Abordaje terapéutico global parapatologías en la experiencia de laacuicultura chilena.

Antecedentes

• Durante la fase de agua dulce, bacterias como Flavobacterium spp. y otras entrelas que se destaca Renibacterium salmoninarum (causante del BKD) son factoresque de una u otra forma además de causar una no menor mortalidad,

• BKD es una enfermedad la que se presenta en agua dulce y que existe en Chiledesde los inicios de la Industria Salmonera Nacional hacia la década del 80, de ahíen adelante esta ha sido controlada mediante el uso de Antibióticos frente a brotescon diagnóstico y antibiograma positivo y mediante el control de la transmisiónvertical (Reproductores/Ovas) mediante la eliminación de positivos medianteScreening a los lotes de desove.

• El daño a nivel renal causado por Renibacterium salmoninarum que afecta la calidaddel alevín a trasladar y reduciendo el impacto que estados inmunitarios deprimidospuedan facilitar el ataque de otras patologías como IPNv y otras entidadesemergentes que pudieran provocar en un futuro, reduciendo además el uso deantibióticos en la industria.

• La caracterización de los aislados es fundamental para determinar si existendiferencias o similitudes entre ellos a nivel bioquímico, genético, antigénico yserológico.

• Además de determinar virulencia de los aislados. Para esto se realizan diferentestécnicas moleculares de tipificación y serotipificación, como también desafíos enpeces en condiciones controladas.

Diagnóstico primario

Levantamiento de información

Desafíos

• Busqueda de aislados• Metodos de cultivo• Reproducibilidad del cuadro• Expresiones no deseadas (p57)

(IX, X, XI, XII y XIV regiones de Chile)

Aislamiento y cultivo exitoso de R. salmonimarum

Medios solidos KDMC y KDM–2, 13 aislados nacionales de R. salmoninarum obtenidos del levantamiento en campo (IX, X, XI, XII y XIV regiones de Chile).

Aislados de la bacteria que hoy en día se encuentran activos y asociados a brotes en las producciones de salmones en Chile.

Cocos y diplococos en algunos casos, Gram positivos, oxidasa y catalasa positivos. Es un microorganismo de fastidioso crecimiento ya que tarda en crecer entre 15 a 21 días en placas de KDM–C o KDM–2 incubadas a 15ºC.

Transcurrido ese período de incubación, en las placas se pueden observar colonias blancas

y redondas de entre 1 a 3 mm de diámetro.

. Frotis 1000X de un aislado nacional del patógeno de peces R. salmoninarum. En la imagen se pueden apreciar abundantes cocos Gram positivos. B. Imagen de las colonias de un aislado nacional del patógeno de peces R. salmoninarum, colonias puntiformes, redondas y blancas.

Cepa Huésped Origen (Región de Chile) Año Fase Tipo de agua

ATCC 33209T Oncorhynchus tshawytscha Leaburg Hatchery, Oregon 1980 Hatchery Dulce

BV 911–009 PA Oncorhychus kisutch Ensenada baja, Chacabuco (XI) 2009 Engorda Mar

BV 912–013 PA Oncorhychus kisutch Ensenada baja, Chacabuco (XI) 2009 Engorda Mar

BV 0083–1109 PA Oncorhychus kisutch Pto. Aysén (XI) 2009 Engorda Mar

RsSS–10 PM Oncorhychus kisutch Estero del Reloncaví (X) 2010 Engorda Mar

BV 48379 PM Oncorhychus kisutch s/i 2011 Smolt s/i

RsSS–12 PM Oncorhychus kisutch Estero del Reloncaví (X) 2012 Engorda Mar

BV 49950 PM Oncorhychus mykiss Niebla (XIV) 2012 Alevinaje Dulce

BV 810–008 PA Salmo salar Fiordo Aysén, Bahía Acantilada (XI) 2008 Engorda Mar

BV 910–008 PA Salmo salar Pto. Aysén (XI) 2008 Engorda Mar

BV 1104–033 PA Salmo salar XI región (barrio 26B) 2011 Engorda Mar

RsSME–12 HP Salmo salar Hornopirén (X) 2012 Engorda Mar

BV 49923 PM Salmo salar Conguillío (IX) 2012 Alevinaje Dulce

BV 50157 PA Salmo salar Seno Aracena (XII) 2012 Engorda Mar

Colección (cepario) VQ R. salmonimarum

• Crecimiento bacteriano de los 13 aislados de campo del patógeno en los dosmedios de cultivo recomendados en la literatura para el crecimiento delagente, después de 21–24 días a 15°C.

• Está reportado en la literatura que R. salmoninarum es un organismo defastidioso crecimiento, motivo por el cual su crecimiento demora entre 18 a 25días.

• Generacion de crioviales de cada uno de los aislados y cepa de referencia de R.salmoninarum ATCC 33209T, los cuales se conservan a –80°C.

Cepas bacterianas y condiciones de cultivo.

Elisa, Kit comercial

PCR anidado especie–específico de acuerdo al protocolo de Pascho et al., (1998), fragmento de 320pb.

Identificación de los aislados por Elisa y PCR especie–específico.

Figura 1. Resultados del PCR anidado especie–específico para la detección del patógeno de peces Renibacterium salmoninarum de acuerdo al protocolo de Pascho et al., (1998). C+, Control positivo ATCC 33209T; C–, Control negativo; M, estándar de peso molecular de 100pb. 1–13 aislados chilenos de R. salmoninarum.

Caracterización bioquímica, métodos convencionales y sistemas miniaturizados api® ZYM.

Susceptibilidad a agentes antimicrobianos.

Aislado/Halo (Ømm) FFC AML E SXT ENR OA UB TE OT

ATCC 33209T 27 R 28 R 51 R 28 96 50

BV 911–009 PA 33 42 R 32 R R 23 86 91

BV 912–013 PA 35 41 R 33 R R 25 84 92

BV 0083–1109 PA 39 41 5 42 R R 12 96 100

RsSS–10 PM R 19 13 R 22 R 22 R R

BV 48379 PM 41 25 43 R 50 R 18 60 52

RsSS–12 PM 30 R 50 R 44 R 31 42 R

BV 49950 PM 28 48 52 R 50 R 36 52 62

BV 810–008 PA 42 42 15 21 R R 23 81 82

BV 910–008 PA 42 42 15 21 R R 23 80 83

BV 1104–033 PA 32 31 15 42 12 R 13 98 120

RsSME–12 HP 32 32 53 R 44 R 29 66 36

BV 49923 PM 27 23 52 R 40 R 35 34 54

BV 50157 PA 29 32 55 R 66 R 41 87 90

• Los patrones de susceptibilidad de los 13 aislados chilenos a losantimicrobianos estudiados, indican que todos los aislados son resistentesal ácido oxolínico.

• 7 de los 13 de los aislados (3 de salmón coho, 1 de trucha y 3 de salmóndel Atlántico) son resistentes al SXT al igual que la cepa de referencia y 5aislados resultaron resistentes al ENR (3 de salmón Coho y 2 de Atlántico).

Antibióticos

• Se logró aislar y cultivar en medio solidos KDMC y KDM–2 los aisladosnacionales de R. salmoninarum.

• Se generaron 3 viales de cada uno de los aislados del patógeno.

• Se comprobó que los 13 aislados corresponden al patógeno de peces R.salmoninarum mediante dos protocolos de PCR.

• Los 13 aislados bioquímicamente constituyen un grupo homogéneo yademás presentan el mismo perfil que la cepa de referencia utilizando lossistemas miniaturizados api® ZYM.

• Los 13 aislados son resistentes al ácido oxolínico. Además se observaron 9aislados resistentes al sulfamida potenciada, 5 aislados resistentes alenrofloxacino.

Conclusiones.

Análisis filogenético de una región del ARN 16S de Renibacterium salmoninarum

( 1445 pb del gen)

Determinación de patogenicidad en peces.

Inoculación mediante émbolo oral, utilizando alimento mezclado con inoculo bacteriano ajustado, a peces previamente sedados.

Ensayo vía inmersión, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada cepas RsSS–10 PM (amarillo) y BV 1104–033 PA (verde).

Desafío inmersión.

Primer ensayo desafío oral (émbolo).

Ensayo vía oral, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada para el primer ensayo oral (E) cepas RsSS–10 PM (amarillo) y BV 1104–033 PA (verde).

Desafío intraperitoneal (IP).

Ensayo vía IP, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada cepas RsSS–10 PM (amarillo) y BV 1104–033 PA (verde).

Ensayo vía IM, Mortalidad diaria y porcentaje de mortalidad acumulada cepas RsSS–10 PM (amarillo) y BV 1104–033 PA (verde).

Desafío intramuscular (IM).

Se logró reproducir en condiciones experimentales de acuario, el cuadro clínico dela enfermedad bacteriana del riñón (BKD, por su sigla en inglés) utilizando truchasarcoíris como modelo animal con las cepas RsSS–10 PM, BV 1104–033 PA y BV49950 PM.

Independiente de la vía de inoculación utilizada se pudieron observar las cuatroetapas de la enfermedad propuestas por Nance et al., 2010, durante una infecciónpor Renibacterium salmoninarum a medida que trascurría el desafío.

Se observa un efecto dosis dependiente entre la concentración del inóculo y elporcentaje de mortalidad acumulada, especialmente en el caso de los desafíos IP eIM..

Se estableció como desafío la vía oral (émbolo) a través del alimento comometodología para la evaluación de vacunas en condiciones experimentales y conuna duración del desafío de no menos de 60 días.

Conclusiones

Determinación de cinética de inactivación

Cinética de inactivación del cultivo bacteriano titulado de la cepa RsSS–10 PM.

Hitos.

Aislamiento y cultivo exitoso de R. salmonimarum.

Generación de cepario caracterizado de R. salmoninarum.

Caracterización de perfiles proteicos y análisis serológico de los aislados de R. salmoninarum.

Estudio de infectividad y patogenicidad de los aislados de R.salmoninarum:

De acuerdo a las técnica de PCR especie específico, se comprobó que los 13 aisladosde campo de la colección, corresponden al patógeno de peces R. salmoninarum.

Se comprobó que los 13, bioquímicamente constituyen un grupo homogéneo yademás presentan el mismo perfil que la cepa de referencia utilizando los sistemasminiaturizados api® ZYM.

Realizados los estudios de susceptibilidad antibiótica, se observa que los 13aislados son resistentes al ácido oxolínico. Además se observaron 9 aisladosresistentes a sulfamida potenciada y 5 aislados resistentes a enrofloxacino.

. Vacunación por inmersión (alevinaje)

. Vacunación oral (alevinaje).

. Vacunación Inyectable un antígeno.

. Vacunación Inyectable poli antigénicas.

Vacunas disponibles en Chile

Enfrentando los problemas.

• Atrasar hasta donde se pueda, el contacto del agente con los peces

• Vacunación: Oral (baños) + vacunas inyectables

• Bioseguridad: Agua Dulce

• Manejo del Stress

• Temperatura:– Implementar alternativas de subir temperatura (recirculación re uso)

• Genética:– Parte de la variabilidad en la mortalidad para patógenos, estádeterminada genéticamente (estudios serios)

Gracias por su atención.