudia enlonces el desarrollo de colonias caracteriacutesticas (dependeraacute de la especie) y se procede a la identillcadoacuten por caracteriacutesticas morfoloacutegicas y bioquiacutemicas como son

Morfologia mediante Uncioacuten de gram se observan bacilos en forma de S con los extremos afilados

Citocromo-oxIdasa ambas especies son citocromo-oxidasa positivas

Catalasa ambas especies poseen este enzima que desdobla el agua oxigenada en agua y oxiacutegeno libre

84 Auxiliar de Laboratorio Ouiacutemico Anaacutelisis cliacutenicos


Son aquellos cuya presencia Indica una posible contaminacioacuten o la exIstenshycia de patoacutegenos poLenciales Muchos microorganismos o grupos de microorshyganismos han sido propuestos como indicadores y siguen buscaacutendose indicashydores ideales para disUnlas muestras de agua En cualquier caso un indicador de contaminacioacuten debe reunir los siguientes requisitos

lt1 estar presentes en heces aguas de desecho aguas residuales (cualshyquier medio en que los patoacutegenos esteacuten presentes) y ausentes en aguas sin polucioacuten fecal

Los niveles de indicadores deben tener una relacioacuten con la densidad de patoacutegenos en el medio acuaacutetico y ser proporcionales a la magnitud de la contaminacioacuten

3 La s ervlvencla de los indIcadores en agua debe ser al menos simishylar a la de los patoacutegenos Ademaacutes la resIstencia de lo indicadores a los factores de depuracioacuten y desinfectantes debe ser similar a ta de los patoacutegenos

4 Los Indicadores deben ser detectables r meacutetodos simples baratos eguros y raacutepidos

5 Los indicadores pueden no ser patoacutegenos y aplicables a todo tipo de muestras de aguas que requieran un programa de monitorizacioacuten

6 Las caracteriacutesticas de los indicadores deben ser coW~oWI_

7 Deben ser capaces de CreceT mulUplkarse en el agua

La calidad microbioloacutegica ysanitaria de las aguas se ha medido durante casi un siglo por anaacutelisis de microorganismos indicadores Los grupos de microorshyganismos maacutes ampliamente utilizados son

- Coliformes totales

Coliformes fecales y Escherichia eolio

) - Estreptococos fecales y Bnterococos


- Oostridios sulfito-reductores


Pseudomonas aeruginosa =

84 Auxiliar de Laboratorio Quiacutemico Anaacutelisis clfnicos


Son aquellos cuya presencia Indica una posible contaminacioacuten o la exIstenshycia de patoacutegenos poLenclales Muchos microorgani mos o grupos de microorshyganismos han sido propueslos como indicadores y siguen buscaacutendose indicashydores ideales para distintas muestras de agua En cualquier caso un indicador de contaminacioacuten debe reunir los siguientes requisitos

ltp rstar presentes en heces aguas de desecho aguas residuales (cualshyquier medio en que los patoacutegenos esteacuten presentes) y ausentes en aguas sin polucioacuten fecal

(j) Los niveles de indicadores deben tener una relacioacuten con la densidad de patoacutegenos en el medio acuaacutetico y ser proporcionales a la magnitud de la contaminacioacuten

3 La su ervIvenc1a de los indIcadores en agua debe ser al menos simishylar a la de los paloacutegenos Ademaacutes la resistencia de lo indicadores a los factores de depuracioacuten y desinfectantes debe seT similar a la de los patoacutegenos

4 Los Indicadores deben ser detectables T meacutetodos simples baratos seguros y raacutepidos

5 Lo indicadores pueden no ser patoacutegenos y aplicables a todo tipo de muestras de aguas que requieran un programa de monitorizacioacuten

La camcteriacutesUcas de los indicadores deben ser co~jjjiexcl_

Deben seT capaces de crecer mnlUpUcarse en el agua

La calidad microbioloacutegica y sanitaria de las aguas se ha medldo durante casi un siglo por anaacutelisis de microorganismos indicadores Los grupos de microorshyganismos maacutes ampliamente utilizados son

)

- Colirormes totales

Coliformes fecales y EscherlchIa coU

- Estreptococos fecales y Enterococos


1--- C1ostridios sulfito-reductores


Pseudomonas aeruginosa












































Problemas







Problemas





















Inconvenientes
















lnconvenientes









Inconvenientes














Inconvenientes












J -24 de~a7 C

-24 __ mrmon~

~paI_


B

_Il10


B lM1NopUvo


de 0i00

tUb09










































Dmctos





ut+nMII










Directos





ut+YH1II




2352 Nemalodes

























bullbull f


Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















DetCT1l1lr~~










- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































geno)







I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































bull bull bull

bull


























ulwEqnMII
















t-JlwE9~









Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






t-JlwfrYU1fl

- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

Sf negativo











35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter






















































Problemas







Problemas





















Inconvenientes
















lnconvenientes









Inconvenientes














Inconvenientes












J -24 de~a7 C

-24 __ mrmon~

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B

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B lM1NopUvo


de 0i00

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Dmctos





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Directos





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2352 Nemalodes

























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Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















DetCT1l1lr~~










- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































geno)







I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































bull bull bull

bull


























ulwEqnMII
















t-JlwE9~









Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

Sf negativo











35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter























Inconvenientes
















lnconvenientes









Inconvenientes














Inconvenientes












J -24 de~a7 C

-24 __ mrmon~

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B

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B lM1NopUvo


de 0i00

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Dmctos





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2352 Nemalodes

























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Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















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- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































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I









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flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

Sf negativo











35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter















Inconvenientes














Inconvenientes












J -24 de~a7 C

-24 __ mrmon~

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B

_Il10


B lM1NopUvo


de 0i00

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2352 Nemalodes

























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Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















DetCT1l1lr~~










- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































geno)







I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































bull bull bull

bull


























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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

Sf negativo











35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter













J -24 de~a7 C

-24 __ mrmon~

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B

_Il10


B lM1NopUvo


de 0i00

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Dmctos





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Directos





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2352 Nemalodes

























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Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















DetCT1l1lr~~










- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































geno)







I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































bull bull bull

bull


























ulwEqnMII
















t-JlwE9~









Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

Sf negativo











35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter

















































Dmctos





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Directos





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2352 Nemalodes

























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Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















DetCT1l1lr~~










- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































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I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

Sf negativo











35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter














2352 Nemalodes

























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Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















DetCT1l1lr~~










- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































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I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

Sf negativo











35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter





























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Paraacutesitos No


Anlmaacuteculos No

Algas No


















DetCT1l1lr~~










- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































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I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

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35~ Clostridium







Lactosa negativa

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35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter
















- UumllterocOCOS





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































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I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

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Lactosa negativa

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Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter





















Medidas indirectas













Medidas indirectas











Medidas directas




















































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I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

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Anaerobiosis





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37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



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Medidas directas




















































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I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Intoxicaciones













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Anaerobiosis





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Anaerobiosis





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I









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flora anaerobia















Escherichla eoll





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Inloxicaciones













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Intoxicaciones













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- -























33 Shigella














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Anaerobiosis





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37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



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I









93










flora anaerobia















Escherichla eoll





Flora anaerobia
































































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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

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Anaerobiosis





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Anaerobiosis





36 Vibrio



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flora anaerobia















Escherichla eoll





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Inloxicaciones













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Intoxicaciones













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33 Shigella














Lactosa negativa

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Lactosa negativa

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Anaerobiosis





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Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter
































































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Inloxicaciones













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Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














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Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



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Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























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Lactosa negativa

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Lactosa negativa

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Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter



















Inloxicaciones













por los anmen o



Intoxicaciones













32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

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Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter

















32 Salmonella






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- -























33 Shigella














Lactosa negativa

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Lactosa negativa

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Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter











- -























33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

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35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter

















33 Shigella














Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

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35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter















Lactosa negativa

S~ negativo











35~ Clostridium







Lactosa negativa

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35 Costridium







Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter
















Anaerobiosis





36 Vibro



37 Campylobacter







Anaerobiosis





36 Vibrio



37 Campylobacter











6. Analisis de Agua y Alimentos

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