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I
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por permitirme llegar a esta etapa de mi vida y poder disfrutar este logro
con mi familia y seres queridos
Mi máximo agradecimiento al Pueblo de México, que a través de la Universidad Autónoma
Chapingo me ha brindado los recursos económicos necesarios para llevar a cabo mis estudios
de licenciatura
Agradezco a mi Alma Máter, la Universidad Autónoma Chapingo y a la División de Ciencias
Forestales por haberme brindado los conocimientos científicos y tecnológicos, que han sido
y serán la base en mi desarrollo como futura profesionista
A la DGIP (Dirección General de Investigación y Postgrado), porque a través del PROFONI
(Programa de Formación de Nuevos Investigadores), despertó en mí las ganas de desarrollar
Investigación Científica en beneficio del sector forestal
A mi comité revisor por sus aportaciones durante la elaboración de este proyecto, en especial
a la M.C Silvia Edith García Díaz, le agradezco por haber dedicado parte de su tiempo, y
transmitirme sus enseñanzas y aportaciones de manera incondicional y generosa.
A los demás miembros del comité revisor, al M.C José Luis Navarro Sandoval, Dr. David
Cibrián Tovar, Ing. José Tulio Méndez Montiel y al M.C Rodolfo Campos Bolaños, por sus
aportaciones hacia este trabajo
Al COMECYT (Consejo Mexiquense de Ciencia y Tecnología), por la beca otorgada para el
finiquito de este proyecto
A mis padres, hermanos y demás familiares, les agradezco por haber confiado en mí y por
todo el apoyo que me han brindado, agradezco sus consejos y motivaciones para seguir
adelante
A mi esposo, Enrique Reyes Mendoza y a su familia, por cuidar a mi hijo Emiliano durante
la realización de este proyecto.
II
DEDICATORIA
A mi hijo EMILIANO,
quien es y será la motivación de todas mis metas y logros.
A mis padres Carmen e Ignacio,
por haberme inculcado valores y principios desde pequeña,
para lograr lo que ahora soy, los amo y espero compensar
todo lo que han hecho por mi hasta este momento.
A mis hermanos Carmen, Israel, Erika y Natali,
porque han sido ejemplares en mi formación
y he aprendido tanto de ellos.
A mi tío José Luis (Mi tío Chapo),
porque ha sido como un segundo padre para mí y mis hermanos.
A mi esposo Enrique Reyes Mendoza,
por su apoyo y comprensión en esta etapa de mi vida.
III
ÍNDICE
AGRADECIMIENTOS ..................................................................................................................... I
DEDICATORIA ................................................................................................................................ II
RESUMEN ....................................................................................................................................... VII
SUMMARY .................................................................................................................................... VIII
I. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1
II. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 3
III. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 3
3.1 Objetivo general ...................................................................................................................... 3
3.2 Objetivos específicos ............................................................................................................... 3
IV. REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................................................ 4
4.1 Proceso de reactivación de cepas ........................................................................................... 4
4.2 Características morfológicas de Trichoderma ....................................................................... 5
4.3 Contribuciones a la caracterización molecular de Trichoderma ......................................... 7
4.4 Características morfológicas de Fusarium ............................................................................ 9
4.5 Contribuciones a la caracterización molecular de Fusarium ............................................ 12
4.6 Control biológico con Trichoderma ...................................................................................... 13
a) Trichoderma, género antagonista ................................................................................... 13
b) Patógeno Fusarium ............................................................................................................. 14
4.7 Mecanismos de acción de Trichoderma spp ........................................................................ 15
V. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................................. 17
5.1 Metodología general .............................................................................................................. 17
5.2 Reactivación de cepas............................................................................................................ 17
5.3 Caracterización morfológica de Trichoderma spp y Fusarium spp ................................... 19
5.4 Caracterización molecular de Trichoderma spp y Fusarium spp ...................................... 21
5.4.1 Extracción de DNA............................................................................................................. 21
5.4.2 Amplificación de las secuencias mediante la PCR....................................................... 22
5.4.3 Ensamble de las secuencias ............................................................................................ 23
IV
5.5 Pruebas de antagonismo in vitro .......................................................................................... 24
5.6 Mecanismos de acción de Trichoderma ............................................................................... 27
5.6.1 Micoparasitismo ............................................................................................................. 27
5.6.2 Competencia por espacio ............................................................................................... 27
5.7 Análisis estadístico ................................................................................................................ 29
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................................. 30
6.1 Reactivación de cepas............................................................................................................ 30
6.2 Caracterización morfológica de Trichoderma spp .............................................................. 30
Trichoderma 1 .......................................................................................................................... 31
Trichoderma 2 .......................................................................................................................... 33
Trichoderma 3 .......................................................................................................................... 35
6.3 Caracterización morfológica de Fusarium spp ................................................................... 37
Fusarium 1 ............................................................................................................................... 37
Fusarium 2 ............................................................................................................................... 40
6.4 Caracterización molecular de Trichoderma spp y Fusarium spp ...................................... 43
6.4.1 Extracción de ADN y amplificación de secuencias ...................................................... 43
6.5 Pruebas de antagonismo in vitro .......................................................................................... 47
6.6 Mecanismos de acción ........................................................................................................... 47
6.6.1 Micoparasitismo ............................................................................................................. 47
6.6.2 Competencia por espacio ............................................................................................... 51
VII. CONCLUSIONES ................................................................................................................... 55
VIII. RECOMENDACIONES ....................................................................................................... 55
IX. LITERATURA CITADA ......................................................................................................... 56
X. ANEXOS ..................................................................................................................................... 62
V
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro 1. Comparación de la clasificación morfológica de Trichoderma con la clasificación basada
en estudios moleculares ....................................................................................................................... 7
Cuadro 2. Esquema de tratamientos y testigos establecidos para pruebas de antagonismo ............. 25
Cuadro 3. Escala de grado de micoparasitismo ejercido por Trichoderma spp sobre Fusarium spp.
(Bell et al, 1982) ............................................................................................................................... 27
Cuadro 4. Comparación de las variables para determinar capacidad antagónica de Trichoderma .. 54
INDICE DE FIGURAS
Figura 1. Caracteristicas morfologicas microscopicas del género Fusarium.
Fuente: Centro Nacional de Microbiología SEIMC ......................................................................... 11
Figura 2. Metodología general del proyecto de investigación. ........................................................ 17
Figura 3. Proceso de reaislamiento de cepas. A) Cepas conservadas en aceite mineral, B)
Eliminación de aceite con agua destilada, C) Intemperización de cepas, D) Transferencia a medio de
cultivo PDA ....................................................................................................................................... 18
Figura 4. Transferencia del micelio para eliminar contaminación bacteriana .................................. 18
Figura 5. Adaptación de reglilla calibrada LEICA E2 WF 10x/18 a microscopio óptico ................ 19
Figura 6. Medición de estructuras de Trichoderma spp y Fusarium spp. A) Conidióforo de
Fusarium. B) Microconidios de Fusarium. C)Macroconidio de Fusarium. D) Clamidospora de
Trichoderma. ..................................................................................................................................... 20
Figura 7. Cepas utilizadas para extracción de ADN. A) De izquierda a derecha Trichoderma 1,
Trichoderma 2, Trichoderma 3. B) Fusarium 1, Fusarium 2 ........................................................... 21
Figura 8. Equipo para realizar extracción de ADN. A) Transiluminador. B) Vortex.
C)Termociclador. D) Centrifuga. E) Nanodrop ................................................................................ 23
Figura 9. Comparación de secuencias en el Gen Bank. A) Introducción de secuencia al BLAST. B)
Resultados de búsqueda, la secuencia en estudio se relaciona al 100% con especies de Fusarium
oxysporum ......................................................................................................................................... 24
Figura 10. Cultivos monospóricos. A y B) Fusarium 1 y 2 con 7 días de crecimiento. C - E)
Trichoderma 1, 2 y 3 con 4 días de crecimiento. F) medio de cultivo PDA de 24 horas de
solidificación ..................................................................................................................................... 25
Figura 11. Pruebas de antagonismo. De lado izquierdo testigos de antagonistas y patógenos, de lado
derecho confrontación cultivos duales .............................................................................................. 26
Figura 12. Medición del crecimiento micelial para obtener porcentajes de colonización y de
inhibición. A) Medición de cultivo dual. B) Medición de testigos del patógeno Fusarium spp ....... 28
Figura 13. Reactivación de cepas. Trichoderma 1 (A y F). Trichoderma 2 (B y G). Trichoderma 3
(C y H). Fusarium 1 (D e I), Fusarium 2 (E y J) ............................................................................... 30
Figura 14. Trichoderma 1. A) Vista frontal de colonia de Trichoderma 1. B) Reverso de colonia
con coloración amarillenta. ............................................................................................................... 31
Figura 15. Trichoderma 1. A) Ramificación de conidióforos. B) Fiálides simples. C) Conidios
esféricos............................................................................................................................................. 32
Figura 16. Trichoderma 2. A) Vista frontal de colonia de Trichoderma 2. B) Reverso de colonia
con coloración ámbar ........................................................................................................................ 33
Figura 17. Trichoderma 2. A) Conidióforo de Trichoderma 2. B) Clamidosporas. C) Conidios. D)
Fiálides simples. ................................................................................................................................ 34
VI
Figura 18. Trichoderma 3. A) Vista frontal de colonia de Trichoderma 3. B) Reverso de colonia
con coloración amarillenta ................................................................................................................ 35
Figura 19. Trichoderma 3. A) Conidióforo de Trichoderma 3. B) Fiálides. C) Clamidosporas D)
Conidios ............................................................................................................................................ 36
Figura 20. Fusarium 1. A) Vista frontal de colonia de Fusarium 1. B) Reverso de colonia con
coloración rojizo bajo ........................................................................................................................ 37
Figura 21. Fusarium 1. A) Conidióforo de Fusarium 1. B) Microconidios. C) Grupos de
macroconidios. D) Monofiálide. E) Macroconidio con forma apical obtusa, y basal apenas
dentada. F) Esporodoquios ................................................................................................................ 39
Figura 22. Fusarium 2. A) Vista frontal de colonia de Fusarium 2. B) Reverso de colonia con
coloración blanca .............................................................................................................................. 40
Figura 23. Fusarium 2. A) Monofiálides de Fusarium 2. B) Macro y microconidios. C)
Microconidios D)Monofáiálides en forma de botella. E) Esporodoquios ......................................... 41
Figura 24. Electroforesis en gel de agarosa visto en transiluminador. Carril MPM (Marcador de
Peso Molecular, Carril FY1: Fusarium 1, FY2: Fusarium 2, TY1: Trichoderma 1, TY2:
Trichoderma 2, TY3: Trichoderma 3 ................................................................................................ 43
Figura 25. Pruebas de antagonismo. A) Tratamientos y testigos. B) Testigos, C) Cultivos duales . 47
Figura 26. Mecanismo de acción de Trichoderma sobre Fusarium. A) Adhesión y enrollamiento.
B) Enrollamiento de hifas. C)arriba Adhesión, abajo Enrollamiento de hifas. ................................. 48
Figura 27. Diferencias estadísticas del micoparasitismo a los 7 días ............................................... 49
Figura 28. Diferencias estadísticas del micoparasitismo a los 16 días ............................................. 49
Figura 29. Micoparasitismo a los siete días. A) Tratamiento 1: T1 vs F1. B) Tratamiento 2: T1 vs
F2. C) Tratamiento 3: T2 vs F1. D)Tratamiento 4: T2 vs F2. E) Tratamiento 5: T3 vs F1. F)
Tratamiento 6: T3 vs F2 .................................................................................................................... 50
Figura 30. Micoparasitismo a los 16 días. A) Tratamiento 1: T1 vs F1. B) Tratamiento 2: T1 vs F2.
C) Tratamiento 3: T2 vs F1. D)Tratamiento 4: T2 vs F2. E) Tratamiento 5: T3 vs F1. F)
Tratamiento 6: T3 vs F2 .................................................................................................................... 51
Figura 31. Diferencias estadísticas del porcentaje de colonización de Trichoderma sobre Fusarium
........................................................................................................................................................... 52
Figura 32. Diferencias estadísticas del PICR % a los 5 días ............................................................ 53
Figura 33. Diferencias estadísticas del PICR% a los 7 días ............................................................. 53
VII
RESUMEN
Se realizó la identificación morfológica y molecular de tres cepas nativas del género
Trichoderma y dos del género Fusarium aisladas de muestras de suelo y de raíces de árboles
de Tamarix chinensis, provenientes del Ex lago de Texcoco (T1, T2, T3 y F1, F2); donde la
cepa T1: se identificó como Trichoderma asperellum, T2: T. atroviride, T3: T. atroviride.
F1 y F2: corresponden a Fusarium oxysporum, todas con 100% de similitud al compararlas
en la base de datos del GenBank. Por medio de las pruebas de antagonismo in vitro, se
evaluaron los mecanismos de acción, a partir de los aislamientos nativos, resultando seis
tratamientos T1 vs F1, T1 vs F2, T2 vs F1, T2 vs F2, T3 vs F1, T3 vs F2, determinando el
micoparasitismo y competencia por espacio, este último mediante el porcentaje de
colonización y el porcentaje de inhibición. El micoparasitismo, fue evaluado mediante la
observación de la adhesión y enrollamiento de hifas y de la valoración a través de la escala
propuesta por Bell et al., en 1982. Los valores de las mediciones fueron sometidos a un
análisis de varianza y a una comparación de medias de Tukey, y finalmente los resultados
indicaron que el aislamiento T3: T. atroviridae, obtuvo los mejores resultados de
micoparasitismo y competencia. Por lo cual, se propone a esta cepa como un medio de control
biológico para Fusarium, causante de la muerte descendente de Tamarix en el Ex-lago de
Texcoco, por lo que, se recomienda llevar a campo y validar su comportamiento in vivo.
Palabras clave: Tamarix spp., micoparasitismo, competencia, suelos salinos, porcentaje de
inhibición.
VIII
SUMMARY
Morphological and molecular identification of three native strains of the genus Trichoderma
and two of the genus Fusarium isolated from samples of soil and roots of Tamarix chinensis
trees, from the Ex Lake of Texcoco (T1, T2, T3 and F1, F2); where strain T1: was identified
as Trichoderma asperellum, T2: T. atroviride, T3: T. atroviride. F1 and F2: correspond to
Fusarium oxysporum, all with 100% similarity when compared in the GenBank database. By
means of in vitro antagonism tests, the mechanisms of action were evaluated, from the native
isolates, resulting in six treatments T1 vs F1, T1 vs F2, T2 vs F1, T2 vs F2, T3 vs F1, T3 vs
F2, determining the mycoparasitism and competition for space, the latter by the percentage
of colonization and the percentage of inhibition. Mycoparasitism was evaluated by observing
the adhesion and coiling of hyphae and the evaluation through the scale proposed by Bell et
al., In 1982. The values of the measurements were subjected to an analysis of variance and a
comparison of Tukey stockings, and finally the results indicated that the T3: T. atroviridae
isolation, obtained the best results of mycoparasitism and competition. Therefore, this strain
is proposed as a means of biological control for Fusarium, which causes the downward death
of Tamarix in the Ex-Texcoco lake, so it is recommended to take it to the field and validate
its behavior in vivo.
Key words: Tamarix spp., Mycoparasitism, competition, saline soils, percentage of
inhibition.
1
I. INTRODUCCIÓN
El establecimiento de proyectos de gran impacto ecológico en el Ex – lago de
Texcoco, como la construcción de un nuevo aeropuerto, han llevado a cabo actividades de
reubicación de flora y fauna. Entre estas actividades destaca el rescate y reubicación de
árboles de Tamarix spp., esta especie se encuentra en esta área sujeta al cambio de uso de
suelo, y presentan muerte descendente ocasionada por hongos patógenos como Fusarium
spp., por lo que, se requiere realizar aplicación de un fungicida biológico, que evite el
establecimiento de este patógeno y conserve a estas especies de Tamarix, que además de estar
adaptadas a suelos salinos, cumplen funciones ecológicas benéficas para la zona. Entre ellas,
habita en medios salobres y es capaz de soportar un breve periodo de inundación (Martínez,
2007), con una cubierta vegetal halófita en los suelos del Ex – lago de Texcoco, se puede dar
solución a la problemática de partículas suspendidas que han propiciado cambios en las
condiciones ambientales de la región, en otras palabras, el género Tamarix forma un estrato
arbustivo para el control de tolvaneras (Arévalo, 2007). Además, Tamarix se sigue
recomendando como vegetación característica de la zona, ya que es la única especie que hasta
el momento ha soportado las condiciones del lugar, y que además ayuda a retener gran
cantidad del CO2 emitido por la Ciudad de México y zonas aledañas. (Morales, 2015)
Para hacer el rescate de los ejemplares de Tamarix spp., se realizaron banqueos,
mismos que deben cumplir con los criterios de vigorosidad fitosanitarios. Al haber estudiado
la micobiota existente en el suelo y raíces de estos árboles se encontraron los géneros
Fusarium spp y Trichoderma spp, estos últimos son un grupo de hongos antagonistas capaces
de controlar biológicamente al patógeno Fusarium spp. (Zavala, 2017).
Derivado del estudio realizado por Zavala en el 2017 y Méndez et al., 2014, en este
proyecto fue primordial la identificación a nivel de especie de las cepas de Trichoderma spp.,
y del patógeno Fusarium spp, aislado de Tamarix, enfermos de vivero y plantación;
provenientes del Ex–lago de Texcoco, y con ello realizar pruebas de antagonismo in vitro
que nos permitan contar con una alternativa viable para promover a estas cepas como
controladores biológicos de esta enfermedad. A su vez, se desea reducir el uso de fungicidas
de origen químico y que estas especies de Tamarix spp., sigan cumpliendo con su función de
2
retener las emisiones de contaminantes del Valle de México y soportar la salinidad y
humedad característica de la zona.
Cabe señalar que el uso y aplicación de productos químicos sintéticos son aún la
principal herramienta de control para estas enfermedades, por otro lado, los agentes
biológicos son una manera efectiva para proporcionar un control más rápido y más seguro,
además de que pueden ser incluidos dentro del control integrado de plagas y enfermedades
(Verma et al., 2007).
El control biológico, busca reducir la incidencia de patógenos en especies vegetales
y adquirir productos y servicios libres de compuestos tóxicos. Para tal fin, es necesario
conocer a los organismos que podrían ser controles biológicos de algunos patógenos, y
además es necesario identificar los mecanismos que participan en la regulación de las
poblaciones de patógenos. En este sentido, se han obtenido resultados satisfactorios de
control biológico de fitopatógenos con especies del género Trichoderma en un rango amplio
de enfermedades de raíz (Nelson, 1991).
Los llamados microorganismos antagonistas como el hongo Trichoderma spp., actúan
a través de diversos mecanismos que incluyen la competencia por los nutrientes, el
micoparasitismo y la antibiosis de los patógenos. Este hongo, tiene la capacidad de tomar
nutrientes de los hongos fitopatógenos para competir con ellos o los degrada. Además, este
hongo, tiene una velocidad alta de crecimiento, por lo que es capaz de establecerse en el suelo
y controlar enfermedades que afectan a los cultivos y plantaciones forestales (Chiriboga et
al, 2015)
Otra cualidad de este género es su gran tolerancia a condiciones ambientales extremas
y hábitats donde otros hongos son causantes de diversas enfermedades, le permiten ser un
eficiente agente de control, asimismo pueden sobrevivir en medios con contenidos
significativos de pesticidas y otros químicos (Tovar, 2008)
Una herramienta útil y confiable para conocer el potencial como agente de biocontrol
de cepas de Trichoderma son los ensayos in vitro para determinar antagonismo (Larralde et
al., 2008), los cuales se utilizan principalmente como herramienta predictiva para determinar
la capacidad de inhibición del crecimiento en campo o en medios menos controlados.
3
II. HIPÓTESIS
Ha: Las cepas nativas de Trichoderma spp, provenientes del Ex – lago de Texcoco,
tienen la capacidad de controlar al patógeno Fusarium spp, a través de las pruebas in vitro.
H0: Las cepas nativas de Trichoderma spp, provenientes del Ex - lago de Texcoco no
tienen la capacidad de controlar a Fusarium spp, a través de pruebas in vitro
III. OBJETIVOS
3.1 Objetivo general
Identificar las cepas nativas de Trichoderma y de Fusarium, aislados del Ex –lago de
Texcoco a nivel de especie y realizar pruebas de antagonismo in vitro, a partir de los
aislamientos nativos
3.2 Objetivos específicos
a) Realizar la reactivación de cepas conservadas en el laboratorio de Patología Forestal, de
la División de Ciencias Forestales de la Universidad Autónoma Chapingo
b) Identificar las cepas nativas de Trichoderma y de Fusarium aisaldos del Ex –lago de
Texcoco a nivel de especie
c) Evaluar el antagonismo in vitro de Trichoderma spp., contra Fusarium spp., mediante sus
mecanismos de acción como:
- Micoparasitismo y competencia
- Porcentaje de colonización
- Porcentaje de inhibición
4
IV. REVISIÓN DE LITERATURA
4.1 Proceso de reactivación de cepas
El uso de microorganismos benéficos como hongos antagonistas, involucran una serie
de procesos para su crecimiento, desde la preparación de materiales y medios de cultivo, así
como las técnicas de asepsia para evitar contaminantes, cuyo objetivo principal es la
obtención de un producto eficiente para ser utilizado en el biocontrol de enfermedades. Se
debe trabajar con los hongos libres del crecimiento de otros organismos. Este crecimiento se
obtiene haciendo un aislamiento del hongo a partir del cultivo o fuente de inóculo original.
El inóculo se deposita en cajas Petri que contienen el medio de cultivo adecuado (CATIE,
2010).
La reactivación de cepas comprende actividades previas como, la recolección de
muestras, el procesamiento de muestras, el aislamiento del hongo, obtención del cultivo puro,
obtención de nuevas cepas, conservación de cepas, mantenimiento y reactivación. (Gómez,
et al, 2013)
- Recolección de muestras: se obtienen de la parte infectada o con síntomas de
infección fungal, así como de suelo recolectado cerca de la raíz.
- Procesamiento de muestras: las muestras recolectadas se llevan a laboratorio y son
procesadas para aislar el hongo antagonista o patógeno.
- Aislamiento: se obtiene de la parte infectada, ésta debe cortarse en pedacitos y se
siembra en cajas Petri con medio de cultivo PDA. En las muestras de suelo, se sigue
el protocolo que mejor convenga para obtener una dilución, misma que deberá
contenerse en cajas Petri con medio de cultivo PDA.
- Obtención de cultivo puro: un cultivo puro es aquel en que está presente únicamente
el hongo de interés sin ningún tipo de contaminante. Los cultivos puros se obtienen a
partir del reaislamiento del hongo a partir del cepario de producción, el cual es
sembrado en cajas Petri con medio de cultivo PDA. Se suma a esta etapa del proceso
de reactivación de cepas el control de calidad, que es la evaluación de las
características de las cepas, detectar la presencia de contaminantes en los medios de
cultivo para su eliminación. El control de calidad de realizarse con mucho rigor,
5
debido a que en esta etapa se seleccionan cepas puras, mismas que servirán para
posteriores estudios de interés.
- Conservación: es necesario conservar a temperaturas correspondientes y en medios
de cultivo PDA con aceites minerales, mismos que pueden conservar las cepas por
periodos prolongados que van de meses a años.
- Reactivación: será la remoción del medio de conservación en el que se encuentre la
cepa. Las cepas utilizadas para cualquier fin, deberán reactivarse periódicamente.
4.2 Características morfológicas de Trichoderma
Existen claves de identificación del género, muchas con modificaciones y
aportaciones de diferentes autores, sin embargo, los estudios morfológicos se han basado en
la descripción macroscópica de la colonia y sus características microscópicas. Para este
estudio ha sido necesario la revisión de estas características y se ha considerado tener la guía
de los autores que a continuación se presentan.
Las colonias del género Trichoderma se caracterizan por su rápido crecimiento, en
cuanto a su coloración pueden variar de blanca-verde o amarillo-verdosas, pudiendo
presentar anillos concéntricos. Al observar al reverso de la caja de las cepas, las colonias son
de color amarillo, ámbar o amarillo-verde. (Poalacin, 2015). Las colonias generalmente
desarrollan muy rápido, el micelio es mayormente sumergido, algunas especies presentan
micelio aéreo algodonoso, el reverso puede ser incoloro, crema, amarillo claro a amarillo
oscuro. Conidiación difusa o formando pústulas de color verde. (Gómez, et al, 2013)
De acuerdo a Poalacin (2015), las principales características microscópicas son:
Conidióforos: hialinos, erectos, no verticilados, generalmente ramificados, pueden
estar solitarios o agrupados. Los conidióforos con un eje principal ramificados en
forma piramidal.
Fiálides: en esta estructura se forman los conidios (esporas asexuales). Presentan una
forma de botella, están solas o agrupadas, son hinchadas en la región central pero
6
delgada en sus terminaciones. Algunas fiálides son verticiladas, con apéndices
terminales en el extremo del conidióforo.
Conidios: Unicelulares, hialinos a verdes, amarillo o blanco; con esporulación densa
para asegurar la supervivencia, dispersión y reproducción del hongo. Las paredes de
los conidios están compuestas por quitina y glucanos. Pueden ser lisos u
ornamentados, subglobosos, ovoides o elipsoides.
Clamidosporas: Presentan coloración amarillenta o verdosa, un olor a humedad, en
forma de globo o elipse, estas estructuras son comunes en las especies del género
Trichoderma, su diámetro en la mayoría de especies es de 6-15 micras. Pueden ser,
en otros casos, hialinas verdosas.
Según Villegas (2005), el género Trichoderma se ubica en:
Clase: Hyphomycetes
Orden: Moniliales
Familia: Moniliaceae
Género: Trichoderma
Su fase sexual (estado Teleomorfo) se encuentra ubicado en:
Clase: Ascomycetes
Serie: Pyrenomycetes
Orden: Hypocreales
Género: Hypocrea (derivados clonales que han perdido la capacidad de completar un
ciclo sexual)
Los estudios más detallados en cuanto a morfología de los anamorfismos fueron
realizados por Bissett (1984, 1991, 1992), quien ahora distingue cerca de 21 especies en la
sección Pachybasium y siete en la sección Longibrachiatum, mientras que las demás
secciones se ha comparado en menor medida. Tales estudios demuestran que la delimitación
biológica de las especies en este género solo con argumentos morfológicos con extrema
complejidad (Kubicek, et al, 1998)
7
4.3 Contribuciones a la caracterización molecular de Trichoderma
La identificación de las especies del género Trichoderma resultó ambigua mediante
la caracterización morfológica con el uso de claves tradicionales. Por estas razones se
introdujeron técnicas moleculares que apoyaron y facilitaron la caracterización e
identificación de las especies del género con mayor precisión. (Martinez, et al, 2015)
El género Trichoderma se describió por Persoon en 1794. Posteriormente, Rifai en
1969 lo revisó y propuso nueve especies agregadas: Trichoderma piluliferum, Trichoderma
hamatum, Trichoderma kiningii, Trichoderma aureoviride, Trchoderma harzianum,
Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii y Trichoderma viride. Estas
especies se identificaron teniendo en cuenta diferencias morfológicas y fisiológicas, sin
embargo, con la taxonomía establecida sobre caracteres morfológicos no se diferencian
satisfactoriamente las especies en el género (Rifai, 1969)
Dentro de los aportes de Bissett (1991) al género Trichoderma, se encuentra el uso
de métodos moleculares, en donde las secuencias de ADN dieron la pauta de características
de las cinco secciones Longibrachiatum, Saturnisporum, Pachybasium, Hypocreanum,
Trichoderma. Poco antes de estas aportaciones, las secciones contaban solo con aportaciones
morfológicas, posteriormente con ayuda de las herramientas moleculares, se establecieron
diferencias entre aportaciones moleculares y morfológicas, así como se muestra en el Cuadro
1.
Cuadro 1. Comparación de la clasificación morfológica de Trichoderma con la clasificación
basada en estudios moleculares
Clasificación basada en las
características morfológicas
Bissett (1984,1991)
Secciones Clasificación basada en los datos
macromoleculares izoensimas ADN
Trichoderma longibrachiatum
Sección
Longibrachiatum
T.longibrachiatum/H. schweinitzii A
T. citrinoviride T. ressei/H.jercorina
T. parceramosum T. citroviride/H.schweinitzii
Hypocrea shweinitzii
(anamorfismo) T. pseudokoningii/H.schweinitzii C.
T.parceramosum =T.todica
8
T. ghanense H. schweinitzii D,
schweinitzii E.
T. saturnisporum Sección
Saturnisporum T. saturnisporum
T. ghanense
T. hamatum
Sección
Pachybasium
T. hamatum A
T. harzianum T. harzianum A
T. polysporum T. polysporum
T.virens H. pilulifera
T. piluliferum H.ceramica
T.viride
Sección
Trichoderma
T. viride/H. rufa
T.koningii T. koningii/H.muroiona
T. atroviride T. atroviride
T. auroviride T. hamatum B
H. rufa (anamorfismo) T. harzianum B H. patella
Fuente. Aportaciones al género Trichoderma (Kubicek et al 2003, Samuels, 2006)
Trabajos continuos, dentro de la descripción morfológica y la investigación
conveniente de los genes aplicables a las consideraciones filogenéticas llevaron a la división
actual de Trichoderma/Hypocrea spp., dentro de 13 clases/secciones y una revisión adicional
de las especies agregadas Trichoderma y T. koningii, (Samuels et al. 2006).
En la actualidad se utilizan herramientas moleculares para la identificación y
clasificación de estos organismos. Dentro de las herramientas moleculares más usadas para
la identificación se incluyen: cariotipos electroforéticos y la secuenciación de las regiones
ITS1 e ITS2 del ADN ribosomal (ADNr) y del Factor de elongación. La región del ADNr
está conformada por el gen 18S (SSU), el espaciador intergénico ITS1, le gen 5.8S, el
espaciador ITS2 y el gen 28S (LSU). Los genes 18S, 5.8S y 28S están relativamente
conservados en los hongos y proporcionan una base molecular para investigar relaciones
filogenéticas a diferentes niveles. (Martínez, et al, 2015)
Con las herramientas moleculares el número de teleomorfismos Hypocrea ha ido en
aumento (Gams y Bissett, 1998) La descripción de Trichoderma/Hypocrea es complicado
9
debido a la falta de un gran número de caracteres morfológicos, pero los marcadores
filogenéticos facilitan la identificación de las especies conocidas (Kubicek, 2003)
Las técnicas moleculares mostraron su gran potencial en estudios a nivel inter
específico y, combinadas con criterios morfológicos, condujeron a la reubicación de algunas
especies (Lieckfeldt, et al, 1999), la definición de otras nuevas y/o conectar fases anamorfas
con su teleomorfo. ( Kuhls K, 1996)
Actualmente, las secuencias de las especies de Trichoderma identificadas por
métodos moleculares referidas en el sitio www:isth.info de la International Commission on
the Taxonomy of Fungi subcommision on Trichoderma an Hypocrea (Gomes, et al, 2002),
están depositadas en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=29859
Para una correcta identificación, se utilizan en conjunto diferentes técnicas, a esto se
le conoce como identificación polifásica (Martínez, et al, 2015)
4.4 Características morfológicas de Fusarium
Para la morfología de género Fusarium spp., se tiene que analizar las características
macro y microscópicas. Dentro de las características macroscópicas se observa el micelio
aéreo, pigmentación y tasa de crecimiento de la colonia. En las características microscópicas,
las especies de este género pueden producir esporas asexuales conocidas como
macroconidios, microconidios y clamidosporas (Kikot, 2012)
La taxonomía para este género es bastante compleja y ha sufrido diversos cambios
desde las primeras descripciones hechas por Link en 1803. A pesar de los avances en la
taxonomía molecular, y la aparición de metodologías como MALDI-TOF, la taxonomía
clásica continua vigente, aunque requiere la experiencia del observador. (Tapia, 2014)
10
Nelson (1983) señalan que entre las principales características microscópicas de este género
destacan:
Conidióforos: Es la zona de la hifa fértil simple o ramificada que soporta a las fiálides
Fiálides: son generalmente finas y afiladas con forma de botella; simples o
ramificadas, cortas o largas; monofiálides (cuando emergen las esporas de un solo
orificio) o polifiálides (cuando las esporas emergen de varios orificios).
Macroconidios: presentan forma de canoa o media luna, hialinos y septados. Para su
correcta clasificación es importante el largo, ancho, curvatura, septos, agrupaciones
muciodes (esporodoquios) y detalles de las células de los extremos (célula apical y
basal).
Microconidios: son pequeños, generalmente unicelulares y poseen variadas formas
(oval, esférico, reniforme, etc.), a veces se presentan agrupados, en cadenas largas o
cortas.
Clamidosporas: son características por su doble pared gruesa, lisa o rugosa, se
presentan de manera aislada, en pares o agrupadas. Funcionan como agentes de
resistencia ante ambientes adversos que garantizan la propagación y supervivencia
del hongo
Esporodoquios: son agrupaciones de conidióforos cortos y estrechamente ramificados
que nacen directamente de una maraña de hifas. Se producen más frecuentemente en
la naturaleza que en los cultivos de laboratorio.
11
Figura 1. Caracteristicas morfologicas microscopicas del género Fusarium.
Fuente: Centro Nacional de Microbiología SEIMC
Existen distintos medios de cultivo para establecer su crecimiento, entre ellos: Agar
papa dextrosa (PDA), Agar Sabouraud, Agar Clavel (CLA), Agar de Spezieller Nährstof-
farmer (SNA), y Agar avena. Los agares PDA y Sabouraud permiten observar el diámetro de
la colonia, morfología y pigmento (café, rojo, violeta, naranja, gris, blanco), mientras que el
Agar CLA, permite observar el desarrollo de cadenas de microconidios y morfología en
detalle de macroconidios (Tapia, 2014). A nivel de especies muchos caracteres fenotípicos
presentan gran variación y son afectados por condiciones de cultivo.
De acuerdo a Leslie y Summerell (2006), el género Fusarium se ubica:
En forma asexual de diferentes géneros de Ascomicetos
familia Nectriaceae,
orden Hypocreales,
género: Fusarium (anamorfo)
Y de forma sexual (teleomorfos), los géneros Albonectria, Gibberella y Haematonectria.
12
4.5 Contribuciones a la caracterización molecular de Fusarium
Fusarium es un género muy difícil de identificar, sobre todo en relación a la
especie, y generalmente hay que recurrir a laboratorios especializados. (Acevedo, 2013)
Fusarium es un género muy heterogéneo, difícil de identificar y clasificar (Nelson et al,
1983).
Entre las secuencias utilizadas comúnmente para el estudio taxonómico de hongos
se encuentran los genes que codifican paras los ARN ribosómicos (ARN r) y sus regiones
espaciadoras internas (ITS). Sin embargo, en la mayoría de análisis se ha observado una
marcada tendencia a secuenciar más de un gen con el fin de realizar análisis multigénicos
para incrementar la fiabilidad de los resultados obtenidos. Para el género Fusarium, los
genes utilizados, pueden ser estructurales que codifican proteínas como β- tubulina (BT2,
TUB), el factor de elongación 1α de la traducción (EF-1α) y la calmodulina (CAL). Al
utilizar la metodología MOTU´s se obtiene mayor consistencia de los diferentes taxa y
grupos taxonómicos, ya que éstos pueden corroborarse de manera individual, ya sea por
uno o varios genes diferentes y también en análisis concadenados de las secuencias
(Floyd, et al, 2002)
La región 28S del ADN ribosómico nuclear también llamada LSU, ha sido útil en
el análisis de la historia evolutiva del complejo Gibberella fujikoroi, que incluye las
especies F. verticillioides, F. proliferatum, F. subglutinans y otras especies relacionada;
también se ha permitido detectar múltiples orígenes evolutivos dentro del complejo de
especies Fusarium oxysporum (Acevedo, 2013)
Otro gen estructural utilizado para la identificación de Fusarium es EF-1α y el
RPB2, han demostrado tener un alto nivel de resolución para el género Fusarium, es decir
discriminan especies aun dentro de complejos de especies, aunque RPB2 no es muy
adecuado para el complejo de Fusarium oxysporum, que es quizá el grupo de mayor
dificultad taxonómica del género y uno de los más importantes en plantas y humanos.
(Acevedo, 2013)
13
Actualmente se dispone de una base de datos denominada FUSARIUM –ID
(Fusarium identification), que alberga un número considerable de secuencias de estos dos
genes y además secuencias de β- tubulina, IGS, ITS1, ITS2, RDNA y RPB1, que pueden
ser usados como referencia para una identificación, tipificación y taxonomía y filogenia
más precisa de aislamiento de Fusarium (Geiser et al, 2004)
4.6 Control biológico con Trichoderma
El control biológico es un método de control de plagas, enfermedades y malezas que
consiste en utilizar organismos vivos con objeto de controlar las poblaciones de otro
organismo. Posee muchas ventajas entre las que se pueden destacar, la resistencia de las
plagas al control biológico es muy rara (Robledo, 2009)
El control biológico representa una alternativa al control químico, fundamentándose
en el uso de antagonistas nativos, aspecto que le confiere ser más cuerdo con el medio
ambiente. (Ríos, et al, 2016)
En este sentido el control biológico con Trichoderma (= Gliocadium) se reporta ser
más eficiente con las especies comerciales de Trichoderma harzianum sobre los patógenos
de los géneros Rizhotocnia spp, Colletotrichum spp, Sclerotium spp, Fusarium spp,
Phytophtora spp, Verticillium spp, Thelaviopsis spp, entre otros (Nelson, 1991 y Samuels,
2006).
a) Trichoderma, género antagonista
Los hongos pertenecientes al género Trichoderma son saprófitos de crecimiento
rápido, se distribuyen por todas las latitudes y en diferentes ambientes, especialmente en
aquellos que contienen materia orgánica o desechos vegetales en descomposición.
Reconocidos a nivel mundial como excelentes agentes de control biológico (Villegas, 2005).
Tiene plasticidad ecológica, además de que tiene un eficaz control para una amplia gama de
fitopatogénos (Cervantes, 2007).
14
Su amplia distribución y su plasticidad ecológica se encuentran estrechamente
relacionadas con la alta capacidad enzimática que posee parad degradar sustratos, un
metabolismo versátil y resistencia a inhibidores microbianos (Howell, 2003) Conocer cuáles,
en qué momento y bajo qué condiciones se favorece la expresión de estas enzimas, permite,
además de la selección de cepas, orientar la forma de producción y aplicación de las mismas
(González, et al, 2012)
Los patógenos que principalmente controla se encuentra Phytophthora, Rhizoctonia,
Sclerotium, Phytium y Fusarium
El género Trichoderma tiene cinco especies consideradas como antagonistas:
Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum,
Trichoderma pseudokoningii y Trichoderma viride (García, et al., 2006).
Entre las cepas de Trichoderma más comercializadas para el control biológico son
Trichoderma viride, T. polysporum y T. harzianum, ésta última es la más utilizada y reportada
en la literatura (Ávila-Miranda et. al., 2006).
Por otra parte, algunas cepas de Trichoderma spp, pueden secretar fitohormonas
como el Ácido Indol Acético que estimula la germinación, el crecimiento y desarrollo
radicular, mejorando la asimilación de nutrientes, lo que influye en el crecimiento vegetativo
(Sánchez-Pérez, 2009).
b) Patógeno Fusarium
Los hongos del género Fusarium son un grupo de ascomicetos, son hongos
filamentosos ampliamente distribuidos en el suelo y plantas. Debido a su capacidad de crecer
a 37°C, con considerados oportunistas. Pueden causar infecciones sistémicas, ocasionando
alta mortalidad. De las 100 especies de Fusarium descritas, sólo 12 se consideran patógenas
para el ser humano, entre ellas destacan Fusarium solani, F.oxysporum y F.verticilloides, en
orden decreciente de frecuencia. (Tapia, 2014)
15
Los hongos del género Fusarium infectan a la planta por el sistema radicular,
ingresando por heridas o directamente; las esporas y micelios ascienden por la xilema de la
planta. Se propagan por medio de esporas, clamidosporas o micelios presentes en el agua de
riego, equipo agrícola, estructuras vegetativas y semillas (Santema, 2015)
De acuerdo a Cruz Varona (2016), los daños que ocasiona Fusarium spp, pueden
agruparse de acuerdo al complejo de daños que ocasiona en su hospedante, como son:
Fusarium oxysporum, es responsable del marchitamiento vascular de más de cien
especies vegetales de importancia económica y alimenticias como el tomate, plátano,
espárragos, etc.
Fusarium solani, produce la podredumbre del tallo y la raíz de diversas plantas
Fusarium fujikuroi, abarca el mayor número de especies, se les asocia con diversas
enfermedades como la podredumbre del maíz, cancro en el pino, la enfermedad de
bakanae en arroz, etc.
Fusarium graminearum, comprende los daños que ocasionan la fusariosis de espiga
en cebada, trigo, arroz, etc.
Para el control de Fusarium spp y otros patógenos se emplean fungicidas sistémicos
como los benzimidazoles (benoml, carbendazim, tiabendazol y tiofanato), mismos que
ocasionan problemas como intoxicación en humanos y animales, daños al medio ambiente,
efectos nocivos en microorganismos, entre otros. (Villa, et al, 2015). Por ello, se ha dado
mucha importancia al control biológico de este patógeno a través de hongos antagonistas del
género Trichoderma.
4.7 Mecanismos de acción de Trichoderma spp
Para las especies del género Trichoderma se han descrito varios mecanismos de
acción, entre ellos se encuentran:
a) Competencia por espacio o nutrientes: la competencia por espacio o nutrientes es un
mecanismo de antagonismo muy importante; el cual se define como el comportamiento
16
desigual de dos o más organismos hacia un mismo requerimiento, siempre que la utilización
por uno de los microorganismos reduzca la cantidad o espacio disponible para los demás. La
competencia puede ser por espacio físico, nutrientes, luz, oxígeno, etc. Dentro de los
nutrientes compite principalmente por carbono, nitrógeno y hierro. (Infante, et al, 2009).
b) Micoparasitismo: es una simbiosis antagónica entre microorganismos, en la cual, se ven
implicadas enzimas extracelulares como son: quitinasas y celulasas, culmina con la pérdida
del contenido citoplasmático del patógeno. (Infante, et al, 2009).
c) Antibiosis: es la acción directa del antibiótico o algún metabolito tóxico, producido por un
microorganismo sobre todo sensible a este compuesto (Vero, 1999).
d) Adhesión y enrollamiento: se presenta cuando hay reconocimiento positivo del antagonista
con el patógeno; las hifas se adhieren a las del patógeno, utilizando estructuras parecidas a
ganchos o apresorios, las cuales se enrollan alrededor. (Infante, et al, 2009).
Y algunos otros como: desactivación de enzimas del patógeno, resistencia inducida y
actividad lítica. De los mencionados, los tres primeros son los principales (Infante et al, 2009)
Infante y colaboradores en el 2009, y Chi García en el 2015, sostienen con los
resultados de sus investigaciones, que Trichoderma puede presentar más de un mecanismo
de acción, y, además, el uso y combinación de diferentes antagonistas podrán reducir en gran
medida que el patógeno genere resistencia.
Independientemente de cual sea el mecanismo de acción de Trichoderma, el efecto
que éste tiene al ser aplicado al suelo, es que coloniza las raíces, formando una capa
protectora sobre ellas, haciendo una simbiosis, el hongo se alimenta de los exudados de las
raíces y al mismo tiempo la protege, reduciendo o eliminando las fuentes de alimento del
patógeno que atreviese esa protección, es destruido consumiéndolo y usándolo como
alimento (hiperparasitismo). También actúa como una barrera para prevenir la entrada de
patógenos a las raíces (Gómez, et al, 2013)
17
V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Metodología general
En el presente proyecto de investigación se consideró puntualizar el método de trabajo que
se llevó a cabo para cumplir con cada uno de los objetivos, se muestra en la Figura 2
Figura 2. Metodología general del proyecto de investigación.
5.2 Reactivación de cepas
Para llevar a cabo la reactivación de las cepas de Trichoderma spp, y de Fusarium
spp., fue necesario reaislar las cepas de los hongos del cepario de la División de Ciencias
Forestales del área de Patología Forestal, previamente de aislamientos nativos de muestras
de suelo con Trichoderma spp. y de raíz de árboles de Tamarix chinensis del Ex-lago de
Texcoco (Campos et al.2016), este proceso se muestra en la Figura 3A-D. La reactivación
consistió en hacer el reaislamiento conjuntamente con la transferencia del micelio de cada
cepa a cajas Petri con medio de cultivo PDA, cuantas veces fue necesario, hasta obtener cepas
libres de contaminación bacteriana o algún otro tipo de contaminante (Figura 4). La
reactivación de las cepas fue uno de los procedimientos más determinantes para continuar
con los siguientes puntos de la metodología general, además fue necesario, en algunos casos
18
realizar la transferencia en otros medios de cultivo, como por ejemplo PDA más Ácido
láctico, PDA más Sulfato de estreptomicina (antibiótico) y PDA más acaricida. Para el caso
de Fusarium spp., fue necesario la elaboración de medios de cultivo selectivos para
esporulación, como: Agua Agar más hojas de clavel y medio SNA (Agar Sintético Nutritivo).
Los protocolos para elaboración de estos medios de cultivo se encuentran disponibles en el
apartado de Anexos.
Figura 3. Proceso de reaislamiento de cepas. A) Cepas conservadas en aceite mineral, B)
Eliminación de aceite con agua destilada, C) Intemperización de cepas, D) Transferencia a
medio de cultivo PDA
Figura 4. Transferencia del micelio para eliminar contaminación bacteriana
A B
C D
Bacterias
Micelio limpio transferido
19
5.3 Caracterización morfológica de Trichoderma spp y Fusarium spp
Se utilizaron cepas purificadas de Trichoderma spp, y de Fusarium spp. Se tomó una
fracción del micelio, se colocó en placas portaobjetos con una gota de glicerol más azul de
algodón, y una vez contando con las preparaciones semi permanentes se utilizó un
microscopio óptico LEICA GME a 40X, para observar las estructuras morfológicas de cada
género, como son: forma del conidio, fiálides, presencia o ausencia de clamidosporas, forma
del conidióforo. Se adaptó a uno de los oculares del microscopio una reglilla calibrada
LEICA E2 WF 10x/18 (Figura 5), para medir las estructuras antes mencionadas, ejemplo de
cómo se obtuvieron estas mediciones se observa en la Figura 6A-D
Figura 5. Adaptación de reglilla calibrada LEICA E2 WF 10x/18 a microscopio óptico
20
Figura 6. Medición de estructuras de Trichoderma spp y Fusarium spp. A) Conidióforo de
Fusarium. B) Microconidios de Fusarium. C)Macroconidio de Fusarium. D) Clamidospora
de Trichoderma.
El registro de las mediciones se hizo con apoyo de los formatos de medición que se
encuentran en el apartado de Anexos de este documento. Al obtener las mediciones en valores
de la reglilla calibrada, se hizo la conversión a valores de micras multiplicando por un
coeficiente micrométrico y con ello se obtuvieron valores mínimo, máximo y promedio de
las mediciones del ancho y largo de fiálides y conidios de cada cepa.
Para obtener el coeficiente micrométrico se utilizó la ecuación siguiente:
𝐂𝐌 =No. de divisiones del objetivo
No. de unidades del ocular micrometrico
Donde:
CM = Coeficiente micrométrico 40X CM =100
40 ; 40X CM =
100
40= 2.5
Posteriormente, se hizo la descripción morfológica de cada cepa, y después se compararon
los resultados con la descripción propuesta por Gams and Bisset (1991) en el caso de
Trichoderma y la descripción de Leslie J. and Summerell B. (2006) para el caso de Fusarium.
A B
C D
21
5.4 Caracterización molecular de Trichoderma spp y Fusarium spp
Una vez reactivadas y purificadas las cepas de Trichoderma y Fusarium, se realizó la
extracción, amplificación, secuenciación y ensamble de los fragmentos de ADN de las cepas
en estudio. Para ello, se utilizaron las cepas con las etiquetas: TY1, TY2, TY3, FY1 y FY2.
(Figura 7A-B).
Figura 7. Cepas utilizadas para extracción de ADN. A) De izquierda a derecha
Trichoderma 1, Trichoderma 2, Trichoderma 3. B) Fusarium 1, Fusarium 2
5.4.1 Extracción de DNA
El ADN genómico se extrajo a partir de 2-3 mg de tejido por el método de CTAB (Bromuro
de hexadeciltrimetilamonio) (Martínez-González et al., 2017). El ADN se cuantificó en un
Nanodrop (Thermo, USA). De cada una de las muestras se prepararon diluciones a 20 ng
para la amplificación de los genes.
A
B
22
5.4.2 Amplificación de las secuencias mediante la PCR
Para la amplificación de la región ITS se utilizaron los primers ITS5 e ITS4 (White et al.
1990). La mezcla de reacción para PCR se preparó en un volumen final de 15 µL
conteniendo:
buffer de la enzima 1 x Taq DNA polimerasa
0.8 mM deoxinucleósido trifosfatos (0.2 mM cada uno)
100 ng DNA
20 pmol de cada iniciador
2 unidades de GoTaq DNA (Promega, USA).
Las amplificaciones se realizaron con un ciclo inicial de desnaturalización a 96°C por
2 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94°C por 1 min, hibridación con los iniciadores a 57,
durante 1 min, seguido de una extensión final de 5 min a 72°C.
Todas las reacciones de PCR se llevaron a cabo en un Peltier Thermal Cycler PTC-
200 (BIORAD, México), las amplificaciones se verificaron por electroforesis en un gel de
agarosa al 1.5% preparado con 1x TAE buffer (Tris Acetate-EDTA) y corrido a 95 V cm-
3 durante 1 h.
El gel se tiñó con Gel red (Biotium, USA) y las bandas se visualizaron en un
transiluminador (Figura 8A) (Infinity 3000 Vilber Lourmat, Germany). Los productos
amplificados se purificaron con el kit ExoSAP (Affymetrix, USA), siguiendo las
instrucciones del fabricante, se prepararon para la reacción de secuenciación usando el
Bigdye terminator v. 3.1 (Appli ed Biosystem).
Los productos de la PCR se enviaron a secuenciar en el Applied Biosystems modelo
3130XL (Applied BioSystems, USA), en el Instituto de Biología de la Universidad Nacional
Autónoma de México.
23
Figura 8. Equipo para realizar extracción de ADN. A) Transiluminador. B) Vortex.
C)Termociclador. D) Centrifuga. E) Nanodrop
5.4.3 Ensamble de las secuencias
Las secuencias de ambas hebras para cada muestra se analizaron, editaron y
ensamblaron usando BioEdit versión 7.0.5 (Hall, 1999) para crear una secuencia consenso.
La secuencia consenso se comparó con las depositadas en GenBank del National Center for
Biotechnology Information (NCBI), empleando la herramienta BLASTN SUITE 2.2.19
(Zhang et al., 2000). De los valores encontrados, se consideraron las secuencias con el valor
más alto de similitud en comparación con las secuencias en estudio. Figura 9A-B
A
D
B C
E
24
Figura 9. Comparación de secuencias en el Gen Bank. A) Introducción de secuencia al
BLAST. B) Resultados de búsqueda, la secuencia en estudio se relaciona al 100% con
especies de Fusarium oxysporum
Finalmente, se tiene en proceso el alta de las secuencias en el GenBank del NCBI,
para obtener el número de accesión de las secuencias.
5.5 Pruebas de antagonismo in vitro
Previo al establecimiento de cultivos duales fue necesario el crecimiento de cultivos
monospóricos de Trichoderma spp y Fusarium spp., de 4 y 7 días respectivamente. Después
del periodo de crecimiento establecido para los cultivos monospóricos, se preparó el medio
de cultivo PDA con Ácido láctico, Sulfato de estreptomicina y acaricida, se vació en cajas
Petri de 9 cm de diámetro y se dejó por 24 horas hasta su solidificación. Los cultivos
monospóricos de 4 y 7 días de crecimiento se observan en la Figura 10A-E
B
A
25
Figura 10. Cultivos monospóricos. A y B) Fusarium 1 y 2 con 7 días de crecimiento.
C - E) Trichoderma 1, 2 y 3 con 4 días de crecimiento. F) medio de cultivo PDA de 24
horas de solidificación
De esta manera, y con ayuda de un sacabocados se colocó en un extremo de la caja
un disco de 8 mm de diámetro con cultivo de Trichoderma de 4 días de crecimiento y
separado a una distancia de 7 cm aproximadamente, se colocó en el otro extremo un disco
con cultivo de Fusarium de 7 días de crecimiento, para el caso de los testigos el disco se
colocó en el centro de la caja Petri. (Figura 11). Se siguió un esquema de los tratamientos,
cada tratamiento con sus 4 repeticiones, como se señala en el Cuadro 2, obteniendo de esta
manera un total de 44 cajas Petri.
Cuadro 2. Esquema de tratamientos y testigos establecidos para pruebas de antagonismo
Testigos No. de
repeticiones Tratamientos
No. de
repeticiones
Trichoderma 1 4 Trichoderma 1 vs Fusarium 1 4
Trichoderma 2 4 Trichoderma 1 vs Fusarium 2 4
Trichoderma 3 4 Trichoderma 2 vs Fusarium 1 4
Fusarium 1 4 Trichoderma 2 vs Fusarium 2 4
Fusarium 2 4 Trichoderma 3 vs Fusarium 1 4
Trichoderma 3 vs Fusarium 2 4
A B C
D E
26
Figura 11. Pruebas de antagonismo. De lado izquierdo testigos de antagonistas y
patógenos, de lado derecho confrontación cultivos duales
La evaluación del crecimiento de las cepas se llevó a cabo durante 7 días
consecutivos, y se midió cada 24 horas desde el día de establecimiento. Las cepas se
sometieron a temperatura ambiente (±15-30°C) y luz continua. Las mediciones se
concentraron en los formatos: “Medición de cepas para obtener porcentaje de colonización
C”, y “Medición de cepas para obtener el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial
(PICR)”, que se encuentran disponibles en el apartado de Anexos de este documento.
27
5.6 Mecanismos de acción de Trichoderma
5.6.1 Micoparasitismo
Para observar el efecto antagónico de Trichoderma sobre Fusarium, se tomó una
porción de los hongos con parte de medio de cultivo en el halo de unión de ambos hongos,
se colocó en una placa portaobjetos con una gota de glicerol más azul de algodón y se observó
en un microscopio LEICA GME a 40X para conocer el mecanismo de acción del antagonista
(Guédez, et al., 2009).
El grado de micoparasitismo ejercido por las cepas de Trichoderma spp. sobre el
crecimiento del patógeno se evaluó a los 7 y 16 días de establecidos los cultivos duales, esta
variable se estimó con una escala de cinco clases propuestas por Bell et al (1982) Cuadro 3.
La evaluación se hizo en dos días distintos para efectuar diferencias significativas entre
tratamientos de ambos días de enfrentamiento.
Cuadro 3. Escala de grado de micoparasitismo ejercido por Trichoderma spp sobre
Fusarium spp. (Bell et al, 1982)
Índice de
micoparasitismo Capacidad antagónica
0 Ninguna invasión del antagonista sobre la colonia de Fusarium sp
1 Invasión y destrucción del 25% de la colonia de Fusarium spp
2 Invasión y destrucción del 50% de la colonia de Fusarium spp
3 Invasión y destrucción del 100% de la colonia de Fusarium spp
4 Invasión y destrucción del 100% de la colonia de Fusarium spp;
esporulando sobre ella
5.6.2 Competencia por espacio
La medición de los cultivos duales y la medición de los testigos del patógeno es
necesaria para estimar el mecanismo de acción: competencia por espacio, a partir del
porcentaje de inhibición y del porcentaje de colonización.
28
a) Porcentaje de colonización
La medición del crecimiento micelial se hizo cada 24 horas, como se observa en la
Figura 12A. Los valores utilizados para calcular el porcentaje de colonización fueron a partir
de medias de los tratamientos y resultados superiores de 50% y fueron considerados
efectivos. Para obtener el porcentaje de colonización (C), se utilizó la técnica de Cheriff y
Benhamou 1990, mediante la ecuación siguiente:
C = (DTP
DE) ∗ 100
Donde:
C = Porcentaje de colonización
DTP = Distancia recorrida por la colonia de Trichoderma spp, sobre la colonia del patógeno
(Fusarium spp.), en el eje que separa a ambas colonias.
DE = Distancia entre ambos puntos de siembra
Figura 12. Medición del crecimiento micelial para obtener porcentajes de colonización y
de inhibición. A) Medición de cultivo dual. B) Medición de testigos del patógeno Fusarium
spp
A B
29
b) Porcentaje de Inhibición de Trichoderma spp
Al igual que el porcentaje de colonización, las mediciones para calcular el porcentaje de
inhibición se efectuaron a partir de las 24 horas de haber establecido las pruebas de
antagonismo, se empleó la fórmula propuesta por Ezziyyani et al, 2004.
PICR =R1 − R2
R1∗ 100
Donde:
PICR = Porcentaje de inhibición en el crecimiento del micelio
R1 = Radio del patógeno testigo
R2 = Radio del patógeno enfrentado
Los valores de las medias de los tratamientos del quinto y séptimo día fueron la base para
establecer la comparación entre tratamientos y conocer diferencias estadísticas del
bioensayo.
5.7 Análisis estadístico
Para conocer las diferencias estadísticas entre tratamientos, se sometieron los
resultados del porcentaje de colonización, micoparasitismo y competencia a un diseño
experimental completamente al azar. Los datos de las variables a evaluarse se analizaron con
el modelo lineal general, con un análisis de varianza. En los casos con diferencias
significativas (p≤ 0.05) entre tratamientos se realizó una prueba de Tukey (InfoStat, Versión
Libre)
30
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Reactivación de cepas
Se obtuvo la reactivación de las 5 cepas en estudio: Trichoderma 1, Trichoderma 2,
Trichoderma 3, Fusarium 1 y Fusarium 2 (Figura 13A-J). Estas cepas fueron la base para
producir las cepas que se utilizaron para la caracterización morfológica, molecular y las
pruebas de antagonismo.
Figura 13. Reactivación de cepas. Trichoderma 1 (A y F). Trichoderma 2 (B y G).
Trichoderma 3 (C y H). Fusarium 1 (D e I), Fusarium 2 (E y J)
6.2 Caracterización morfológica de Trichoderma spp
Se hizo la descripción del crecimiento de la colonia, además de obtener las
mediciones de las estructuras de Trichoderma spp, como son: Fiálides y conidios, y la
observación de las demás características como: conidióforos y clamidosporas. Los resultados
de la descripción morfológica se muestran a continuación:
A B C D E
F G H I J
31
Trichoderma 1
Descripción de la colonia: Colonia de crecimiento rápido, micelio aéreo inicialmente
hialino cambiando a amarillo hasta tener un aspecto lanoso verdoso-amarillento, al reverso
de la caja inicialmente es incoloro y después amarillento. De olor débil semejante al coco.
Formando anillos concéntricos, así como se muestra en la Figura 14-A
Figura 14. Trichoderma 1. A) Vista frontal de colonia de Trichoderma 1. B) Reverso de
colonia con coloración amarillenta.
Características morfológicas
Conidióforos: hialinos a verdes delgados de pared rugosa, pueden ser ramificados. (Figura
15-A)
Fiálides: simples o ramificadas, delgadas y en forma de pequeñas botellas que llegan a medir
de 12.5-25 (19.49) µm de largo y de 2.5-5 (3.6) µm de ancho. En algunos casos se presentan
conidios agregados en las puntas (Figura 15-B)
Conidios: esféricos unicelulares de pared lisa. De tamaños variables que van de los 2.5-5
(4.57) µm de largo y de 2.5-7.5 (4.76) µm de ancho, de color verde, en su mayoría solitarios,
algunos agregados a las puntas de las fiálides y en otros casos unidos en pequeños grupos
(Figura 15-C)
A B
32
Clamidosporas: Presencia de clamidosporas, características por su doble pared celular.
Miden entre 7.5-8.75 µm de diámetro aproximadamente, presentan coloración verdosa.
Figura 15. Trichoderma 1. A) Ramificación de conidióforos. B) Fiálides simples. C)
Conidios esféricos
Se obtuvo que esta cepa corresponde a la especie Trichoderma asperellum. Al
introducir las características morfológicas a la clave de identificación propuesta por Gams
and Bisset (1991), resultó no ser suficiente para determinar la especie, sin embargo, con el
auxilio de los resultados moleculares, se recurrió a la comparación con otros estudios donde
se describe a Trichoderma sperellum, dichas comparaciones se mencionan a continuación:
Martínez y colaboradores en el 2015, citaron a Lieckfeldt & Nirenberg, y en sus
aportaciones al género Trichoderma, mencionan que T.viride, presenta dos tipos
morfológicamente distintos (I y II), el tipo I fue designado como el “verdadero”, anamorfo
de Hypocrea rufa (Pers.:Fr) y al tipo II como una nueva especie Trichoderma asperellum
Samuels, la cual en términos moleculares se considera cercana al neotipo de T. hamatum, con
esta referencia se reintrodujeron los valores a la clave de identificación y se mostraron
cercanías con esta especie. Además, los resultados de este estudio concuerdan con los
resultados generados por García y Martínez-Campos (2016), ya que, en los aislados que ellos
A B
C
33
identificaron con técnicas moleculares y morfológicas, las cepas de Trichoderma asperellum
también presentan anillos concéntricos bien definidos, el color de la cepa es verde claro a
verde oscuro, los conidios son ovoides y esféricos y también se encuentran en solitarios o en
grupos, los conidióforos también son ramificados, etc.
En 1999, Gary Samuels, hizo oficialmente la nueva descripción de T. asperellum
Samuels, en ella vienen las mediciones de fiálides y conidios, mismos que concuerdan con
los valores obtenidos para la cepa en estudio. Por lo que se asimila que corresponde a esta
especie, además de que ya se cuenta con el respaldo molecular.
Trichoderma 2
Descripción de la colonia: Colonia de crecimiento moderadamente rápido, micelio
aéreo inicialmente hialino cambiando a amarillo-ámbar hasta tener un aspecto algodonoso
amarillo-verdoso, al reverso de la caja inicialmente es incoloro y después se torna a color
ámbar. (Figura 16-B), el olor es débil similar al del suelo.
Figura 16. Trichoderma 2. A) Vista frontal de colonia de Trichoderma 2. B) Reverso de
colonia con coloración ámbar
A B
34
Características morfológicas
Conidióforos: hialinos, delgados de pared lisa, eje principal alargado, ramificados formando
grupos de fiálides dispuestas en cruceta (Figura 17-A)
Fiálides: Simples o ramificadas de tamaños diversos que van de 10 - 25 (18.85) µm de largo
y 2.5-10 (3.49) µm de ancho (Figura 17-D)
Conidios: Esféricos, hialinos a verdes, solitarios y unicelulares de pared lisa de tamaños
variables que van de 2.5-5 (3.89) µm de largo y de 2.5-5 (3.92) µm de ancho (Figura 17-C)
Clamidosporas: Abundantes de gran tamaño, que va de 13.75-15 µm de diámetro. Color
verde de doble pared celular (Figura 17-B)
Figura 17. Trichoderma 2. A) Conidióforo de Trichoderma 2. B) Clamidosporas. C)
Conidios. D) Fiálides simples.
A
B
D C
35
Las características de esta cepa, se introdujeron a la clave de identificación de Gams
& Bisset (1991), esta cepa coincide con las características de Trichoderma atroviride.
Resultados similares reporta Vázquez- Angulo (2013), en un estudio realizado en el valle de
Mexicali, donde las cepas nativas de Trichoderma fueron identificadas morfológica y
molecularmente, al igual que sus resultados, señala que las cepas son de crecimiento rápido,
el crecimiento inicialmente es blanco, cambiando a un verde amarillento, al reverso de la
placa la coloración es amarillenta, los conidióforos son ramificados, los conidios concuerdan
con el rango de la medición que se obtuvo en este estudio, dichos rangos son de 2.75-5 µm
de largo por 1.25-2.5 µm de ancho, son de color verde y se muestran agregados en las puntas
de las fiálides.
Trichoderma 3
Descripción de la colonia: Colonia de crecimiento rápido, micelio aéreo inicialmente
hialino cambiando a un verde amarillento hasta tener un aspecto lanoso totalmente verde, al
reverso de la caja inicialmente incoloro y después se torna a amarillo. De olor débil semejante
al coco. Forma anillos concéntricos como se observa en la Figura 18-A
Figura 18. Trichoderma 3. A) Vista frontal de colonia de Trichoderma 3. B) Reverso de
colonia con coloración amarillenta
A B
36
Características morfológicas
Conidióforos: hialinos y en algunos casos color verde, delgados de pared rugosa, eje
principal corto de tamaños diversos, con ramas laterales (Figura 19-A)
Fiálides: simples o ramificadas dispuestas en forma de crucetas, de tamaños diversos que
van de 12.5-25 (19.61) µm de largo y 2.5-5.0 (3.0) µm de ancho (Figura 19-B)
Conidios: Esféricos, unicelulares, de pared lisa, solitarios y a veces en grupos de color verde.
De tamaños diversos que van de 2.5-5 (3.82) µm de largo y 2.5-5 (3.8) µm de ancho (Figura
19-D)
Clamidosporas: De color verde, miden entre 12.5- 15 µm de diámetro, características por
su doble pared (Figura 19-C)
Figura 19. Trichoderma 3. A) Conidióforo de Trichoderma 3. B) Fiálides. C) Clamidosporas
D) Conidios
A B
C D
37
Al introducir las características morfológicas a la clave de identificación, se obtuvo
que esta cepa también corresponde a la especie Trichoderma atroviride, aunado a la
identificación mediante claves, se hizo la comparación con los resultados generados por
Almaraz y colaboradores (2012), en los aislamientos tomados de bosques de encino en el
estado de Guerrero, donde reportan que las cepas de esta especie presentan micelio septado,
conidióforos hialinos y delgados, presencia de clamidosporas y conidios de coloración verde
sobre fiálides simples. También se tuvo el respaldo de la identificación molecular.
6.3 Caracterización morfológica de Fusarium spp
Se obtuvieron los resultados de la caracterización morfológica son los siguientes:
Fusarium 1
Descripción de la colonia: Colonia de crecimiento lento, micelio aéreo inicialmente
hialino, después empieza a tener un aspecto algodonoso color blanco, al reverso de la caja
inicialmente es incoloro y después se colora a rojizo bajo. (Figura 20A-B)
Figura 20. Fusarium 1. A) Vista frontal de colonia de Fusarium 1. B) Reverso de colonia
con coloración rojizo bajo
A B
38
Características morfológicas
Conidióforos: Se le llama conidióforo a la zona de la hifa fértil simple o ramificada que
soporta a las fiálides, en este caso se presentan hialinos y delgados, no ramificados (Figura
21-A)
Esporodoquios: Presencia de esporodoquios en medio de cultivo Agua Agar con hojas de
clavel (Figura 21-F)
Fiálides: se presentan monofíálides hialinas y delgadas de tamaños variables que miden entre
10-50 (24.92) µm de largo y 2.5-5 (3.44) µm de ancho. En algunas se observa que los
conidios emergen de un orificio fino, afilado o en forma de botella (Figura 21-D)
Macroconidios: En forma de canoa, hialinos y septados (3-5 septos). La célula apical es
obtusa y la basal es apenas dentada, se encuentran de tamaños variables en un rango de 20-
42.5 (31.25) µm de largo y de 5- 7.5 (5.83) µm de ancho, además se observaron otros
macroconidios con célula apical en forma de gancho y la basal es apenas dentada. Otras
formas en la célula apical son: estrecha, papilada y recta o alargada, y en la célula basal
también se observó la forma de pie y recta o alargada. En algunos casos se aglomeraban en
grupos simulando un racimo de plátanos (Figura 21- C y E)
Microconidios: son pequeños, generalmente unicelulares y con formas variables (oval,
esférica, reniforme, etc.), destacando la forma oval, de éstos se obtuvieron valores de 7.5-
22.5 (13.94) µm de largo y de 2.5-8.75 (5.03) µm de ancho, en el caso de los esféricos miden
de 3.75-10 (5) µm de largo y de 3.75-8.75 (5) µm de ancho. Se producen en el micelio aéreo
a partir de las monofiálides o polifiálides. Se pueden ver solitarios, en grupos e incluso
cadenas (Figura 21-B)
Clamidosporas: Clamidosporas simples de doble pared celular lisa y de tamaños variables
de 5-17.5 (8.71) µm de largo y de 5-17.5 (8.62) µm de ancho, también se observaron
clamidosporas simples verrucosas, verrucosas en pares y verrucosas en cadena.
39
Figura 21. Fusarium 1. A) Conidióforo de Fusarium 1. B) Microconidios. C) Grupos de
macroconidios. D) Monofiálide. E) Macroconidio con forma apical obtusa, y basal
apenas dentada. F) Esporodoquios
A B
D
C
E
F
40
Fusarium 2
Descripción de la colonia: Colonia de crecimiento lento, micelio aéreo inicialmente
hialino, después empieza a tener un aspecto algodonoso color blanco, al reverso de la caja
inicialmente es incoloro y después totalmente blanco. (Figura 22A-B)
Figura 22. Fusarium 2. A) Vista frontal de colonia de Fusarium 2. B) Reverso de colonia
con coloración blanca
Características morfológicas
Conidióforos: Se presentan conidióforos simples y ramificados son hialinos y delgados.
Esporodoquios: Presencia de esporodoquios en medio de cultivo Agua Agar con hojas de
clavel (Figura 23-E)
Fiálides: se presentan monofíálides hialinas y delgadas que miden entre 12.5-42.5 (25.42)
µm de largo y 2.5-5 (3.56) µm de ancho. En algunas se observa que los conidios emergen
de un orificio fino, afilado o en forma de botella (Figura 23-A y D)
Macroconidios: con forma de canoa, hialinos y septados (3-5). Se observaron varias formas
en la célula apical (obtusa, gancho, recta o alargada, papilada), de manera general son obtusos
en la célula apical y en la basal son apenas dentados, miden entre 27.5- 45 (34.79) µm de
A B
41
largo y 3.75-10 (6.15) µm de ancho. En algunos casos se aglomeraban en grupos simulando
un racimo de plátanos (Figura 23-B)
Microconidios: son pequeños, generalmente unicelulares y con formas variables (oval,
esférica, reniforme, etc.), destacando la forma oval, de éstos se obtuvieron valores de 7.5-
22.5 (13.89) µm de largo y de 2.5-8.75 (4.7) µm de ancho, en el caso de los esféricos miden
de 5-10 (5.37) µm de largo y de 5-7.5 (5.22) µm de ancho. Se producen en el micelio aéreo
a partir de las monofiálides o polifiálides. Se pueden ver solitarios, en grupos e incluso
cadenas. (Figura 23-B y C)
Clamidosporas: Clamidosporas simples de doble pared celular lisa y de tamaños variables
de 5-10 (7.19) µm de largo y de 5-8.75 (6.88) µm de ancho.
Figura 23. Fusarium 2. A) Monofiálides de Fusarium 2. B) Macro y microconidios. C)
Microconidios D)Monofáiálides en forma de botella. E) Esporodoquios
A B
C
D E
42
Las cepas antes descritas corresponden a la especie Fusarium oxysporum, esto se
sustenta mejor con la descripción de Leslie J. y Summerell B. (2006), además en los
resultados morfológicos de F.oxysporum de García (2017) y Méndez y Merino (2015),
también se encontraron microconidios ovales unicelulares de 10.53 µm de largo,
macroconidios moderadamente curvados y largos, con su célula apical redondeada (obtusa)
y la basal en forma de pie, y a su vez la formación de esporodoquios blancos similares a los
obtenidos en este estudio.
Otros trabajos similares han documentado, que Fusarium puede desarrollar
variabilidad en la tonalidad de las cepas, Robles y colaboradores en el 2016, obtuvieron cepas
color blanco-amarillento y rojo-violáceo. En este caso se obtuvieron dos tonalidades
distintas, blancas y rojizo bajo. Además, datos similares de medición que reportan los mismos
autores, mencionan que los macroconidios también presentan 3-5 septos y miden entre 19-
43 µm de ancho y 3.1-5.4 µm de ancho. Sin embargo, este tipo de caracterización no es
suficiente para definir a que especie pertenecen ambos aislados, con el auxilio de la
identificación molecular se sustentan mejor estos resultados.
43
6.4 Caracterización molecular de Trichoderma spp y Fusarium spp
Los resultados de la caracterización molecular se mencionan en los numerales
siguientes:
6.4.1 Extracción de ADN y amplificación de secuencias
Se obtuvo la extracción de ADN genómico de las cinco cepas en estudio, para después
amplificar las secuencias mediante la PCR (Reacción de Cadena de la Polimerasa). El
resultado de la electroforesis en gel de agarosa al 1.5% visualizado en el transiluminador se
muestra en la Figura 24. Las bandas de las cinco cepas en estudio se compararon con la
banda del MPM (Marcador de Peso Molecular) y cada una presenta entre 200-300 pb (pares
de bases).
Figura 24. Electroforesis en gel de agarosa visto en transiluminador. Carril MPM (Marcador
de Peso Molecular, Carril FY1: Fusarium 1, FY2: Fusarium 2, TY1: Trichoderma 1, TY2:
Trichoderma 2, TY3: Trichoderma 3
6.4.2 Secuenciación y comparación de secuencias en el GenBank
Las secuencias ensambladas y alineadas en el GenBank del National Center for
Biotechnology Information (NCBI), mediante la herramienta BLASTN SUITE 2.2.19
(Zhang et al., 2000)., nos dieron los resultados siguientes:
44
Secuencia de cepa FY1 con 100% de alineación con Fusarium oxysporum
1 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt accgagttta caactcccaa
61 acccctgtga acataccact tgttgcctcg gcggatcagc ccgctcccgg taaaacggga
121 cggcccgcca gaggacccct aaactctgtt tctatatgta acttctgagt aaaaccataa
181 ataaatcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcaa
241 aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat
301 tgcgcccgcc agtattctgg cgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac cctcaagcac
361 agcttggtgt tgggactcgc gttaattcgc gttccccaaa ttgattggcg gtcacgtcga
421 gcttccatag cgtagtagta aaaccctcgt tactggtaat cgtcgcggcc acgccgttaa
481 accccaactt ctgaatgttg acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata
541 tca
Secuencia de cepa FY2 con 100% de alineación con Fusarium oxysporum
1 gtaacaaggt ctccgttggt gaaccagcgg agggatcatt accgagttta caactcccaa
61 acccctgtga acataccact tgttgcctcg gcggatcagc ccgctcccgg taaaacggga
121 cggcccgcca gaggacccct aaactctgtt tctatatgta acttctgagt aaaaccataa
181 ataaatcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcaa
241 aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat
301 tgcgcccgcc agtattctgg cgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac cctcaagcac
361 agcttggtgt tgggactcgc gttaattcgc gttccccaaa ttgattggcg gtcacgtcga
421 gcttccatag cgtagtagta aaaccctcgt tactggtaat cgtcgcggcc acgccgttaa
481 accccaactt ctgaatgttg acctcggatc aggtaggaat acccgctgaa cttaagcata
541 tc
Estos resultados son equivalentes a los de Méndez y Merino (2015) donde reportan
cuatro cepas alineadas con Fusarium oxysporum, (S15 al 99%, R6 al 99%, R13 al 100%, S7
al 99%). Con esto se puede comprobar que identificación molecular es una herramienta
indispensable para respaldar a los estudios morfológicos.
45
Secuencia de cepa TY1 con 100% de alineación con Trichoderma asperellum
1 taacaaggtc tccgttggtg aaccagcgga gggatcatta ccgagtttac aactcccaaa
61 cccaatgtga acgttaccaa actgttgcct cggcggggtc acgccccggg tgcgtcgcag
121 ccccggaacc aggcgcccgc cggaggaacc aaccaaactc tttctgtagt cccctcgcgg
181 acgtatttct tacagctctg agcaaaaatt caaaatgaat caaaactttc aacaacggat
241 ctcttggttc tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag
301 aattcagtga atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca
361 tgcctgtccg agcgtcattt caaccctcga acccctccgg gggatcggcg ttggggatcg
421 ggacccctca cacgggtgcc ggcccctaaa tacagtggcg gtctcgccgc agcctctcct
481 gcgcagtagt ttgcacaact cgcaccggga gcgcggcgcg tccacgtccg taaaacaccc
541 aactttctga aatgttgacc tcggatcag
Los resultados obtenidos para este estudio concuerdan con los reportados por García-
Núñez y Martínez Campos (2016), al utilizar los primers ITS1 e ITS4, donde el consenso en
el GenBank mediante la herramienta BLAST, corresponde al 99% con T. asperellum. En un
estudio realizado por Guigón-López y Guerrero-Prieto (2010), también se reporta la
identificación de Trichoderma asperellum, con 99 a 100% de homología con las secuencias
del GenBank.
Secuencia de cepa TY2 con 100% de alineación con Trichoderma atroviride
1 tcgtaacaag gtctccgttg gtgaaccagc ggagggatca ttaccgagtt tacaactccc
61 aaacccaatg tgaaccatac caaactgttg cctcggcggg gtcacgcccc gggtgcgtcg
121 cagccccgga accaggcgcc cgccggaggg accaaccaaa ctcttttctg tagtcccctc
181 gcggacgtta tttcttacag ctctgagcaa aaattcaaaa tgaatcaaaa ctttcaacaa
241 cggatctctt ggttctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat
301 tgcagaattc agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca gtattctggc
361 gggcatgcct gtccgagcgt catttcaacc ctcgaacccc tccggggggt cggcgttggg
421 gacctcggga gcccctaaga cgggatcccg gccccgaaat acagtggcgg tctcgccgca
481 gcctctcctg cgcagtagtt tgcacaactc gcaccgggag cgcggcgcgt ccacgtccgt
541 aaaacaccca acttctgaaa tgttgacctc ggatcaggta ggaatacccg ctgaacttaa
46
601 gcatatca
Secuencia de cepa TY3 con 100% de alineación con Trichoderma atroviride
1 attaccgagt ttacaactcc caaacccaat gtgaaccata ccaaactgtt gcctcggcgg
61 ggtcacgccc cgggtgcgtc gcagccccgg aaccaggcgc ccgccggagg gaccaaccaa
121 actcttttct gtagtcccct cgcggacgtt atttcttaca gctctgagca aaaattcaaa
181 atgaatcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag aacgcagcga
241 aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt gaacgcacat
301 tgcgcccgcc agtattctgg cgggcatgcc tgtccgagcg tcatttcaac cctcgaaccc
361 ctccgggggg tcggcgttgg ggacctcggg agcccctaag acgggatccc ggccccgaaa
421 tacagtggcg gtctcgccgc agcctctcct gcgcagtagt ttgcacaact cgcaccggga
481 gcgcggcgcg tccacgtccg taaaacaccc aacttctgaa atgttgacct cggatcagg
Se identificó a Trichoderma atroviride con estas dos últimas secuencias, similar a
Vázquez Angulo (2013), que reporta a Trichoderma atroviride con homología al 86% en
comparación a la base de datos del GenBank.
Almaraz, et al, 2012, también identificaron mediante las secuencias de ADN de las
cepas provenientes de bosque de encino en Guerrero a Trichoderma atroviride, el porcentaje
de similitud obtenido por mencionados autores es de 90 y 95.4 %.
47
6.5 Pruebas de antagonismo in vitro
Se establecieron los tratamientos y testigos, mismos que fueron evaluados en un lapso
de 7 días desde el día de su incubación, con ello se determinaron los porcentajes de
colonización, de inhibición y los mecanismos de acción. Los cultivos duales y los testigos se
muestran en la Figura 25A-C
6.6 Mecanismos de acción
6.6.1 Micoparasitismo
a) Observación: El mecanismo de acción que se presentó, fue Adhesión y Enrollamiento,
como se observa en la Figura 26A-C, ya que hay un reconocimiento positivo del antagonista
con el patógeno y las hifas del antagonista se adhieren a las del patógeno, utilizando
estructuras parecidas a ganchos, las cuales se enrollan y finalmente estrangulan al patógeno.
Otros mecanismos acción de Trichoderma, como la malformación de una hifa,
desintegración del citoplasma y lisis de una hifa, son reportados por Chi García, 2015.
A
B C
Figura 25. Pruebas de antagonismo. A) Tratamientos y testigos. B) Testigos, C) Cultivos
duales
48
Figura 26. Mecanismo de acción de Trichoderma sobre Fusarium. A) Adhesión y
enrollamiento. B) Enrollamiento de hifas. C)arriba Adhesión, abajo Enrollamiento de hifas.
Como menciona Infante et al, 2009, la adherencia de las hifas de Trichoderma ocurre gracias
a la asociación de un azúcar de la pared del antagonista con una lectina presente en la pared
del patógeno.
b) Micoparasitismo con la escala de Bell et al, 1982
A los 7 días de la evaluación del micoparasitismo, el análisis estadístico demostró que
no hay diferencias significativas entre tratamientos (Figura 27), sin embargo, se llega a
apreciar invasión de Trichoderma sobre la colonia de Fusarium. Los tratamientos 3
(Trichoderma 2 contra Fusarium 1) y 5 (Trichoderma 3 contra Fusarium 1) presentan mejor
micoparasitismo en esta fecha, aunque con un porcentaje muy bajo.
A los 16 días hay diferencias significativas entre tratamientos (Figura 28), los
tratamientos 4 (Trichoderma 2 contra Fusarium 2) y 6 (Trichoderma 3 contra Fusarium 2)
presentan mejor grado de invasión-destrucción de la colonia de Fusarium. Resultados
similares reporta Celis Perera (2018), de la capacidad antagónica de Trichoderma sobre
A B
C
49
Fusarium, mediante esta variable, para el caso de su estudio también se muestra que no hay
diferencias significativas en el primer día de evaluación y para la segunda evaluación
aumentó el grado de micoparasitismo.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Figura 27. Diferencias estadísticas del micoparasitismo a los 7 días
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Figura 28. Diferencias estadísticas del micoparasitismo a los 16 días
Las diferencias del grado Invasión-destrucción de Trichoderma sobre Fusarium entre
ambos días se pueden apreciar en la Figura 29A-F y 30A-F, generalmente en los estudios
de micoparasitismo, evalúan en dos días distintos el grado de micoparasitismo para efectuar
que el hongo antagonista tenga un efecto positivo en las dos observaciones, sin embargo,
50
estos resultados solo se amparan con las pruebas in vitro, el efecto que se tenga en campo
podrá ser diferente a lo que se obtenga en laboratorio.
Figura 29. Micoparasitismo a los siete días. A) Tratamiento 1: T1 vs F1. B) Tratamiento 2:
T1 vs F2. C) Tratamiento 3: T2 vs F1. D)Tratamiento 4: T2 vs F2. E) Tratamiento 5: T3 vs
F1. F) Tratamiento 6: T3 vs F2
A
E D
B C
F
51
Figura 30. Micoparasitismo a los 16 días. A) Tratamiento 1: T1 vs F1. B) Tratamiento 2: T1
vs F2. C) Tratamiento 3: T2 vs F1. D)Tratamiento 4: T2 vs F2. E) Tratamiento 5: T3 vs F1.
F) Tratamiento 6: T3 vs F2
6.6.2 Competencia por espacio
a) Porcentaje de colonización
Se utilizaron las mediciones correspondientes al séptimo día de establecida la
confrontación entre Trichoderma y Fusarium, de estos tratamientos se pudo verificar que el
porcentaje de colonización de ninguno de ellos presentó el valor menor al 50%, es decir,
todos los tratamientos demuestran que Trichoderma es efectivo para el control de Fusarium
spp.
Los tratamientos que presentaron mejor porcentaje de colonización son: Tratamiento
3: Trichoderma 2 contra Fusarium 1 con 71.6 %, y Tratamiento 6: Trichoderma 3 contra
Fusarium 2 con 71.5%.
Además, con la comparación de medias de tukey (p≤ 0.05), se mostró que hay diferencias
significativas con los tratamientos 3, 6 y 4 (Figura 31)
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
A B C
D E F
52
Figura 31. Diferencias estadísticas del porcentaje de colonización de Trichoderma sobre
Fusarium
Estos resultados, demuestran que Trichoderma es un efectivo controlador biológico,
independiente del comportamiento de cada aislado. Con la identificación de los aislados, se
comprueba que Trichoderma atroviride presenta mejores porcentajes de colonización.
Estudios similares obtenidos por Chi García en el 2015, demuestran que Trichoderma
también es efectivo en el control de Colletotrichum spp, causante de atracnosis en Aguacate
hass, ya que sus pruebas in vitro demostraron que todas las cepas de Trichoderma superan el
50% de colonización sobre el hongo patógeno.
b) Porcentaje de Inhibición de Trichoderma spp
Se consideraron los valores obtenidos en el quinto y séptimo día de medición, para
ambos días hay diferencias estadísticas entre tratamientos (Figura 32 y 33). Los tratamientos
tienen mejores porcentajes de Inhibición al quinto día de enfrentamiento, en este día el
tratamiento 6 (T3 vs F2) y el tratamiento 5 (T3 vs F1) con 69.4 % y 68.83 % respectivamente,
para este día se tienen porcentajes en un rango de 16.55- 69.4% y en el caso del séptimo día
los porcentajes se encuentran entre 12.99- 69.4%, esto nos quiere decir, que el porcentaje de
inhibición para el séptimo día se vio reducido, ya que Fusarium comenzó a mostrar
resistencia ante el crecimiento de Trichoderma, y además Trichoderma compitió de manera
eficaz en los primeros días de confrontación para competir por el espacio ante un patógeno.
53
Así como señala Celis Perera (2018) y Michel-Aceve (2012), la capacidad competitiva de
Trichoderma se debe a su tasa de incorporación de nutrientes, metabolismo y crecimiento
superior cuando se enfrenta a hongos, ya que es capaz de incorporar al medio de cultivo
enzimas hidrolíticas, como celulasas, quitinasas, glucanasas y proteasas, que están
implicadas en los mecanismos de biocontrol, lo que le permite aprovechar mejor los
nutrientes del medio y privar al patógeno de estos recursos.
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Figura 32. Diferencias estadísticas del PICR % a los 5 días
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0.05)
Figura 33. Diferencias estadísticas del PICR% a los 7 días
54
Finalmente se ha hecho una comparación entre las variables que nos permiten conocer
la capacidad antagónica de Trichoderma sobre Fusarium, obteniendo que el aislamiento
Trichoderma 3, que corresponde a la especie Trichoderma atroviride resulta ser el que
obtiene mejores resultados en todas las pruebas in vitro.
Cuadro 4. Comparación de las variables para determinar capacidad antagónica de
Trichoderma
VARIABLE PERIODO DE
EVALUACION
DIFERENCIAS
ESTADISTICAS
ENTRE
TRATAMIENTOS
α=0.05
MEJORES
TRATAMIENTOS
ESPECIE A LA
QUE
CORRESPONDE
Micoparasitismo
7 días No
Tratamiento 3
(T2 vs F1)
Tratamiento 5
(T3 vs F1)
Trichoderma
atroviride
16 días
Tratamiento 4
(T2 vs F2)
Tratamiento 6
(T3 vs F2)
Trichoderma
atroviride
% PICR
5 días
Tratamiento 6
(T3 vs F2)
Tratamiento 5
(T3 vs F1)
Trichoderma
atroviride
7 días
Tratamiento 6
(T3 vs F2)
Tratamiento 2
(T1 vs F2)
T. atroviride y
T.asperellum
Porcentaje de
colonización
(%C)
7 días
Tratamiento 3
(T2 vs F1)
Tratamiento 6
(T3 vs F2)
Trichoderma
atroviride
Al analizar el antagonismo in vitro, podremos sostener que los tres aislados de
Trichoderma, pero en especial el de Trichoderma 3 tiene un efecto antagónico positivo, por
lo que, de alguna manera beneficiará aplicar estas cepas al suelo y con esto reducir la muerte
descendente de los árboles de Tamarix spp reubicados del Ex –lago de Texcoco. Además,
como señala Robledo y colaboradores (2009), la aplicación de Trichoderma tendrá otros
efectos positivos secundarios, entre ellos beneficios para el ambiente en el control de
Fusarium spp, es un producto de origen natural y forma parte del ecosistema, por lo tanto
presenta muy poco o ningún nivel de toxicidad, los patógenos rara vez generan resistencia a
los controladores biológicos, su aplicación es fácil, evita la aparición de otras enfermedades
55
y controla las ya existentes, además contribuyen a la recuperación de las propiedades
biológicas de los suelos, los cultivos, plantaciones o especies a las que se les aplica tienen
mayor facilidad de recuperación volviéndose más sanos y productivos
VII. CONCLUSIONES
La identificación morfológica y molecular de las cepas de Trichoderma en este
estudio pertenecen a Trichoderma asperellum (T1) y T.atroviride (T2 y T3). Para las
cepas de Fusarium resultaron ser Fusarium oxysporum (F1 y F2). Queda comprobado
que las cepas nativas de Trichoderma en el suelo y las cepas patogénicas de Fusarium
como causante de la muerte descendente de Tamarix spp. de la zona del Ex lago de
Texcoco, pueden ser evaluadas ahora en campo.
El mecanismo de Micoparasitismo de Trichoderma atroviride y T. asperellum fueron
Adhesión y Enrollamiento
De acuerdo con los resultados obtenidos del Porcentaje de colonización (%C)
Micoparasitismo (%) y Porcentaje de Inhibición (% PICR), 71.54, 100, 69.4%
respectivamente, se recomienda al aislado de T3: Trichoderma atroviride, por
presentar los mejores porcentajes estadísticamente para medir la capacidad
antagónica.
VIII. RECOMENDACIONES
Realizar la aplicación en campo y evaluar los mecanismos antagónicos evaluados en
los ejemplares de Tamarix, y que, de esta manera, ayuden a la conservación de estos
ejemplares que fueron reubicados por efecto de la construcción de un gran proyecto de
infraestructura.
56
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62
X. ANEXOS MEDIOS DE CULTIVO
1. Medio de cultivo PDA (Agar Papa Dextrosa)
La preparación de 1 L de medio de cultivo ocupa las cantidades siguientes:
38 gr de DPA deshidratado BD Bioxon ®
1 L de agua destilada
Pasos:
1. Una vez pesado el polvo de DPA comercial, éste se agrega a un matraz y enseguida
añadimos agua destilada hasta obtener una mezcla homogénea libre de grumos. Se cubre el
matraz para su posterior esterilización.
2. En olla de presión o autoclave se coloca el medio y se vigila la válvula hasta llegar a las
15 libras (120° C), una vez que alcance esta marca se mantiene constante la temperatura por
15 o 20 minutos.
3. Después de este tiempo, se apaga la autoclave o la olla de presión y esperamos a que baje
la temperatura, para poder sacar el material.
4. Finalmente esperamos a que se enfríen los materiales, para que se pueda verter el medio
de cultivo en las cajas Petri, este paso se debe hacer con mucho cuidado, ya que de ello
depende obtener un trabajo limpio y sin contaminación, para ello se tiene que encender el
mechero y vaciar el medio lo más cercano al fuego, de esta manera se reduce la
contaminación de las cajas y el medio de cultivo.
2. Medio de cultivo PDA con Sulfato de estreptomicina (antibiótico)
63
La preparación de 1 L de medio de cultivo ocupa las cantidades siguientes:
38 gr de DPA deshidratado BD Bioxon ®
1 L de agua destilada
0.05 gr de sulfato de estreptomicina (antibiótico)
El procedimiento es similar al anterior solo que antes de vaciar el medio a caja Petri se debe
enfriar un poco para agregar el Sulfato de estreptomicina y evitar que lo caliente del medio
inhiba el efecto del antibiótico.
3. Medio de cultivo PDA con Ácido láctico
La preparación de 1 L de medio de cultivo ocupa las cantidades siguientes:
38 gr de DPA deshidratado BD Bioxon ®
1 L de agua destilada
10 gotas de Ácido láctico
Antes de vaciar el medio a caja Petri se debe enfriar un poco para agregar el Ácido láctico y
evitar que lo caliente del medio inhiba el efecto de éste.
4. Medio de cultivo PDA con Acaricida
La preparación de 1 L de medio de cultivo ocupa las cantidades siguientes:
38 gr de DPA deshidratado BD Bioxon ®
1 L de agua destilada
5 gotas de acaricida
El procedimiento es similar al anterior solo que antes de vaciar el medio a caja Petri se debe
enfriar un poco para agregar el acaricida y evitar que lo caliente del medio inhiba el efecto
de éste.
5. Medio de cultivo PDA con Sulfato de estreptomicina, ácido láctico y acaricida
64
La preparación de 1 L de medio de cultivo ocupa las cantidades siguientes:
38 gr de DPA deshidratado BD Bioxon ®
1 L de agua destilada
5 gotas de acaricida
10 gotas de ácido láctico
0.05 gr de Sulfato de estreptomicina (antibiótico)
El procedimiento es similar los anteriores solo que antes de vaciar el medio a caja Petri se
debe enfriar un poco para agregar conjuntamente el acaricida, el antibiótico y el ácido láctico
y evitar que lo caliente del medio inhiba el efecto de éste. Este medio es sumamente efectivo
para eliminar cualquier contaminante y con ello las cepas tengan mejor crecimiento.
MEDIOS SELECTIVOS PARA ESPORULACIÓN DE Fusarium spp
1. Medio Agua Agar con hojas de clavel
Se utiliza los materiales siguientes:
Para 1 Litro:
20 gr de agar BD Bioxon ®
1 L de agua destilada
Hojas de clavel
Pasos:
1. Una vez pesado el agar BD Bioxon ®, se agrega este a un matraz junto con el agua
destilada, se agita de manera que se obtenga una mezcla homogénea libre de grumos
2. Las hojas de clavel deben cortarse en pequeños pedacitos y colocarlos con agua
destilada en un vaso de precipitado, se cubren con papel aluminio para su
esterilización
3. Después de esterilizar el medio y las hojas de clavel, de debe colocar los pedacitos de
hojas en las cajas Petri, y posteriormente se vierte el medio sobre las hojas procurando
que éstas no queden sumergidas en el medio.
65
2. Medio SNA (Agar Sintético Nutritivo)
Utiliza los reactivos siguientes:
Para 1 litro:
KH2PO4 (Fosfato monopotásico) = 1 gr
KNO3 (Nitrato de Potasio) = 1 gr
MgSO4 7H2O (Sulfato de Magnesio Heptahidratado) = 0.55 gr
KCl (Cloruro de Potasio) = 0.5 gr
Glucosa = 0.2 gr
Sacarosa = 0.2 gr
Agar = 23 gr
1 L de agua destilada
Pasos:
1. Se deben pesar todos los reactivos y el agar
2. Una vez pesados se pasan a un matraz que contenga agua destilada se agita hasta
obtener una mezcla homogénea libre de grumos.
3. Se esteriliza el medio asi como en los procedimientos anteriores, y de deja enfriar
para poder verter el medio a cajas Petri.
FORMATOS DE MEDICIÓN
1. Formato de medición de las estructuras de Trichoderma spp
No. De
muestra
Clamidosporas Fiálides
Forma Color Grupo
Conidios
Forma Presencia Ausencia
Largo
(µm)
Ancho
(µm)
Largo
(µm)
Ancho
(µm)
69
2. Formato de medición de las estructuras de Fusarium spp
No. De
muestra
Clamidosporas Conidios Fiálides
Color
del
micelio
Pigmento
Esporodoquios
Presencia
Ausencia
Macro Micro
Presencia Ausencia Forma
Largo (µm)
Ancho (µm)
Forma Tamaño Fo
r
ma
Tamaño Fo
r
ma
Largo (µm)
Ancho (µm) Apical Basal
Largo
(µm)
Ancho
(µm)
Largo
(µm)
Ancho
(µm)
70
3. Formato de medición de cepas para obtener porcentaje de colonización C
C = (DTP
DE) ∗ 100
Donde:
C = Porcentaje de colonización
DTP = Distancia recorrida por la colonia de Trichoderma spp, sobre la colonia del patógeno (Fusarium spp.), en el eje que separa a
ambas colonias.
DE = Distancia entre ambos puntos de siembra
Nota: R1, R2, R3, R4 corresponden a las repeticiones por tratamiento
Formato de medición de cepas para obtener el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento Radial (PICR)
Parámetros Fecha
Tratamiento 1 (T1 vs F1)
Tratamiento 2 (T1 vs F2)
Tratamiento 3 (T2 vs F1)
Tratamiento 4 (T2 vs F2)
Tratamiento 5 (T3 vs F1)
Tratamiento 6 (T3 vs F2)
R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4 R1 R2 R3 R4
DTP
DE
C%
71
4. Formato de medición de cepas para obtener porcentaje de Inhibición (%PICR)
PICR =R1 − R2
R1∗ 100
Donde:
PICR = Porcentaje de inhibición en el crecimiento del micelio
R1 = Crecimiento radial del patógeno sobre el lado opuesto, evaluado en la caja Petri
R2 = Crecimiento radial del patógeno en enfrentamiento
Nota: T1: Trichoderma 1, T2: Trichoderma 2, T3: Trichoderma 3, F1: Fusarium 1, F2: Fusarium 2
No.de
repetición Fecha
Tratamiento
1
(T1 vs F1) PICR
%
Tratamiento
2
(T1 vs F2) PICR
%
Tratamiento
3
(T2 vs F1) PICR
%
Tratamiento
4
(T2 vs F2) PICR
%
Tratamiento
5
(T3 vs F1) PICR
%
Tratamiento
6
(T3 vs F2) PICR
%
TESTIGO
F1(R1)
TESTIGO
F2(R1)
TESTIGO
T1
TESTIGO
T2
TESTIGO
T3
R2 R2 R2 R2 R2 R2
