DETERMINACION DE ACIDOS GRASOS TOTALES EN MEDULA OSEA POR CROMATOGRAFIA GAS-LIQUIDQ

Dr. Julio Flores Rodriguez M. en C. lcela D. Barcel6 Ouintal

M. en C. Hugo E. Solís Correa Q.F.B. Susana Netta Bocardo

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hT!A UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA Casaabertadtenpo UNIDAD AZCAPOTZALCO. Uivisión de Ciencias Básicas e lnganlería

Departamento de Ciencias BBsicas

ISBN-970-620-397-4 Diciembre de 1993

UNIVERSIDAD AUTONOMA METROPOLITANA-AZCAPOTZALCO

DETERMINACION DE ACIDOS GRASOS TOTALES EN MEDULA OSEA POR CROMATOGRAFIA GAS-LIQUID0

Dr. Julio Flores Rodriguez M. en C. Icela D. Barcel6 Quintal M. en C. Hugo E. Solis Correa Q,F.B. Susana Netza Bocardo

DIVISION DE CIENCIAS BASICAS E INGENIERIA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS

AREA DE QUIMICA

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DETERMINACION DE ACIDOS GRASOS TOTALES EN MEDULA OSEA ROJA POR CROMATOGRAFIA GAS-LIQUID0

RESUMEN

El examen de la médula ósea es de una importancia decisiva en una gran viariedad de trastornos hematológi.cos, entre ellos la Angmia Aplásica. En este trabajo se establecieron las condiciones de extracción y análisis de ácidos qrasos totales en aspirados de médula ósea roja y amarilla d ehumanos, se encontr6 a los ácidos oleico, linoléico y palmitic0 en mayor proporción.

ABSTRAC

The analysis of the Bone Marrow has a decisive importance in a great variety of hematological diseases, including the Aplastic Anaemia. The extraction conditions and analysis of total fatty acids were estabilished in samples of red and yellow bone-marrow in humans. The oleic, linoleic and palmitic acids were for in a large proportion.

INTRODUCCION

~1 termino de Anémia Apl6StiCa se aplica a un grupo de anémias, que se caracteria por una parcial o total inhibición del rendimiento de la médula ósea, de lo que resulta una anemia severa con leucopénia, eritropénia y trombocitopénia por 10 que en sangre periferica se refleja una disminucidn de eritrocito§, granulocitos y trombocitos; la médula ósea roja se caracteriza por una disminución de te'ids hematopoyético el cual es reemplazado por cklulas grasas ;1 Se ha determinado que la fracción lipídica, tiene un papel altanente activo en el crecimiento celular ~n Vitro2 como ~n Vivo. Se sugiere de que los componentes lipídicos de médula ósea puedan estar activamente envueltos en mecanismos que regulan la proliferaci6n de células hematopoyéticas y/o la diferenciacidn de precursores sanguíneos3.

Roy1, ha establecido que en los casos de anémia aplástica el tejido hematopoyético de la medula ósea se reemplaza pox células grasas y fibrosis. Fleming4 encontró en el aspirado medular de una an@mia refractoria, numerosos cristales de material lipidico, depositado dentro de globlulos de grasa, identificó la presencia de ácido oléico por técnicas de tinción.

Tavassali5 ha sugerido que la médula. 6sea roja es rica en grasa

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insaturada mientras que la amarilla puede ser saturada.

Lund6 y colaboradores determinaron cromatográficamente la composicón de liquidos en médula ósea amarilla de humanos, resportaron que esta constituida por 96 al 98% de trigliceridos, 3% de fosfolípidos y 1% de colesterol; la distribución de d c i d o s grasos €ué de C12 a c18 saturados y sus respectivos insatxrados, predominando el pa1.mitico (C 6) en un 26% y el oléico ( 1 8 : 2 ) en un 46%. Kingsbury y Morgan+ han reportado una distribución de ácidos grasos de C10 a C24 en depósitos de grasa humana, encontraron al ácido palmitico (c16) en un 2 4 % el ol6ico en un 4 5 % . Tsuyosi8, en un análisis de médula ósea amarilla de humanos reporta que los ácidos grasos predominantes son el palmítico (c16) en un 44% y el ol6ico en un 46%.

Zach9 y colaboradores establecieron la composición de ácidos grasos en médula ósea amarilla de humanos (por medio de autopsia); encontró que el patrón cromatogr6fico es de los ácidos grasos C12 a c18. Los dcidos palmitico (c16) y ol6ico (G18 2 ) se encuentran en mayor proporción 25% y 44% respectivamente. TavassolilO en un estudio con médula ósea roja y amarilla de conejos propone que los ácidos mirístico y pal.mítico se encuentran significativamente en médula ósea roja y sus derivados monoinsaturados, miristoléico y palmitoléico en médula ósea amarilla; el dcido palmítico se encuentra significativamente en un 30% en médula osea roja y 17% en amarilla, y el %cid0 estearico en 35% en ambas médulas.

En éste trabajo se estableció un método para determinar la composición de ácidos grasos en aspirados de médula 6sea, se aplicó para médula ósea roja, a un grupo control y otro de pacientes con Anémia Aplásica, y a un grupo control de médula ósea amarilla.

PARTE EXPERIMENTAL

Disolventes Y Reactivos

Acetona, hexano, cloroformo, metanol, etanol, isooctane, y agua purificada. Acido sulftírico, ácido clorhidrico, dicromato de potasio, hidr6xido de potasio, permanganato de potasio, cloruro de sodio, sulfato de sodio anhidro, carbonato de potasio, carbón granular, Trifluoruro de Boro-Metanol.

Otros materiales

Lana de vidrio, micropipetas desechables, parafilm, cinta de tefl6n.

Estandares

Se utilizó las mezclas de esteres metilicos de ácidos grasas

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Supelco 4-7017 y 3-3020. Los nombres yuinicos y triviales, y ntimero de átomos de carbono que integran su estructura, asi como el número de insaturaciones de los ácidos insaturados se presentan en el cuadro I,

Eaui~o auxiliar Balanza analitica, evaporador rotatorio, mantas de calentamiento, reóstato, mufla, horno, congelador vertical y sellador de viales.

EauiDo Y Materiales para la cromatografia Gas-Liquido (CGLL

Cromat6grafo de gases PYE UNICAM modelo GCV de doble columna con detector de ionización de flama, con programacidn de temperatura y conectado a un registra.dor Pye Unicam modelo A R - 5 5 Linear Recorder, y un integrador de datos Varian Aerograph modelo CDS- 111.

Se usaron columnas de vidrio de 1.5 mts de longitud y 4 mm de diámetro interno, se ajustaron con tuercas de bronce.

Como fase movil se usó nitrógeno de alta pureza ( In f ra , S.A.). Entre el cilindro de gas y el cromatógrafo, se coloc6 un filtra de tamiz molcular 4 AQ malla 30/60. Se usaron sept-as para alta temperatura, tipo HT (Varian Aerograph) o equivalentes.

Las fases estacionarias fueron DEW-PS (Succinato de Dietilenglicol con Acido Fosf6sico), Silar 10 CP (Metil Silicona) y SP-216-PS, como soporte inerte se usó Supelcoport (Supelco inc. malla 8 0 / 190.

CONDICONES DE OPERACION DE LA C.0.L.

En el Cuadro IX se muestra el porcentaje de Ease de. cada empaque y las condiciones de operación respectiva.

PURIFICACION DE DISOLVENTES Y REACTIVOS

Los disolventes y reactivos se purificaron de acuerdo a los metodos del Food Laboratory Departament of Agriculture I Alberta, Canadá11 .

LIMPIEZA DEL MATERIAL DE VIDRIO

Todo el material de vidrio se lavó se enjuagó de acuerdo al método establecido por Albert y Reyes 13 .

MUESTRE0

Se utilizaron tres controles vivos: una mujer y dos hombres y un

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control de autopsia femenino. Los pacientes fueron 4 mujeres y 8 hombres con anemia apldsica, con un tiempo de evolución de 1 a 9 meses sin tratamiento a excepción de tres con tratamiento y de 11 a 35 meses de evolución. La etiologla de l a s anemias apl6sticas pueden ser atribuidas a la exposición de insecticidas o de tipo idiopdticos.

ASPXRACION MEDULAR

La médula 6sea roja de los pacientes y controles vivos se obtuvo por punsión de la espina iiiaca posterior y superior. En el cas6 de la autopsia, una parte del esternón fué removida como muestra representativa de médula 6sea roja, y se punsionó la parte media de la tibia para muestra representativa de médula ósea amarilla.

TOMA DE MUESTRA EN VIVO

Para la toma de muestra se utilizó una jeringa de Thomas modificada de Gale, con una aguja calibre 10 mm. La piel de la zona a punsionar se limpia con una solucidn de merthiolate al 1%, o solución de Benzal al 5%. El periostio se infiltra con un anestésico local del tipo de novocaina al 2%. Se procede d atravesar la capa cortical del hueso, se une la base a una jeringa de 20 m1 que contenga 0-2 m1 de EDTA al 10% como anticoagulante y se succiona de 10 a 12 ml. El aspirado se vierte en un tubo con 0 .5 m1 de EDTA y se guarda a -4's.

EXTRACCION DE LIPID08 TOTALES

Para la extracción de lipidos totales, se implement6 el método de Hexano, propuesto en este trabajo, el cual consiste en pesar la muestra del aspirado de médula 6sea y centrifugarlo a 1500 rpm durante un minuto. La capa de grasa se separa hacia la superficie, y se extrae agregando hexano en fracciones hasta la disolución total de la grasa, se recupera el extracto de hexano con una pipeta desechable y se coloca en un tubo de centrifuga de 50 ml, el cual se evapora a sequedad en baAo maria y bajo corriente de Nitrógeno y se pesa.

De nuevo a la muestra se le agrega un volumen de hexancl igual a la cantidad de ella, con el objeto de extraer algún residuo de grasa; ésta se agita vigorosamente por dos minutos y se guarda durante 2 4 horas con el objeto de que este residuo pueda ser integrado cuantitativamente a la fracción a.nterior. El proceso se repite dos veces.

EXTRACCION SELECTIVA DE LIPIDOS TOTALES POR EL METODO DE F O L C H ~ ~

Al tubo de centrifuga de 50 m1 que contiene la muestra se le agregan 2 0 m1 de mezcla cloroformo-metano1 (2: 1 v/v) por gramo de

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muestra, se le adiciona 1/5 del volumen total de soluci.6n salina al 0.9%, se agita vigorosamente y se deja toda la noche protegiéndolo de la luz. Al día siguiente se separa la fase superior (acuosa). La capa inferior (cloroformica) contiene los llpidos extraldos, ésta capa se pasa a través de sulfato de sodio anhidro para secarse, y el tubo se lava con 20 ml de hexano para una recuperaci6n cuantitativa, recogi,endo el solven,te en otro tubo de centrifuga de 50 m1 y se evapora a sequedad en baño maria y bajo corriente de Nitrbgeno, se deja enfriar a temperatura ambiente y se pesan los lipidos totales.

Los l€pidos extraidos se saponifican por el metodo de Hammarstrandl4.

FORMACION DE LBS METIL ESTERES DE LOS ACID08 GRAS0Sl5

Los dcidos grasos extraídos se transfirieron con una pipeta desechable a un vial de 5 ml y se adicionan 2 m1 de trifluoruro de boro metano1 al lo%, se sella el vial y se deja en agua hirviendo por 30 minutos, se enfria, y se transfiere la mezcla de reaccibn a un embudo de separación de 60 ml, lavando cuantitativamente con 10 m1 de hexano. Se adicionan 5 m1 de solución salina saturada, se agita y se dejan separar las dos fases , se descarta la fase acuosa. Se agregan 5 m1 de agua destilada al embudo, se agita, se deja en reposo, y se descarta la fase acuosa. La fase orgánica se hace pasar a través de un embudo de filtraci6n que contiene 10 g de sulfato de sodio anhidro para secarla. Se transifere cuantitativamente con 20 m1 de hexano a un tubo de centrifuga. Se evapora el hexano hasta sequedad, se pesan los metil esteres de los ácidos grasos, S@

afora hasta 5 m1 con isooctano.

ANALISIS CUALITATIVO

La identificación preliminar de los ácidos grasos estraldos se hace por cromatografía gas-líquido, para ello se alternaron inyecciones de los estandares y de los extractos de las muestras.

Se midieron los tiempos de retención de los picos que resultan en el eromatograma, l o s que se comparan con los correspondientes a cada estandar.

AMALIBIS CUANTITATIVO

El análisis cuantitativo se realizó por cromatografia gas- 15quido, para lo cual se elaboraron curvas de calibración de la concentración contra el área de los picos expresada en nfimero de cuentas de cada uno de los estandares. Las curas se corrigieron por el metodo de mínimos cuadrados, y se elaboraron diariamente.

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CONTROL DE LOS RESULTADOS

Simultaneamente con cada muestra se llevó a cabo un aniilisis en blanco, y un andlisis por duplicado. Estos and1isi.s se hicieron par ael control tanto de la pureza de los reactivos como para rectificar la exactitud y reproducción de los resultados.

RESULTAD08 Y EiISCUSION

En el cuadro I11 se muestran los resultados al aplicar el Método de Hexano para la extracción de Lipidos totales a partir de aspirados de médula ósea roja y amarilla de los controles, y en el cuadro IVA y IVB los resultados obtenidos con los pacjentes.

Como se puede observar, los cuadros de los pacientes presentan un mayor porcentaje de lípidos totales extraidos que el de los controles aunque es necesario señalar que el número de individuos de la muestra control es mucho menor que el grupo de los pacientes. En la Tabla V se indican los lipidos totales extraidos por el método de Folch en las muestras de mdcula ósea amarilla y roja de el grupo control y médula ósea roja del grupo de pacientes.

Se observa que la cantidad de lipidos extraídos por el método de Folch, tanto en los grupos de control como en el grupo de los pacientes es muy semejante aunque se requieren mayor número de datos en los grupos controles para que la comparación sea mas representativa.

En el cuadro VI se presentan los resultados del análisis cualitativa del grupo de controles y pacientes.

En el cuadro VI1 se presentan los resultados del análisis cuantitativo del grupo control y de pacientes. Se observa que en ambos grupos los ácidos predominantes son el palmítico, el oléico y el linoléico, este último no se encuentra reportado en la literatura como uno de los mayores porcentajes an medula 6sea roja. TambiGn se aprecian ligeras diferencias entre el grUpQ control de médula dsea roja y el grupo de pacientes en cuanto a los porcentajes de ácidos oléico y linoléico, siendo mayores en el grupo de los controles.

En el cuadro VI11 se muestran los porcentajes de ácidos grasos del grupo de pacientes tanto baje tratamiento como sin el.

Se observa que los ácidos láurico, miristico, miristoléico y linoléico presentan un ligero aumento en el grupo de los pacientes sin tratamiento. También se observa que en el paciente sin tratamiento número seis hay una ausencia de dcido ladrico y ministaléico.

En el cuadro IX se presentan los resultados obtenidos al analizar una muestra de médula ósea amarilla, y se comparan con los

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reportados en la bibliografia. Se observa mayor porcentaje de los dcidos palmitic0 y oléico en todos los reportes, sin embargo, solamente en este trabajo y lo reportado por Zach indican a l ácido linoléico como otro que se encuentra en alta proporción, lo mismo sucede con el dcido pentadecandico entre este trabajo y el. de Tsuyosi. El dcido miristoléico se reporta s ó l o en este trabajo, esto puede deberse a la fase estacionaria que se us6 en este trabajo. La cual permite una mejor resolución de l o s ácidos saturados y sus respectivos insaturados.

CONCLUSIONES

Con base en los resultados que se obtuvieron en este trabajo se puede afirmar que:

a) El método de hexano para la extracción de lfipidos, a partir de aspirados de médula ósea, es fácil, económico, rápido y da una buena separación de lipidos.

b) Los ácidos predominantes en médula ósea roja y amarilla en humanos son: oléico, palmitic0 y linoléico.

c) Es necesario realizar estudios longitudinales en los pacientes para observar si existen cambios en l o s porcentajes de los ácidos grasos debido al tratamiento y/o al tiempo de evolucibn.

d) Es necesario proseguir el estudio con un mayor número de individuos para obtener estadisticas significativamente confiables.

AGRADECIMIENTO

Agradecemos al Dr. José Gonzdlez Llaven, Jefe del Departamento de Hematologia, del Centro Mbdico la Raza, del Instituto Mexicano del Seguro Social quien proporcionó las muestras que se emplearon en este trabajo.

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Cuadro L . Acidos grasos. Nombre comun y químico.

Nombre comun Nombre quimico %tomos de carbono

Acido Láurico (Acido Dodecanóico Acido Miristico IAcido Tetradecanóico

l- Acido Miristoléico IAcido Tetradecenóico !Acid0 Pentadecanóico

Acido Palmitic0 Acido Hexadecanóico Acido Palmitoleico Acido Hexadecenóico

* numero de insaturaciones

Cuadro II . Fases estacionarias y condiciones de C.G.E.

Velocidad de carta

operación cle la

13

1" Roja 1 0 .8

1 2 3

0.64 0.12 1.16 0 . 7 8 0.67

I o 1 0 . 4 3 "_ll

Cuadro IV. Porcentaje de lipidos totales extraídos en aspirados de médula Bsea roja del grupo de pacientes

Cuadro VA. Porciento de lípidos totales extraidos por el método de Folch en médula Qsea roja en controles.

15

Cuadro VB. de Folch en

Porciento de l í p idos totales extraídos por el método médula ósea roja y amarilla en pacientes.

-1 "1

7 65.7 8 78.8

U 1 1 . 3

n -.I e I t Y I 6 l . Y

10 -. 85.9 i

Médula ósea amarilla

Cuadro VI. An6lisis cualitativo por comparación directa.

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madre VIX. Porcentaje de la composición be los Scidss grasss be la m8dula psea roja en el grupo de control y el grupo de pacientes con anemia aplbsiaa.

Cuadro VIIX. Porcentaje de la composición be á o i b s s pacientes sin tratamiento y con tratamiento.

-_I_

29.3 10.86 28.8 0.98 27.9 0.88 25.4 1.21

I__

""

grasos en

19

Cuadro I X . Porcentaje de la composición de dcidos grasss reportados anteriormente y los que se obtuvieron en este trabajo para médula ósea amarilla de humano.

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