ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

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UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE Facultad de Ciencias Experimentales Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular División de Neurociencias Mauricio Valenzuela Harrington ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO DURANTE APRENDIZAJE ASOCIATIVO Y POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN EXPERIMENTAL EN RATAS. Tesis Doctoral co-dirigida por el Dr. José María Delgado García la Dra. y la Dra. Agnès Gruart i Massó Sevilla, 2009

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UNIVERSIDAD PABLO DE OLAVIDE Facultad de Ciencias Experimentales

Departamento de Fisiología, Anatomía y Biología Celular División de Neurociencias

Mauricio Valenzuela Harrington

ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL

HIPOCAMPO DURANTE APRENDIZAJE

ASOCIATIVO Y POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN

EXPERIMENTAL EN RATAS.

Tesis Doctoral co-dirigida por el Dr. José María Delgado García la Dra. y la

Dra. Agnès Gruart i Massó

Sevilla, 2009

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D. José María Delgado García, Catedrático del Departamento de Fisiología, Anatomía y

Biología Celular de la Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad Pablo de

Olavide, y Dña. Agnès Gruart i Massó, Profesora titular del Departamento de Fisiología,

Anatomía y Biología Celular de la Facultad de Ciencias Experimentales de la Universidad

Pablo de Olavide.

CERTIFICAN:

que el presente trabajo titulado “ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL

HIPOCAMPO DURANTE APRENDIZAJE ASOCIATIVO Y POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN

EXPERIMENTAL EN RATAS” ha sido realizado bajo su dirección y supervisión por Don

Mauricio Valenzuela Harrington, Licenciado en Biología y Ciencias por la Universidad de

Playa Ancha de Ciencias de la Educación (Chile), y consideran que reúne las condiciones de

calidad y rigor científico para ser presentado y defendido como Tesis Doctoral.

Sevilla, 13 de Marzo de 2009

Fdo.: José María Delgado García Fdo.: Agnès Gruart i Massó

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DEDICATORIA

A Ricardo y Ricky

A Vania y Nelly, mis dos amores

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AGRADECIMIENTOS

Difícil es encontrar las palabras que expresen con mediana aproximación los

sentimientos que se generan cuando se desea dar gracias a tantas personas que de una u otra

forma me ha ayudado a concluir esta etapa en mi formación académica. En este pequeño

espacio de mi tesis, quisiera dejar expresados mis más profundos y sinceros agradecimientos a

quienes estuvieron junto a mi en todos los años que duró esta etapa:

A mis familias

Mis hermanos Patricia, Verónica y Esteban, en los años de lejanía,

saber que ustedes estaban junto a los viejitos me hizo más llevadera la distancia. Gracias por el

apoyo y la energía que me enviaron en todo momento, este logro es también vuestro.

Mis suegros, cuñados y con cuñados, por brindarnos su cariño

incondicional y acompañarnos a la distancia, siempre preocupados y dispuestos a ayudarnos.

A los amigos...

Marcos, juntos hemos recorrido el mismo camino, por eso tus cartas y

tu apoyo siempre me llegaron en el momento preciso. Gracias por estar...

Christian, Cristian y Natalia, sus cartas a la distancia me mantuvieron

cerca de mi amado puerto, gracias por acompañarme en los momentos difíciles.

A la Universidad de Playa Ancha...

Gracias a las diferentes autoridades y colegas de mi universidad

quienes me depositaron su confianza y apoyo para realizar este doctorado.

A la División de Neurociencias de la Universidad Pablo de Olavide...

Aquí tuve la suerte de conocer a personas increíbles que me brindaron

siempre su calidez y compañía. En especial quisiera agradecer a José María Delgado y Agnés

Gruart quienes me guiaron en esta tesis doctoral con total entrega y preocupación, siempre

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dispuestos a darme el consejo oportuno y la guía adecuada, por todo lo vivido muchísimas

gracias.

También quisiera agradecer de forma muy especial a Antonio y Sabina

quienes hicieron de Sevilla y Europa lo mejor que he vivido. Finalmente entregar mis

agradecimientos a todos los compañeros de la división de neurociencias y con especial cariño

a Raudel, con quien compartí fantásticos años junto a su alegre compañía.

A mis compañeros del doctorado, Julieta, William, Oscar, Vicente, David, José Luis,

Elena, Rocío, con quienes compartí gratas tardes de estudio y de intercambios culturales,

llevaré por siempre vuestros recuerdos

Por último quisiera agradecer a Nelly, mi hermosa compañera, amiga, confidente y

esposa, todo lo vivido a tu lado fue increíble, porque cada día que pasa doy gracias por haberte

conocido y por poder disfrutar cada momento a tu lado, porque tu risa contagiosa, tu empuje

en los momentos difíciles, tu paciencia para resistir las largas sesiones de trabajo en el

laboratorio, tu comprensión por los fines de semana en casa, tu amor incondicional, fueron mi

mejor compañía. Te amo cada día mas.

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ÍNDICE

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Índice ii

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Índice iii

1. INTRODUCCIÓN 1

1.1 Planteamiento general 3

1.2 Aproximación histórica a los estudios sobre el hipocampo 5

1.3 Anatomía y fisiología del hipocampo 7

1.3.1 La formación hipocampal 7

1.3.2 Citoarquitectura de la formación hipocampal 7

1.3.3 Corteza Entorrinal 8

1.3.4 Giro Dentado 9

1.3.4.1 Aferencias al giro dentado 12

1.3.4.2 Eferencias del giro dentado 13

1.3.5 Hipocampo propio 13

1.3.5.1 Interneuronas en el hipocampo propio 17

1.3.5.2 Citoarquitectura hipocampal 18

1.3.5.3 Complejo subicular 20

1.4.5.4 Principales aferencias y eferencias de la formación hipocampal 22

1.4 Plasticidad sináptica en el hipocampo 22

1.5 Memoria y Aprendizaje 28

1.5.1 Parámetros analizados en pruebas de aprendizaje asociativo 33

1.5.2 Estructuras nerviosas implicadas en el condicionamiento clásico del reflejo palpebral.

34

2. OBJETIVOS 37

2.1 Objetivo General 39

2.2 Objetivos Específicos 39

3. MATERIALES Y MÉTODOS 40

3.1 Sujetos Experimentales 42

3.2. Procedimiento quirúrgico en animal agudo 42

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Índice iv

3.3 Registro de la actividad electroencefalográfica y calibración de los

estímulos eléctricos 45

3.3.1 Protocolo experimental en animales agudos 45

3.3.1.1 Registro de la actividad basal 46

3.3.1.2 Perfil de intensidades 46

3.3.1.3 Prueba de pulsos pareados 46

3.4 Procedimiento quirúrgico para animales crónicos 47

3.4.1 Recuperación, cuidados post-operatorios y habituación a las

condiciones de registro 49

3.5 Registro de las actividades electromiográficas y electroencefalográficas y

calibración de los estímulos eléctricos 50

3.5.1 Registro de la actividad poblacional en la capa piramidal del área CA3

y CA1 del hipocampo 51

3.5.2 Registro de la actividad poblacional en la capa granular del giro

dentado del hipocampo 51

3.5.3 Protocolo experimental en animales crónicos 51

3.6 Grupos experimentales crónicos 52

3.6.1 Condiciones generales para las sesiones de condicionamiento 53

3.6.2 Estructura general de los programas de condicionamiento 53

3.6.3 Paradigmas de condicionamiento empleados 54

3.6.3.1 Paradigma de traza: Tono – choque eléctrico 54

3.6.3.2 Paradigma de seudocondicionamiento 54

3.7 Pruebas electrofisiológicas y farmacológicas 54

3.7.1 Protocolo empleado para inducir una potenciación a largo plazo (LTP) 55

3.7.2 Protocolo empleado para inducir una depresión a largo plazo (LTD) 55

3.7.3 Pruebas farmacológicas y condicionamiento 55

3.8 Análisis de datos 56

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Índice v

3.8.1 Generalidades 56

3.8.2 Parámetros analizados de la actividad del músculo orbicular de los

párpados 56

3.8.2.1 Parámetros de las respuestas condicionadas 56

3.8.2.1.1 Porcentaje de respuestas condicionadas 56

3.8.2.1.2 Latencia al pico máximo de la respuesta condicionada 57

3.8.2.1.3 Latencia al inicio de la respuesta condicionada 57

3.8.2.1.4 Amplitud máxima relativa de la respuesta condicionada 58

3.8.2.2.5 Área relativa de la respuesta condicionada 58

3.8.3 Cálculo de la variación de la pendiente en los registros de potenciales

de campo sinápticos en el hipocampo 58

3.8.4 Análisis Estadístico 60

3.8.4.1 Experimentos de estimulación en hipocampo 60

3.8.4.2 Experimentos de condicionamiento 60

3.9 Histología 61

4. RESULTADOS 62

4.1 Caracterización de los potenciales de campo evocados en tres sitios de

relevo sináptico del hipocampo 64

4.2 Caracterización de las respuestas condicionadas durante las pruebas de

aprendizaje asociativo y de pseudocondicionamiento 65

4.2.1 Porcentaje de respuestas condicionadas ejecutadas por sesión 65

4.2.2 Área bajo la curva de las respuestas condicionadas 67

4.2.3 Amplitud máxima de las respuestas condicionadas 67

4.2.4 Latencia de inicio y al pico máximo de las respuestas condicionadas 70

4.2.5 Características electromiográficas de las respuestas condicionadas 71

4.3 Cálculo de la variación de la pendiente en los registros de potenciales de 73

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Índice vi

campo sinápticos en el hipocampo, durante el condicionamiento clásico del

reflejo palpebral

4.4 Efecto del fármaco Ro 25-6981 en animales sometidos a la prueba de

condicionamiento clásico del reflejo palpebral 74

4.5 Efecto del fármaco Ro 25-6981 en la prueba electrofisiológica de

potenciación a largo plazo 80

4.6 Efecto del fármaco Ro 25-6981 en la prueba electrofisiológica de

depresión a largo plazo 81

4.7 Inducción de potenciación y depresión a largo plazo en tres sitios de

relevo sináptico del hipocampo al estimular la vía perforante homolateral 82

4.8 Prueba de pulsos pareados 85

4.9 Comprobación histológica de la localización final de los electrodos de

estimulación y registro 87

5. DISCUSION 89

5.1 Diseño de un modelo para el registro de la actividad hipocampal durante

pruebas de aprendizaje asociativo y de potenciación y depresión sináptica 91

5.2 Patrones de actividad hipocampal durante pruebas de aprendizaje

asociativo 93

5.3 Proceso de aprendizaje motor por condicionamiento clásico del reflejo

palpebral 99

5.4 Participación de los receptores de glutamato del tipo NMDA en la

generación de un aprendizaje asociativo 100

5.5 Participación de los receptores de glutamato del tipo NMDA en los

mecanismos de plasticidad sináptica como la potenciación y depresión a

largo plazo

103

5.6 Efecto de una estimulación en vía perforante y registro simultáneo en tres

sitios del hipocampo en los mecanismos de plasticidad sináptica como la

potenciación y depresión a largo plazo

105

5.7 Efecto de la prueba de pulsos pareados en las sinapsis del hipocampo 106

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Índice vii

6. CONCLUSIONES 110

7. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 114

8. ANEXOS 115

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Introducción 1

1. INTRODUCCIÓN

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Introducción 2

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Introducción 3

1.1 PLANTEAMIENTO GENERAL

El hipocampo es una estructura implicada en procesos de aprendizaje y memoria

(Thompson y Kim, 1996; Blaise y Bronzino, 2003; O’Keefe y Nadel, 1978), en el control

conductual de la ingesta de alimentos (Tracy y col., 2001) y en la conducta emocional

(Papez, 1937). La presencia de numerosas aferencias de muy diverso origen permite que la

transmisión a través del hipocampo presente un alto grado de modulación sináptica,

haciendo a esta estructura un excelente modelo para el estudio de estas interacciones

(Herreras y col., 1988).

La mayoría de los estudios electrofisiológicos realizados en el hipocampo se han

realizado en preparaciones in vitro, en las que el hipocampo está aislado de conexiones

externas. En estas preparaciones se pueden evaluar las propiedades electrofisiológicas de

las células del hipocampo de manera independiente de la llegada de otras aferencias de

distintas regiones del cerebro, de modo que se pueden estudiar cambios localizados en el

hipocampo (Moyer y col., 1996). En contraste, el empleo de un animal completo, como en

modelos experimentales in vivo, asegura la llegada de aferencias tónicas al hipocampo

provenientes de regiones subcorticales como el septum, el tálamo, las fibras comisuras del

hipocampo contralateral, el hipotálamo y varios núcleos del tronco encefálico como el

locus coeruleus, el área tegmental ventral y el núcleo del rafe medial. Muchas de estas

aferencias proyectan a la formación hipocampal haciendo sinapsis en interneuronas

inhibitorias (Buzsaki, 1984; Shepherd, 1990; Herreras y col., 1988). Este es un aspecto muy

importante a considerar, puesto que se ha demostrado que estas influencias extrínsecas

controlan la excitabilidad de los circuitos locales, lo cual es esencial para la inducción de

plasticidad sináptica en la formación hipocampal (Buzsaki, 1984; Shepherd, 1990; Tóth y

col., 1997).

El sistema motor del párpado constituye un excelente modelo experimental para el

estudio de cómo los circuitos neuronales centrales generan una respuesta motora

(Gormezano et al., 1983; Pellegrini, 1995). Dentro de los tipos de aprendizaje que se

pueden estudiar en este sistema motor se encuentra el condicionamiento clásico del reflejo

palpebral, que a sido ampliamente utilizado como modelo (Gormezano et al., 1983;

McCormick y col., 1982; Thompson, 1986 y 1990; Delgado-García, 2000; Gruart y

Delgado-García, 1994; Domingo et al., 1997; Gruart , 2000; Gruart et al., 2000; Servatius,

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Introducción 4

2000; Delgado-García y Gruart, 2002; Delgado-García et al., 2003; Medina y col., 2002;

Lee y Kim, 2004; Valenzuela-Harrington y col., 2007). Este tipo de aprendizaje asociativo

es de especial interés porque presenta una serie de características que lo hacen muy

apropiado para estos estudios: a) Suponen la presencia de solo dos estímulos, el estímulo

condicionado y el incondicionado, los cuales pueden ser controlados con mucha precisión,

b) Ambos estímulos inducen respuestas conductuales discretas, que pueden ser medidas con

mucha precisión y de manera repetida en y entre cada sesión de prueba, c) Los efectos de

los estímulos condicionado e incondicionado pueden ser disociables anatómica y

conductualmente, d) El hipocampo ha sido mencionado por numerosos autores como una

estructura importante en la generación de la denominada respuesta condicionada (Lee y

Kim, 2004; Tseng y col., 2004).

Los estudios de los mecanismos del condicionamiento clásico se han realizado

mayoritariamente en conejos (Gormezano y col., 1962, Ryou y col., 2001; Leal-

Campanario y col., 2007), ratones (Dominguez-del-Toro y col., 2004; Rodriguez-Moreno y

col., 2004; Gruart y col., 2006), gatos (Múnera y col.,2001) y ratas (Stanton y col., 1992;

Weiss y col., 1999; Nicholson y col., 2003; Lee y Kim, 2004; Valenzuela-Harrington y col.,

2007). Los últimos modelos animales descritos a la fecha contemplan el implante crónico

de electrodos en regiones del hipocampo para registrar su actividad, estimulando en sitios

de fibras aferentes al hipocampo o en el hipocampo mismo. En estos modelos se busca

establecer patrones de actividad hipocampal durante pruebas de aprendizaje asociativo. En

la mayoría de estos estudios se registran uno (Moyer y col., 1996; Múnera y col., 2001;

Valenzuela-Harrington y col., 2007; Gruart y col., 2006) ó dos estructuras neuronales

(Gilmartin y McEchron, 2005). Lo mismo ocurre cuando se desea estudiar fenómenos de

eficacia sináptica en el hipocampo, donde las posibilidades pueden ser: a) estimular en vía

perforante y registrar en giro dentado (Davis y col., 1997; Blaise y Bronzino, 2003;

Valenzuela-Harrington y col., 2007). b) estimular las colaterales de Schaffer y registrar en

CA1 (Gruart y col., 2006, Madroñal y col., 2007). c) estimular en la vía perforante y

registrar en giro dentado y CA3 (Krug y col., 2001; Yackel y Berger, 1998); ó d) estimular

en vía perforante y registrar en giro dentado y CA1 (Gilmartin y McEchron, 2005).

Sin embargo, no basta con conocer qué sucede en la entrada (giro dentado) y salida

(CA1) del hipocampo, ya que hay numerosas evidencias que señalan que las neuronas de

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Introducción 5

CA3 son claves en la memorización adaptativa del tiempo de respuesta condicionada, en un

paradigma de traza. (Kishimoto y col., 2006).

Nuestro interés se centró en conocer la actividad electroencefalográfica de los

principales sitios de relevo sináptico en el hipocampo, en dos situaciones experimentales:

a) pruebas de aprendizaje asociativo (condicionamiento clásico del reflejo palpebral) y b)

pruebas de eficacia sináptica como la potenciación a largo plazo (LTP, del inglés long term

potentiation) y depresión a largo plazo (LTD, del inglés long term depression). Para ello se

diseño un modelo experimental en rata con implantes crónicos de electrodos en tres sitios

del hipocampo: giro dentado, CA3 y CA1. Para determinar la magnitud de los cambios

sinápticos en cada sitio se estimuló, con pulsos de baja intensidad, en el borde angular, una

región donde convergen los axones que forman la vía perforante y desde donde proyectan a

las tres regiones antes mencionadas.

Para este estudio, seleccionamos una variante del condicionamiento clásico del

reflejo palpebral denominada: “condicionamiento de traza”. En este paradigma, el estímulo

condicionado se presenta antes del estímulo incondicionado, quedando entre ellos un

intervalo libre de estímulos. Este tipo de aprendizaje requiere de un hipocampo intacto

(Solomon y col., 1986; Moyer y col., 1990; Kim y col., 1995; Weiss y col., 1999; Takehara

y col., 2002; Tseng y col., 2004). La participación del hipocampo en este tipo de

aprendizaje asociativo se basara en los resultados acumulados por estudios

electrofisiológicos, farmacológicos e histológicos que en su conjunto permitirán hacer una

aproximación al funcionamiento del hipocampo en este tipo particular de aprendizaje.

Para comprender de qué manera el hipocampo participa en este tipo de aprendizaje,

es necesario conocer: a) La anatomía del hipocampo, sus principales tipos neuronas y el

establecimiento de circuitos internos. b) Las aferencias y eferencias que conectan al

hipocampo con otras estructuras corticales y subcorticales. c) Los tipos de

neurotransmisores que se encuentran en los diferentes tipos de neuronas e interneuronas, así

como también la distribución funcional de los subtipos de receptores.

1.2 APROXIMACIÓN HISTÓRICA A LOS ESTUDIOS SOBRE EL HIPOCAMPO

Desde el punto de vista histórico, el término hipocampo fue mencionado por vez

primera por Arantius (Giulio Cesare Aranzi, 1530-1589) quien describe en su libro “De

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Introducción 6

Humano Foetu” una estructura localiza a los costados de los ventrículos laterales, con la

forma de un hipocampo (Caballito de mar) o de un gusano de seda blanco (Bombycinus

vermis candidus) (Sano, 1997; Walther, 2002; El Falougy y Benuska, 2006). Sólo el primer

término se mantuvo en el tiempo. La palabra hipocampo proviene del griego: hippos

(caballo) y Kampos (Monstruo marino) (El Falougy y Benuska, 2006).

Los términos “hipocampo” y “arquicorteza” son comúnmente empleados en la

literatura científica como sinónimos (Schwerdtfeger, 1984; Lopes da Silva y col., 1990). La

nomenclatura anatómica de esta estructura ha sufrido varios cambios desde los estudios de

Santiago Ramón y Cajal, de modo que es posible encontrar al menos tres tipos diferentes de

nomenclaturas. Según Santiago Ramón y Cajal, el hipocampo se divide en dos regiones: a)

la región superior corresponde a la región próxima a la corteza entorrinal, también

denominada giro parahipocampal y b) la región inferior, la cual corresponde a la región

cercana al giro dentado. Para esta región Cajal empleó el termino de fascia dentata. De

acuerdo con la nomenclatura que utilizó Rose (1926) divide al hipocampo en 5 regiones

(H1-H5) que comprenden desde el subiculum hasta el giro dentado. Lorente de Nó,

destacado discípulo de Santiago Ramón y Cajal, también elaboró una nomenclatura para el

hipocampo. En ella empleó el término cuerno de Ammón (CA) para el hipocampo propio.

Aunque Walther (2002) señala que este término fue introducido por Gakengeot en 1742,

refiriéndose al dios egipcio Amun-Re. En su organización, Lorente de Nó reconoce 4

regiones en el cuerno de Ammón: a) CA1 es la región próxima a la corteza entorrinal, b)

CA2 es una estrecha franja entre CA1 y CA3, c) CA3, esta zona se continúa hasta el hilius

de la fascia dentata, y d) CA4 es la región entre los brazos de la fascia dentata. Finalmente,

la terminología anatómica (1998) es la nueva nomenclatura que se emplea en la actualidad.

Esta divide al hipocampo propio en 4 regiones (CA1 – CA4) o regiones I – IV. Además

cambia el término fascia dentata por giro dentado. El subiculum es la región de transición

entre el hipocampo propio y la corteza entorrinal. El subiculum se divide a su vez desde la

corteza entorrinal hacia CA1 en: parasubiculum, presubiculum y subiculum propio. Esta

última será la terminología que se empleará en este estudio para la descripción anatómica

de la formación hipocampal y regiones corticales relacionadas.

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Introducción 7

1.3 ANATOMIA Y FISIOLOGIA DEL HIPOCAMPO

En la búsqueda del sustrato biológico de los procesos de memoria y aprendizaje, el

hipocampo a emergido como una de las estructuras más estudiadas en los últimos años.

Los motivos principales por los cuales es una estructura preferida por los científicos

son: a) sus características anatómicas son fácilmente identificables tanto a nivel macro y

microscópico. Esto se ve facilitado por la existencia de una naturaleza laminar que facilita

los registros electrofisiológicos, unido a una baja densidad celular en las capas ubicadas por

encima y debajo de la principal capa, la piramidal. Y, b) los numerosos estudios que

señalan su rol en el establecimiento de diversas formas de aprendizaje y memoria, su

vulnerabilidad a los efectos de la isquemia e hipoxia, como también la susceptibilidad de

generar focos epilépticos, al ser una región de bajo umbral de excitabilidad (Johnston y

Amaral, 2004).

1.3.1 La formación hipocampal

El término “formación hipocampal” considera un complejo de 6 estructuras: Giro

dentado, hipocampo propio, subiculum propio, presubiculum, parasubiculum y corteza

entorrinal (Bayer, 1985; Yeckel y Berger, 1990; Eichenbaum y col., 1996; Witter y col.,

2000; Johnston y Amaral, 2004).

Desde el punto de vista macroscópico la formación hipocampal origina un repliegue

de la corteza cerebral cuyo eje antero-posterior se extiende en forma de C, teniendo como

límite rostral los núcleos septales y extendiéndose en su parte caudal hasta el lóbulo

temporal, envolviendo el tálamo y girando ventralmente en regiones posteriores. La corteza

entorrinal está situada ventralmente en la porción más caudal y el complejo subicular se

hace más patente en regiones temporales (Figura 1).

1.3.2 Citoarquitectura de la formación hipocampal

La formación hipocampal está constituida por 6 estructuras claramente definidas.

Como estas estructuras conforman un circuito con propiedades reverberantes comenzaré la

descripción del mismo desde la entrada de aferencias corticales hasta la región de salida.

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Introducción 8

Subiculum

Corteza Entorrinal

Giro dentado

Figura 1. Esquema del hipocampo, donde se señalan los principales sitios de relevo sináptico. En azul se

muestra la proyección desde la corteza entorrinal al giro dentado, denominada vía perforante.

1.3.3 Corteza entorrinal

Numerosos estudios señalan que el hipocampo desempeña un papel fundamental en la

formación de nuevas memorias, lo que hace particularmente importante a la corteza entorrinal,

que por su estratégica ubicación, puede regular la interacción entre el hipocampo y la corteza

prefrontal (Eichenbaum y col., 1996; Loren y Brown, 2003).

La corteza entorrinal recibe la mayor parte de entradas corticales, las cuales envía al

hipocampo y subiculum, un aspecto que Cajal describió y sobre el cual propuso que podría

estar implicados en procesos de memoria. La corteza entorrinal se encuentra dividida en 6

capas bien definidas, (I - VI). Las capas II y III reciben aferencias sensoriales, muchas de ellas

provenientes de cortezas adyacentes (Witter y col., 2000; Van Haeften y col., 2003). Los

axones de las células de las capas II, III y en menor medida IV y V, forman la vía perforante

proyectando al giro dentado, al hipocampo propio y al subiculum (Amaral y Witter, 1995;

Deng y col., 2007). Las neuronas de la capa II envían sus axones a los 2/3 externos de la capa

molecular del giro dentado mientras que las neuronas de la capa III proyectan bilateralmente al

estrato lacunosum moleculare del hipocampo (Van Groen y col., 2003; Bartesaghi y col.,

2005; Deng y col., 2007). Las capas V y VI están pobladas por una elevada densidad de

neuronas de proyección que envían sus axones hacia fuera de la formación hipocampal,

además de por otros tipos celulares que engrosan la proyección al giro dentado y al hipocampo

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Introducción 9

propio (Amaral y Witter, 1995) (Figura 2). Además estas capas profundas reciben aferencias

desde el hipocampo originadas tanto en CA1 como en el subiculum. Desde estas dos

estructuras la información puede ser enviada a la corteza prefrontal medial para un

almacenamiento a largo plazo (Buzsaki, 1996; Thierry y col., 2000) o puede ser enviada a las

capas superficiales de la corteza entorrinal, formado un circuito reverberante (Dolorfo y

Amaral, 1998). Esta es una importante característica a considerar cuando se tratan de

establecer los mecanismos de almacenamiento de la información en las redes neuronales

(Lopes da Silva y col., 1990). En esta misma línea, el estudio de Egorov y col. demostró que

las neuronas de la capa V de la corteza entorrinal tienen una actividad persistente,

manteniendo una constante tasa de disparo por varios minutos, aún en ausencia de estímulos.

Esto puede sugerir que las neuronas de esta capa pueden participar en la formación de

asociaciones entre estímulos que ocurren a diferentes tiempos. (Egorov y col., 2002; Frank y

Brown 2003)

Varios estudios han determinado que las aferencias de la corteza entorrinal, a través de

la vía perforante al giro dentado, son principalmente excitatorias, mientras que en CA1 la

estimulación de la corteza entorrinal tiene un efecto dual, ya que pueden generar excitación o

una fuerte inhibición (Empson y Heinemann, 1995). Este último efecto se ve respaldado por

estudios que señalan la fuerte influencia que reciben las dendritas apicales de CA1 por parte de

interneuronas GABAérgicas, una acción que se concentra principalmente en la dendrita apical

principal, disminuyendo su efecto hacia las dendritas de segundo y tercer orden (Papp y col.,

2001).

En el esquema de la Figura 2 se detallan las principales aferencias y eferencias de la

corteza entorrinal.

1.3.4 Giro dentado

En el giro dentado es posible diferenciar tres capas. La más próxima a la fisura se

denomina estrato moleculare (sm) y en ella se encuentran mayoritariamente las dendritas

apicales de las células granulares. El soma de estas células se localiza en la siguiente capa, el

estrato granulare (sg). Ambos estratos sufren un giro que deja en su interior la capa más

profunda, la zona polimórfica o hilus (h), que contiene una amplia variedad de tipos celulares,

siendo el más común las células musgosas (Figura 3). Finalmente, entre la región hilar y la

Page 22: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 10

capa molecular podemos diferenciar una estrecha lámina: la zona subgranular donde residen

células madre que proliferan durante la vida adulta del animal (Ribak y col., 2004).

I

II

III

IV

V

VI

CE

GD

CA 3

CA 1

Sub

Pr S

Pa S

C. Frontal

HipocampoC. Peririnal

C. Postrinal

C. Asociación

Figura 2. Esquema de la corteza entorrinal, donde se detallan las principales aferencias y eferencias, GD: giro

dentado; CE: corteza entorrinal; PaS: parasubiculum; PrS: presubiculum; Sub: subiculum (modificado de

Johnston y Amaral, 2004).

En el giro dentado las neuronas principales son las células granulares. Estas células

son de pequeño tamaño (en el rango de los 10 µm de diámetro) y se ubican en la capa del

mismo nombre. Las células de los granos tienen glutamato como neurotransmisor, su soma

suele ser esférico y proyectan a las dendritas apicales situadas en la capa molecular externa.

En la rata, la capa granular, vista en cortes coronales y dependiendo del nivel antero-

posterior, tiene forma de V (más anterior) o de U (más posterior).

Los axones de las células granulares se denominan fibras musgosas (mossy fiber, en

inglés). Las fibras musgosas se originan en la región basal del soma y se extienden a la capa

polimórfica, también denominada hilus. Estos axones emiten colaterales a los poco milímetros

Page 23: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 11

de su origen, haciendo sinapsis con células musgosas (en el orden de 7 a 12 por cada fibra

musgosa), con células en cesto y otras células de la capa polimórfica.

Existen numerosas interneuronas en el giro dentado, destacando las células en cesto,

que se ubican próximas a la capa granular. Las células en cesto son principalmente inhibitorias

de las células granulares. Su importancia radica en que ejercen influencia sobre un gran

número de células granulares.

Otra de las células inhibidoras presentes en el giro dentado son las células en

candelabro, ubicadas en la capa molecular, las cuales que ejercen su influencia en el segmento

inicial de las células granulares (Kosaka, 1983). Además, existe una población de células

inmunoreactivas a somatostatina que proyectan a las dendritas distales de las células

granulares y ejerciendo otro control inhibitorio sobre las mismas (Freund y Buzsáki, 1996).

A diferencia de las células antes señaladas, las células musgosas localizadas en la capa

polimórfica ejercen una influencia excitatoria sobre las células granulares, formando un

circuito de retroalimentación constante. Estas células presentan somas triangulares de gran

tamaño y dendritas proximales cubiertas de largas espinas (Amaral 1978; Ribak y col., 1985;

Amaral y Witer, 1995) (Ver Figura 3). Este efecto excitador, no es solo local, sino que

también se extiende a regiones más apartadas, tanto a nivel septal como temporal.

Capa Molecular

Capa Granular

Hilus

1

2

3 4

5

6

Figura 3. Esquema del giro dentado, en el que se detallan las interneuronas y sus efectos sobre las células

granulares. La numeración corresponde a: (1) Célula granular, (2) Interneurona inmunoreactiva a somatostatina,

(3) Célula en cesto, (4) Célula en candelabro, (5) Célula musgosa, (6) Fibra musgosa. Los colores señalan el

efecto que ejercen sobre la célula blanco, rojo = inhibición, verde = excitación.

Page 24: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 12

Los axones de las células granulosas del giro dentado (ver el número (6) en la Figura

3) tiene la particularidad que inerva a las células piramidales de CA3 e interneuronas a través

de tres tipos de sinapsis anatómicamente diferentes (Acsady y col., 1998; Lawrence y McBain,

2003).

Las sinapsis que se forman entre las fibras musgosas y las células piramidales de

CA3 han sido descritas como largos y complejos terminales musgosos que contienen

numerosos sitios de liberación, alrededor de 35 zonas activas (Henze y col., 2000). En

cambio, las sinapsis que se establecen con las interneuronas del estrato lucidum son sinapsis

pequeñas del tipo en passant. Además existen extensiones filopodiales de los terminales

musgosos (Acsady y col., 1998). Desde el punto de vista anatómico, estas interneuronas se

encuentran en una posición privilegiada para ejercer un control inhibitorio sobre las células

piramidales, ya que contactan con cientos de células piramidales (Claiborne y col., 1986;

Amaral y Witter, 1989; Chicurel y Harris, 1992; Acsady y col., 1998; Lawrence y McBain,

2003).

1.3.4.1 Aferencias al giro dentado

Como se ha señalado anteriormente, el giro dentado recibe su mayor entrada desde la

corteza entorrinal, principalmente de las células estrelladas de la capa II (Schwartz y Coleman

1981). En esta capa II existe una amplia variedad de células denominadas estrelladas,

piramidales, fusiformes, horizontales y bipolares (Schwartz y Coleman, 1981; Klink y Alonso,

1997). De todas ellas, las células estrelladas se localizan preferentemente en la corteza

entorrinal medial. Existe además una pequeña proyección desde las capas profundas de la

corteza entorrinal (IV y VI) a la capa II (Köler, 1985).

La vía perforante es principalmente glutamatérgica, aunque los terminales que

provienen de vía perforante lateral son también inmunoreactivos a encefalinas, mientras que

los terminales de la vía perforante medial son inmunoreactivos a la colecistoquinina (Fredens

y col., 1984).

Algunos autores señalan que el giro dentado recibe aferencias desde la corteza

perirrinal (Liu y Bilkey, 1996); sin embargo, otros investigadores señalan que las proyecciones

de la corteza perirrinal terminarían en las dendritas de las células piramidales de CA1 y no se

Page 25: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 13

proyectarían al giro dentado (Amaral y Witer, 1995; Witter y col., 1999; Dolorfo y Amaral,

1998).

Otras regiones que envían proyecciones al giro dentado tienen una localización

subcortical y corresponden a los núcleos septales, la región supramamilar del hipotálamo

posterior, el locus coeruleus, el área tegmental ventral y los núcleos del rafe (Amaral y Witter,

1995; Johnston y Amaral, 2004). El núcleo septal medial y el núcleo de la banda diagonal de

Broca inervan preferencialmente la capa polimórfica (Johnston y Amaral, 2004). La

proyección de la región supramamilar termina principalmente en la capa molecular y en menor

medida en la zona polimórfica (Pan y McNaughton, 2004).

El núcleo locus coeruleus emite importantes proyecciones noradrenérgicas, las cuales

finalizan principalmente en la capa polimorfica (Swanson y Hartman, 1975). Desde el área

tegmental ventral y el núcleo del rafe medial se envían al giro dentado aferencias

dopaminérgicas y serotoninérgicas, respectivamente, las cuales terminan preferentemente en la

capa polimorfica.

1.3.4.2 Eferencias del giro dentado

El giro dentado no proyecta a otras regiones cerebrales, sólo emite proyecciones a las

células piramidales de CA3, a través de las fibras musgosas. Aunque estas fibras tienen como

principal neurotransmisor el glutamato, se ha descrito que muchas de ellas liberan péptidos

opiáceos de tipo dinorfina y encefalinas, así como GABA (Sloviter y col., 1996).

1.3.5 Hipocampo propio

En el cuerno de Ammón es posible distinguir tres regiones: una región próxima al giro

dentado, donde se localizan células piramidales de gran tamaño, las cuales se conocen como

piramidales de CA3. A continuación se ubica una estrecha región de no más de 250 µm,

donde se localizan las células piramidales de CA2. Finalmente hay una porción más distal

respecto del cuerno de Ammón que contiene células piramidales pequeñas, conocidas como

CA1 (Ribak y col., 1985). A lo largo de todas estas regiones es posible distinguir una bien

definida organización laminar (ver Figura 4).

La superficie de los ventrículos está recubierta por una fina capa de fibras, denominado

alveus (a) o sustancia blanca del hipocampo. Justo por encima se encuentra el estrato oriens

Page 26: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 14

(so), una capa estrecha con baja densidad neuronal que contiene fundamentalmente las

dendritas basales de las células piramidales, cuyos somas definen la siguiente capa, el estrato

piramidale (sp), donde se ordenan de 3 a 6 células en profundidad. Si consideramos la

ubicación anatómica de las células piramidales de CA3, sus árboles dendríticos apicales se

extienden perpendicularmente atravesando tres estratos: el estrato lucidum (sl), el estrato

radiatum (sr) y el estrato lacunosum-moleculare (slm). Estos árboles dendríticos se expanden

en ambas direcciones y por eso, estas células son consideradas multipolares. De los tres

estratos antes mencionados el primero es un estrato acelular estrecho que contiene la región

proximal de las dendritas apicales de las pirámides de CA3, donde contactan los terminales

sinápticos de las fibras musgosas procedentes del giro dentado. El segundo está ocupado por

las dendritas apicales de las células pirámides. Y, finalmente el tercer estrato es la capa más

próxima a la fisura hipocámpica conteniendo las ramificaciones más distales de las dendritas

apicales de las células piramidales. La superficie más externa del hipocampo propio recibe el

nombre de fisura hipocámpica. Esta fisura lo separa del giro dentado y es donde se encuentran

las meninges (Amaral y Witer, 1995; Johnston y Amaral, 2004). En la Figura 4 se muestran en

detalle estos circuitos.

Las células piramidales de CA3 emiten colaterales en dirección a las células

piramidales de CA1, conocidas como colaterales de Schaffer , las cuales proyectan a través de

los estratos radiatum y oriens (Amaral y Witter, 1995). De modo que tanto las dendritas

apicales y basales de CA1 están bajo la fuerte influencia de las piramidales de CA3, se ha

estimado que una célula piramidal de CA1 puede ser inervada por más de 5.000 células

piramidales de CA3 (Amaral y col., 1990). En la rata, las proyecciones comisurales desde

CA3 se envían a las regiones contralateral e ipsilateral, finalizando preferentemente en los dos

estratos antes mencionados. La única proyección fuera del hipocampo de las piramidales de

CA3 es al núcleo septal lateral (Swanson y Cowan, 1977). Este núcleo septal es también el

origen de la principal aferencia subcortical que reciben las células piramidales de CA3, junto

con núcleo de la banda diagonal de Broca; en ambos casos, sus aferencias finalizan en las

interneuronas inhibitorias del estrato oriens (Gaykema y col., 1990). Uno de los aspectos

estructurales más importantes de las células piramidales de CA3 es la existencia de colaterales

que inervan a las propias piramidales de CA3, formando un circuito de retroalimentación, en

el que las terminales sinápticas finalizan en los estratos oriens y radiatum, principalmente.

Page 27: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 15

Figura 4. Citoarquitectura de la formación hipocámpica. ab: haz angular; DG: giro dentado; EC: córtex

entorrinal; fi: fimbria; GL: capa granular; ML: capa molecular; PaS: parasubiculum; pcl: stratum piramidale;

PoDG: capa polimórfica; PrS: presubiculum; S: subiculum; sl: stratum lucidum; slm: stratum lacunosum

moleculare; sr: stratum radiatum (modificado del Amaral y Witter, 1995).

Page 28: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 16

Estas células piramidales reciben también aferencias subcorticales, desde el locus

coeruleus, cuyas fibras finalizan preferentemente en el estrato lucidum y en la región más

superficial del estrato lacunosum-moleculare.

El campo de CA2 ha sido materia de controversia, tiene características que lo asemejan

a los campos de CA3 y CA1. Tiene somas neuronales grandes como en CA3, pero no recibe

inervación de las fibras musgosas, como las células piramidales de CA1. Este campo de

células piramidales de CA2 parece ser más resistente a la muerte celular por epilepsia respecto

de CA3 y CA1 y algunas veces a sido referido como el “sector resistente” (Corsellis y Bruton,

1983). Al igual que las neuronas de CA3, las piramidales de CA2 envían proyecciones a las

piramidales de CA1 (Ishizuka y col., 1990).

En general, las dendritas de las neuronas piramidales están cubiertas con espinas a las

cuales llegan muchas terminales sinápticas excitatorias. El análisis cuantitativo de la

organización dendrítica de las células piramidales del hipocampo indica que las neuronas de

CA3 tiene dendritas de una extensión variable (Ishizuka y col., 1995). Aquellas localizadas

cerca del giro dentado tienden a ser más cortas sus dendritas que aquellas localizadas cerca de

CA1. Megias y col. (2001) calcularon que una típica neurona piramidal de CA1 puede tener

cerca de 30.000 aferencias excitatorias y 1.700 aferencias inhibitorias; en particular, estas

últimas se concentran en la porción proximal de la dendrítica apical (Papp y col., 2001).

Finalmente podemos señalar que las células piramidales de CA1 reciben aferencias de

las neuronas de la capa III de la corteza entorrinal, las cuales se activan a frecuencias de

estimulación diferenciadas (Bartesaghi y Gessi, 2003) y también desde las piramidales de CA3

a través de las colaterales de Schaffer.

Desde el punto de vista electrofisiológico, cuando se activan simultáneamente las

colaterales de Schaffer y la vía perforante se pueden generar diferentes patrones de respuesta

en las piramidales de CA1. El efecto excitatorio de las colaterales de Schaffer sobre las

piramidales de CA1 puede verse muy atenuado cuando es precedido por la estimulación de la

vía perforante, dentro de una bien definida ventana temporal (Dvorak y Schuman, 1999;

Pissadaki y Poirazi, 2007).

De manera que el registro de potenciales de campo extracelulares en CA1, luego de

una estimulación en el borde angular, es muy diferente del que se registra en CA1 cuando se

estimulan las colaterales de Schaffer. Algunos estudios señalan que los registros extracelulares

Page 29: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 17

obtenidos en CA1 serían producto de una transmisión por volumen desde el giro dentado

(Stringer y Colbert, 1994). Otros investigadores han registrado respuestas en CA1 estimulando

a baja frecuencia en la corteza entorrinal, proponiendo que el sistema vía perforante –> CA1

responde a patrones específicos de entrada (Bartesaghi y Gessi, 2003).

Respecto de sus aferencias, las piramidales de CA1 reciben importantes proyecciones

del núcleo reuniens (tálamo) y del núcleo basolateral (complejo amigdaloide), las cuales

proyectan al estrato lacunosum –moleculare. También reciben aferencias noradrenérgicas y

dopaminérgicas de terminación difusa.

Numerosos autores consideran a las células piramidales de CA1 como la vía de salida

del hipocampo. Sus axones emiten dos importantes proyecciones dentro del hipocampo: La

primera es al subiculum (Amaral y col., 1991) y la segunda es hacia las capas profundas de la

corteza entorrinal (Naber y col., 2001). Las proyecciones de las piramidales de CA1 fuera del

hipocampo incluyen varias regiones: la corteza retrosplenial y perirrinal, el área infrarradiata

de la corteza frontal medial, el núcleo olfatorio anterior y el bulbo olfatorio, el núcleo

accumbens, los núcleos basales de la amígdala, distintas áreas hipotalámicas y el área lateral

septal y la banda diagonal de Broca (Amaral y Witer, 1995; Johnston y Amaral, 2004).

1.3.5.1 Interneuronas en el hipocampo propio

Las interneuronas propias del hipocampo han sido generalmente definidas como

neuronas con una influencia restringida a espacios locales que no tiene espinas y liberan

GABA (Buckmaster y Soltesz, 1996).

Las interneuronas hipocampales con sus cuerpos celulares cercanos a las capas de

células piramidales pueden ser clasificadas en tres grupos, en base de sus destinos sinápticos:

Células axo-axónicas, células en cesta y células biestratificadas. Como el nombre indica, las

primeras células hacen sinapsis en el segmento inicial de las neuronas piramidales y pueden

ejercer un fuerte control sobre la iniciación de los potenciales de acción. Las células en cesto

hacen sinapsis con el soma neuronal de las piramidales y, finalmente, las células

biestratificadas hacen contacto sináptico con las dendritas apicales y basales de las neuronas

piramidales.

Aunque hay muy poco solapamiento en sus regiones de destino, las dendritas de los

tres tipos celulares proyectan a los estratos oriens y radiatum y pueden recibir entradas

Page 30: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 18

excitatorias desde las colaterales de Schaffer, fibras de asociación comisural y colaterales

desde las mismas piramidales que están ubicadas próximas a las interneuronas.

Hay también conexiones inhibitorias mutuas entre estas interneuronas. Se piensa que

estas conexiones inhibitorias permitirían sincronizar a las interneuronas para producir

oscilaciones a varias frecuencias, incluyendo los ritmos theta y gamma.

Un nuevo grupo celular descrito recientemente (Price y col., 2005) lo constituyen

interneuronas con forma de neuroglia, las cuales tiene dendritas cortas y estrelladas que

proyectan al estrato lacunosum-moleculare. Estas interneuronas responden a la llegada de

aferencias de la vía perforante, originada en la capa III de la corteza entorrinal. Además, existe

un alto grado de conectividad entre ellas, lo que permitiría su activación sincrónica (Pissadaki

y Poirazi, 2007).

El efecto de la actividad de las interneuronas no debe restringirse al hipocampo en

exclusiva, debido a que existen poblaciones de interneuronas GABAérgicas que proyectan

fuera del hipocampo (por ejemplo, neuronas inhibidoras del hipocampo a los núcleos septales)

(Freund y Buzsáki, 1996; Maccaferri y Lacaille, 2003).

1.3.5.2. Citoarquitectura hipocampal

Andersen y colaboradores (1971) acuñaron el término “circuito trisináptico”

enfatizando la progresión unidireccional de las entradas excitadoras al hipocampo (Andersen y

col., 1971). Sin embargo en los estudios de Berger y col., se amplía esta visión de un circuito

trisináptico, describiendo la existencia de aferencias que son mono-di- y trisinápticas desde la

corteza entorrinal al hipocampo propio.

De modo simplificado podemos señalar que la corteza entorrinal se considera el punto

de partida del circuito, debido a que mucha de la información sensorial que recibe el

hipocampo entra a través de la corteza entorrinal. Gran parte de las aferencias sensoriales que

recibe la formación hipocampal se origina en dos áreas corticales adyacentes: las cortezas

peririnal y postrinal (parahipocampal, en el primate), las cuales reciben importantes aferencias

desde cortezas asociativas. Estas entradas a la corteza entorrinal son generalmente excitatorias

(Martina et al., 2001). Para este punto ver Figura 2.

Page 31: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 19

Figura 5. Esquema de la ubicación de las principales interneuronas presentes en el hipocampo, en relación con: a)

la posición de la célula piramidal y los distintos estratos, y b) los diferentes tipos de neurotransmisores. (Tomado

de McBain y Fisahn, 2001).

Como se indica más arriba, en la organización citoarquitectónica del hipocampo se ha

podido establecer que existen proyecciones bien delimitadas, las cuales forman un circuito

trisináptico, en el que básicamente se consideran las relaciones que se establecen entre las

células del giro dentado y las piramidales de CA3 y CA1.

Como señalamos anteriormente, la corteza entorrinal constituye el punto de partida de

la información que ingresa al hipocampo, originándose principalmente de las capas II y III,

desde donde las células estrelladas y piramidales de proyección allí localizadas envían sus

axones, los cuales formarán la vía perforante (Chrobak y col., 2000). Un aspecto interesante es

que estás neuronas de proyección de la corteza entorrinal tienen potenciales de membrana

oscilantes, lo cual les permite generar patrones rítmicos (Chrobak y col., 2000).

Page 32: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 20

La vía perforante hace sinapsis con las células granulares del giro dentado y los axones

de ellas se proyectan a la región de CA3 del hipocampo propio, haciendo contacto sináptico

principalmente con las dendritas basales localizadas en el stratum lúcidum. El circuito

continúa con las proyecciones de las colaterales de Schaffer que van a conectar con las

dendritas de las células piramidales de CA1.

El cierre del circuito lo constituyen los axones de las células piramidales de CA1 que

proyectan principalmente a las capas profundas de la corteza entorrinal, en la misma zona

donde se originó la aferencia- También pueden hacerlo de manera indirecta a través del

subiculum. Este circuito por lo tanto permitiría la integración en serie de la información que

llega al hipocampo (Iijima et al., 1996).

El circuito adquiere mayor complejidad cuando consideramos que la corteza entorrinal

puede enviar proyecciones que activan directamente las neuronas del campo CA1 (Bartesaghi

y Gessi, 2003)

La capacidad de constituir un circuito reverberante entre la corteza entorrinal y el

hipocampo podría contribuir a la construcción de memorias a largo plazo.

1.3.5.3 Complejo subicular

El complejo subicular es un importante componente de salida de la formación

hipocampal. Se divide usualmente en tres regiones corticales citoarquitectónicamente

diferentes situadas entre el hipocampo y la corteza entorrinal: el subiculum propio, el

presubiculum y parasubiculum. El subiculum es el más próximo al hipocampo y se considera

generalmente como la principal estructura de salida de la formación hipocámpica. El

presubiculum y parasubiculum, situados a continuación, se consideran las principales entradas

de información desde el tálamo (Amaral y Witter, 1995; O’Mara y col., 2001; O’Mara 2006).

El subiculum propio está constituido por tres capas: una capa molecular, una capa que

es la continuación del estrato lacunosum moleculare y radiatum y una extensa capa de células

piramidales. Estas células piramidales forman un denso plexo local, que conforma una

organización columnar. Rodeando a estas células hay una alta densidad de pequeñas células

que se consideran como interneuronas subiculares. (Harris y col., 2001; O’Mara 2006).

Dentro de la columna, las células profundas emiten axones colaterales que proyectan a las

dendritas apicales, conformando un patrón de activación columnar. Por otro lado, las células

Page 33: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 21

superficiales emiten axones que recorren largas distancias permitiendo la organización a través

de columnas (Harris y col., 2001). Desde el punto de vista de su actividad eléctrica, las células

piramidales de las capas profundas, tienden a descargar en ráfagas de potenciales de acción, en

cambio las piramidales superficiales lo hacen en espigas (Harris y col., 2001; O’Mara 2006).

Las principales aferencias al subiculum provienen de las células piramidales de CA1,

corteza entorrinal, corteza perirrinal y prefrontal. El subículum recibe también importantes

aferencias de cortezas secundarias y terciarias (O’Mara 2006). Desde el punto de vista de sus

conexiones subcorticales, el subiculum establece contactos recíprocos con el núcleo

premamilar ventral, el núcleo del septum medial, el núcleo de la banda diagonal de Broca, los

núcleos talámicos anteroventral y anteromedial y el núcleo del rafe medial.

Str. Oriens

Str. Pyr

Str. Radiatum

Str. Lac-Mol

Subiculum

C A1

C A 2

Col. Schaffer

NMDAR 2A y 2B

Mossy Fiber

IV

V

VI

Inner Outer

C A 3

Hilus

Perforant Path

Str. Gr

Str. Molec

NMDAR 2A y 2B

NMDAR 2A y 2B D.G.

Figura 6. Esquema de las interconexiones del hipocampo. Se ilustran básicamente las aferencias a través de

la vía perforante, los diversos tipos celulares en giro dentado (DG) y en las áreas piramidales de CA3 y CA1 y

la organización laminar del hipocampo.

Page 34: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 22

1.3.5.4 Principales aferencias y eferencias de la formación hipocampal

Las eferencias del hipocampo proyectan por el alveus constituyendo la fimbria del

fornix, la cual asciende en su región posterior para proyectarse hacia adelante y hacia abajo,

conformando las columnas del fornix. En su trayecto envía eferencias a los núcleos septales

para finalizar en los cuerpos mamilares del hipotálamo. Por otra parte, existen fibras que se

cruzan al hemisferio contralateral en una posición caudal respecto del área septal formando la

comisura ventral hipocámpica (Amaral y Witter, 1995). Además hay una segunda comisura,

denominada comisura dorsal del hipocampo, la cual envía fibras a las regiones de

presubiculum y parasubículum, además de la corteza entorrinal. Estas fibras comisurales se

unen con las fibras de la vía perforante ipsilateral formando en conjunto el denominado haz

angular (Amaral y Witter, 1995). Entre las aferencias que recibe el hipocampo están las fibras

originadas desde los núcleos del septum medial y la banda diagonal de Broca, también recibe

aferencias desde la corteza perirrinal, aunque es escasa y de baja importancia (Witter y col.,

1999).

1.4 PLASTICIDAD SINÁPTICA EN EL HIPOCAMPO

Como he señalado en apartados anteriores, el hipocampo es una de las estructuras más

estudiadas en los últimos años. Esto se debe, en parte, a su participación en la formación de

nuevas memorias episódicas y en el almacenamiento de recuerdos a largo plazo (Neves y col.,

2008).

Esta formación de nuevas memorias está en intima relación con la propiedad del tejido

nervioso de experimentar plasticidad sináptica, concebida como la capacidad de modificar la

actividad neural de un circuito neuronal por acción de una experiencia y que conduce a

modificaciones en los pensamientos, sensaciones y finalmente en la conducta (Citri y

Malenka, 2008).

La plasticidad neuronal se refiere específicamente a un cambio, dependiente de la

actividad, en la fuerza o eficacia de la transmisión sináptica (Citri y Malenka, 2008). De

manera que es posible identificar diferentes tipos de plasticidades sinápticas, desde aquellas

que se expresan en aumentos o descensos en la actividad expresados en milisegundos a horas,

días o semanas, a aquellas que implican cambios mucho más duraderos (Citri y Malenka,

2008).

Page 35: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 23

En el hipocampo se han podido estudiar muchos de estos tipos de plasticidad sináptica,

empleando técnicas de registro intracelular (Skrede y Westgaard, 1971), cultivos celulares de

neuronas del hipocampo (Banker y Cowan, 1977; Gahwiler, 1981), o registros de su actividad

in vivo durante pruebas de aprendizaje (Gruart y col., 2006; Whitlock y col., 2006; Valenzuela

y col., 2007). Como señalan en su revisión Citri y Malenka, 2008, por definición la plasticidad

sináptica es un fenómeno electrofisiológico y sólo con el registro de las respuestas

electrofisiológicas se puede determinar si una sinapsis se ha modificado.

Aunque existen numerosas formas de plasticidad sináptica en el cerebro de los

mamíferos, centraremos nuestra descripción en aquellas que son consideradas como

plasticidades sinápticas de corto y largo plazo.

En el primer caso, la plasticidad de corto plazo contempla cambios en el rango de

milisegundos a minutos y desempeñarían un papel en adaptaciones rápidas, formas de

memoria de corto plazo y cambio transitorios de conducta (Citri y Malenka, 2008). Los

protocolos más utilizados consisten en breves descargas que incrementan las concentraciones

de Ca++ intracelular, en el terminal presináptico, el cual aumenta la probabilidad de libración

de las vesículas. En la prueba de facilitación o depresión por pares de pulsos, se observa que a

intervalos cortos (20 ms) el efecto en la segunda respuesta es de depresión, básicamente por la

desactivación de canales de sodio y/o calcio del tipo voltaje dependientes, lo cual afecta la

sumación temporo-espacial para el segundo estímulo. Si, en cambio, el intervalo

interestímulos se incrementa (20 – 500 ms), se observa una facilitación en la segunda

respuesta. La explicación estaría en la cantidad de Ca++ residual que se mantiene en el terminal

y que se sumarían al ingreso de Ca++ en el segundo estímulo, produciendo una mayor

liberación de vesículas.

Para el caso de plasticidad sináptica de larga duración, dos son los ejemplos más

conocidos desde el punto de vista molecular y electrofisiológico. El primero de ellos fue

descubierto en 1973 es una forma de plasticidad sináptica llamada potenciación a largo plazo

(LTP, del inglés Long Term Potentiation) y consiste en un aumento en la potencia sináptica

que puede durar horas o incluso días por la acción de una estimulación repetitiva previa (Bliss

y Lømø, 1973; Bliss y Gardner-Medwin, 1973). Existen en el hipocampo dos formas distintas

de LTP, una de ellas contempla la participación de receptores de glutamato del tipo NMDA

(N-metil-D-aspartato) y la otra es una LTP independiente del receptor de NMDA y que se

Page 36: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 24

presenta en las sinapsis de giro dentado con las células piramidales de CA3 (Nicoll y Malenka,

1995).

En términos generales, los tipos de receptores de glutamato se pueden dividir en dos

grandes grupos: los ionotrópicos y los metabotrópicos. En el primer grupo encontramos

aquellos que son activados por NMDA y los que son activados por α-amino-3-hidroxi-5-metil-

4-isoxazolepropionato (AMPA) también denominados receptores de quisqualato/kainato.

Estos dos tipos de receptores presentan diferencias en sus características electrofisiológicas y

farmacológicas y en lo que respecta a su participación en la LTP (Dingledine y col., 1999).

En el segundo grupo, encontramos los receptores metabotrópicos (mGluRs). Estos

receptores modulan los estados de excitación e inhibición en la transmisión sináptica a

través de la interacción con canales operados por voltaje por la vía de segundos mensajeros

(Ben-Ari y Aniksztejn, 1995; Anwyl, R. 2006).

La LTP dependiente de los receptores de NMDA se ha estudiado profusamente en las

células piramidales de CA1. En ella se pudo determinar que tiene tres características muy

importantes: es asociativa, cooperativa y tiene especificidad (Nicoll y col., 1988). La

asociatividad se refiere a la capacidad de potenciar una aferencia débil cuando es activada en

asociación con una aferencia fuerte. La cooperatividad se refiere a que la LTP puede ser

inducida cuando se activa coincidentemente un número crítico de sinapsis. Finalmente la

especificidad se refiere a que sólo aquella sinapsis estimulada, y no las adyacentes, es la que

experimenta la LTP.

En el caso de la LTP que es dependiente de los receptores de glutamato del tipo

NMDA, se ha visto que co-localiza con receptores glutamatérgicos del tipo AMPA. Estos

últimos son receptores/canales permeables a cationes (Na+ y K

+) y con baja conductancia

iónica (4-5 pS), siendo los principales responsables de las corrientes de entrada que generan

las respuestas sinápticas excitatorias. En cambio, los receptores NMDA en condiciones de

reposo de la célula, están bloqueados por iones extracelulares de magnesio, de modo que

contribuyen muy poco a la respuesta postsináptica durante el estado basal. Sin embargo,

cuando la célula se despolariza, el magnesio es liberado de la escotadura del canal y permite

que por la acción conjunta del ligando endógeno, glutamato, más el agonista glicina, el canal

se abra y permita el ingreso inespecífico de iones de Na+, Ca

++ y la salida de K

+. Como es un

canal que posee una elevada conductancia iónica (50 pS) su efecto sobre la despolarización

Page 37: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 25

postsináptica es muy importante (Nowak y col., 1984; Mayer y col., 1984; Luo y col. 1997;

Mayer, 2005; Bartlett y col., 2007).

Los mecanismos moleculares que subyacen a la inducción de la LTP consideran la

participación de receptores sinápticos. Numerosa evidencias señalan que el glutamato es el

principal neurotransmisor excitatorio presente en el hipocampo y que varios tipos de

receptores de glutamato han sido relacionados con el fenómeno de la LTP (Eichenbaum y

Cohen, 2004). Durante los últimos años ha existido dos puntos de vista, el primero señala que

el mecanismo responsable sería un cambio en la expresión y propiedades de receptores de tipo

AMPA postsinápticos y el segundo postula que habrían cambios en la probabilidad de

liberación del neurotransmisor (Citri y Malenka, 2008). La aparición de la hipótesis de

sinapsis silenciosas inclinó las preferencias a la primera opción, de modo que durante la LTP

hay cambios en las densidades postsinapticas que corresponderían a tráfico de receptores del

tipo AMPA (Bredt y Nicoll, 2003; Kauer y Malenka, 2006; Derkach y col., 2007; Citri y

Malenka, 2008)

Figura 7. Modelo del tráfico de receptores del tipo AMPA durante los procesos de LTP y LTD. Durante el estado

basal, los receptores de NMDA y AMPA se van reciclando en las regiones adyacentes a la zona activa. Cuando se

induce la LTP (izquierda de la figura) hay un aumento de receptores modulado por la acción de la CaMKII y la

proteínas Rab 11a. Para el caso de la LTD (derecha de la figura) hay un aumento de la endocitosis de receptores

del tipo AMPA, donde participan la calcineurina, clatrina y la proteína fosfatas 1 (Tomado de Citri y Malenka,

2008).

Page 38: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 26

De esta manera, el efecto inicial de la aplicación de trenes de alta frecuencia es activar

los receptores AMPA, los cuales despolarizan la membrana y eso permite el desbloqueo de los

receptores NMDA, aumentando los niveles de Ca++ intracelular (Raymond, 2007). Esta

activación de los receptores de NMDA requiere, por tanto, que exista simultáneamente

liberación de glutamato desde el terminal presináptico y una despolarización postsináptica, así

pues, el receptor de NMDA sirve como un detector de coincidencias que correlaciona las

actividades pre y post sinápticas (Poncer, 2003).

Las concentraciones elevadas de Ca++ intracelular constituyen una etapa importante en

la generación de la LTP, debido a la presencia de enzimas como la calmodulina, que en

presencia de Ca++ forma un complejo denominado calcio-calmodulin-kinasa II (CaMKII) el

cual posee propiedades de autofosforilación con lo cual puede promover cambios en la

densidad postsináptica favoreciendo la inserción de receptores AMPA y/o incrementando la

conductancia de canales iónicos, o fosforilando proteínas importantes en la plasticidad

sináptica (Izquierdo y Medina, 1997; Nicoll y Malenka, 1999; Bayer y col., 2001; Pittenger y

Duman, 2008).

Para la LTD (LTD, del inglés Long Term Depression), también existen diversos tipos,

algunas pueden ser inducidas farmacológicamente ó eléctricamente. En el caso de las

primeras, se realiza por intermedio de receptores metabotrópicos de glutamato (Malenka y

Bear, 2004) y en las segundas, se generan por estimulación a baja frecuencia en períodos de 5

a 15 minutos (Braunewell y Manahan-Vaughan, 2001). El efecto de dicha estimulación se

observa de inmediato en la sinapsis y puede persistir de días a semanas en animales in vivo

(Manahan-Vaughan y Braunewell, 1999; Kemp y Manahan-Vaughan, 2004).

En la región de CA1 del hipocampo la LTD que se genera es dependiente de

receptores de NMDA y de la síntesis de nuevas proteínas, es además una LTD homosinaptica,

lo cual significa que se expresa en la sinapsis que recibe la estimulación tetanizadas (Dudek y

Bear, 1992). En el giro dentado, en cambio, la LTD es independiente de la presencia de

receptores de NMDA y de la síntesis de nuevas proteínas, además se puede ser del tipo homo

y heterosináptica (Doyere y col., 1997; Abraham y col., 2006; Poschel y col., 2007), en el

último caso, la LTD se desencadena en aferentes que convergen sobre una población neuronal

postsináptica tetanizada, pero en ausencia de tétanos.

Page 39: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 27

Los protocolos para generar una LTD varían dependiendo de la región cerebral que se

estudie, algunas veces es necesario aplicar estímulos del alta frecuencia (HFS, del inglés high

frequency stimulation) (Lee y col., 2000). Sin embargo en el hipocampo el protocolo más

utilizado considera una tetanización a baja frecuencia (600 – 900 pulsos) (O’Keefe y Nadel,

1978), el cual produce una reducción persistente de la eficacia sináptica. El hipocampo varía

su umbral de inducción a la LTD en función de la edad, siendo más difícil producir una LTD

en animales adultos que en los juveniles. En la Figura 8 se detallan algunos de los mecanismos

aceptados respecto del efecto de los distintos protocolos de estimulación y el mecanismo

molecular implicado.

Figura 8. La aplicación de una protocolo de estímulos de alta frecuencia activa la CaMKII el cual fosforila a

la Serina 831 del receptor AMPA, produciendo una LTP. Si se aplica un protocolo de baja frecuencia de

estimulación, se activa las proteínas fosfatasas 1/2ªA, las cuales desfosforilan la Serina 845 y se produce una

LTD (tomado de Lee y col., 2000).

En resumen, tanto la LTP como la LTD son dependientes de incrementos

postsinapticos de calcio regulados por receptores de NMDA (Mulkey y Malenka, 1992). La

hipótesis más aceptada es que las propiedades cuantitativas de las señales de calcio dentro de

la espina dendrítica, determinan si se genera una LTP o una LTD: si la concentración de calcio

es mínima, se genera una LTD, en cambio si las concentraciones sobrepasan valores críticos se

produce una LTP (Cummings y col., 1996; Malenka y Nicoll, 1993; Bliss y Schoepfer, 2004),

de modo que al conocer estas interrelaciones con el calcio, numerosos estudios han tratado de

Page 40: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 28

establecer la relación entre las propiedades de la LTP/LTD y las de la memoria (Morris, 1989;

Poncer, 2003; Wang y col., 2006).

1.5 MEMORIA Y APRENDIZAJE

Los procesos de memoria y aprendizaje están íntimamente relacionados. Cuando se

somete al sistema nervioso a experiencias, hay modificaciones en la fisiología e incluso

morfología de las neuronas que se reflejan en conductas, muchas de ellas adaptativas.

Podemos señalar por tanto que el aprendizaje es el proceso por el cual el individuo adquiere

nueva información y la memoria sería el proceso que permite que dicha información sea

almacenada, recuperada y utilizada por períodos variables de tiempo (Thorpe, 1963; Navarick

D.J., 1979; Squire, 1987; Gazzaniga y col., 1998; Kandel y col., 2000; Carlson N., 2006). Si

dicha información se mantiene por períodos breves de tiempo se considera como memoria de

corto plazo, en cambio si es almacenada por intervalos más prolongados se denomina

memoria a largo plazo (Squire, 1987; Gazzaniga y col., 1998; Saavedra, 1999; Tranel y

Damasio, 2000; Kandel y col., 2000).

El desarrollo de las actuales teorías del aprendizaje tienen una fuerte influencia de la

filosofía empirista británica y de las teorías asociacionistas. Básicamente, dichos filósofos

postulaban que la mente del hombre era “una tabla rasa” sobre la cual la experiencia dejaría su

legado. Los asociacionistas consideraban dos condiciones para establecer una asociación. Una,

que si las sensaciones se dan en cortos períodos de tiempo y son contiguos, tienden a

asociarse. Por otro lado está la frecuencia, entendida como el número de eventos por unidad de

tiempo. Así al ser más alta la frecuencia, más consistente es la asociación.

Para entender los postulados del asociacionismo, el condicionamiento clásico surge

como una herramienta de extraordinaria utilidad, haciendo una clasificación de los

aprendizajes en: a) No asociativos: Habituación y sensibilización (o

seudocondicionamiento). Son las dos formas menos complejas de aprendizaje. En la

habituación el animal se expone repetidamente a un estímulo inocuo, lo que conlleva una

disminución progresiva de su respuesta refleja. Por otro lado, en la sensibilización ocurre el

proceso inverso: hay un incremento de la respuesta refleja como resultado de la

presentación de estímulos de diferente naturaleza, que sean precedidos por otros estímulos

Page 41: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 29

intensos o nocivos (Navarick D.J., 1979; Morgado, 1998; Saavedra 1999; Kandel et al.,

2000) b) Asociativas: Dentro de ellas encontramos el condicionamiento operante o

instrumental, donde se produce la asociación en una respuesta conductual específica y una

consecuencia reforzadora. Aquí el animal realiza actos que le permiten reforzar o atenuar la

probabilidad de expresar una conducta. También se encuentra bajo esta clasificación el

condicionamiento clásico o Pavloviano, en 1904 Iván Petrovich Pavlov (1849 –1936)

investigó y describió los reflejos condicionados, un fenómeno que centró todo su interés ,

realizando fructíferos aportes a lo largo de su vida. En este tipo de condicionamiento se

busca formar una asociación entre un estímulo inicialmente neutral y un evento. Pavlov

descubrió que un perro podía presentar el condicionamiento de salivación, cuando es

sometido al entrenamiento de una respuesta ante un estímulo auditivo, que va seguido de un

trozo de carne. Si el experimentador hace sonar un timbre inmediatamente antes de poner la

carne cerca del perro, la repetición de esta secuencia hará que el sonido sea el que genere la

respuesta de salivación (Navarick D.J. 1979; Rosenzweig y Leiman, 1997; Saavedra, M.A.

1999; Kandel y col., 2000).

Para obtener la salivación, que es la respuesta condicionada, la repetición de la

secuencia varias veces, permite que el animal establezca la asociación entre los dos eventos,

extrayendo de ellos “la información que un estímulo entrega sobre el otro” (Saavedra, 1999).

De modo que el sonido se transforma en una “señal” del alimento y el perro responde a él

como si el alimento estuviese presente.

En el presente estudio, la respuesta condicionada corresponde al registro

electromiográfico del cierre palpebral. Este registro representa la variable dependiente que es

la que se analiza. En este registro, se puede medir la amplitud de la respuesta condicionada, así

como la latencia de inicio de dicha respuesta condicionada. También se puede medir la

latencia a la amplitud máxima de la respuesta, el porcentaje de respuestas condicionadas en

una sesión y, finalmente, la resistencia a la extinción.

En la Figura 9 se muestra el diseño básico del condicionamiento clásico o

pavloviano.

Page 42: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 30

A

Estímulo Neutro

Sin salivación

EstímuloNeutro

Estímulo Incondicionado

Salivación

Estímulo Incondicionado Salivación

+

B

Estímulo Neutro (despuésde emparejarlos)

Salivación

Figura 9. Esquema del modelo tradicional del condicionamiento clásico de Pavlov. A. Fotografía de Iván Pavlov observando las respuestas en uno de sus animales de experimentación. B. En el protocolo del condicionamiento el

estímulo neutro corresponde al sonido de una campana, la cual no produce respuesta en el animal, en el período

de condicionamiento se presentan los estímulos neutro (campana) e incondicionado (carne) pareados y se produce

la respuesta de salivación, finalmente en el período post condicionamiento, la sola exposición de la campana

(ahora estímulo condicionado) y se produce la salivación, demostrando que el animal fue capaz de aprender a

asociar el sonido de la campana con la llegada del alimento.

Page 43: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 31

La formación de la respuesta condicionada se construye sobre la base del reflejo

incondicionado, estableciéndose una asociación entre el estímulo condicionado y

incondicionado. Sin embargo, hay límites biológicos en la contigüidad temporal entre el

estímulo condicionado e incondicionado para producir la respuesta condicionada, los cuales se

detallarán más adelante.

El condicionamiento clásico del reflejo corneal es un tipo de aprendizaje motor que

depende del hipocampo y del cerebelo (Takehara 2002; McCormick y col., 1982). Como se

señalo anteriormente, es un tipo de modelo extensamente utilizado y que ha permitido estudiar

los mecanismos electrofisiológicos asociados al aprendizaje motor, como también conocer los

circuitos neuronales implicados (Gormezano, 1965, 1966; Gormezano y col., 1983; Gruart y

col., 1994, 2000; 2006; Thompson y Kim, 1996; Thompson, 1986, 1988; Bao, et al., 1998;

Weiss et al., 1999; Trigo y col., 1999; Ramnani y col., 2000; Múnera y col., 2001; Valenzuela-

Harrington y col., 2007). Como se describió en párrafos anteriores, este modelo considera la

presencia de un estímulo condicionado neutro (un tono), que es emparejado con un estímulo

incondicionado, generalmente aversivo (choque eléctrico, soplo de aire, etc). Entre ambos

estímulos se establecen distintas relaciones temporales (Gormezano y col., 1983). Estas

relaciones temporales en los estímulos condicionado e incondicionado son las que caracterizan

a los diferentes tipos de paradigma. En el estudio del condicionamiento clásico del reflejo

corneal hay dos paradigmas fundamentales y que son los más utilizados: el paradigma de

retraso o demora y el paradigma de traza o huella.

En el paradigma de retraso ambos estímulos se solapan temporalmente y deben

terminar idealmente juntos (ver Figura 10). El intervalo interestímulos depende del tipo de

especie en estudio, siendo el rango óptimo para el caso de los roedores entre 250 y 500 ms

(Thompson, 1989; Gruart, 1993; Clarke y col., 1996).

En el paradigma de traza, el estímulo condicionado y incondicionado están separados

por intervalos variables de tiempo (Takehara, 2002). Los rangos de intervalos más empleados

varían entre 150 y 2000 ms para el entrenamiento (Steinmetz, 2000). Sin embargo, la duración

de estos intervalos es específica para cada especie. Los humanos tienen respuestas

condicionadas a intervalos mayores que los conejos y estos a su vez mayores que las ratas

(Power y col., 1997).

Page 44: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 32

EC

EI

Paradigma de traza

Paradigma de retraso

EC

EI

Figura 10. Dos tipos de paradigmas empleados en el condicionamiento clásico. En el paradigma de traza existe

una separación tempral entre el estímulo condicionado y el incondicionado. En el paradigma de retraso, ambos

estímulos comienzan a intervalos distintos pero finalizan simultáneamente. Abreviaturas: EC: Estímulo

Condicionado; EI: Estímulo Incondicionado.

A través de la asociación entre el estímulo condicionado y el estímulo incondicionado,

este último es capaz de elicitar una respuesta denominada respuesta condicionada, (Lee y Kim,

2004, Jimenez-Díaz, 2003). Sin embargo, si el estímulo condicionado es presentado en

repetidas oportunidades en ausencia del estímulo incondicionado, la probabilidad de que

ocurra la respuesta condicionada disminuye, lo cual se conoce como extinción. (Gormezano,

1965, 1966; Kandel et al., 2000). Es importante señalar que la generación de esta respuesta

condicionada no solo depende de la proximidad entre el estímulo condicionado y el

incondicionado, sino que también debe existir una relación de contingencia, lo que implica

una verdadera posibilidad de ocurrencia inmediata del estímulo incondicionado (Rescola,

1988, Kandel y col., 2000); además, hay que considerar que la respuesta condicionada se

produce en el intervalo de tiempo que sigue a la aparición del estímulo condicionado, es en

este período donde queda la huella que permite al animal asociar ambos estímulos.

Considerando que a intervalos mayores de 500 ms las ratas no son capaces de

generar una respuesta condicionada (Thompson 1989; Power y col., 1997; Domingo y col.,

1997), y por los experimentos previos realizados en nuestra División de Neurociencias, se

seleccionó para nuestro modelo experimental el rango libre de estímulos de 300 ms

(Múnera, 2001; Gruart y col., 2006; Valenzuela-Harrington y col., 2007).

Page 45: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 33

1.5.1. Parámetros analizados en pruebas de aprendizaje asociativo

En una situación de aprendizaje, el animal se expone a una tarea que debe aprender.

Hay dos formas de aprender: i) la tarea problema, donde los animales deben explorar la

situación, ejemplo un laberinto T, y encontrar la solución y ii) la tarea lección aquí el animal

no explora y sólo aprende una respuesta. En los aprendizajes asociativos, el condicionamiento

instrumental implica una tarea problema y el condicionamiento clásico una tarea lección.

El esquema general de un experimento sobre aprendizaje, transferencia o memoria está

constituido por tres etapas: a) La actividad que produce el aprendizaje, b) Un intervalo de

tiempo, y c) En sentido general, un recuerdo, que demuestra el post efecto del aprendizaje.

El tiempo de intervalo entre la actividad y el recuerdo puede variar: si es largo,

estamos frente a un experimento de memoria, si es corto, es un experimento de adquisición.

Dentro de ese contexto, el utilizar un intervalo muy breve minimiza el olvido. A medida que el

animal se expone regularmente a la tarea, se van produciendo respuestas que representarán una

“curva de aprendizaje”. Esta curva es una relación funcional entre dos o más datos que han

sido procesados.

Se puede extraer mucha información al analizar la curva de aprendizaje. A medida que

transcurren los días, las respuestas van cambiando, al hacerse más conocida la tarea por los

sujetos experimentales Por ejemplo, si se considera la pendiente, ésta representa la tasa de

aprendizaje, que es la proporción de aprendizaje en el tiempo. También se pueden considerar

el número de ensayos que debe emplearse para llegar a un criterio de aprendizaje pre-

establecido. También, en estas curvas se puede graficar un reaprendizaje, donde se señalarán

la cantidad de ensayos necesarios para volver a obtener el porcentaje de aprendizaje pre-

establecido, de esta manera obtendremos una medida de la cantidad de olvido producida

(Stevens, 1951).

En la Figura 11 se muestra un ejemplo de curva de aprendizaje, mediante

condicionamiento clásico del reflejo palpebral en ratas. Se muestra el porcentaje de respuestas

condicionadas obtenidas durante las sucesivas sesiones de habituación, condicionamiento y

extinción en animales condicionados y pseudocondicionados.

Page 46: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 34

Figura 11. Esquema de una curva de aprendizaje donde se representa el número de días versus el porcentaje de

respuestas correctas obtenidas en dos animales distintos, los con en círculo relleno son los controles y que se

sometieron a pruebas de condicionamiento clásico y los demarcados en círculos sin relleno que son los animales

pseudocondicionados.

1.5.2. Estructuras nerviosas implicadas en el condicionamiento clásico del reflejo corneal

El condicionamiento clásico del reflejo corneal ha sido extensamente utilizado para

identificar los sustratos neuroanatómicos del aprendizaje asociativo (Steinmetz, 2000;

Woodruff-Pak y Steinmetz, 2000; Delgado-García y Gruart, 2006). Existen estudios donde se

sugiere que ciertas estructuras neuronales serían las responsables exclusivas de la generación

de la respuesta condicionada (Yeo y Hardiman, 1992; Llínas y Welsh, 1993; Bloedel y

Bracha, 1995); sin embargo, también existen propuestas que señalan la existencia de varías

estructuras neuronales que participarían de manera conjunta en la formación de la respuesta

condicionada (Krupa y col., 1993; Thompson y Kim, 1996; Steinmetz, 2000; Delgado-García

y Gruart, 2002, 2006; Jiménez-Díaz y col., 2004, Bloedel y col., 2007).

Las primeras propuestas respecto del circuito del aprendizaje señalaban que las

primeras aferencias (del estímulo incondicionado, o sea, del soplo de aire) llegarían a los

núcleos olivares inferiores contralaterales y desde aquí se proyectarían a través de las fibras

trepadoras hacía la corteza cerebelosa, haciendo sinapsis con las células de Purkinje. En su

1 4Habituation

1 1Conditioning Extinction

5 510

Con

ditio

ned

resp

onse

s (%

)

Page 47: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 35

trayecto a la corteza, las fibras trepadoras emiten colaterales excitatorias a los núcleos

profundos del cerebelo (Marr, 1969; Matsushita y Ikeda, 1970; Albus 1971; Thompson, 1986).

En el caso del estímulo condicionado, provenientes de las células ciliadas de la cóclea

(en el caso del sonido), hacen sinapsis con los núcleos del puente desde donde surgen las

fibras musgosas. Estás últimas al igual que las fibras paralelas también hacen un relevo a los

núcleos profundos del cerebelo (Tsukahara y col., 1968; Ito y col., 1970) previo a su llegada a

la corteza cerebelosa, específicamente a la capa granular, donde hacen sinapsis con un

complejo denominado “glomérulo cerebeloso”. El complejo está constituido por las dendritas

de las células de los granos y los axones de las células de Golgi. Son los axones de las células

de los granos que en la capa molecular de la corteza cerebelosa pasan a denominarse fibras

paralelas, los que hacen sinapsis con las dendritas de las células de Purkinje, de modo que

ambas fibras extracerebelosas están influenciando directa e indirectamente la actividad

sináptica de la única vía de salida de la corteza cerebelosa, la célula de Purkinje (Carpenter,

1994).

Entre los núcleos profundos de cerebelo, el interpósito ha sido propuesto como una

estructura esencial en el aprendizaje del condicionamiento clásico, basándose

fundamentalmente en estudios de lesiones, de modo que si la estructura es responsable de la

respuesta condicionada, su eliminación supondrá la imposibilidad de adquirirla (McCormick y

col., 1981,1982; Lavond y col., 1985; Yeo y col., 1985; Weisz y Lo Turco, 1988; Steinmetz y

col, 1992, Krupa y col., 1993; Clark y Lavond, 1994; Chen y col., 1999) sin embargo cuando

se produce una lesión pueden afectarse otras vías de comunicación entre el cerebelo y el

tronco encefálico (Yeo y co., 1985) o activarse mecanismos de compensación. Además, puede

disfacilitarse la respuesta aprendida, lo que impide su expresión.

Además del cerebelo han sido propuestos varios núcleos del tronco encefálico, como el

núcleo rojo, la formación reticular, los núcleos del puente, como estructuras implicadas en la

formación de la respuesta condicionada (Chapman y col., 1990; Irwin y col., 1992; Welsh y

Harvey, 1998). Aparte de estas estructuras subcorticales, también se ha documentado la

participación de estructuras corticales como la amígdala, el hipocampo y otras zonas de la

corteza cerebral. De entre las estructuras corticales, el hipocampo ha sido destacado como una

estructura importante en este tipo de aprendizaje asociativo (Thompson, 1986; Woody, 1986;

Thompson y Krupa, 1994; Múnera y col., 2001; Gruart y col., 2006; Valenzuela-Harrington y

Page 48: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Introducción 36

col., 2007, Green y Arenos, 2007). Su participación se hace fundamental en

condicionamientos con el paradigma de traza (Kim y col., 1995), pero no así en el paradigma

de demora (Thompson, 1988; Kim y col., 1995; Moyer y col., 1990, 1996; Weiss y col.,

1999). La posible explicación estaría en la necesidad del sujeto experimental de percibir y

asociar los estímulos, para lo cual debe emplear un conocimiento consciente para ese

aprendizaje (Clarke y Squire, 1998) como también una memoria declarativa o explícita

(Eichenbaum, 1999).

En recientes trabajos de nuestro laboratorio, se ha demostrado que durante la

adquisición de respuestas palpebrales condicionadas se modifica la actividad sináptica en el

circuito hipocampal, fortaleciendo la idea de la participación del hipocampo en la generación,

en parte, de la respuesta condicionada (Gruart y col., 2006).

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Objetivos 37

2. OBJETIVOS

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Objetivos 38

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Objetivos 39

2.1 OBJETIVO GENERAL

El objetivo general de esta tesis doctoral fue caracterizar la actividad electroencefalográfica de

los principales sitios de relevo sináptico en el circuito del hipocampo en situaciones de

aprendizaje motor y pruebas de eficacia sináptica en ratas en condiciones fisiológicas.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Para lograr el objetivo general de esta investigación, se plantearon los siguientes objetivos

específicos:

1. Establecer la existencia de patrones de actividad hipocampal asociados a la generación

de respuestas condicionadas en tres sitios específicos del hipocampo como son el giro

dentado y las células piramidales de CA3 y CA1,

2. Establecer la existencia de cambios en parámetros electrofisiológicos como

pendientes, amplitudes y latencias sinapticas de los potenciales de campo producidos

en las regiones registradas, durante las pruebas de aprendizaje asociativo. Como

prueba de aprendizaje se utilizó el condicionamiento clásico del reflejo corneal, con

un paradigma de traza.

3. Estudiar la participación de los receptores NMDA en la generación de un aprendizaje

asociativo y en los mecanismos de plasticidad neuronal como la potenciación a largo

plazo y la depresión a largo plazo.

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MATERIALES y MÉTODOS 40

3. MATERIALES Y MÉTODOS

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MATERIALES y MÉTODOS 41

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MATERIALES y MÉTODOS 42

3. MATERIALES Y MÉTODOS

Para estudiar el fenómeno de la plasticidad neuronal en el hipocampo fue necesario

inicialmente caracterizar cada sitio de relevo sináptico (giro dentado (GD); células

piramidales de CA3 (CA3) y células piramidales de CA1 (CA1)), a fin de conocer la

respuesta electrofisiológica que se evoca al estimular las diferentes vías aferentes

(colaterales de Schaffer y vía perforante). Por este motivo, los animales de dividieron en

dos tipos de grupo: agudos y crónicos. En los primeros se caracterizó la actividad

electroencefalográfica de cada sitio de relevo, determinando las coordenadas más

adecuadas para los electrodos de registro y estimulación. En los animales crónicos se

implantaron electrodos intracraneales y se registró in vivo la actividad

electroencefalográfica del hipocampo durante pruebas de aprendizaje asociativo. En este

último grupo se hicieron subdivisiones experimentales dependiendo de la posición y

número de los electrodos de registro y estimulación.

3.1. SUJETOS EXPERIMENTALES

Para los experimentos agudos y crónicos se emplearon 83 ratas macho de la cepa

Wistar, criadas en condiciones de libre acceso a comida y bebida. Los pesos al momento

de la cirugía fluctuaron entre los 250 y 300 gr. Los animales se obtuvieron de dos

proveedores oficiales (Animalario de la Universidad de Granada y Centro de Reproducción

Animal de la Universidad de Sevilla) y se manipularon de acuerdo a la legislación de la

Unión Europea (86/609/EU) y de España (BOE 67/8509-12, 1998 y BOE 252/34367-91,

2005) en materia de obtención y cuidado de animales de experimentación. Las ratas se

mantuvieron bajo condiciones estables de iluminación (ciclo de 12 horas de luz –

oscuridad), temperatura (21 ± 1º C) y humedad relativa (55 ± 5%).

3.2. PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO EN ANIMAL AGUDO

En la preparación quirúrgica para el registro de la actividad eléctrica basal en los

sitios seleccionados del hipocampo, los animales se mantuvieron en ayuno durante las doce

horas previas a la cirugía. Quince minutos antes de la misma, las ratas se anestesiaron con

hidrato de cloral al 4% a una dosis de 0,5 ml por cada 100 g de peso por vía intraperitoneal

y se administraron dosis controladas durante el desarrollo de la operación para mantener el

nivel adecuado de anestesia. Primero, se afeitó la región fronto-parieto-occipital de la

cabeza y parte del tercio rostral de la nuca. A continuación, se situó el animal sobre una

manta térmica durante toda la operación, manteniendo su temperatura controlada. Las ratas

Page 55: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 43

se montaron en un aparato estereotáxico (David Kopf Instrument 1204, Tujunga, CA,

EE.UU.) en el que se les fijó firmemente la cabeza (ver Figura 11). Todo el material

quirúrgico, así como el área operatoria, se esterilizaron antes de su uso.

Los pasos quirúrgicos realizados fueron los siguientes:

1.- Se realizó una incisión mediana fronto-occipital, comprendiendo piel y tejido celular

subcutáneo.

2.- Se expuso el cráneo (huesos frontal, parietal y occipital) mediante retracción de los

músculos temporales y el periostio. Se hizo hemostasia con cera quirúrgica

(Ethicon ®, Johnson-Johnson Intl., Bélgica) en los puntos sangrantes.

3.- Se identificó la posición de Bregma y se fijaron las coordenadas estereotáxicas para la

localización de los electrodos intracraneales.

4.- Se localizaron y marcaron, bajo guía estereotáxica, los puntos de inserción de los

electrodos intracraneales de registro y estimulación siguiendo las coordenadas del

atlas estereotáxico de Paxinos y Watson, (1986) (ver Figura 12).

5.- Se taladró la tabla ósea en los lugares marcados, respetando la duramadre, en un

diámetro que permitía el fácil ingreso de los electrodos.

6.- Previa extirpación de la duramadre, se insertaron los electrodos intracraneales hasta la

profundidad prevista.

Figura 11. Fotografía de los equipos utilizados durante las operaciones agudas y crónicas. El animal se ubicó

en un aparato estereotáxico y a ambos costados se colocaron los micromanipuladores empleados para implantar intracranealmente los electrodos de estimulación y registro.

Page 56: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 44

En los primeros registros extracelulares se emplearon pipetas realizadas en tubos de

borosilicato, utilizando un estirador de pipetas para su elaboración (modelo PE–2,

Narishige, Tokio, Japón) que contenía NaCl 2M como solución conductora. Las

resistencias de los electrodos fluctuaron entre 1 a 5 MOhmios.

Las pipetas se montaron en un micromanipulador (ME–7, Narishige) unidas a un

soporte de metacrilato, se recubrieron parcialmente con papel aluminio que se unió a la

tierra del sistema. Por el extremo libre de la pipeta se introdujo un alambre de plata en

cuyo extremo se conectó la entrada del amplificador (NEX – 1 Biomedical Engineering,

New York, EE.UU).

El adecuado control del ruido eléctrico del sistema de registro obtenido con el uso de

pipetas, permitió caracterizar los potenciales de campo de cada sitio que sería registrado

posteriormente de manera crónica.

Finalmente, se conectaron los electrodos con sus respectivos cables a los equipos de

registro y estimulación y toda la preparación se llevó a tierra, dando inicio a los diferentes

protocolos de estimulación, para caracterizar electrofisiológicamente el sitio de interés.

Figura 12. Vista dorsal del cráneo de una rata, colocada en un aparato estereotáxico. Como se describe en el procedimiento quirúrgico para animales agudos, se observa la separación del tejido subcutáneo y muscular del cráneo. Además, en el hueso parietal derecho se observan dos orificios, realizados para descender los

electrodos de estimulación y registro. El orificio más rostral corresponde al sitio de registro (Giro dentado) y el orificio más caudal es el sitio de estimulación (Vía perforante).

Page 57: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 45

3.3. REGISTRO DE LA ACTIVIDAD ELECTROENCEFALOGRÁFICA Y

CALIBRACIÓN DE LOS ESTÍMULOS ELÉCTRICOS

Las pipetas se implantaron en el cerebro bajo inspección visual de los potenciales

de campo evocados, con la ayuda de un osciloscopio digital. El protocolo de estimulación

empleado constó de estímulos de 0,1 a 5 mA de intensidad, 50 µs de duración y de 0,1 a 1

Hercios de frecuencia. Los electrodos de estimulación fueron bipolares, para minimizar la

zona estimulada y atenuar los artefactos de estimulación en la zona de registro (Delgado-

García, 1995). El montaje de los equipos de estimulación y registro permitió tener

movilidad independiente para cada electrodo, lo cual facilitó la localización de la zona de

registro. De modo que, una vez identificada por coordenadas estereotáxicas la capa que se

deseaba estudiar, se pudieron realizar perfiles electrofisiológicos descendiendo en pasos de

0,1 mm hasta localizar el sitio ideal, que correspondió al sitio donde los registros de campo

fueron de mayor amplitud empleando una mínima intensidad de estimulación.

Las señales electrofisiológicas se amplificaron diez veces con un preamplificador

acoplado a corriente continua (NEX -1, Biomedical Engineering). La señal preamplificada

se aumentó 100 veces y se filtró, con una amplitud de banda entre corriente continua y 10

KHercios con un amplificador multicanal (MCA -1 Biomedical Engineering). La

digitalización de la señal se realizó por medio de una unidad de digitalización Neuro

Corder, (DR – 890 Cyngus Technology, Nueva York, EE.UU.) y se almacenó en cintas de

vídeo (Fuji E-180) para, posteriormente, traspasar los datos a un ordenador, empleando una

tarjeta de adquisición (POWER 1401, Cambrige, Reino Unido) y un programa de análisis

comercial (Spike 2 CED, Cambrige, Reino Unido).

3.3.1 Protocolo experimental en animales agudos

El descenso de la pipeta se realizó lentamente de manera que el tiempo transcurrido

desde el inicio hasta la ubicación óptima del electrodo fue del orden de 50 – 60 minutos.

En este diseño experimental, se estudiaron los principales sitios de relevo sináptico

del hipocampo. A continuación se señala en primer término la zona de estimulación y

posteriormente el (los) sitio(s) de registro:

a) Vía perforante – Giro dentado

b) Vía perforante – Giro dentado y CA3

c) Giro dentado (fibras musgosas) – Piramidales de CA3

d) Colaterales de Schaffer – Piramidales de CA1

e) Vía perforante – Giro dentado, CA3 y CA1

Page 58: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 46

3.3.1.1 Registro de la actividad basal

Previo a las pruebas electrofisiológicas, se realizó un registro de dos minutos de la

actividad basal del hipocampo, controlando la presencia de actividad rítmica tipo theta,

característica del hipocampo.

3.3.1.2 Perfil de intensidades

El perfil de intensidades comenzó con valores subumbrales y a una frecuencia de

0,3 Hercios. Estos valores se incrementaron paulatinamente, hasta obtener la máxima

amplitud del campo, realizándose seis mediciones de un minuto cada una por cada animal.

Se construyeron curvas estímulo/respuesta aplicando intensidades crecientes. Sobre

esta curva se determinó el valor de intensidad de estimulación capaz de producir una

espiga poblacional semi-máxima que se empleó para la obtención de registros en la prueba

de pulsos pareados. (López-Planes y col., 1999)

3.3.1.3 Prueba de pulsos pareados

Esta prueba se utilizó para examinar la modulación de la excitabilidad celular a

corto plazo. (López-Planes y col., 1999; Yorns y col., 2004). La prueba consistió en el

cálculo de la diferencia entre una segunda respuesta postsinaptica (SRP) producida

brevemente después de una primera respuesta (PRP). La selección de diferentes

frecuencias de estimulación buscó establecer si existen cambios en la transmisión

sináptica, en los diferentes sitios de relevo sináptico del hipocampo. En los registros

obtenidos se tomó como parámetro para comparar, la pendiente del EPSP (siglas en inglés

de Excitatory Post Synaptic Potencial). En cada animal se registraron 10 pares de

respuestas en cada intervalo interpulsos de 10, 20, 30, 50, 100, 200 y 500 ms.

El IPP (índice de pulsos pareados) fue determinado al analizar el porcentaje de

cambio en la pendiente del EPSP de la segunda respuesta con respecto a la primera

respuesta (PPR) (Yorns, y col., 2004). Para ello se empleó la siguiente fórmula:

IPP = ((SRP – PRP)/ (PRP)) 100

Se realizaron cuatro ensayos de pulsos pareados. En los dos primeros se mantuvo la

frecuencia constante (0,3 Hercios) y se varió la intensidad de los estímulos. En los otros

dos ensayos se mantuvo la intensidad constante (valor medio del perfil de intensidades) y

se cambió la frecuencia de estimulación (1 y 5 Hercios, respectivamente).

Page 59: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 47

Se midió la variación de la pendiente del EPSP en ambos potenciales y el grado de

facilitación o inhibición se expresó en la relación porcentual de la amplitud de la espiga

poblacional del segundo potencial (SRP) en relación con el primero (PRP) (López-Planes y

col., 1999).

3.4. PROCEDIMIENTO QUIRÚRGICO PARA ANIMALES CRÓNICOS

Los primeros pasos quirúrgicos (del 1 al 5) fueron idénticos a los realizados en los

animales agudos. Las diferencias se detallan a continuación:

1.- Se localizaron y marcaron bajo guía estereotáxica los puntos de inserción de los

electrodos intracraneales de registro y estimulación. Se marcaron, además, los sitios para

insertar los tres tornillos (dos para el anclaje de las torretas y uno como referencia para los

electrodos de estimulación del hipocampo izquierdo).

2.- Se taladró la tabla ósea en los lugares marcados, respetando la duramadre.

3.- Se insertaron y aseguraron al cráneo los tornillos de anclaje, siendo recubiertos

por una capa de cianocrilato y, posteriormente, con cemento dental (Duralay, Worth, IL,

EE.UU.).

4.- Previa extirpación de la duramadre, se insertaron los electrodos intracraneales

hasta la profundidad prevista por las coordenadas estereotáxicas (ver Figura 16). La

posición dorso – ventral final de los electrodos de estimulación y registro se determinó por

inspección visual de los potenciales de campo provocados por estimulación con pulsos

simples y monitorizados en el osciloscopio.

5.- Una vez localizados en su posición definitiva, los electrodos, unidos a sus

respectivas torretas, se fijaron al cráneo con cemento dental (Duralay).

6.- Partiendo del extremo rostral de la incisión, se disecó un trayecto subcutáneo

hasta el borde libre del párpado superior del lado izquierdo. Se identificó la posición de la

rama supraorbitaria del trigémino y se ubicó en su proximidad dos electrodos de

estimulación, confeccionados en acero inoxidable recubiertos de Teflón (Du Pont de

Nemours, Boston EE.UU.) de un diámetro de 50 µm, con las puntas descubiertas y

dobladas en forma de arpón.

7.- En el mismo trayecto subcutáneo se identificó la posición de los músculos

orbiculares de los párpados superior e inferior y en ellos se situaron dos electrodos de

registro confeccionados en acero inoxidable recubiertos de Teflón® de un diámetro de 50

µm, con las puntas descubiertas y dobladas en forma de arpón. Los electrodos no afectaron

la posición ni la movilidad del párpado implantado en ningún caso.

Page 60: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 48

8.- Los extremos libres de los cuatro electrodos se soldaron a un terminal de

zócalos rectos (RS, Amidata, Madrid, España). Los sitios de unión se recubrieron con

esmalte de uñas y la torreta se fijó al cráneo con cemento dental (Duralay).

9.- Los extremos caudal y rostral de la incisión se suturaron con seda de 2-0,

usando puntos simples y separados. Al suturar se aproximaron al máximo los bordes libres

de la herida a la torreta. Todo el borde de la incisión de cubrió con una pomada cicatrizante

(Blastoestimulina, Almirall Prodesfarma, Barcelona, España).

En los animales crónicos, para la estimulación y registro de las estructuras

nerviosas, se probaron distintos tipos de electrodos metálicos, siendo finalmente

seleccionados los de tungsteno de 25 µm recubiertos con esmalte. En ambos tipos de

electrodos se emplearon dos cables trenzados, con sus puntas peladas y separadas diez

micras aproximadamente. Los extremos libres fueron soldados a conectores machos libres.

Los electrodos de estimulación se implantaron con la ayuda de un

micromanipulador Narishige, modelo M–3. Para estimular, se empleó un estimulador CS–

20 (Cibertec, Madrid, España) unido a una unidad de aislamiento modelo ISU- 165

(Cibertec). El resultado final de la operación se aprecia en la figura 14.

AB C

Figura 14. Se muestra el resultado final de la operación de implantes crónicos y la condición de registro de las ratas. La caja de metacrilato posee en la cara anterior agujeros que permiten el paso del sonido. Se

observan los tres cables unidos a cada tortea. La A corresponde a los cables de estimulación y registro del músculo orbicular de los párpados, la B es el cable de estimulación en el hipocampo y las tierras del sistema.

Finalmente, la letra C corresponde a los cables de registro de la actividad hipocampal.

Page 61: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 49

3.4.1. Recuperación, cuidados post-operatorios y habituación a las condiciones de

registro

Tras el procedimiento quirúrgico, los animales se recuperaron en unos 10 días antes

de iniciar los experimentos. En tres días sucesivos, durante la segunda semana de este

período, se condujo al animal a la sala de registro en una caja de plástico translúcido. Los

dos primeros días se mantuvo al animal sin conectar las torretas a los cables de

estimulación y registro. Las torretas se conectaron al tercer día. Las ratas se mantuvieron

en la caja de registro por intervalos de tiempo crecientes para habituarlas a las condiciones

experimentales.

Para los registros experimentales, se ubicaron las ratas en una caja de metacrilato,

especialmente diseñada para este experimento (Figura 3.5.). A cada conector [terminal de

zócalos rectos, (RS, Amidata)] situado en la cabeza del animal, se acopló un conector

complementario (terminal sin cubierta recto, de Tyco/Electronic, Amidata) soldado a un

conjunto de cables, que permitieron la estimulación del hipocampo y a la rama

supraorbitaria del trigémino y el registro de la actividad de campo del hipocampo y las

respuestas electromiográficas del músculo orbicular de los párpados. Este fue el diseño

más completo que se logró y fue empleado en aquellos animales que tuvieron tres sitios de

registro simultáneo en el hipocampo, tal como se detalla en la Figura 15.

Estimulación Rama trigemino

Registro EMGOrbicular de lospárpados

Registro sitioGiro dentado

Registro sitiopiramidales CA 3

Registro sitiopiramidales CA 1

Estimulación envía perforante

Tierras

R

L M

C

Figura 15. Esquema de la distribución de las torretas ubicadas en los animales crónicos. Cada cuadrado

envolviendo, a su vez, a cuatro cuadrados más, corresponde a un conector hembra que se fijo firmemente al cráneo del animal. Este orden corresponde a los animales crónicos que tuvieron tres sitios de registro.

Abreviaciones: R, L, M, y C: rostral, lateral, medial y caudal.

Page 62: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 50

Coordenadas estereotáxicas:

CA 3CA 1

G D

Stim. PP - 6.8 mm AP; -3.0 mm L; + 2.0 mm DV

- 3.3 mm AP; -3.2 mm L; + 3.2 mm DV

- 3.6 mm AP; - 1.2 mm L; + 3.4 mm DV

- 4.3 mm AP; - 2.8 mm L; + 2.0 mm DV

Figura 16. En el dibujo se señalan las coordenadas estereotáxicas utilizadas para los electrodos de estimulación y registro. Para el giro dentado (GD) fueron en el eje anteroposterior (AP) - 3.6 mm; en el eje lateral (L) –1.2 mm; y en el eje dorsoventral (DV) + 3.4 mm. Para el área CA3 fueron: - 3.3 mm AP; - 3.2 mm L; y + 3.2 mm DV. Para la región de CA1 fueron: - 4.3 mm AP; - 2.8 mm L y + 2.0 mm DV. Finalmente, para los electrodos de estimulación fueron: - 6.8 mm AP; - 3.0 mm L; y + 2.0 mm DV.

3.5. REGISTRO DE LAS ACTIVIDADES ELECTROMIOGRÁFICAS Y

ELECTROENCEFALOGRÁFICAS Y CALIBRACIÓN DE LOS ESTÍMULOS

ELÉCTRICOS

La actividad electromiográfica del músculo orbicular de los párpados se registró

con la ayuda de un amplificador diferencial (P511 AC Amplifier, GRASS, Instruments

Division, Astro-Med, Inc. West Warmick, RI, EE.UU.) que filtró la señal con una amplitud

de banda entre 10 Hz y 10 KHz, previa amplificación de 1000 veces.

La actividad electroencefalográfica del hipocampo se registro en tres

amplificadores diferenciales (P511 AC Amplifier, GRASS) en los cuales se filtró la señal

con una amplitud de banda entre 10 Hercios y 10 KHercios, previa amplificación * 1000.

Para determinar los estímulos a emplear en cada animal, en una sesión previa al

inicio de los experimentos de condicionamiento, se realizó un perfil de intensidades en el

Page 63: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 51

hipocampo y rama supraorbitaria del trigémino. Se seleccionó aquel estímulo que

equivaliese aproximadamente al 70% de la intensidad máxima empleada, para estimular en

el hipocampo y para provocar en el párpado un movimiento reflejo como un ligero

movimiento palpebral. Para cada animal experimental se registró y almacenó el tipo de

respuestas inducidas por ambos estímulos para establecer una referencia basal.

3.5.1. Registro de la actividad poblacional en la capa piramidal del área CA3 y CA1

del hipocampo

La actividad poblacional se registro a través de electrodos de tungsteno de 25 µm

desplazado a la capa piramidal del área CA3 y CA1 de manera independiente, la señal se

aumento 10 veces con un amplificador acoplado a corriente continua (NEX-1, de

Biomedical Engineering). La señal preamplificada se aumentó 100 veces y se filtró con

una amplitud de banda de 10 KHercios en un amplificador diferencial (P511 AC

Amplifier, GRASS).

3.5.2. Registro de la actividad poblacional en la capa granular del giro dentado del

hipocampo

La actividad poblacional se registro a través de electrodos de tungsteno de 25 µm

desplazado a la capa granular del giro dentado, la señal se aumento 10 veces con un

amplificador acoplado a corriente continua (NEX-1, Biomedical Engineering). La señal

preamplificada se aumentó 100 veces y se filtró con una amplitud de banda de 10

KHercios en un amplificador diferencial (P511 AC Amplifier, GRASS).

3.5.3. Protocolo experimental en animales crónicos

El protocolo experimental empleado en los animales crónicos una vez determinada

la localización definitiva de los electrodos de registro y estimulación fue la misma que se

empleó en los animales agudos. En cada animal, se realizaron registros de la actividad

basal del ritmo theta del hipocampo, series de pulsos pareados y perfiles de intensidad.

Esto permitió caracterizar cada sitio en la etapa preoperatoria y compararla con las posibles

variaciones que los registros pudieran sufrir al recuperarse el tejido nervioso de la acción

lesiva de los electrodos.

Page 64: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 52

3.6. GRUPOS EXPERIMENTALES CRÓNICOS Las ratas se dividieron en 6 grupos experimentales:

1) GRUPO I: Animales con cuatro electrodos de registro colocados en un sitio del

hipocampo.

a. Seis animales con implante de electrodos de registro en la región CA1 y

electrodos de estimulación en las colaterales de Schaffer.

b. Tres animales con implante de electrodos de registro en el giro dentado (GD,

células granulosas) y electrodos de estimulación en las fibras de la vía

perforante medial.

2) GRUPO II: Animales con dos sitios de registro en el hipocampo, de dos electrodos

cada uno.

a. Tres animales con implante de electrodos de registro en las regiones CA3 y

CA1. Los electrodos de estimulación estaban en la vía perforante medial.

b. Cinco animales con implante de electrodos de registro en la región CA3 y en

el giro dentado (GD) y electrodos de estimulación en la vía perforante

medial.

c. Tres animales con implante de electrodos de registro en el giro dentado (GD)

y la región CA1. Los electrodos de estimulación se colocaron en las fibras

de la vía perforante medial.

3) GRUPO III: Este grupo solo tuvo implantes de electrodos de registro en el músculo

orbicular de los párpados y se sometió a la prueba de condicionamiento clásico del

reflejo palpebral.

a. Dos animales se destinaron al seudocondicionamiento (control aprendizaje).

b. Dos fueron control normal, y

c. Dos recibieron tratamiento farmacológico (Ro 25-6981) durante el

condicionamiento.

4) GRUPO IV: Este grupo consistió en 7 animales con tres sitios de registro en

hipocampo (G.D., CA3 y CA1) que se sometieron a la prueba de condicionamiento

clásico del reflejo palpebral, además de pruebas de eficacia sináptica (LTP y LTD).

5) GRUPO V: 6 animales destinados a pruebas electrofisiológicas (LTD, siglas del

inglés long-term potentiation) y LTP (siglas del inglés long-term depression)

6) GRUPO VI: 6 animales destinados a pruebas farmacológicas (Ro 25-6981,

AV1625, CPP, NBQX)

Page 65: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 53

3.6.1. Condiciones generales para las sesiones de condicionamiento

Las sesiones de condicionamiento clásico comenzaron 9 a 10 días después de la

operación de implante de los electrodos intracraneales en el hipocampo y los electrodos de

estimulación y registro de los movimientos palpebrales.

Todas las sesiones tuvieron una duración aproximada de 35 min. Con el fin de

evitar ruidos que pudiesen alterar el aprendizaje, se utilizó como ruido blanco el producido

por el aparato de aire acondicionado en la habituación del registro, de unos 60 dB. Las

sesiones se realizaron en días consecutivos, y a la misma hora para cada animal.

La presentación de los distintos estímulos se controló por medio de un programa de

ordenador (Estimulador Multicanal de Pulsos Programable, EMDPP, Cibertec). Una tarjeta

de generación de pulsos, diseñada en el laboratorio, permitió establecer las características

de los estímulos condicionado e incondicionado, los intervalos entre estímulos, parejas de

estímulos y bloques de estimulación, para el paradigma de condicionamiento seleccionado.

3.6.2. Estructura general de los programas de condicionamiento

Un programa de condicionamiento está formado por tres fases sucesivas:

habituación, condicionamiento y extinción. Cada una de esas fases se llevó a cabo en

varias sesiones. En cada sesión se hicieron 60 presentaciones de estímulos o ensayos. El

intervalo entre ensayos consecutivos fue de 30 ± 5 s variando, en este rango, de forma

aleatoria. La fase de habituación se llevó a cabo en cuatro sesiones sucesivas. En todos los

ensayos de estas sesiones se presentó aisladamente el estímulo condicionado. Durante la

fase de condicionamiento se realizaron diez sesiones. Para poder apreciar mejor la

adquisición de la respuesta condicionada, en el primer ensayo de cada diez consecutivos,

se presentó únicamente el estímulo condicionado. En el resto de los ensayos se presentaron

los estímulos condicionado e incondicionado, asociados según el programa de

condicionamiento elegido. Finalmente, la fase de extinción consistió en cinco sesiones

donde se volvió a aplicar aisladamente el estímulo condicionado.

En el programa empleado se utilizó un intervalo interestímulos de 500 ms, lo que

permitió que a los 300 ms se programara un tercer estímulo dirigido al hipocampo,

aplicado a las colaterales de Schaffer o a la vía perforante, dependiendo del diseño

experimental, el cual generó un potencial de campo postsináptico en el área de registro

correspondiente.

Page 66: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 54

3.6.3. Paradigmas de condicionamiento empleados

3.6.3.1. Paradigma de traza: tono – choque eléctrico

En este tipo de paradigma, se presenta inicialmente el estímulo condicionado que

en este caso fue un tono de 50 ms de duración, con una frecuencia de 2.400 Hercios y una

intensidad de 85 dB (Gruart y col., 2006). Al cabo de 500 ms del inicio del sonido se

aplicó, como estímulo incondicionado, un choque eléctrico en la rama supraorbitaria del

nervio trigémino, de 500 µs de duración y con una intensidad suficiente para producir un

cierre consistente del párpado (ver detalle en la Figura 17 ).

500 ms

E IE C

EC =Tono de 50 ms, 2.400 Hercios y 85 dB

E I = Choque de 500 µs, 3 x Umbral

Figura 17. Representación esquemática del paradigma de condicionamiento empleado. EC indica el estímulo condicionado y EI el estímulo incondicionado.

3.6.3.2. Paradigma de Pseudocondicionamiento

En este paradigma los animales recibieron, en cada ensayo, dos estímulos con la

misma intensidad y duración que las indicadas en sección 3.6.3.1. pero presentados de

manera aleatoria de modo que el animal no puede establecer una asociación temporal entre

ellos.

3.7. PRUEBAS ELECTROFISIOLÓGICAS Y FARMACOLÓGICAS

Un total de 34 ratas se sometieron a pruebas de eficacia sináptica como la LTP y y

la LTD. Además se emplearon los siguientes fármacos:

1) Ro 25-6981 (Sigma) un antagonista específico de la subunidad NR2B de los

receptores de NMDA (Fischer y col., 1997; Pinard y col., 2001; Lynch y col., 2001) en la

prueba de LTD y LTP (Liu L, y col., 2004).

Page 67: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 55

2) NBQX: Es un antagonista específico de receptores de No-NMDA (AMPA)

(Svendsen y col., 1999; Kapuz y col., 2000), que se empleó en la prueba de LTP en

conjunto con

3) CPP, un fármaco antagonista de receptores NMDA (Harris y col., 1986;

Lehmann y col., 1987) que también se empleó en la prueba de LTP (Escobar y col., 1998).

4) Ifenprodil, un antagonista selectivo para la subunidad NR2B del receptor de

NMDA (Williams, K., 1993).

3.7.1 Protocolo empleado para inducir una potenciación a largo plazo (LTP)

Inicialmente se estableció un registro de línea base de quince minutos con estímulos

a una frecuencia de 0,2 Hercios, y con una duración del pulso de 50 µs. Transcurrido este

tiempo, se aplicó el protocolo de LTP que consistió en seis series de estimulaciones

tetánicas, donde cada serie estaba compuesta de cinco trenes de una frecuencia de 200

pulsos y una duración de 50 µs/pulso. Se dejó un intervalo inter-series de 1 min.

Posteriormente se volvió a la condición inicial y se registró durante dos horas.

3.7.2 Protocolo empleado para inducir una depresión a largo plazo (LTD)

Las características para evocar LTD son similares a lo antes señalado, también se

establece una línea base de quince minutos con estímulos a una frecuencia de 0,2 Hercios,

duración de 50 µs/pulso. Posteriormente, se aplicó durante 10 minutos un total de 600

pulsos a 1 Hercio a la misma intensidad de los pulsos control. Transcurrido este tiempo, se

restableció la frecuencia inicial y se registró durante dos horas.

3.7.3. Pruebas farmacológicas y condicionamiento

En las pruebas farmacológicas durante el condicionamiento con el antagonista

selectivo de la subunidad NR2B del receptor de NMDA (Ro 25-6981). La administración

se realizó en animales bajo dos condiciones:

- Animales que habían aprendido la asociación a los que se les inyectó el fármaco

en un período post condicionamiento de 10 días, durante los primeros 5 se les administró el

fármaco 30 minutos antes de iniciar la sesión y se suspendió su administración en los 5

días posteriores.

- Animales que no habían aprendido la asociación y se les inyectó el fármaco

durante todo el programa de condicionamiento. La dosis empelada en ambos casos fue de

10 mg/kg i.p. de Ro 25-6981 (Sigma, Madrid, España).

Page 68: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 56

3.8 ANÁLISIS DE DATOS

3.8.1. Generalidades

Todas las señales analógicas se procesaron on-line con una frecuencia de muestreo

de 11 KHercios, una ganancia de 2,5 y una resolución vertical de 12 bits, en una unidad

digitalizadora de ocho canales (NeuroCorder DR-890, NEURO DATA, Nueva York,

EE.UU). Bajo estas condiciones, las señales registradas se almacenaron en cintas de vídeo.

Los datos almacenados se traspasaron a discos compactos mediante el convertidor

analógico – digital (1401 plus, CED, Cambridge, Reino Unido). Los archivos generados

tuvieron las extensiones .smr que son compatibles con el programa comercial Spike2

(CED). Las señales grabadas fueron la actividad electroencefalográfica del hipocampo, la

electromiografía del músculo orbicular de los párpados y los perfiles de los estímulos

aplicados.

3.8.2 Parámetros analizados de la actividad del músculo orbicular de los párpados.

Se analizaron las variables de latencia, amplitud y área bajo la curva de las respuestas

reflejas y condicionadas del músculo orbicular de los párpados tras la estimulación

eléctrica de la rama infraorbitaria del nervio trigémino y sonido respectivamente. Las

mediciones de las variables de las respuestas reflejas y condicionadas de la musculatura

intrínseca se hicieron sobre el registro electromiográfico rectificado (EMGr), como se

ilustra en la Figura 18.

3.8.2.1 Parámetros de las respuestas condicionadas En este estudio se aplicaron los siguientes criterios para considerar un movimiento

palpebral como una respuesta condicionada. Así pues, se consideró como respuesta

condicionada a todo registro electromiográfico que tuviese un aumento significativo de la

amplitud y que fuese el resultado de un movimiento activo del cierre del párpado, durante

el intervalo interestímulos, con un valor del área bajo la curva del 90% mayor que la

actividad electromiográfica registrada en los 100 ms previos a la aparición del estímulo

condicionado.

3.8.2.1.1 Porcentaje de respuestas condicionadas

Para cada sesión se contabilizó el número de respuestas palpebrales que cumplían los

criterios antes señalados. Basándose en ello, se calculó el porcentaje de respuestas

condicionadas por el animal en cada sesión. También se calcularon los porcentajes de

Page 69: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 57

ensayos sin respuestas condicionadas y los ensayos eliminados. Cuando los animales

realizaron al menos el 60% de respuestas condicionadas en una sesión se consideró que

había cumplido con el criterio de aprendizaje.

1

3

4

5

6

7

8

EI

EC

Figura 18. Ejemplo de un registro de electromiografía rectificada (EMGr) en la que se incluye la respuesta condicionada y la respuesta incondicionada. En la ventana de tiempo se observa la presentación del estímulo condicionado (EC) y del estímulo incondicionado (EI). Los números corresponden a: (1) Período previo al

estímulo condicionado, (2) presentación del estímulo condicionado, (3) intervalo entre estímulo condicionado y el estímulo incondicionado, (4) Período posterior al estímulo incondicionado, (5) Latencia de inicio de la respuesta condicionada, (6) Latencia al pico máximo de la respuesta condicionada, (7) Amplitud máxima de

la respuesta condicionada, (8) Área bajo la curva de la respuesta condicionada.

3.8.2.1.2. Latencia al pico máximo de la respuesta condicionada.

La latencia al pico máximo de las respuestas en la musculatura orbicular se calculó

como el tiempo entre el inicio del estímulo y la máxima respuesta electromiográfica

rectificada en el intervalo entre el estímulo condicionado y el estímulo incondicionado

(número 3 en la Figura 18).

3.8.2.1.3. Latencia al inicio de la respuesta condicionada.

La latencia al inicio de las respuestas condicionadas se calculó como el tiempo

entre el inicio del estímulo y el incremento de la amplitud en la respuesta electromiográfica

rectificada (número 5 en la Figura 18).

Page 70: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 58

3.8.2.1.4. Amplitud máxima relativa de la respuesta condicionada.

Para determinar la amplitud máxima relativa de la respuesta condicionada, en todos

los ensayos de cada sesión se midió la amplitud máxima (en mV) de la actividad

electromiográfica rectificada en el período entre el estímulo condicionado y el estímulo

incondicionado (número 3 de la Figura 18) y la amplitud media (en mV) de la línea de base

(la actividad electromiográfica durante los 40 ms previos a la administración del estímulo).

Se calculó entonces la variación porcentual de la amplitud máxima con respecto a la

amplitud media de la línea de base.

3.8.2.1.5. Área relativa de la respuesta condicionada.

Para determinar el área relativa de la respuesta condicionada, en todos los ensayos

de cada sesión se midió el área bajo la curva (en mV × ms) de la actividad

electromiográfica rectificada en el intervalo entre el estímulo condicionado y el estímulo

incondicionado (número 3 de la Figura 18) y el área bajo la curva (en mV × ms) de la línea

de base (período de 40 ms previos a la llegada del estímulo). Para cada componente se

calculó entonces la variación porcentual del área bajo la curva con respecto a la línea de

base.

3.8.3. Cálculo de la variación de la pendiente en los registros de potenciales de campo

sinápticos en el hipocampo.

La pendiente de los EPSPs se calculó mediante un programa diseñado en el

laboratorio (por el Dr. R. Sánchez Campuzano) empleando el programa MatLab 12.0. Este

programa permitió promediar los valores de los potenciales de campo sinápticos y

seleccionar en la fase ascendente un período que comprende entre el 10% del inicio y el

10% final de la pendiente, evitando contabilizar las espigas poblacionales. El programa

permitió seleccionar los registros libres de interferencias. A este respecto, hay que recordar

que se realizaron las pruebas en animales despiertos y en movimiento, los análisis se

realizaron para cada sesión, pudiendo seleccionar también el número de sesiones a

analizar.

En este programa se consideraron un total de 19 parámetros de entrada, que fueron

incorporados ordenadamente antes de cualquier análisis:

1: NI, se refiere al número de individuos involucrados en el análisis

2: NS, se refiere al número de sesiones, ya sean de habituación, condicionamiento o

de extinción

Page 71: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 59

Figura 19. Ventana del programa MatLab, donde se observa que al ingresar los criterios solicitados se obtiene como resultado: A la izquierda, tres promedios de los potenciales de campo sinápticos en tres sitios

diferentes del hipocampo (mV v/s ms). A la derecha se muestran los promedios de las pendientes en dos puntos distintos de cada campo promediado (Mean Slope v/s Number).

3 y 4: R1 y R2, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el

primer canal del hipocampo)

5 y 6: R3 y R4, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el

segundo canal del hipocampo)

7 y 8: R5 y R6, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el

tercer canal del hipocampo)

9 y 10: R7 y R8, se refieren a las dos latencias (en segundos) de referencia (para el

cuarto canal del hipocampo)

11 y 12: r1 y r2, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el

primer canal)

13 y 14: r3 y r4, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el

segundo canal)

Page 72: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 60

15 y 16: r5 y r6, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el

tercer canal)

17 y 18: r7 y r8, se refieren a los valores de desplazamiento del cursor (para el

cuarto canal)

Y 19: (salvo). Si salvo = 1, entonces deben salvarse todas las salidas. Si salvo = 0,

entonces no se salvan las salidas independientes.

El programa garantizó el análisis de los valores reales obtenidos en los registros

electroencefalográficos y aseguró la repetición fiable de los análisis evitando los típicos

errores de cálculo visual.

3.8.4. Análisis estadístico

Para todos los análisis estadísticos se empleó el programa SigmaStat 3.0 (SPSS,

Inc., Chicago, IL, USA). Como índice de significancia estadística se utilizó un nivel de

probabilidad de P ≤ 0,05.

3.8.4.1 Experimentos de estimulación en hipocampo

En los potenciales de campo postsinápticos excitatorios se calculó el promedio y la

desviación estándar de cada pendiente.

Se realizó un análisis de regresión para establecer si existía alguna relación en los

valores de las pendientes de los potenciales de campo y los porcentajes de respuestas

condicionadas durante las diferentes condiciones de aprendizaje.

3.8.4.2 Experimentos de condicionamiento

En cada sesión de condicionamiento se calculó el promedio y la desviación estándar

para cada una de las variables estudiadas entre los animales que tuvieron el mismo

paradigma de condicionamiento.

Para cada variable se evaluó la existencia de tendencias evolutivas a lo largo del

programa de entrenamiento mediante un ANOVA de una vía para medidas repetidas.

Para determinar si estos cambios evolutivos eran debidos específicamente al

aprendizaje asociativo, se tomaron como referencia los valores obtenidos durante las

sesiones de pseudocondicionamiento. Las medidas de los parámetros de dicha variable en

las sesiones de condicionamiento se compararon con los valores de referencia, mediante un

ANOVA de dos vías para medidas repetidas, asociado con un procedimiento de Tukey.

Page 73: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

MATERIALES y MÉTODOS 61

3.9. HISTOLOGÍA

Una vez finalizado el experimento, cada rata se anestesió con hidrato de cloral con

una dosis de 5 ml/kg por vía intraperitoneal. Se procedió a colocar al animal en posición

decúbito supino, en la mesa de perfusión. Se rasuró la región torácica abdominal para

posteriormente cortar la piel y la pared abdominal bajo el reborde costal. Empleando una

tijera se practicó una costotomía bilateral para exhibir las vísceras torácicas. Se seccionó

periféricamente el diafragma y se cortaron las costillas en ambos lados, retrayendo el peto

esternocostal sujeto con una pinza Keller dejando expuesto el corazón para visualizar el

ventrículo izquierdo. Se practicó una incisión en el ventrículo izquierdo introduciendo por

ella la cánula en dirección a la aorta ascendente. Se pinzó la aorta descendente y se cortó la

aurícula derecha, por donde fluyó libremente la solución salina. La presión del líquido de

perfusión fue semejante a la sistólica (13 mmHg). Se continuó la perfusión con el líquido

fijador (paraformaldehido al 4%), para la fijación del tejido nervioso.

Una vez concluida la perfusión, se extrajo el cerebro y se le retiraron las meninges,

siendo colocado en un tubo con paraformaldehido al 4% y almacenados en un refrigerador

a 4º C. (Fiaren y col., 1995)

En las 48 horas previas al corte en un micrótomo de congelación, los cerebros se

sumergieron en una solución de sacarosa al 17%. El cerebro se colocó sobre la plataforma

de congelación y se bañó con la solución de sacarosa, procurando su total congelación

antes de iniciar los cortes coronales seriados, que se realizaron con un espesor de 50 µm y

recogidos en una solución tampón fosfato sódico 0,1 M a pH 7,4. Posteriormente, los

cortes obtenidos fueron montados en portaobjetos gelatinizados y se dejaron secar durante

12 h, aproximadamente, para luego teñirlos con azul de toluidina al 0,5 %.

Las preparaciones histológicas se examinaron al microscopio óptico Zeiss (Carl

Zeiss, Oberkochen, Alemania) conectado a una cámara digital (Cool-Snap, Roper

Scientific GmbH, Munich, Alemania) para determinar la ubicación de los electrodos de

registro y estimulación, utilizando como referencia el atlas estereotáxico de Paxinos y

Watson (1986).

Page 74: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 62

4. RESULTADOS

Page 75: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 63

Page 76: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 64

4.1 CARACTERIZACIÓN DE LOS POTENCIALES DE CAMPO EVOCADOS EN

TRES SITIOS DE RELEVO SINÁPTICO DEL HIPOCAMPO

Con la finalidad de identificar correctamente los potenciales de campo provocados

en las neuronas del giro dentado y en las células piramidales de CA3 y CA1, se realizaron

perfiles en profundidad atravesando las diferentes láminas del hipocampo y registrando las

variaciones del potencial de campo que se generaba, a partir de la estimulación de la vía

perforante. En la Figura 4.1 se muestran ejemplos de potenciales de campo a diferentes

profundidades y sus relaciones anatómicas con las regiones neuronales determinadas por

coordenadas estereotáxicas.

Figura 4.1 Perfiles laminares del hipocampo, estimulando la vía perforante y registrando en CA1, CA3 y giro

dentado (G.D.). A la derecha del esquema se observa cómo el registro del campo se va invirtiendo desde la

región del soma (estratos oriens y radiatum) hacía la región de las dendritas distales (estrato lacunosum

moleculare), donde se obtiene el mayor flujo de corriente sináptica. A la izquierda se muestra un perfil en el

giro dentado en el que los primeros registros corresponden a las dendritas distales de las células granulosas;

posteriormente se invierte el potencial a la altura de los somas neuronales. Abreviaturas: E. Lac. Mol ., estrato lacunosum moleculare.

10 ms

0.5 mV

CA1

G.D.

10 ms

0.5 mV

E. Oriens

E. Radiatum

E. Lac. Mol.

E. Lac. Mol.

Hilus

Page 77: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 65

Los registros de los potenciales de campo provocados en el giro dentado se

realizaron a profundidades comprendidas entre los 100 a 130 µm buscando registrar en la

proximidad de los somas neuronales. Los potenciales de campo consistieron en una onda

inicial positiva (EPSP) sobre la cual podían montarse espigas poblacionales expresadas

como una onda aguda y negativa, a intensidades altas de estimulación. En el caso de los

registros de campo obtenidos en las células piramidales de CA3 y CA1 realizados a

profundidades de 100 a 150 µm, los potenciales consistieron en una onda inicial positiva

(EPSP) sobre la cual se monta una espiga poblacional expresada como una onda aguda y

negativa. La morfología del registro varió dependiendo de la profundidad del electrodo de

registro (ver Figura 4.1), siendo mayor su amplitud cuando éste se localizó en las dendritas

apicales. En términos generales, los perfiles de profundidad mostraron que los flujos de

corrientes en las regiones de las dendritas apicales se comportan como sumideros de

corriente, en cambio en las proximidades de los somas se comportan como fuentes de

corriente, lo que se explica por que estas sinapsis se ubican en las dendritas apicales.

Para la obtención de estos registros, el diseño del modelo experimental empleado

permitió desplazar de manera independiente los electrodos de estimulación y registro, lo

cual facilitó la selección de aquellas sinapsis que son específicamente estimuladas por las

fibras aferentes. Gracias a ello, las intensidades de estimulación empleadas fueron bajas

(rango de 0,2 a 0,4 mA) evitando activar un número mayor de interneuronas, adyacentes a

los estratos de los somas de las neuronas principales del hipocampo.

4.2 CARACTERIZACIÓN DE LAS RESPUESTAS CONDICIONADAS DURANTE

LAS PRUEBAS DE APRENDIZAJE ASOCIATIVO Y DE

PSEUDOCONDICIONAMIENTO

4.2.1 Porcentaje de respuestas condicionadas ejecutadas por sesión

Como se ilustra en la Figura 4.2 los animales control presentaron una curva normal

de aprendizaje, las cuales se han descrito en trabajos previos para ratones (Gruart y col.,

2006, 2008; Madroñal y col., 2007) y ratas (Servatius, 2000). Durante la etapa de

habituación, los animales control presentaron valores de respuestas condicionadas similares

a los obtenidos en los animales pseudocondicionados (6,77 ± 1,60 y 6,94 ± 1,18,

Page 78: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 66

respectivamente).

En la evolución de su aprendizaje, los animales condicionados presentaron un

promedio de 34,58 ± 5,67 % de respuestas durante la cuarta sesión de condicionamiento.

Este porcentaje fue incrementándose de manera asintótica hasta llegar a valores mayores a

60 % de respuestas condicionadas en las sesiones 9 y 10 de condicionamiento. Durante la

fase de extinción se produjo una disminución del porcentaje de respuestas condicionadas

(13,01 ± 3,64 en la cuarta sesión). En cambio, los animales pseudocondicionados tuvieron

un bajo rendimiento a lo largo de todo las etapas del condicionamiento y nunca lograron

sobrepasar el 7 % de respuestas condicionadas durante las sesiones de entrenamiento.

Figura 4.2 Curva de aprendizaje expresado como el porcentaje de respuestas condicionadas en los grupos

condicionado y pseudocondicionado, durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción. Se

obtuvieron diferencias significativas entre ambos grupos en todas las sesiones de condicionamiento y

extinción, a excepción de la sesión 4 de extinción (F (18,54) = 32,34, P < 0,001).

* * * * * * * * * * * * * *

Page 79: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 67

Considerando que todos los animales pseudocondicionados tuvieron respuestas

reflejas normales en respuesta a los estímulos eléctricos de la rama supraorbitaria del

trigémino, la ausencia de respuestas condicionadas no se debió a ningún problema en la

cirugía de implante de electrodos o a errores técnicos en los equipos de registro. Los

porcentajes de respuestas condicionadas de los animales control comparados con los

animales pseudocondicionados fueron estadisticamente diferentes (P < 0,001, ANOVA de

dos vías, F (18, 54) = 32,34).

4.2.2 Área bajo la curva de las respuestas condicionadas

La evolución del área bajo la curva de las respuestas condicionadas de ambos

grupos estudiados se muestran en la Figura 4.3, durante las sesiones de habituación,

condicionamiento y extinción. Se entiende como el área bajo la curva la presencia de

componentes estables del registro electroencefalográfico que corresponden a la respuesta

condicionada. Dicha respuesta se midió en el registro del electromiograma como la

variación con respecto a la línea base. Durante la sesiones de habituación, no se observaron

diferencias significativas entre ambos grupos (ANOVA dos vías, t ═ 1,507, P < 0,01). En

las primeras cinco sesiones de condicionamiento tampoco se obtuvieron diferencias

significativas. Las diferencias empezaron a manifestarse a partir de la sexta sesión,

incrementándose hasta la sesión 10. Finalmente, en las sesiones de extinción, aun cuando el

área bajo la curva disminuyó, sus valores siguieron siendo significativamente mayores a los

encontrados en el grupo pseudocondicionado. En el caso del grupo pseudocondicionado,

los valores promedios de las áreas bajo la curva se mantuvieron relativamente constantes

durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción.

4.2.3 Amplitud máxima de las respuestas condicionadas

Como se ilustra en la Figura 4.4, la evolución de la amplitud máxima de las

respuestas condicionadas durante el paradigma de traza, se mantuvo durante la etapa de

habituación sin diferencias entre los grupos control (condicionado) y el

pseudocondicionado. La amplitud máxima de las respuestas condicionadas se determinó en

el registro electromiográfico del músculo orbicular de los párpados. Durante la mitad del

condicionamiento tampoco se observaron diferencias significativas; pero a partir del sexto

día de condicionamiento aparecieron diferencias entre ambos grupos (F (18,72) = 1,965; P <

Page 80: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 68

0,023). Estas diferencias se mantuvieron hasta finalizar las sesiones de condicionamiento y

durante la primera sesión de extinción. Posteriormente, la amplitud de las respuestas

condicionadas disminuyó a valores similares a los encontrados durante la primera parte del

condicionamiento. Aún cuando la amplitud de las respuestas condicionadas fue

incrementando paulatinamente durante la segunda parte del condicionamiento, sólo al final,

en la sesión 10, alcanzó su valor porcentual máximo: 1243,45 ± 34,26 (mV x ms).

Figura 4.3 Evolución de la variación del área bajo la curva de las respuestas condicionadas expresada en porcentaje. Las respuestas se obtuvieron durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción

para el condicionamiento clásico del reflejo palpebral. Los datos se obtuvieron de animales condicionados (n

= 5) y pseudocondicionados (n = 5) y se encontraron diferencias significativas a partir de la sesión 6 de

condicionamiento hasta la sesión 5 de extinción (F (18,72) = 3,29, P < 0,001). El área bajo la curva se expresa

como el porcentaje de aumento con respecto a los valores de la línea base, calculado en el registro

electromiográfico del músculo orbicular de los párpados. Los círculos corresponden a los valores promedios y

sus desviaciones estándar para ambos grupos.

1 5 10

Condicionamiento o Pseudocondicionamiento

* * * * * * * ** *

Page 81: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 69

Esta variación de la amplitud máxima de la respuesta condicionada está

estrechamente relacionada con la prueba de aprendizaje, debido a que los animales

pseudocondicionados no mostraron ningún tipo de variación con respecto a los valores

promedios de sus respuestas condicionadas durante las sesiones de condicionamiento.

Figura 4.4 Evolución temporal de las variaciones de amplitud de las respuestas condicionadas durante las

sesiones de habituación, condicionamiento y extinción. A partir de la sesión 6 de condicionamiento se

obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (F (18,72) = 1,965 ; P < 0,023), las

cuales se mantuvieron hasta la primera sesión de extinción. La amplitud de la respuesta condicionada se

expresa como el porcentaje de aumento con respecto a los valores de la línea base en el registro

electromiográfico del músculo orbicular de los párpados. Los círculos corresponden a los valores promedios,

con indicación de los errores estándar para ambos grupos.

* * * * * *

Page 82: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 70

4.2.4 Latencia de inicio y al pico máximo de las respuestas condicionadas

Se analizaron tanto la latencia de inicio, como la latencia al pico máximo de las

respuestas condicionadas en los registros electromiográficos del musculo orbicular del

grupo condicionado durante las sesiones de condicionamiento y extinción. No se incluyeron

las sesiones de habituación porque en ellas no se presentaron respuestas condicionadas,

sino más bien repuestas tipo alfa o de sensibilización (ver Gruart y col., 1995). En lo que

respecta a las latencias al pico máximo de la respuesta condicionada (ver Figura 4.5), al

inicio de las sesiones de condicionamiento los valores de las latencias fueron cercanos a los

400 ms pero a medida que transcurrieron las sesiones de condicionamiento sus valores

disminuyeron progresivamente. En el caso de la sesiones de extinción, se observó la

tendencia inversa. Es decir, hubo un incremento progresivo pero que no alcanzó los valores

de las primeras sesiones de condicionamiento. La misma tendencia se observó en las

latencias al inicio de la respuesta condicionada (ver Figura 4.6) en las que inicialmente los

valores fueron cercanos a los 320 ± 20 ms. Pero a medida que transcurrieron las sesiones,

se observó una disminución en la latencia de la respuesta condicionada respecto del

estímulo condicionado (condicionamiento 10 = 200 ± 30 ms)

Figura 4.5 Gráfico que muestra los valores promedios y sus errores estándar de las latencias al pico máximo

de la amplitud de las respuestas condicionadas (RC) en las sesiones de condicionamiento dos y nueve (C2 y

C9) y los valores recogidos en las sesiones de extinción dos y cuatro (E2 y E4).

Latencia al Pico de la RC (m

s)

0

100

200

300

400

C2 C9 E2 E4

Page 83: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 71

Figura 4.6 Gráfico que muestra los valores promedios y sus errores estándar de las latencias al inicio de las

respuestas condicionadas (RC) en las sesiones de condicionamiento dos, cinco y nueve (C2, C5 y C9) y los

valores recogidos en las sesiones de extinción dos y cuatro (E2 y E4).

4.2.5 Características electromiográficas de las respuestas condicionadas

En la parte superior de la Figura 4.7 se ilustra el protocolo de traza empleado para el

condicionamiento clásico del reflejo palpebral. Este protocolo de condicionamiento clásico

consiste en la aplicación de un estímulo condicionado (tono 20 ms, 2.400 Hercios y 85 dB)

distanciado 500 ms del estímulo incondicionado que fue un choque eléctrico de 500 µs, tres

veces el umbral de activación y con una intensidad menor de 1 mA. En la parte intermedia

de la misma figura se ilustra el estímulo eléctrico que se aplicó en el hipocampo, a los 300

ms del inicio del estímulo condicionado, con una duración de 50 µs.

En la Figura 4.7 se muestran también ejemplos de respuestas electromiográficas

registradas en un animal experimental durante las diferentes etapas del condicionamiento.

En la fase de habituación se observó que en el espacio interestímulo no hubo actividad

electromiográfica, sólo un ligero incremento en respuesta al estímulo condicionado. En el

tercer día de condicionamiento se evidenció una respuesta en el espacio entre los estímulos

condicionados e incondicionados (ver flecha con N° 1). Dicha respuesta fue de baja

amplitud y área bajo la curva. En la misma sesión también se observa la respuesta refleja al

Latencia de inicio de la RC (m

s)

Page 84: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 72

Figura 4.7 En la parte superior de la figura se representa el paradigma experimental empleado para el

condicionamiento clásico del reflejo palpebral, el cual incluye la aplicación de un estímulo condicionado (EC)

y uno incondicionado (EI). En la figura se indican las características de ambos estímulos. En el intervalo entre

ambos estímulos se aplicó un pulso simple (100 µs, cuadrado y bifásico) en el hipocampo. Abajo en la figura

se muestran ejemplos de los registros electromiográficos obtenidos en un mismo animal durante las diferentes

sesiones de habituación (Habit 2), condicionamiento (Condi 3 y 9) y extinción (Extinc 4). Nótese cómo el

tamaño de la respuesta condicionada se incrementa hacia las sesiones finales del condicionamiento y

desaparece en la extinción.

50 ms

Habit 2

Condi 3

Extinc 4 O.O. EMG

EC

EI

1 2

3 4

Page 85: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 73

estímulo incondicionado (ver flecha con N° 2). Hacia el día nueve de condicionamiento se

observó que la respuesta condicionada se incrementó, involucrando una mayor cantidad de

unidades motoras, implicando un aumento del área bajo la curva (ver flecha N° 3). Como se

puede ver la respuesta refleja se mantuvo presente (ver flecha N° 4). Finalmente, en la

sesión cuatro de la extinción se observó la ausencia de respuestas condicionadas.

Así pues, durante la prueba de condicionamiento clásico del reflejo corneal con un

paradigma de traza, los animales experimentales modificaron las respuestas condicionadas,

incrementando la amplitud y duración de las mismas, lo cual implica que las conexiones

sinápticas se potenciaron, pudiendo involucrar un mayor número de unidades motoras o

mejorando la eficacia en la transmisión sináptica.

4.3 CÁLCULO DE LA VARIACIÓN DE LA PENDIENTE EN LOS REGISTROS

DE POTENCIALES DE CAMPO SINÁPTICOS EN EL HIPOCAMPO, DURANTE

EL CONDICIONAMIENTO CLÁSICO DEL REFLEJO PALPEBRAL

Los potenciales sinápticos de campo (siglas en inglés: fEPSP) provocados en las

sinapsis del giro dentado, y en las de las piramidales de CA3 y CA1, por la aplicación de un

pulso simple en la vía perforante homolateral, se registraron en paralelo con la adquisición

de una respuesta condicionada con el paradigma de traza para el condicionamiento clásico

del reflejo palpebral. Estos fEPSPs presentaron un comportamiento inverso en las sinapsis

del giro dentado y CA3 con respecto a las de CA1. En los dos primeros casos, se observó

una facilitación mientras que, en el caso de las piramidales de CA1, se observó una

inhibición (ver Figura 4.8). De acuerdo con recientes estudios (Gruart y col., 2006;

Madroñal y col., 2007; Whitlock y col., 2006) estas modificaciones a nivel sináptico están

relacionados con la generación de las respuestas palpebrales aprendidas. Las diferencias

entre los tres sitios se observaron a partir de la primera sesión de condicionamiento, con

una mayor pendiente en el caso de las piramidales de CA3 y en menor medida en el giro

dentado. Estas diferencias se mantuvieron entre los tres sitios hasta la sesión 8 de

condicionamiento, posteriormente las piramidales de CA3 decrecen en sus valores y

pierden significancia respecto de las células granulosas del giro dentado que continúan

incrementando sus valores (F (36, 108) = 8,419, P = 0,001).

Page 86: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 74

En el caso de las piramidales de CA1, su descenso comienza en la primera sesión en

valores de un 25% por debajo de la línea base. Estas diferencias se acentúan con el

transcurrir de las sesiones de condicionamiento y experimentan un incremento a partir de

las sesiones de extinción, logrando aproximarse a los valores registrados en la etapa de

habituación.

4.4 EFECTO DEL FÁRMACO RO 25-6981 EN ANIMALES SOMETIDOS A LA

PRUEBA DE CONDICIONAMIENTO CLÁSICO DEL REFLEJO PALPEBRAL

En este experimento contamos con dos grupos controles, los animales normales a

los cuales se les inyectó el vehículo (dimetil sulfóxido, DMSO, intraperitoneal) y los

animales pseudocondicionados a quienes también se les inyectó DMSO mas un grupo

experimental que recibió dosis diarias de un antagonista específico de la subunidad NR2B

del receptor NMDA (Ro 25-6981).

Durante la fase de habituación, no se obtuvieron diferencias estadísticamente

significativas entre los tres grupos. Sin embargo, a partir de la primera sesión de

condicionamiento, se observó que tanto el grupo experimental como el pseudocondicionado

tuvieron diferencias estadísticamente significativas, respecto del grupo control (ANOVA

dos vías, control frente pseudocondicionado t = 27,451 P < 0,01; control frente a

experimental t = 26,443 P < 0,01). Estas diferencias se mantuvieron durante las diez

sesiones de condicionamiento y las cinco de extinción.

Otra aproximación experimental empleada fue la administración de un antagonista

de la subunidad NR2B del receptor NMDA (Ro 25-6981) en animales que previamente

habían aprendido a asociar dos estímulos en el paradigma de traza del condicionamiento

clásico del reflejo palpebral. Esta inyección se realizó durante cinco días del período de

recondicionamiento (ver Figura 4.10). Los resultados obtenidos demuestran que los

animales que recibieron el fármaco durante los primeros cinco días de la etapa de

recondicionamiento sufrieron una inhibición en la capacidad de expresar la respuesta

condicionada, presentando porcentajes de respuestas condicionadas similares a los

obtenidos en la etapa de habituación. De hecho, el porcentaje de respuestas condicionadas

Page 87: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 75

durante estos cinco días presentó diferencias estadísticamente significativas respecto del

grupo control (F (9,45) = 27,34; P < 0,001).

Una vez que se les suspendió la administración del fármaco, los animales

experimentales aumentaron sus porcentajes de respuestas condicionadas aproximándose a

los valores del grupo control, pero siendo incapaces de lograr los porcentajes alcanzados

por dicho grupo (F (9,45) = 27,34; P < 0,001).

Figura 4.8 Evolución de los potenciales de campo evocados en el giro dentado (triángulos blancos),

piramidales de CA3 (triángulos negros) y piramidales de CA1 (triángulos rojos) por pulsos simples aplicados

a la vía perforante, durante las sesiones de habituación, condicionamiento y extinción. Se obtuvieron

diferencias significativas entre las tres regiones desde la sesión 1 a la 8 del condicionamiento. (F (36, 108) =

8,419, P = 0,001). Desde la sesión 9 de condicionamiento a la 5 de extinción se mantuvieron diferencias entre

el giro dentado y las piramidales de CA1 y entre las sesiones 9 de condicionamiento y 3 de extinción las

diferencias fueron entre las piramidales de CA1 y CA3. Asteriscos = * diferencia significativa entre CA3 y

CA1 (P < 0,001), ** diferencia significativa entre CA1 y giro dentado (P < 0,001), *** diferencia

significativa entre CA3 y giro dentado (P < 0,001).

75

50

100

125

150

170

ExtinciónCondicionamiento

Pendiente fEPSP (% de la línea base)

******

******

******

******

******

******

******

****** *** *** *** *** *** ** **

Page 88: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 76

Figura 4.9 Evolución de los porcentajes de respuestas condicionadas durante las sucesivas sesiones de aprendizaje (habituación, condicionamiento o pseudocondicionamiento y extinción) en ratas condicionadas,

pseudocondicionadas y ratas inyectadas con Ro 25-6981. Las diferencias entre el grupo condicionado y los

grupos pseudocondicionados y Ro 25-6981 fueron estadísticamente significativas en todas las sesiones de condicionamiento y extinción (asteriscos, P < 0,01). Abreviatura: DMSO, dimetil sulfóxido.

También se realizaron algunos estudios preliminares con el antagonista selectivo de

la subunidad NR2B del receptor NMDA ifenprodil (a una dosis de 10 mg/kg de peso, i.p.),

obteniéndose resultados similares a los descritos para el RO25-6981. Dado el pequeño

tamaño de la muestra, no se analizaron estadísticamente los resultados obtenidos

0

1 4

Habituación

Respuestas condicionadas (%)

20

40

60

80

100

Extinción

1

Condicionamiento yPseudocondicionamiento

5 10 1 5

* ** * ** * ** *** * **

Pseudo (DMSO)

Control (DMSO)

Ro 25-6981

Page 89: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 77

Figura 4.10 Efectos del fármaco Ro 25-6981 durante el recondicionamiento. Un grupo de animales se inyectó

con Ro 25-6981 (10 mg/kg, i.p., círculos negros) durante las cinco primeras sesiones. Se observaron

diferencias significativas entre los controles (círculos blancos) y los animales inyectados en las cinco primeras

sesiones de recondicionamiento (F (9,45) = 27,34 ; P < 0,001). Desde la sexta sesión en adelante, se suspendió

la administración del fármaco. En esta situación, los animales incrementaron su tasa de respuestas

condicionadas, pero fueron incapaces de alcanzar los valores del grupo control.

En paralelo con el estudio de la generación de las respuestas condicionadas, se

estudiaron las variaciones en los potenciales sinápticos de campo provocados en las células

del giro dentado por la estimulación con pulsos eléctricos simples de la vía perforante

medial a los 300 ms después de aplicado el estímulo condicionado (ver Figura 4.7). Los

fEPSPs inducidos en los dos grupos (control y experimental) incrementaron

progresivamente su pendiente, respecto de los valores basales establecidos con las

pendientes registradas en las sesiones de habituación. Este incremento alcanzó valores

cercanos al 125% durante las últimas sesiones. Se obtuvieron diferencias estadísticamente

significativas a partir de la sesión cuatro hasta la diez (F (18,90) = 54,32; P < 0,01), cuando se

compararon con los valores obtenidos en la habituación. Sin embargo, si se comparan

01 4

Habituación

Respuestas condicionadas (%)

20

40

60

80

100

1

Recondicionamiento5 10

Extinción1

Condicionamiento 5 10 1 5

* * * **

Page 90: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 78

ambos grupos en las distintas sesiones de habituación, condicionamiento y extinción, no se

obtuvieron diferencias estadísticamente significativas (F (18,90) = 0,37; P = 0,741).

Por otra parte, los potenciales evocados registrados durante las cinco primeras

sesiones de recondicionamiento en el grupo experimental fueron significativamente

menores a los valores obtenidos en el grupo control (F (9,45) = 83,04; P < 0,001).

Figura 11. Evolución de los potenciales sinápticos de campo evocados (fEPSP) en el giro dentado por pulsos

simples aplicados a la vía perforante en animales control (triángulos blancos) y animales inyectados con un

antagonista selectivo de la subunidad NR2B del receptor NMDA(Ro 25-6981, triángulos negros), durante las

sesiones de habituación, condicionamiento, extinción y recondicionamiento. Sólo en los primeros cinco días

de recondicionamiento se les inyectó Ro 25-6981 (10 mg/kg i.p.). Arriba se muestran ejemplos de fEPSPs

recogidos de ambos grupos experimentales en las sesiones indicadas por las flechas.

En estos experimentos, se analizó también la relación entre el porcentaje de

respuestas condicionadas y los valores de las pendientes de los potenciales de campo,

encontrando que estaban relacionados linealmente (r ≥ 0,75, P < 0,001) a lo largo de las

sesiones de condicionamiento (pendiente, 1,78), extinción (pendiente, 1,11) y

recondicionamiento (pendiente, 1,04), pero no con la habituación (ver Figura 4.12).

75

501 4

Habituación

100

125

150

1

Recondicionamiento5 10

Extinción1

Condicionamiento 5 10 1 5

* * * **

Pendiente fEPSP (% de la línea base)

5 ms0.5 mV

Page 91: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 79

Por otro lado, de el grupo experimental (que recibió la administración del Ro 25-

6981) no sólo no se pudo readquirir la respuesta condicionada ni la potenciación del fEPSP,

sino que tampoco se pudieron establecer diferencias significativas entre el porcentaje de

respuestas condicionadas y el valor de las pendientes de los fEPSPs (r = 0,36; P = 0,689;

ver Figura 4.13).

Figura 4.12 Análisis cuantitativo de la relación entre el porcentaje de respuestas condicionadas y las pendientes de los potenciales sinápticos de campo provocados (fEPSP) para el grupo control. Cada punto

representa el valor medio de sólo un animal durante la correspondiente sesión: habituación (triángulos

negros), condicionamiento (círculos negros), extinción (cuadrados negros) y recondicionamiento (círculos

blancos). Las líneas de regresión y sus correspondientes ecuaciones se incluyen sólo para coeficientes de

correlación estadísticamente significativos (P ≤ 0,05 y de un valor de r > 0,6).

Respuestas condicionadas (%)

20

050 75 100 125 150

40

60

80

100

Pendiente fEPSP (% de la línea base)

Y = -76,84 + 1,11x; = 0,76, < 0,001r P

Y = -165,9 + 1,78x; = 0,81, < 0,001 r P

Y = -62,83 + 1,04x; = 0,75, < 0,001r P

r P = 0,01, = 0,974

Page 92: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 80

Figura 4.13 Análisis cuantitativo de la relación entre el porcentaje de respuestas condicionadas y las

pendientes de los potenciales de campo (fEPSP) para el grupo inyectado con Ro 25-6981, un antagonista

selectivo de la subunidad NR2B de los receptores NMDA. Cada punto representa el valor medio de sólo un

animal durante la correspondiente sesión: habituación (triángulos oscuros), condicionamiento (círculos

oscuros), extinción (cuadrados oscuros) y recondicionamiento (círculos claros). Las líneas de regresión y sus

correspondientes ecuaciones sólo se incluyen para coeficientes de correlación estadísticamente significativos

y de r > 0,6. Los resultados obtenidos en las primeras cinco sesiones de recondicionamiento, durante las

cuales se les inyectó Ro 25-6981, se indican por la flecha (círculos sombreados). Nótese que no hay una

relación lineal entre las respuestas condicionadas y las pendientes de los fEPSP (r > 0,36, P = 0,689) en los

animales inyectados con Ro 25-6981 durante las primeras cinco sesiones de recondicionamiento.

4.5 EFECTO DEL FÁRMACO RO 25-6981 EN LA PRUEBA

ELECTROFISIOLÓGICA DE POTENCIACIÓN A LARGO PLAZO

Este experimento se diseño para determinar qué papel desempeña la subunidad

NR2B del receptor NMDA en la potenciación a largo plazo evocada in vivo en las células

granulares del hipocampo, estimulando en la vía perforante medial. Se formaron tres grupos

de animales. Aquellos que recibieron una dosis única del antagonista Ro 25-6981 fue el

Respuestas condicionadas (%)

20

050 75 100 125 150

40

60

80

100

Pendiente fEPSP (% de la línea base)

Y = -32,34 + 0,74x; = 0,65, < 0,001 r PY = -76,94 + 1,05x;

= 0,67, < 0,001r P r P = 0,36, = 0,689

Y = -98,64 + 1,33x; = 0,74, < ,.001 r P

r P = 0,01, = 0,861

Page 93: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 81

grupo experimental. Además se realizaron dos grupos controles: uno que recibió una

inyección del vehículo (DMSO) y otro que no recibió ningún tratamiento previo. Como se

ilustra en la Figura 4.14, tras registrar la línea base durante 15 min se aplicó un protocolo

de potenciación a largo plazo. Se obtuvieron incrementos del orden de los 250% a 300% en

los valores promedio de las pendientes de los potenciales de campo (fEPSPs) registrados,

todas estadísticamente significativas respecto de los valores obtenidos en la línea basal

(ANOVA de dos vías, F(10,50) = 140,7; P ≤ 0,01). Sin embargo, no se obtuvieron diferencias

estadísticamente significativas entre los grupos, comportándose los tres de manera similar.

En el caso del grupo experimental se puede señalar que el valor de la pendiente porcentual

máxima fue menor comparada con los otros grupos y su descenso se produjo a los 80 min

de registro. El grupo control y el grupo DMSO tuvieron valores mayores en las variaciones

de la pendiente pero presentaron descensos diferenciados: el grupo control inició su

descenso a los 50 minutos de registro y el grupo DMSO pasados los 80 min. En los tres

casos, los animales recuperaron los valores basales al final de los 110 minutos.

4.6 EFECTO DEL FÁRMACO RO 25-6981 EN LA PRUEBA

ELECTROFISIOLÓGICA DE DEPRESIÓN A LARGO PLAZO

La prueba complementaria a la potenciación a largo plazo, es la depresión a largo

plazo (o LTD, del inglés long-term potentiation) ya que en ella también participan los

receptores de glutamato del tipo NMDA. Empleando los mismos grupos experimentales, se

estableció la línea base durante 15 minutos con estímulos de baja frecuencia (0,3 Hercios).

Posteriormente, se indujo una depresión a largo plazo empleando un protocolo de estímulos

a baja frecuencia (600 pulsos a 1 Hercio) por diez minutos.

Sólo los grupos control y DMSO experimentaron un descenso en los valores de las

pendientes, alcanzando valores del 60%, estableciendo diferencias estadísticamente

significativas respecto del grupo que recibió el fármaco Ro 25-6981. El grupo control

experimento una LTD que duró aproximadamente 60 min, mientras que el grupo que

recibió el vehículo DMSO tuvo una LTD cercana a los 110 min. Por otro lado, el grupo que

recibió el antagonista selectivo de la subunidad NR2B no experimento una depresión a

largo plazo. Desde el punto de vista estadístico, se obtuvo que el grupo Ro 25-6981 no

presentó diferencias al compararse con los valores basales; en cambio, los grupos control y

Page 94: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 82

DMSO presentaron diferencias estadísticamente significativas (P ≤ 0,01; ANOVA de dos

vías, F (10,50) = 82,1) en los valores de las pendientes de los potenciales de campo evocados,

al compararlos con los valores de la línea basal.

Figura 4.14 Efecto del fármaco Ro 25-6981, antagonista selectivo de la subunidad NR2B de los receptores de NMDA, en la potenciación a largo plazo in vivo medido como la evolución de la pendiente de los potenciales

de campo provocados (fEPSPs) con pulsos de baja frecuencia. A, en tres series experimentales se indujo un

protocolo de potenciación a largo plazo (LTP) en los tres grupos de animales. Arriba se ilustran ejemplos de

registros de fEPSPs recogidos durante los tiempos (línea base, 1 y 2) indicados en A. B, los valores de las

medias obtenidas para los grupos control (n = 10), DMSO (n = 4) y Ro 25-6981(n = 5) fueron

estadísticamente diferentes de los valores de la línea basal (P ≤ 0,01, ANOVA de dos vías, F(10,50) = 140,7)

pero no hubo diferencias estadísticamente significativas si se comparan los grupos entre sí. Abreviatura:

DMSO, dimetil sulfóxido.

4.7 INDUCCIÓN DE POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN A LARGO PLAZO EN

TRES SITIOS DE RELEVO SINÁPTICO DEL HIPOCAMPO AL ESTIMULAR LA

VÍA PERFORANTE HOMOLATERAL

De acuerdo con en el diseño del modelo experimental propuesto en este estudio, se

estimuló en el borde angular homolateral a los sitios de registro (CA1, CA3 y giro

Tiempo (min)

0 0

250 250

150 150

200 200

350 350

300 300

Pendiente fEPSP (%

de la línea base)

Pendiente fEPSP (%

de la línea base)

100 100

50 50

0 20 40 60 80 100 120

Línea base

30 min

15 min

60 min

90 min

120 min-20

HFS

DMSO

DMSO

1

1 1 1

2

22 2

Línea base

Línea base

B

Control

Control

Ro 25-6981

Ro 25-6981

5 ms0.5 mV

*

*

*

*

*

***

**

*

*

Línea base Línea base

A

Page 95: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 83

dentado). Antes de aplicar el protocolo de depresión a largo plazo se registró la actividad

electroencefalográfica y posteriormente se aplicaron pulsos de baja frecuencia para

determinar las características de los potenciales de campo monosinápticos en cada sitio de

registro, estableciendo para cada sitio los valores de la línea basal. Así mismo, se realizó un

protocolo de potenciación a largo plazo en 6 animales, el cual consistió en 15 min de

registro de la línea base. Para ello se aplicaron estímulos simples de una frecuencia de 0,2

Hercios, una duración de 50 µs, una latencia de 70 µs y una intensidad entre 0,4 a 2 mA.

Figura 4.15 Efecto del fármaco Ro 25-6981, antagonista selectivo de la subunidad NR2B de los receptores de

NMDA, en la depresión a largo plazo in vivo medido como la evolución de la pendiente de los potenciales de

campo provocados (fEPSP) con pulsos de baja frecuencia. A, en tres series de experimentos se indujo una

depresión a largo plazo (LTD) que duró algo más de 80 min para los animales control (n = 5) y cercano a los

110 para los animales con vehículo (DMSO, n = 5). Los animales que se inyectaron con Ro 25-6981, (n = 6)

no presentaron signos de LTD. Arriba se ilustran ejemplos de registros de fEPSPs recogidos durante los

tiempo (línea base, 1 y 2) indicados en A. B a la derecha de la figura se muestran los valores medios

recolectados para cada grupo y sus errores estándar, confirmando que el grupo Ro 25-6981 no presenta

indicación de LTD, mientras los grupos control y DMSO presentan una disminución significativa en la

pendiente los potenciales de campo comparados con los valores de la línea base (P ≤ 0,01; ANOVA de dos

vías, F(10,50) = 82,1). Abreviatura: DMSO, dimetil sulfóxido.

Tiempo (min)

0 0

100 100

60 60

80 80

140

120 120

Pendiente fEPSP (%

de la línea base)

Pendiente fEPSP (%

de la línea base)

40 40

20 20

0 20 40 60 80 100 120

Línea base

30 min

15 min

60 min

90 min

120 min-20

LFS

DMSO

DMSO

1

11

2

2

2 21

Línea Base

Línea Base

B

Control

Control

Ro 25-6981

Ro 25-6981

5 ms0.5 mV

*

*

*

*

*

*

*

*

Línea Base

Línea Base

A

Page 96: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 84

Los estímulos se aplicaron en la región del borde angular, donde atraviesa un gran

número de fibras de la vía perforante. Posteriormente, se aplicaron cinco trenes de alta

frecuencia (200 Hercios) por seis veces, con un intervalo de 1 minuto y una duración de

100 ms. Al regresar a las condiciones basales, se observaron cambios en la pendiente del

potencial de campo registrado, siendo estos cambios más notorios en los sitios de CA3 y

CA1.

En los animales estudiados, el protocolo de potenciación a largo plazo empleado

indujo la respuesta de potenciación de manera simultánea en los tres sitios registrados. Sin

embargo, la evolución temporal de cada sitio fue diferente (ver Figura 4.16). Así, en los

potenciales de campo registrados en CA3 se obtuvieron los mayores incrementos

porcentuales (382 ± 45%), pero a los 5 minutos los valores de los fEPSP evocados

descendieron rápidamente a valores superiores al 200%, manteniéndose dentro de ese rango

hasta el final del registro (120 min). Las pendientes registradas en las células piramidales

de CA1 aumentaron a valores ligeramente superiores al 300% y los valores descendieron

de manera menos pronunciada, llegando a los 40 minutos a valores estables dentro del

rango de los 240%. En el giro dentado, el incremento post estimulación de alta frecuencia,

fue menor comparado con los otros sitios registrados (296 ± 31%). La disminución de los

valores de las pendientes se acentuaron durante los primeros 20 minutos y tuvo una

duración de sólo 60 minutos. En este último caso, la corta duración de la potenciación

inducida en el giro dentado por la estimulación a alta frecuencia de la vía perforante no

permite hablar de potenciación a largo plazo, en sentido estricto.

En el caso de la depresión a largo plazo, se obtuvo una disminución simultánea en

los tres sitios de registro de un 70%. Esta disminución se mantuvo con pocas variaciones

durante los 120 minutos de registro, mostrando un patrón similar en la evolución temporal

de los sitios sometidos al protocolo de LTD (ver Figura 4.17).

En algunos animales (n = 2), se siguió la evolución de la LTP y de la LTD en días

sucesivos. En ambas situaciones experimentales, la LTP y la LTD se mantuvieron hasta 4

días tras las sesiones de estimulación a alta y baja frecuencia, respectivamente. Dado el

pequeño tamaño de la muestra no se realizó un análisis cuantitativo de los datos obtenidos.

Page 97: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 85

Figura 4.16 Potenciación a largo plazo en tres sitios del hipocampo por estimulación en la vía perforante.

Evolución temporal del promedio ± el desvío estándar de la pendiente de los potenciales de campo

provocados (fEPSP) en los tres sitios de relevo sináptico CA3, CA1 y giro dentado (G.D.) expresados como

aumento porcentual con relación a la línea de base (15 minutos antes de la estimulación tetánica en la vía

perforante). Estimulación basal: Un pulso de 50 µs de duración, 0,6 mA de intensidad, a una frecuencia de 0,1

Hercios. Estimulación tetánica o de pulsos de alta frecuencia (HFS): Pulsos de 50 µs de duración, 1 mA de

intensidad, a una frecuencia de 100 Hercios. Durante la HFS se aplicó un total de 600 estímulos. Abreviatura:

HFS (siglas en inglés de High Frecuency Stimulation)

4.8 PRUEBA DE PULSOS PAREADOS

Se implementó la prueba de pulsos pareados a fin de conocer las características

funcionales de las principales sinapsis registradas en el hipocampo y su relación con las

fibras aferentes de la vía perforante. De las cuatro modalidades implementadas se observó

que las sinapsis entre la vía perforante y CA3 presentaron facilitación en el primer intervalo

interestímulo registrado y esa facilitación se mantuvo hasta los 50 ms salvo cuando se

aplicaron los estímulos a 5 Hercios, donde hubo inhibición entre los 20 y 50 ms. En CA1 se

HFS

0 20 40 60 80 100 120-15

Tiempo (min)

Pendiente

(% de la linea base)

fEPSP

Page 98: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 86

observó facilitación en las frecuencias de 0,03 Hercios a la intensidad alta y a 1 y 5 Hercios

en el primer intervalo interestímulos. Hubo inhibición en la frecuencia de 0,03 Hercios a

baja intensidad en la sinapsis entre la vía perforante y CA3. Finalmente, en la sinapsis del

giro dentado con las aferencias de la vía perforante hubo inhibición en los tres primeros

intervalos interestímulos a excepción de la frecuencia de 5 Hercios.

Figura 4.17 Depresión a largo plazo en tres sitios del hipocampo por estimulación en la vía perforante. Evolución temporal del promedio ± el desvío estándar de la pendiente de los potenciales de campo

provocados (fEPSP) en los tres sitios de relevo sináptico CA3, CA1 y giro dentado (G.D.) expresados como

aumento porcentual con relación a la línea de base (15 minutos antes de la estimulación en la vía perforante).

Estimulación basal: 50 µs de duración, 0,6 mA de intensidad, frecuencia de 0,1 Hz. Estimulación de pulsos de

baja frecuencia (LFS) presentada para provocar la depresión a largo plazo: 50 µs de duración, 1 mA de

intensidad, frecuencia de 1 Hercios. Abreviatura: LFS (siglas en inglés de Low Frecuency Stimulation).

0

100

60

80

180

160

Pendiente

(% de la línea bas)

fEPSP

40

20

LFS

100

120

140

Tiempo (min)

0 20 40 60 80 100 120-15

Page 99: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 87

Figura 4.18 Gráficos de las variaciones de los potenciales de campo en la prueba de pulsos pareados. El

protocolo implementado consistió en series de siete pares de pulsos con intervalos interestímulos crecientes

(10, 20, 30, 50, 100, 200 y 500 ms). Cada serie tuvo una duración de un minuto y se representó el porcentaje

de variación de la pendiente de la respuesta del segundo pulso en relación con la pendiente de la respuesta del

primer pulso. Las frecuencias de estimulación fueron de 0,03, 1 y 5 Hercios. En el caso de la frecuencia de

0,03 Hercios se registró además con intensidades mínimas (arriba a la derecha) y máximas (arriba a la

izquierda). Sólo se obtuvieron diferencias estadísticamente significativas entre las regiones de CA1 y CA3, y

CA1 y GD para la frecuencia de 0,03 Hercios y en el primer intervalo interestímulos (F (12,12) = 11, 30; P <

0,001)

4.9 COMPROBACIÓN HISTOLÓGICA DE LA LOCALIZACIÓN FINAL DE LOS

ELECTRODOS DE ESTIMULACIÓN Y REGISTRO

A la finalización de los experimentos, se realizaron cortes coronales de los cerebros

de los animales experimentales a fin de determinar la correcta ubicación de los electrodos

de estimulación y registro. Los cortes se montaron y tiñeron con la técnica de Nissl con

azul de toluidina al 0,1%, como se explica en la sección de Materiales y Métodos.

Porcentaje de cambio Ca1

GD

Ca3

Intervalo interestímulos (ms)

Frec. Estim = 0,03 Hercios(alta intensidad)

Porcentaje de cambio Ca1

GD

Ca3

Intervalo interestímulos (ms)

Frec. Estim = 1 Hercio

Intervalo interestímulos (ms)

Frec. Estim = 5 Hercios

Porcentaje de cam

bio

Ca1

GD

Ca3

10 20 30 50 100 200 500

Ca1

GD

Ca3*

**

-100

-50

0

50

100

150

Porcentaje de cambio

Intervalo interestímulos (ms)

Frec. Estim = 0,03 Hercios(baja intensidad)

Page 100: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Resultados 88

En las fotomicrografías de la Figura 4.19 se muestran la ubicación de los electrodos

en los tres sitios de registro [CA1, CA3 y giro dentado (G.D.)] y en el sitio de estimulación

(vía perforante, V.p). Los datos cuantitativos utilizados en el presente estudio se

seleccionaron de entre aquellos registros en los que la posterior comprobación histológica

indicó una correcta ubicación de los electrodos de estimulación y registro.

Figura 4.19 Fotomicrografías de cortes de hipocampo de rata, teñidos con la tinción de Nissl, en los que las

flechas señalan la ubicación final de los electrodos de registro en el estrato piramidal de CA1 y CA3 y en el

estrato granular del giro dentado. Se señala además en la fotografía inferior derecha la posición de los

electrodos de estimulación en el borde angular por donde atraviesa la vía perforante. Barras de calibración:

500 µm. Abreviaciones: D, M, dorsal, medial; G.D., giro dentado; V.p., vía perforante.

1. CA 1

3. G.D. 4. V.p.

CA1

CA 3G.D.

CA1

CA 3

G.D.

CA1

CA 3G.D.

V.p.

500µm

D

M

500µm 500µm

500µm

Page 101: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 89

5. DISCUSIÓN

Page 102: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 90

Page 103: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 91

5.1 DISEÑO DE UN MODELO PARA EL ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD

HIPOCAMPAL DURANTE PRUEBAS DE APRENDIZAJE ASOCIATIVO Y DE

POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN SINÁPTICA

Como se señaló en la Introducción de este estudio, los modelos animales in vivo

para el estudio de la fisiología del hipocampo difieren de los que se realizan en rodajas

de cerebro, ya que en rodajas se cortan las conexiones neuronales provenientes de

regiones más alejadas a esta estructura (Matthews y col., 1976). Por lo tanto, los

circuitos presentes en las rodajas carecen de factores importantes como las aferencias

tónicas que recibe el hipocampo (por ejemplo: septum medial, núcleo del rafe medial,

locus coeruleus, etc.) y que están presentes en el animal intacto cuando se produce el

aprendizaje (Herreras y col., 1988, Freund y Antal, 1988; Frotscher y Leranth, 1988;

Freund y col., 1990). Además, es un método ciertamente artificial cuando se compara

con procesos funcionales en un animal intacto (Hassan y col., 2006) y que está sujeto al

deterioro de la rodaja en el tiempo (Teyler, 1980). Aún así, los estudios realizados en

rodajas de hipocampo han permitido avanzar en nuestros conocimientos acerca de la

fisiología sináptica y de la intervención de numerosos fenómenos moleculares y

celulares en los procesos de aprendizaje y memoria. Una buena forma de complementar

las limitaciones en el uso de registros de rodajas in vitro, es estudiar los mismos

fenómenos en un animal in vivo (Hassan y col., 2006). Las diferencias se presentan

incluso con el uso de modelos de animales anestesiados, en los que la utilización de

anestésicos como el uretano producen una disminución de las pendientes de los

potenciales de campo excitatorios postsinapticos y eliminan la presencia de las espigas

poblacionales (Riedel y col., 1994; Hassan y col., 2006).

Al ser nuestro interés el análisis de funciones cognitivas como la memoria y el

aprendizaje en una estructura como el hipocampo (lo cual involucra la activación de

grupos neuronales ampliamente distribuidos) fue necesario que en el diseño del modelo

experimental se tuviese en cuenta que el implante crónico de los electrodos en el

hipocampo no afectara la salud ni la libre movilidad de la rata dentro de su hábitat,

permitiendo, además, el registro electroencefalográfico en el animal despierto. Los

modelos animales que utilizan implantes crónicos publicados a la fecha consideran sólo

uno o dos sitios de registro en hipocampo (Moyer y col., 1996; Davis y col., 1997;

Múnera y col., 2001 ; Gilmartin y McEchron 2005; Hassan y col., 2006; Gruart y col.,

2006 y 2007; Valenzuela-Harrington y col., 2007), lo cual supone que se estudia el

sistema parcialmente, considerando sólo algunas vías sinápticas dentro de un sistema

Page 104: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 92

complejo donde interactúan una importante red de interneuronas y las células

piramidales y granulares del hipocampo que son las principales células de esta

estructura en procesos de aprendizaje asociativo (McEchron y Disterhoft, 1997; Gruart

y col., 2006; Whitlock y col., 2006). Tomando en consideración los estudios de Yeckel

y Berger (1990), en los que se redefine el circuito trisináptico del hipocampo,

describiendo que las aferencias provenientes de la corteza entorrinal pueden hacer

sinapsis con las células granulares del giro dentado, las células piramidales de CA3 y las

células piramidales de CA1 de manera monosináptica, se buscó obtener registros

monosinápticos en todos los sitios del circuito trisináptico del hipocampo mediante la

estimulación de la vía perforante.

Es importante señalar que en el diseño del modelo experimental se tuvo que

considerar el tipo de electrodo que se utilizaría, buscando emplear el de menor diámetro

a fin de provocar el menor daño posible en el tejido nervioso, que tuviera la suficiente

rigidez para no torcerse durante el descenso hacia la región de registro o estimulación y

que evitara adecuadamente las señales ruidosas de origen no nervioso. Además, se

adaptó una torreta que debía ser lo suficientemente fuerte para evitar que la rata, un

animal que se acicala constantemente, no la dañase, o se la sacara, y que tuviese un

tamaño pequeño para que le permitiera libertad de movimientos dentro de su jaula.

Como se detalló en la sección de Materiales y Métodos, cada animal experimental tuvo

finalmente ocho electrodos de registro, distribuidos en: cuatro para giro dentado, dos

para las células piramidales de CA1 y dos para las células piramidales de CA3. Esto

permitió, incluso, poder seleccionar cuál de los sitios de registro tenía el mejor potencial

de campo sináptico para estudiar. Adicionalmente, se agregaron dos electrodos de

estimulación. El modelo incluyó así mismo electrodos para el registro de la

electromiografía del músculo orbicular de los párpados y para la estimulación de la

rama supraorbitaria del nervio trigémino. Todos estos electrodos se concentraron en

cuatro torretas, lo cual permitió que, por su bajo peso y la reducción de la superficie de

contacto, los animales pudieran desenvolverse con comodidad dentro de su jaula,

disminuyendo el estrés.

El modelo diseñado y empleado en este trabajo, al desplazar de manera

independiente los electrodos de estimulación y registro, permitió seleccionar aquellas

sinapsis que son específicamente estimuladas, de manera que hizo posible la inducción

de potenciales sinápticos de campo con intensidades muy bajas de estimulación,

atenuando la activación inespecífica de las transmisiones sinápticas que pudieran alterar

Page 105: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 93

los registros electroencefalográficos. Además, esta independencia de movimiento de los

electrodos de registro y de estimulación, a la hora de su implementación, permitió

potenciar una de las ventajas de la LTP denominada especificidad, por la cual las

sinapsis que se modifican son aquellas que son específicamente estimuladas (Whitlock

y col., 2006).

Hasta la fecha no se ha publicado ningún estudio realizado en roedores, que

suponga el registro simultáneo en el hipocampo de tres sitios diferentes, estimulando en

una de sus principales vía aferentes como es la vía perforante, lo cual convierte a este

modelo experimental en el primero que permite estudiar en tiempo real las variaciones

funcionales en el circuito del hipocampo en una prueba de aprendizaje asociativo, así

como en pruebas de eficacia sináptica.

5.2 PATRONES DE ACTIVIDAD HIPOCAMPAL DURANTE PRUEBAS DE

APRENDIZAJE ASOCIATIVO

En este estudio se tuvieron en cuenta los antecedentes anatómicos que

cláramente señalan que la vía perforante es la principal aferencia al hipocampo,

estableciendo conexiones monosinapticas con las células granulosas del giro dentado

(Lee y Kesner, 2004), las piramidales de CA3 (Steward, 1976; Lee y Kesner, 2004) y

las piramidales de CA1 (Doller y Weight, 1982). En el caso de las sinapsis entre la vía

perforante y CA3, su número puede llegar a ser casi igual al que establece las vía

perforante con el giro dentado, lo que indica la importancia que adquiere esta vía para el

funcionamiento de las células piramidales de CA3 (Berzhanskaya y col., 2001). En el

trabajo de McNaughton y col., 1989 se demostró que las células de lugar siguen

disparando en las áreas de CA1 y CA3 aún después de destruir las células del giro

dentado. Estos hallazgos sugieren que las aferencias directas de la vía perforante sobre

CA3 y CA1 desempeñan un rol importante en el funcionamiento del hipocampo

(Berzhanskaya y col., 2001). Además, las extensas colaterales excitatorias dentro del

campo de CA3 constituyen el principal candidato para un sistema de memoria

recurrente de corto plazo en el hipocampo (Weibe y col., 1997). Esto es así porque las

células piramidales de CA3 presentan una prolongada actividad post-estímulo frente a

aferencias sensoriales presentadas en paradigmas de condicionamiento con retraso (Otto

y Eichenbaum, 1992; Wiebe y Staübli, 1996), paradigmas de traza (Solomon y col.,

1986) y en situaciones de aprendizaje asociativo (Vinogradova 1975, Vinogradova y

Brazhnik 1978; Vinogradova 1995). Todo esto ha llevado a proponer hipótesis

Page 106: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 94

funcionales que señalan que la región de CA3 estaría involucrada en el desarrollo de

predicciones en secuencias de aprendizaje (Abbott y Blum, 1996; Jensen y Lisman,

1996; Levy, 1996; August y Levy, 1999).

Para estudiar la actividad sináptica neuronal en el hipocampo durante las

sesiones de aprendizaje del condicionamiento clásico del reflejo palpebral (ó corneal),

se aplicó un pulso eléctrico en el borde angular por donde transitan los axones de la vía

perforante medial. Estos pulsos aplicados a un intervalo de 300 ms del estímulo

condicionado, no afectaron el ritmo theta característico del hipocampo, de modo que a

partir de estos pulsos eléctricos se pudieron medir las variaciones en las pendientes de

los potenciales de campo excitatorios postsinápticos (fEPSP) en las principales células

del hipocampo durante las diferentes sesiones de aprendizaje.

En el momento actual se acepta en general que las redes neuronales cambian

estructural y funcionalmente cuando se adquiere una habilidad cognitiva o un

aprendizaje motor. Y es en los cambios funcionales o estructurales de las sinapsis donde

se asume que se almacena esta información (Hebb, 1949; Delgado-García y Gruart,

2006). En ese mismo sentido, Power y col., (1997a) han señalado que en el incremento

en las sinapsis hipocampales puede subyacer la adquisición de las respuestas

condicionadas del parpadeo (Power y col., 1997a). Si consideramos que la adquisición

de la respuesta condicionada permite inferir la formación de asociaciones entre el

estímulo condicionado y el incondicionado (Holland y Bouton, 1999), los registros de

los potenciales sinápticos de campo (fEPSPs) obtenidos en los distintos relevos

sinápticos en nuestro estudio presentaron cambios a lo largo de las diferentes sesiones

de condicionamiento. Durante la habituación no existieron diferencias significativas en

la potenciación sináptica porque en estas sesiones no hay respuestas condicionadas. En

el caso de la habituación, las actividades electromiográficas que se registran

corresponden a respuestas de tipo alfa o de sensibilización, donde no hay asociación

entre estímulos (Gruart y col., 1995). De modo que en la etapa de habituación no se

obtuvieron variaciones estadísticamente significativas en las pendientes de los

potenciales de campo que se asocien a la generación de un aprendizaje. Los cambios se

observaron a partir de las sesiones de condicionamiento, en las que las pendientes de los

potenciales sinápticos de campo experimentaron incrementos, en el caso de las células

piramidales de CA3 y células granulares del giro dentado, y decrementos en el caso de

las células piramidales de CA1.

Page 107: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 95

En algunos trabajos similares al nuestro se señala la existencia de patrones con

relaciones inversas entre las distintas regiones del hipocampo; sin embargo, estas

relaciones sólo se han determinado entre dos sitios del hipocampo: generalmente, entre

el giro dentado y las células piramidales de CA1, considerados como la entrada y la

salida del hipocampo respectivamente (Gilmartin y McEchron, 2005). En algunos

modelos computacionales se sugiere que las neuronas del giro dentado se

especializarían en codificar patrones para las entradas sensoriales y enviarlas a las

células piramidales de CA3 y CA1 (McClelland y col., 1995; Rolls, 1996). Por otro

lado, en otros modelos experimentales se plantea que las neuronas de CA1 actuarían

como comparadores de las aferencias provenientes de la corteza entorrinal y de las áreas

del giro dentado y CA3, lo cual les permitiría distinguir patrones familiares de patrones

novedosos (Hasselmo y col., 2000).

En el estudio de Gilmartin y McEchron (2005) se registraron neuronas del giro

dentado y de CA1, en ratas sometidas a un tipo de aprendizaje asociativo como es el

condicionamiento de miedo, usando un paradigma de traza. En este estudio mostraron

que la información en el condicionamiento de traza de miedo se codifica en las neuronas

del giro dentado y en las células piramidales de CA1 de una manera inversa.

Observaron que las neuronas del giro dentado incrementan su actividad en el período

comprendido entre los estímulos condicionado e incondicionado, lo cual se mantiene

durante las diferentes sesiones de aprendizaje, y sirve, probablemente para mantener la

fuerza de la asociación sináptica de los estímulos aplicados. Por otro lado, las neuronas

piramidales de CA1 muestran una actividad inversa a la observada en el giro dentado.

Las células piramidales de CA1 incrementan su actividad sólo en el día 1, posiblemente

por la llegada de un nuevo patrón de estímulos, como son los dos estímulos y su

intervalo. Posteriormente, la respuesta neuronal de las piramidales de CA1 comienzó a

disminuir progresivamente con el avance de las sesiones y en la medida que el patrón

neuronal disminuyó en novedad. Esto se interpreta como la capacidad de la neuronas

piramidales de CA1 para distinguir patrones nuevos y patrones familiares. Otros

estudios mantienen la idea de que el giro dentado y las células piramidales de CA1

tiene distintos roles en el aprendizaje (Gilbert y col., 2001). En este último estudio

demostraron que lesiones realizadas en el giro dentado de la rata dificultan una tarea de

localización espacial, mientras que lesiones en las células piramidales de CA1 no tienen

efectos en esta tarea.

Page 108: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 96

Se ha descrito que durante el condicionamiento clásico del reflejo palpebral el

hipocampo participa en la asociación entre el estímulo condicionado e incondicionado,

enviando el patrón que se genera como resultado de esta asociación a regiones

cerebrales superiores como la corteza prefrontal, un área que recibe una densa

proyección desde el hipocampo (Chiba, 2000; Jay y Witter, 1991), donde se

almacenaría la respuesta aprendida. Algunos autores consideran la corteza prefrontal

como otro elemento clave en la formación de la respuesta condicionada, ya que esta

corteza mantiene niveles de actividad tónicos durante los intervalos temporales (Chang

y col., 2002; Fuster 1973; Fuster 1990; Frank y Brown, 2003). De modo que las

neuronas del hipocampo van respondiendo a medida que producen las sesiones de

aprendizaje de manera progresiva ante la llegada de los estímulos sensoriales, buscando

establecer el patrón de respuesta.

En nuestro estudio obtuvimos que la estimulación de la vía perforante implicó

que en los tres sitios de relevo registrados se pudieron observar cambios en los valores

de las pendientes a medida que se sucedían las sesiones de aprendizaje. El incremento

en los valores de las pendientes de los potenciales sinápticos de campo indicaría que

está participando un número mayor de neuronas y, por el contrario, si hay un

decremento en los valores de las pendientes, es indicativo que un menor número de

neuronas están participando, o que las interneuronas inhibitorias están más activas sobre

las células piramidales, considerando que estas células piramidales son las estructuras

neuronales del hipocampo que expresan los cambios relacionados con el aprendizaje

(Berger y Thompson, 1978).

El potencial sináptico de campo obtenido en cada caso constituye una verdadera

“fotografía” de los procesos sinápticos que estaban sucediéndose en las proximidades

del electrodo de registro por la acción de las aferencias sensoriales originadas por los

estímulos condicionado e incondicionado. Es importante señalar que los pulsos

aplicados en la vía perforante fueron del orden de 0,02 mA, por lo que prácticamente no

tuvieron efecto en la actividad global que estaba realizando el hipocampo en el

momento del aprendizaje. En estudios previos de nuestro laboratorio (Gruart y col.,

2006) se obtuvo que registrando la sinapsis entre las células piramidales de CA3 y las

células piramidales de CA1 los valores de las pendientes de los potenciales sinápticos

de campo registrados se incrementa en paralelo con la aparición de la respuesta

condicionada y a medida que el animal se somete a las sesiones de condicionamiento.

En nuestro estudio, cuando registramos la sinapsis de la vía perforante sobre las células

Page 109: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 97

piramidales de CA1 obtuvimos que la pendiente decrece durante las mismas sesiones de

condicionamiento. Esto podría deberse a que las neuronas no funcionan como un todo

sino que pueden presentar regiones de su anatomía activas y inactivas, dependiendo de

los tipos de receptores presentes, de las concentraciones iónicas del medio intra. y

extracelular, de los cambios en las afinidades por los neurotransmisores que

experimentan los receptores, de los cambios en las densidades de receptores en las

sinapsis y, por último, de los efectos de las interneuronas inhibitorias que rodean a las

células piramidales. Podríamos suponer que, durante este tipo de aprendizaje, el células

del giro dentado se activan cuando reciben las aferencias de los estímulos condicionado

e incondicionado y también lo hace CA3, pero en esta estación de relevo sináptico la

proyecciones desde las colaterales de Schaffer adquieren mayor peso sináptico sobre las

piramidales de CA1 observándose un incremento en las pendientes cuando se registra

estimulando las colaterales de Schaffer (Gruart y col., 2006), pero no se observa ese

incremento cuando la vía que se estimula es la vía perforante y se registra en las células

piramidales de CA1. Así pues, las células de CA1 enviarían al subículum y corteza

prefrontal los patrones de actividad neuronales provenientes de la activación de las

piramidales de CA3, lo cual indicaría que en este circuito las conexiones internas del

hipocampo son las que se encuentran facilitadas. Es importante destacar, como señala

Fries y col. (2003), que la generación de patrones de actividad neuronal son producidos

por la ejecución de la tarea y no son simplemente estados producidos por defecto del

sistema (Fries y col., 2003). Además, la activación de estos patrones durante la

ejecución de la tarea contiene una estructura temporal debido a que diferentes grupos

neuronales están involucrados a tiempos diferentes durante la tarea (Fries y col., 2003).

Otro elemento a considerar es el que aporta el trabajo de Bartesaghi y Gessi

(2003), en el que los autores señalan que las neuronas de la capa II de la corteza

entorrinal poseen un bajo umbral de excitación, lo cual facilita la rápida transferencia de

señales corticales al giro dentado. En cambio, las neuronas de la capa III poseen un alto

umbral de excitación, y serían incapaces de transferir las señales sensoriales a las

células piramidales de CA1. Esto podría explicar que cuando estimulamos en la corteza

entorrinal, activando las aferencias monosinapticas con las piramidales de CA1, éstas

obtienen un descenso en las pendientes de los potenciales evocados ya que esta región

se encontraría inhibida respecto a las sinapsis provenientes de las colaterales de

Schaffer, las cuales aumentarían. Esto último ha sido demostrado en anteriores trabajos

Page 110: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 98

con ratones (Gruart y col., 2006) y correspondería a la activación del mecanismo de

memoria recurrente a corto plazo de las piramidales de CA3.

El esquema de la Figura 5.1 resume las variaciones de los potenciales sinápticos

de campo en el hipocampo durante la prueba de aprendizaje asociativo del

condicionamiento clásico del reflejo palpebral en el paradigma de traza, obtenidas en

este estudio.

Figura 5.1 Esquema de las variaciones en los potenciales sinápticos de campo registrados

simultáneamente en tres regiones del hipocampo durante las sesiones de habituación (Habit 2),

condicionamiento (Condi 3 y 9) y extinción (Extinc 4) del programa de condicionamiento clásico del

reflejo palpebral con un paradigma de traza. Todos los potenciales se indujeron por la estimulación de la

vía perforante. Se señala con círculos los sitios donde hacen sinapsis las aferencias de la corteza entorrinal

a través de la vía perforante (V.p.) y se proyectan los cambios que experimentaron los potenciales de

campo en las diferentes sesiones de aprendizaje. Nótese cómo en las células piramidales de CA3 y giro

dentado hay un incremento en los potenciales evocados de la sesión 3 de condicionamiento, en cambio en

las células piramidales de CA1 se observa una disminución del campo, para la misma sesión.

Abreviaturas: G.D.= giro dentado.

Habit 2

Condi 3

Condi 9

Extinc 4

0.1 mV

10 ms

CA1

G.D.

Habit 2

Condi 3

Condi 9

Extinc 4

Habit 2

Condi 3

Condi 9

Extinc 4

0.1 mV

10 ms

0.1 mV

10 ms

V.p.

Page 111: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 99

5.3 PROCESO DE APRENDIZAJE MOTOR POR CONDICIONAMIENTO

CLÁSICO DEL REFLEJO PALPEBRAL

En el modelo de aprendizaje asociativo del condicionamiento clásico del reflejo

palpebral, con un paradigma de traza, los animales experimentales presentaron una

curva de aprendizaje que alcanzó valores máximos sobre el 60% de las respuestas

condicionadas. Estudios anteriores señalan que utilizando intervalos interestímulos de

250 ms, permiten que los animales (gatos), obtengan un 100% de las respuestas

condicionadas a partir de la cuarta a sexta sesión de condicionamiento (Gruart y col.,

1995). En el caso de este estudio en el que empleamos un intervalo interestímulos de

500 ms, el porcentaje de aprendizaje se logró en las dos últimas sesiones de

condicionamiento. En la etapa de extinción no se pudo obtener la extinción completa de

las respuestas: sólo al cuarto día se obtuvieron valores cercanos a los del grupo

pseudocondicionado; en los días restantes los valores fueron estadísticamente

significativos. De acuerdo a la progresión del descenso en el porcentaje, es probable que

con más días de extinción la respuestas se suprimieran por completo. Estos resultados

concuerdan con la bibliografía que señala que cuando el intervalo interestímulos es

mayor de los 250 ms, se dificulta la capacidad de adquirir la respuesta condicionada

(Gormezano, 1966; Beylin y col., 2001; Power y col., 1997).

Junto con el aumento en el porcentaje de respuestas condicionadas, se

observaron aumentos en la amplitud de la respuesta condicionada y del área bajo la

curva. En el caso de las latencias de inicio de las respuesta condicionada y latencia al

inicio del pico máximo, también se observaron variaciones a lo largo de las sesiones de

condicionamiento y extinción. Todas estas características se analizaron en los registros

electromiográficos del músculo orbicular de los párpados. La amplitud de la respuesta

condicionada evolucionó con una progresión lenta, obteniendo diferencias

estadísticamente significativa a partir del sexto día de condicionamiento. Algo similar

se obtuvo en el caso del área bajo la curva; es decir, las diferencias entre los grupos

condicionado y pseudocondicionado se observaron a partir del sexto día de

condicionamiento, alcanzando los valores máximos en la última sesión de

condicionamiento. Tendencias similares se describen en el trabajo de Troncoso (2005)

para un estudio similar realizado en ratones. Esto indicaría que a medida que los

animales adquieren los patrones neuronales que asocian los estímulos condicionado e

incondicionado, mejora el nivel de sincronización neuronal; por lo tanto, se suma un

mayor número de neuronas del núcleo facial en el proceso de transformación sensorio-

Page 112: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 100

motriz. Este mayor número de motoneuronas va a permitir que respondan más fibras

musculares y, por lo tanto, que el área bajo la curva se incremente en el registro

electromiográfico del músculo orbicular del párpado.

Para los parámetros de latencia, tanto al inicio de la respuesta condicionada

como al pico máximo de la misma, se observó una disminución progresiva en las

sesiones de condicionamiento, lo que significa que, a medida que los animales

experimentales aprenden a asociar los dos estímulos sensoriales, la respuesta es cada

vez más cercana a la aparición del estímulo condicionado y se mantiene en los

milisegundos posteriores, lo cual estaría relacionado con la mayor sincronización. En

este caso, las neuronas alcanzan de manera más rápida los valores umbrales de

excitación y esto les permite realizar una sumación temporo-espacial suficiente para

generar potenciales de acción lo cual implica una disminución en la latencia de la

respuesta. La tendencia se invierte cuando los animales experimentales están en las

sesiones de extinción: al no existir el estímulo incondicionado las respuestas empiezan a

alejarse del estímulo condicionado, aunque no logran las latencias observadas en los

primeros días de condicionamiento. Al igual que con la extinción de las respuestas

condicionadas, si el número de sesiones fuese mayor se lograrían los valores iniciales de

latencia.

5.4 PARTICIPACIÓN DE LOS RECEPTORES DE GLUTAMATO DEL TIPO

NMDA EN LA GENERACIÓN DE UN APRENDIZAJE ASOCIATIVO

Para discutir los resultados acerca de la participación del receptor de NMDA en

la generación de las respuestas condicionadas con el paradigma de traza, es necesario

señalar previamente que los receptores de glutamato del tipo NMDA y AMPA

intervienen directamente en la transmisión sináptica excitatoria en el cerebro. Ambos

son receptores ionotrópicos activados por glutamato que transforman una señal química

en una corriente eléctrica transmembrana (Yashiro y Philpot, 2008). Los receptores tipo

NMDA se denominan detectores de coincidencia, ya que requieren de la llegada

simultánea de glutamato de origen presináptico junto con una potente despolarización

de la membrana postsináptica que permita la liberación del Mg2+ que bloquea el

receptor (Mayer y col., 1984; Nowak y col., 1984). Se han descrito siete subunidades

del receptor de NMDA: la subunidad NR1 (Moriyoshi y col., 1991), la subunidad NR2

(incluye desde la A a la D; Kutsuwada y col, 1992; Monyer y col., 1994; Ishii y col.,

Page 113: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 101

1993) y la subunidad NR3 (A y B; Ciabarra y col., 1995; Sucher y col., 1995; Nishi y

col., 2001; Matsuda y col., 2002).

Cada miembro de las tres familias de subunidades poseen patrones de

distribución diferentes durante el desarrollo, siendo las subunidades NR1 las de más

amplia distribución en las distintas áreas cerebrales. En cambio, las subunidades NR2

son de distribución selectiva (Kutsuwada y col., 1992; Laurie y Seeburg, 1994; Monyer

y col., 1994; Mori y Mishina, 1995; Fischer y col., 1997). De la asociación de estas

distintas subunidades se forma el receptor NMDA operado por glutamato que va a

permitir el paso inespecífico de iones de sodio, potasio y, de manera muy importante, de

calcio. Ahora bien, dependiendo de qué subunidades se ensamblen, así serán las

propiedades funcionales de los receptores de NMDA observadas a nivel

electrofisiológico y farmacológico. (Luo y col., 1997, Paoletti y Neyton, 2007; Chaffey

y Chazot, 2008).

En diversos estudios, se ha examinado la expresión de diferentes combinaciones

de las subunidades del receptor NMDA empleando oocitos o líneas celulares

transfectadas, encontrando claros indicios de diferencias farmacológicas entre las

diferentes combinaciones (Farrant y col., 1994; Grimwood y col., 1996a,b; Lynch y

col., 1995; Williams y col., 1993).

La presencia de la subunidad NR2B no es fija en la sinapsis, sino que sufre

cambios durante del desarrollo, así como por la experiencia sensorial (Sheng y col.,

1994; Liu y col., 2004; Carmignoto y Vicini, 1992; Nase y col., 1999) y la plasticidad

sináptica (Bellone y Nicoll, 2007; Sobczyk y Svodoba, 2007). Asumiendo que el

aprendizaje adquirido se almacena en la forma de cambios estructurales, o funcionales,

de la eficacia sináptica y estos cambios están mediados en el hipocampo por la

presencia de receptores del tipo NMDA, es que buscamos estudiar la participación de

subunidades del receptor NMDA en la adquisición de la respuesta condicionada en el

paradigma de traza y, más específicamente, cuál es el papel que desempeña la

subunidad NR2B en la adquisición de ese aprendizaje asociativo. Para ello utilizamos

un potente antagonista de la subunidad NR2B de los receptores de NMDA, el Ro 25-

6981 (Fischer y col., 1997; Pinard y col., 2001).

Basándonos en los resultados obtenidos en este estudio, podemos señalar que los

receptores de NMDA que contienen la subunidad NR2B desempeñan un importante

papel tanto en las etapas de adquisición (y readquisición, período posterior a las

sesiones de extinción) de aprendizaje asociativo de condicionamiento clásico del reflejo

Page 114: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 102

palpebral en un paradigma de traza, en ratas adultas y conductualmente alertas. Estos

resultados confirman hallazgos previos en cuanto a la participación de la subunidad

NR2B en los mecanismos subyacentes a la generación de las señales de LTP, como se

muestra en la sinapsis CA3-CA1 (Köhr y col., 2003; Berberich y col., 2005) y en la

corteza cingulada anterior (Zhao y col., 2005). De hecho, la unión entre la potenciación

sináptica funcional durante la adquisición del aprendizaje asociativo y los procesos de

LTP ha sido convincentemente demostrado recientemente durante experimentos in vivo

realizados en nuestro laboratorio con ratones (Gruart y col., 2006) y ratas (Whitlock y

col., 2006). Junto con esto, se ha demostrado así mismo que la subunidad NR2B parece

que juega un rol crítico en el condicionamiento clásico del parpadeo en ratones

mutantes heterocigotos para el GluRe2 (NR2B; Takehara y col., 2003).

En un trabajo pionero, Weiz y col. (1984) demostraron una potenciación de las

sinapsis entre los axones de la vía perforante y las células del giro dentado durante la

adquisición de las respuestas condicionadas de la membrana nictitante. Esta modulación

del fortalecimiento sináptico durante el proceso de aprendizaje ha sido confirmada en

este estudio para la misma vía sináptica, como también para la sinapsis CA3-CA1

(Gruart y col., 2006; Whitlock y col., 2006). Aparentemente, el condicionamiento de

traza requiere de una modificación dependiente de actividad de la respuesta sináptica

para que el aprendizaje ocurra (Weiz y col., 1984; Gruart y col., 2006) y esto podría

estar unido a la activación de receptores de NMDA que contienen la subunidad NR2B,

ya que el Ro 25-6981, fue capaz de bloquear tanto la potenciación sináptica y la

adquisición de las respuestas condicionadas de parpadeo. De hecho la disminución de la

amplitud de los fEPSP durante la aplicación del Ro 25-6981 se puede explicar como

una regulación a la baja (down-regulation) de los receptores de AMPA, lo cual

resultaría muy probablemente del bloqueo sostenido de los receptores de NMDA

(Zhong y col., 2006). En resumen, podemos señalar que los receptores de NMDA que

contienen subunidades NR2B localizados en selectivos sitios postsinápticos del

hipocampo podrían jugar un rol regulatorio y/o homeostático (Pérez-Otaño y Ehlers,

2005), contribuyendo a depotenciación sinaptica (Abraham y Williams, 2003) o

debilitamiento de la transmisión sináptica (Kim y col., 2005).

Page 115: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 103

5.5 PARTICIPACIÓN DE LOS RECEPTORES DE GLUTAMATO DEL TIPO

NMDA EN LOS MECANISMOS DE PLASTICIDAD SINÁPTICA COMO LA

POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN A LARGO PLAZO

Hay varias ventajas al medir una potenciación o una depresión sináptica a largo

plazo in vivo frente a in vitro, entre las cuales la más obvia es la posibilidad de seguir el

curso temporal completo del efecto. Además, existe la posibilidad de que la magnitud

de una LTP o LTD en el ambiente artificial de la rodaja de hipocampo pueda ser muy

diferente de la obtenida en la misma región en un animal anestesiado o despierto

(Nosten-Bertrand y col., 1996).

Como hemos mencionado con anterioridad, en el mecanismo de la potenciación

a largo plazo tienen una activa participación los receptores de NMDA y la composición

de éstos es fundamental para producir dicha potenciación. De hecho, aún empleando

una baja frecuencia de estimulación, que sería mas propio de una depresión a largo

plazo, es posible inducir una LTP si las células post-sinápticas tienen sus potenciales de

membrana despolarizados (Kelso y col., 1986; Wigstrom y Gustafsson, 1986). Por lo

tanto, más importante que el protocolo que se emplee es el tipo de composición de las

subunidades que tengan los receptores de NMDA en el momento en que se produzca la

estimulación.

Habiendo demostrado que el receptor de NMDA y particularmente su subunidad

NR2B están relacionados con en la adquisición del aprendizaje asociativo, lo cual

supone un fortalecimiento en las sinapsis participantes y, como mencionamos

anteriormente, que la unión entre la potenciación sináptica funcional durante la

adquisición del aprendizaje asociativo y los procesos de LTP ha sido recientemente

demostrado en ratones (Gruart y col., 2006) y ratas (Whitlock y col., 2006) es que

buscamos estudiar cuál es el papel que desempeña la subunidad NR2B en los

mecanismos de potenciación y depresión a largo plazo. Para determinar la participación

de la subunidad NR2B, al igual como se realizó en los estudios del condicionamiento,

empleamos un inhibidor selectivo de la misma que fue el Ro 25-6981 (Fischer y col.,

1997; Pinard y col., 2001).

En lo que respecta a los mecanismos de plasticidad sináptica, los resultados

presentes no pueden ser relacionados con la generación de señales del tipo LTD, como

se demostró in vitro usando rodajas de hipocampo (Liu y col., 2004) y corteza perirrinal

(Massey y col., 2004), y en un ratón mutante defectuoso de la subunidad NR2B para el

receptor de NMDA (Kutusuwada y col., 1996). La principal razón es que la pendiente

Page 116: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 104

de los fEPSP evocados en el giro dentado por pulsos simples presentados en la vía

perforante medial durante el intervalo entre el estímulo condicionado y el estímulo

incondicionado se incrementan (y no decrecen, como debería esperarse en un proceso

relacionado a la depresión a largo plazo) a través de las sesiones de condicionamiento y

recondicionamiento. El inhibidor de la subunidad NR2B, Ro 25-6981 induce una

disfacilitación de la potenciación fisiológica sináptica producida por el

condicionamiento. A este respecto ha sido recientemente publicado que el Ro 25-6981

reduce selectivamente la potenciación a largo plazo, pero no la depresión a largo plazo

provocada en la región de CA1 en rodajas de hipocampo (Bartlett y col., 2007). Otro

elemento importante a considerar es que mientras la potenciación a largo plazo es

fácilmente provocada in vivo en las sinapsis de la vía perforante – giro dentado (Fazeli y

col., 1993), la depresión a largo plazo no lo es tanto (Kemp y Bashir, 2001). Es también

importante destacar que el cerebelo no está involucrado en los déficit de aprendizaje

evocados por Ro 25-6981, debido a que en el estado adulto esta estructura carece de

subunidades de NR2B (Watanabe y col., 1993; Mori y Mishina 1995). De hecho, las

subunidades NR2B son sustituidas en el cerebelo adulto por subunidades NR2C

(Watanabe y col., 1993; Mori y Mishina 1995).

Una posible explicación de los presentes resultados y de las contradictorias

publicaciones referentes a los efectos de los receptores de NMDA que contienen la

subunidad NR2B (Kutsuwada y col., 1996; Tang y col., 1999; Liu y col., 2004; Massey

y col., 2004; Barberich y col., 2005) es que las subunidades NR2B juegan diferentes

roles en el desarrollo sináptico y en la plasticidad sináptica, dependiendo del estado del

desarrollo y de los circuitos sinápticos y las áreas cerebrales involucradas. Por ejemplo,

ratones que sobreexpresan subunidades NR2B inmaduras presentan una aumentada

potenciación a largo plazo en el hipocampo y muestran una gran capacidad de

aprendizaje (Tang y col., 1999), mientras que ratones mutantes defectuosos en las

subunidades NR2B tienen dificultades para evocar depresión a largo plazo en la sinapsis

hipocampal entre las células piramidales de CA3 y las células piramidales de CA1. Sin

embargo, el incremento de la disponibilidad o el bloqueo de las subunidades de NR2B

puede producir diferentes efectos en la depresión a largo plazo o en la potenciación a

largo plazo, dependiendo de los sitios neuronales o de la activación de diferentes vías

intracelulares (Liu y col., 2004). Así, las contradicciones presentes en varias

publicaciones indicarían la presencia de diferentes procesos regulatorios y

Page 117: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 105

homeostáticos que implican a los diferentes tipos de receptores de NMDA (Pérez-

Otaño y Ehlers, 2005).

Otra posible explicación de estos resultados la encontramos en el modelo

planteado recientemente sobre la regulación de la plasticidad sináptica por las

subunidades de los receptores de NMDA (Philpot y col., 1999; Yashiro y Philpot,

2008). En este modelo, si la proporción entre las subunidades NR2A y NR2B es

elevada, se requiere de una estimulación de alta frecuencia para generar una

potenciación a largo plazo; pero no ocurría lo mismo si la proporción de las

subunidades NR2A y NR2B es baja. Esto se debería a que, al tener una alta proporción

de NR2A y NR2B, se limita el ingreso de Ca2+ por los receptores de NMDA y eso

también dificulta la activación de la calmodulin kinasa II. Por lo tanto, es necesario una

fuerte estimulación que permita elevar las concentraciones de Ca2+ intracelular para

activar la calmodulina e inducir la potenciación a largo plazo (Yashiro y Philpot, 2008).

A la inversa, si la proporción entre NR2A y NR2B es baja, es muy probable que una

baja estimulación permita el ingreso masivo de Ca2+ y active los niveles de calmodulin

kinasa II para provocar la potenciación a largo plazo. Se ha demostrado que el grado de

LTP que se obtenga, depende de proporción de NR2A / NR2B y este valor cambia entre

las espinas dendríticas (Matsuzaki y col, 2004). Por eso al inhibir los receptores de

NMDA con la subunidad NR2B se bajaría artificialmente la proporción de las

subunidades NR2A y NR2B y eso permitiría generar una potenciación a largo plazo aún

en presencia del antagonista. Si por el contrario se aplica un protocolo de depresión a

largo plazo el ingreso de Ca++

por las subunidades NR2B sólo permitiría la activación

de la calcineurina y no de la calmodulina kinasa II, por lo tanto la depresión a largo

plazo sería inducida.

5.6 EFECTO DE UNA ESTIMULACIÓN EN VÍA PERFORANTE Y REGISTRO

SIMULTÁNEO DE TRES SITIOS DEL HIPOCAMPO EN LOS MECANISMOS

DE PLASTICIDAD SINÁPTICA COMO LA POTENCIACIÓN Y DEPRESIÓN

A LARGO PLAZO

Al tener un registro simultáneo de los tres principales sitios de relevo en el

hipocampo, y dada la intrincada red de interneuronas inhibidoras, pensamos que un

mismo protocolo de potenciación a largo plazo podría producir depresión en un sitio y

potenciación en otro. A partir de los resultados obtenidos en el presente estudio, se

puede proponer que estimulando en el borde angular los tres sitios de registro

Page 118: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 106

experimentan simultáneamente la misma respuesta fisiológica con algunas diferencias

en los porcentajes de cambio de la pendiente de los potenciales sinápticos de campo

(fEPSP). Esta diferencia se vio más acentuada en los fEPSP del giro dentado, durante la

prueba de la potenciación a largo plazo. En la figura 4.16 de los Resultados, se

demuestra que existen diferencias en los cursos temporales de los tres sitios sometidos a

una potenciación a largo plazo simultáneamente, ya que la potenciación a largo plazo

obtenida en el giro dentado tiene una duración aproximada de 60 min, lo que

consideraríamos una potenciación corta. En cambio las células piramidales de CA1 y

CA3, al cabo de los 120 min de registro mantienen todavía la potenciación.

En el caso de la depresión a largo plazo, no se observaron diferencias en los

cursos temporales para los tres sitios registrados (ver Figura 4.17), manteniéndose

inhibidas las sinapsis incluso más allá de los 120 minutos registrados (datos no

presentados). Es importante destacar que en los tres sitios registrados se produjo un

descenso simultáneo de los potenciales de campo.

De modo que en este modelo experimental fue posible inducir una potenciación

a largo plazo o una depresión a largo plazo en el hipocampo de manera simultánea en

los principales tipos celulares, aplicando los protocolos adecuados en la vía perforante.

5.7 EFECTO DE LA PRUEBA DE PULSOS PAREADOS EN LAS SINAPSIS

DEL HIPOCAMPO

Existen varias formas de plasticidad a corto plazo, que abarcan desde los

milisegundos a los minutos, las cuales se han descrito desde en invertebrados hasta en

mamíferos (Zucker y Regehr, 2002). Estas formas de plasticidad jugarían importantes

roles en las adaptaciones a estímulos sensoriales, cambios en los estados conductuales y

formas de memoria (Citri y Malenka, 2008). La prueba de pulsos pareados es un

ejemplo de plasticidad sináptica a corto plazo, en la que dos estímulos son aplicados con

un breve intervalo de tiempo y en la que la respuesta al segundo estímulo puede

incrementarse o decrecer con respecto a la evocada por el primero (Katz y Miledi, 1968;

Zucker y Regehr, 2002; Yorns y col., 2004). En el caso de los pares de pulsos que

producen depresión se suelen observar en las sinapsis en las que el intervalo

interestímulo es menor de 20 ms (Citri y Malenka, 2008). Este efecto se produciría

probablemente porque los canales iónicos de sodio o calcio, de tipo voltaje dependiente,

se encuentran todavía en estado inactivo por lo que la llegada de un estímulo no

Page 119: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 107

generaría un nuevo potencial de acción. Otras posibilidad estaría en una depleción

transitoria de la reserva de vesículas sinápticas que impediría un incremento en la

concentración de neurotransmisor en el espacio sináptico (Citri y Malenka, 2008) o un

incremento en la actividad de las interneuronas inhibitorias (Yorns y col., 2004).

En el caso de la facilitación por pares de pulsos se ha observado cuando los

intervalos interestímulos son mayores, abarcando un rango desde los 20 a 500 ms. Las

posibles explicaciones pasarían por: i) incrementos de la concentración de calcio en el

espacio sináptico que favorezcan una mayor liberación de vesículas sinápticas; o, ii)

activación de cascadas de segundos mensajeros que activarían proteína quinasas (Citri y

Malenka, 2008) las que fosforilarian proteínas presinápticas como la sinapsina, una

proteína de la membrana de la vesícula sináptica que se ancla al citoesqueleto y que al

ser fosforilada, libera las vesículas sinápticas hacia las barras densas de la zona activa.

Un aspecto importante a tener en cuenta en el análisis de los resultados

obtenidos en los experimentos realizados es este estudio es que si una sinapsis expresa

una facilitación o depresión a un determinado protocolo de pulsos pareados, su

respuesta dependerá de la historia reciente de activación de esa sinapsis (Citri y

Malenka, 2008). De modo que si una sinapsis tiene una alta probabilidad de liberar sus

vesículas, tenderá a deprimirse en respuesta al segundo estímulo; por el contrario si la

sinapsis tiene bajas probabilidades de liberación del neurotransmisor, casi siempre se

producirá un incremento en la respuesta al segundo estímulo.

En nuestro estudio se registraron las sinapsis entre la vía perforante y el giro

dentado (Vp-GD), vía perforante y piramidales de CA3 (Vp-CA3) y vía perforante con

piramidales de CA1 (Vp-CA1). Se emplearon siete series de pares de pulso con

intervalos interestímulos crecientes (10, 20, 30, 50, 100, 200 y 500 ms). Además se

utilizaron tres frecuencias de estimulación: 0,03, 1 y 5 Hercios. En el caso de la

frecuencia de 0,03 Hercios se utilizaron estímulos con bajas y altas intensidades.

A la frecuencia de 0,03 Hercios, las principales diferencias se observaron en la

sinapsis Vp-CA1 y en las tres primeras series de pares de pulsos. A baja intensidad y en

los intervalos antes señalados, se observó una inhibición que puede explicarse de

acuerdo con los argumentos antes señalados, es decir una inactivación de los canales

iónicos voltaje dependientes de Na+ y/o Ca

2+. El fenómeno anterior impide la entrada de

corrientes despolarizantes y, por lo tanto, imposibilita la sumación temporo-espacial que

permitiría generar un segundo potencial de acción. Hay que señalar que al ser registros

extracelulares, los potenciales de acción registrados suelen corresponder a potenciales

Page 120: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 108

de acción compuestos. Sin embargo, cuando se incrementó la intensidad de los

estímulos, la misma sinapsis experimentó una facilitación sináptica en el primer y tercer

par de pulsos. Esto podría significar que a mayores intensidades la cantidad de

neurotransmisor liberado se incrementa y, por lo tanto, ejercen su influencia en un

número mayor de receptores postsinápticos, elevando la excitabilidad y favoreciendo la

sumación temporo-espacial para generar nuevos potenciales de acción. Además, el

incremento de la actividad de las células piramidales de CA1 podría enviarla hacia las

capa III de la corteza entorrinal proporcionando una facilitación en las neuronas de esta

capa, que poseen un alto umbral de excitación, lo cual permitiría una mayor descarga

que sería transferida a las piramidales de CA1 incrementando la excitabilidad de la

región (Bartesaghi y Gressi, 2003).

A la frecuencia de 1 Hercio, las células piramidales de CA1 y CA3 se comportan

de modo diferente a lo que señala la bibliografía. Se esperaría que a intervalos

interestímulos breves, las sinapsis se deprimieran; si embargo, en las tres primeras

series se observó una facilitación. La explicación podría estar en que las series

experimentales fueron sucesivas, empezando con 0,03 Hercios y eso podría mantener un

alto nivel de excitabilidad en estas regiones, por aumento en la cantidad de

neurotransmisores liberados, o aumento en las concentraciones iónicas de Na+ y/o Ca

2+

lo que aumentó las probabilidades de respuesta al segundo estímulo en estas neuronas.

En las pruebas de pares de pulsos a 5 Hercios, se obtuvo una facilitación

sináptica en el primer par de pulsos en las tres regiones registradas. Posteriormente, las

tres regiones experimentaron una depresión en los siguientes tres pares de pulsos, para

finalmente variar entre facilitación, inhibición y facilitación en los últimos tres pares de

pulsos aplicados. La frecuencia de 5 Hercios aplicada es una frecuencia que cae en el

ritmo theta y diversos estudios han demostrado que la generación del ritmo theta puede

no sólo fortalecer las sinapsis glutamatérgicas, sino también las GABAérgicas (Yorns y

col., 2004). Hay que considerar, además, la participación de la glía en la fisiología

sináptica, ya que este elemento celular del sistema nervioso presenta en su membrana

diferentes receptores para neurotransmisores, los cuales al activarse pueden liberar

sustancias como el ATP y actuar sobre los terminales presinápticos modulando la

liberación de los neurotransmisores (Araque y col., 2001; Citri y Malenka, 2008).

En estas variaciones de las respuestas al segundo estímulo con respecto al

primero tenemos que considerar que, en los experimentos in vivo, no se pueden eliminar

los factores extrahipocampales como son las aferencias provenientes de núcleos del

Page 121: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Discusión 109

tronco como el locus coeruleus, rafe medial entre otros, que pueden influenciar en los

cambios electrofisiológicos del hipocampo, así como otras aferencias de origen cortical

y subcortical.

Page 122: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Conclusiones 110

6. CONCLUSIONES

Page 123: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Conclusiones 111

Page 124: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Conclusiones 112

El interés final de este estudio se centró en conocer los cambios en la actividad

sináptica de los tres principales tipos celulares (células de los granos del giro dentado y

células piramidales de CA3 y CA1) del hipocampo, en dos situaciones experimentales:

i) pruebas de aprendizaje asociativo (condicionamiento clásico del reflejo palpebral) y

ii) pruebas de eficacia sináptica como la LTP (long term potentiation) y LTD (long term

depression). Las principales conclusiones obtenidas son las siguientes:

1. Se desarrolló por primera vez un modelo animal que permitió el registro

simultáneo del arco trisináptico del hipocampo in vivo, en ratas adultas y

despiertas, sin afectar la salud o la conducta del animal. El modelo experimental

permitió registrar la actividad electroencefalográfica de los animales en un

estado de libre movimiento y por varias semanas.

2. Durante el condicionamiento clásico, las neuronas del giro dentado y las células

piramidales de CA3 codifican información relacionada al aprendizaje asociativo

con un patrón inverso al que realizan las células piramidales de CA1, expresado

en los valores de las pendientes de los potenciales de campo provocados.

3. De acuerdo con los resultados presentados en este trabajo se puede concluir que

el hipocampo participa en la generación de la respuesta condicionada de manera

diferenciada en sus regiones, empleando el giro dentado y CA3 un patrón

similar, incrementando la pendiente de sus respuestas y las células piramidales

de CA1 exhibiendo un patrón inverso.

4. El fármaco Ro 25-6981 aplicado durante el condicionamiento clásico impidió la

adquisición de las respuestas condicionadas en los animales experimentales.

Aplicado en animales que ya hubiesen aprendido la respuesta condicionada,

durante un período de cinco días, en un período de recondicionamiento, impidió

la expresión de la respuesta condicionada, de modo que la subunidad NR2B

desempeña un papel esencial en la adquisición y expresión de la respuestas

condicionadas.

5. La inhibición de la subunidad NR2B impidió la expresión de la depresión a

largo plazo obtenida en este estudio.

6. La inhibición de la subunidad NR2B no impidió que los animales

experimentales expresaran una potenciación a largo plazo.

Page 125: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Conclusiones 113

7. Los receptores de NMDA son necesarios para la generación y expresión de las

respuestas condicionadas, especialmente su subunidad NR2B. Dicha subunidad

sería necesaria para que se genere y exprese la LTD, pero no así para la LTP.

8. Durante el condicionamiento clásico del reflejo palpebral, en el paradigma de

traza, se observó un incremento en el área bajo la curva de la actividad

electromiográfica rectificada y en la amplitud de la respuestas condicionadas.

Dicha incremento está estrechamente relacionado con la adquisición de la

respuesta condicionada ya que no se observa en los animales

pseudocondicionados.

9. Las neuronas piramidales de CA3 y CA1 a iguales frecuencias de estimulación

pero a diferentes intensidades, modifican sus respuesta a pares de estímulos en el

rango de los 10 a los 30 ms.

10. Existen diferencias en los cursos temporales en los tres sitios registrados del

hipocampo, cuando son sometidos a una potenciación a largo plazo simultánea,

siendo el giro dentado quien experimentan un descenso en su actividad más

tempranamente.

11. La estimulación simultánea en el hipocampo produce variaciones en las

respuestas temporales lo cual indicaría que las interneuronas inhibitorias estarían

jugando un papel importante en las generación de respuestas de eficacia

sináptica del tipo LTP.

En resumen, los principales resultados obtenidos en esta tesis doctoral nos

permiten señalar la necesidad de incrementar estos estudios en animales vivos y en

condiciones fisiológicas a fin de mantener las influencias de los factores

extrahipocampales sobre el hipocampo, especialmente las provenientes desde otras

estructuras corticales y subcorticales.

Page 126: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Referencias Bibliográficas 114

7. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Page 127: ACTIVIDAD SINÁPTICA EN EL CIRCUITO DEL HIPOCAMPO …

Referencias Bibliográficas 115

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Anexo 115

8. ANEXOS

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Contribution of NMDA receptor NR2B subunit to synapticplasticity during associative learning in behaving rats

Mauricio Valenzuela-Harrington, Agnes Gruart and Jose M. Delgado-GarcıaDivision de Neurociencias, Universidad Pablo de Olavide, Ctra. de Utrera, Km. 1, 41013-Sevilla, Spain

Keywords: classical conditioning; hippocampus; LTD; LTP; NMDA receptor; NR2B subunits

Abstract

The difference in the amounts of NR2 subunits contained in NMDA receptors of the hippocampus has been related to their differentinvolvement in activity-dependent synaptic plasticity. Here, we show that Ro 25-6981, a high-affinity and selective blocker of NMDAreceptors containing NR2B subunits, is able to block the acquisition of a trace conditioning paradigm in adult rats, a task that requiresthe active participation of hippocampal circuits. Reconditioning with the same trace paradigm was also prevented by Ro 25-6981. Inaddition, we show that the slope of monosynaptic field excitatory postsynaptic potentials evoked at the dentate gyrus by single pulsespresented to the medial perforant pathway increases significantly across conditioning sessions and during reconditioning, in a linearrelationship with the increase in the number of classically conditioned eyelid responses. Administration of Ro 25-6981 preventedthese learning-related changes in synaptic strength at the perforant pathway–dentate granule cell synapse. The present resultssuggest the involvement of NR2B-containing NMDA receptors in hippocampal functions related to both associative learning andactivity-dependent synaptic plasticity.

Introduction

The NMDA receptor (NMDAR) plays a crucial role in the activity-dependent synaptic processes underlying learning and memory. TheNMDAR has a heteromeric nature, presenting NR1, NR2A-D andNR3A-B subunits (Mori & Mishina, 1995). In the hippocampus ofadult mammals, NMDARs are assembled from NR1 and NR2Aand ⁄ or NR2B subunits (Kohr et al., 2003). It has been proposed thatthe functional properties of NMDARs depend, at least in part, on thetype of NR2 subunit incorporated (Perez-Otano & Ehlers, 2005;Bartlett et al., 2007; Neyton & Paoletti, 2006). The availability ofNR2A subunits increases with age, whereas the opposite trend isfound for NR2B subunits (Watanabe et al., 1993), but it is assumedthat NR2B subunits do have a role (one that is not well defined) in theenhancement of learning and memory functions (Tang et al., 2001;Loftis & Janowsky, 2003; Zhao et al., 2005).There is some controversy regarding the function of NMDARs

containing NR2B subunits. For example, it has been shown thatoverexpression of NR2B subunits increased both learning capabilitiesand long-term potentiation (LTP), with no changes in long-termdepression (LTD; Tang et al. 1999), but mutant mice defective inNR2B subunits show an impairment in hippocampal LTD (Kutsuwadaet al., 1996). Recently, it has been proposed that NR2A-containingNMDARs are required for LTP, whereas NR2B subunits are requiredfor LTD (Liu et al., 2004; Massey et al., 2004), a proposal notconfirmed by others (Berberich et al., 2005; Bartlett et al., 2007).Indeed, a role of NR2B subunits in LTP has been described at theCA3–CA1 synapse (Kohr et al., 2003; Berberich et al., 2005) and inthe anterior cingulate cortex (Zhao et al., 2005).Here, we studied the effects of Ro 25-6981 on the acquisition and

reconditioning of classically conditioned eyelid responses (CRs) using

a trace paradigm, and on the slope of field excitatory postsynapticpotentials (fEPSPs) evoked at the dentate gyrus by single pulsespresented at the medial perforant pathway. Ro 25-6981 is an activity-dependent and highly selective blocker of NMDARs containing NR2Bsubunits (Fisher et al., 1997). In trace conditioning, the conditionedstimulus (CS) is separated from unconditioned stimulus (US) presen-tation by a stimulus-free interval. Trace conditioning requires an intacthippocampus (Moyer et al., 1990), and it has been shown recently thathippocampal synaptic strength is modulated by this type of associativelearning (Gruart et al., 2006). Moreover, trace conditioning is severelyaffected in NR2B heterozygous mutant mice (Takehara et al., 2003).Adult rats were prepared for the chronic recording of the electromy-ographic (EMG) activity of the orbicularis oculi muscle and for theelectrical stimulation of the supraorbitary nerve. A tone was used as aCS and, after a time interval of 500 ms, an electrical shock waspresented to the supraorbitary nerve as a US. Modulation in thesynaptic strength of the perforant pathway–dentate granule cellsynapse during the acquisition and reconditioning of associativelearning in controls and following the administration of Ro 25-6981was also studied here, following technical developments describedrecently (Gruart et al., 2006; Whitlock et al., 2006). The presentresults provide substantial evidence of the involvement of NR2B-containing NMDARs both in hippocampally dependent associativelearning and in activity-related changes in the synaptic strength of theperforant pathway–dentate granule cell synapse.

Materials and methods

Subjects

Experiments were performed on adult male Wistar rats (3 months old;200–250 g) obtained from an official supplier (University of GranadaAnimal House, Granada, Spain). Before surgery, animals were housedin separate cages (3–4 per cage) and kept on a 12-h ⁄ 12-h light ⁄ dark

Correspondence: Professor J. M. Delgado-Garcıa, as above.E-mail: [email protected]

Received 11 October 2006, revised 26 November 2006, accepted 28 November 2006

European Journal of Neuroscience, Vol. 25, pp. 830–836, 2007 doi:10.1111/j.1460-9568.2007.05325.x

ª The Authors (2007). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing Ltd

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cycle with constant temperature (21 ± 1 �C) and humidity (50 ± 7%).Food and water were provided ad libitum. Behavioral and electro-physiological studies were conducted in accordance with the guide-lines of the European Union Council (86 ⁄ 609 ⁄ EU) and followingSpanish regulations (BOE 67 ⁄ 8509-12, 1988) for the use of laboratoryanimals in chronic experiments. Experiments were approved by thelocal Ethics Committee.

Surgery

Animals were anesthetized with 4% chloral hydrate (0.5–1 mL ⁄ 100 g,i.p.) following a protective injection of atropine sulfate(0.1 mg ⁄ 100 g, i.m.). Animals aimed exclusively for classical condi-tioning (n ¼ 15) were implanted with bipolar EMG recordingelectrodes in the left orbicularis oculi muscle and with bipolarstimulating electrodes on the ipsilateral supraorbitary branch of thetrigeminal nerve (Fig. 1A). Electrodes were made of 50-lm, Teflon-coated, annealed stainless steel wire (A-M Systems, Carlsborg, WA,USA), and with their tips bared of the isolating cover for � 0.5 mm.The electrode tips were bent as a hook to facilitate a stable insertion inthe upper eyelid tissues. A 0.1-mm bare silver wire was affixed to theskull as a ground. Wires were connected to a five-pin socket (RSAmidata, Madrid, Spain), and the socket was fixed to the skull withthe help of three small screws and dental cement (Domınguez-del-Toro et al., 2004).

Animals selected for classical conditioning and fEPSP recordings(n ¼ 12) were anesthetized as described above and implanted withsimilar recording and stimulating electrodes in the left orbicularis oculi

muscle. As illustrated in Fig. 1A, stereotaxic coordinates (Paxinos &Watson, 1986) were followed to implant these animals with bipolarstimulating electrodes in the dorsomedial aspect of the right angularbundle (6.8 mm posterior and 3 mm lateral to Bregma; depth frombrain surface, 2 mm) and with three recording electrodes aimed at thegranular cell layer and ⁄ or the hilus of the right dorsal dentate gyrus(3.6 mm posterior and 1.2 mm lateral to Bregma; depth, 3.2–3.6 mm).These electrodes were made of 25-lm, Teflon-coated tungsten wire(Advent Research Materials, Eynsham, UK). Animals were alsoimplanted with a 0.1-mm bare silver wire as ground. All wires (fourimplanted in the left eyelid, five implanted in the right cerebral cortex,and a ground) were soldered to two five-pin sockets, and the socketswere fixed to the skull as indicated above (Gruart et al., 2006).

Classical conditioning

For conditioning, the animal was placed in a Faraday box(30 · 30 · 30 cm), and the stimulating and recording wires wereconnected to the implanted socket. Sessions started 10 days aftersurgery. Classical conditioning was achieved with a trace paradigm(Fig. 2A). For this, a tone (50 ms, 2.4 kHz, 85 dB) was presented as aCS. The US started 500 ms from CS onset, and consisted of a 500-ls,3· threshold, square, cathodal pulse (< 0.8 mA). A total of fourhabituation, ten conditioning and five extinction sessions were

Fig. 1. Experimental design. (A) Animals aimed for classical conditioningwere implanted with bipolar electromyographic (EMG) recording electrodes inthe orbicularis oculi (O.O.) muscle of the upper left eyelid. For trace eyeblinkconditioning, a tone was presented as a conditioned stimulus (CS). The CS wasfollowed 500 ms from its onset by an unconditioned stimulus (US) consistingof an electrical shock applied to the supraorbitary nerve. As shown in the topdiagram, another group of animals was prepared for recording the fieldexcitatory postsynaptic potential (fEPSP) evoked on dentate granule cells bythe electrical stimulation of the medial perforant pathway. For this, animalswere implanted with stimulating (St.) and recording (Rec.) electrodes aimed atactivating medial perforant pathway projections to the dentate gyrus. (B and C)Photomicrographs illustrating the location of recording (B) and stimulating(C) sites (arrows). Scale bar ¼ 500 lm. Abbreviations: D, L, M, V, dorsal,lateral, medial, ventral; DG, dentate gyrus.

Fig. 2. Learning curves in conditioned (control), pseudoconditioned andRo 25-6981-injected animals. (A) A schematic representation of the condi-tioning paradigm, illustrating the conditioned (CS) and unconditioned (US)stimuli. An example of an electromyographic (EMG) record collected from theeighth conditioning session of a control animal is illustrated. (B) Evolution ofthe percentage of conditioned responses (CRs) during the successive sessionsfor control, pseudoconditioned and Ro 25-6981-injected animals. Ro 25-6981(10 mg ⁄ kg, i.p.) was administered 30 min before each conditioning session.Control and pseudoconditioned animals were injected with vehicle (DMSO).Mean percentage values and their SEM are given. Differences between controland pseudoconditioned and Ro 25-6981-injected groups were statisticallysignificant for all conditioning and extinction sessions (asterisks, P < 0.01).

NMDAR NR2B subunit and synaptic plasticity 831

ª The Authors (2007). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing LtdEuropean Journal of Neuroscience, 25, 830–836

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performed (Fig. 2B). For the experiment illustrated in Fig. 3 below, tenadditional reconditioning sessions were carried out. A conditioningsession consisted of 60 CS–US presentations separated at random by30 ± 5 s. Conditioning sessions lasted � 30 min. For habituation andextinction sessions, the CS was presented alone, also for 60 times persession at intervals of 30 ± 5 s. For reconditioning, we followed thesame procedure as for conditioning. Pseudoconditioned animalsreceived ten sessions of unpaired CS and US presentations, as wellas four habituation and five extinction sessions (Domınguez-del-Toroet al., 2004).

Recording and stimulation procedures

EMG recordings were performed using Grass P511 differentialamplifiers with a bandwidth of 0.1 Hz to 10 kHz (Grass-Telefactor,West Warwick, RI, USA). As a criterion, we considered a ‘CR’ as thepresence, during the CS–US period, of EMG activity lasting > 20 msand initiated > 50 ms after CS onset. In addition, the integrated EMGactivity recorded during the CS–US interval had to be 2.5 timesgreater than the averaged activity recorded 500 ms before CSpresentation (Gruart et al., 2006). For hippocampal recordings, weused the same Grass amplifiers, with a high-impedance probe(2 · 1012 W, 10 pF). To determine the final location of dentate gyruselectrodes, we used, as a guide, the field potential depth profile evokedby paired (interval of 10–50 ms) pulses presented to the medialperforant pathway. The middle of the three recording electrodes wasfixed at the site where a reliable monosynaptic (� 2–3 ms) fEPSP wasrecorded (McNaughton, 1980; Kosub et al., 2005). For in vivorecordings during classical conditioning, the stimulus intensity was setat 30–40% of the intensity necessary for evoking a maximum fEPSPresponse (Gureviciene et al., 2004). An additional criterion forselecting stimulus intensity was that a second stimulus, presented 10–50 ms after a conditioning pulse, evoked a larger (> 20%) fEPSP(Bliss & Gardner-Medwin, 1973).

Drugs and histology

R-(R*,S*)-a-(4-hydroxyphenyl)-b-methyl-4-(phenylmethyl)-1-piperi-dine propranolol (Ro 25-6981) hydrochloride (Sigma, Madrid, Spain)was dissolved in DMSO (vehicle) at a concentration of 10 mg ⁄ mL.Animals received 10 mg ⁄ kg (i.p.) of this solution or the same volumeof DMSO. At the end of the experiments, rats were re-anesthetized(sodium pentobarbital, 50 mg ⁄ kg), and perfused transcardially withsaline and 4% phosphate-buffered paraformaldehyde. Selected sec-tions (50 lm) were mounted on gelatinized glass slides and stained

Fig. 3. Learning curves and evolution of the synaptic field potential incontrols and in Ro 25-6981-injected animals. (A) A representation of theexperimental paradigm, including the conditioned (CS) and unconditioned (US)stimuli, and the moment at which a single pulse (100 ls, square, biphasic) waspresented to the medial perforant pathway (vertical arrow). An example of anelectromyographic (EMG) recording from the orbicularis oculi muscle (O.O),obtained from the eighth conditioning session of a control animal, is illustrated,as well as an extracellular recording of dentate gyrus activity from the sameanimal, session and trial. Note the field excitatory postsynaptic potential(fEPSP) evoked by the single pulse presented to the perforant pathway (smallarrow, St.). Calibrations are indicated for both traces. (B) Effects ofRo 25-6981 during reconditioning. A group of animals were injected withRo 25-6981 (10 mg ⁄ kg, i.p., closed circles) during the first five sessions ofreconditioning (shaded rectangle). Mean percentage values of conditionedresponses and their SEM are illustrated. Differences with the corresponding(first–fifth) reconditioning sessions of controls (open circles) were statisticallysignificant (asterisks, P < 0.001). From the sixth session onwards, animalsfrom the experimental group (closed circles) were maintained under the samereconditioning protocol, with no further administration of Ro 25-6981, but theywere unable to reach control values (sixth–tenth sessions, P < 0.001).(C) Evolution of fEPSPs evoked at dentate granule cells by single pulsesapplied to the perforant pathway for controls (open triangles) and Ro 25-6981-injected animals (closed triangles). Injection sessions are indicated by theshaded rectangle. At the top are illustrated representative examples of fEPSPsrecorded from controls and experimental animals during the third habituation(left), the ninth conditioning (middle) and the third reconditioning (right)sessions. The graphs at the bottom show the evolution of the fEPSP slope forcontrols and experimental groups. fEPSP slopes from controls and experimen-tal animals during the first–fifth reconditioning sessions were significantlydifferent (P < 0.001), as well as during the following sixth–ninth sessions(P < 0.001).

832 M. Valenzuela-Harrington et al.

ª The Authors (2007). Journal Compilation ª Federation of European Neuroscience Societies and Blackwell Publishing LtdEuropean Journal of Neuroscience, 25, 830–836

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with 0.1% Toluidine blue to determine the location of recording andstimulating electrodes (Fig. 1B and C).

Data analysis

EMG and hippocampal recordings were stored digitally on a computerthrough an analog ⁄ digital converter (CED 1401 Plus, Cambridge,UK), at a sampling frequency of 11–22 kHz with an amplituderesolution of 12 bits. Commercial computer programs (Spike 2 andSIGAVG from CED) were modified to represent EMG and fEPSPrecordings. Data were analysed off-line for quantitation of CRs andthe fEPSP slope with the help of custom-designed representationprograms (Domınguez-del-Toro et al., 2004; Gruart et al., 2006). Theslope of evoked fEPSPs was collected as the first derivative (V ⁄ s) offEPSP records (V). For this, five successive evoked field synapticpotentials were averaged, and the mean value of the slope wasdetermined for the rise-time period (i.e. the period of the slopebetween the initial 10% and the final 10% of the evoked fieldpotential). Computed results were processed for statistical analysisusing the SPSS for Windows package. Unless otherwise indicated,data are represented as mean ± SEM. Collected data were analysedusing a two-way anova test, with time or session as the repeatedmeasure, coupled with contrast analysis when appropriate. Repeated-measures anova allowed us to check the statistical differences of thesame group across sessions. Regression analysis was used to find therelationship between the fEPSP slope and the percentage of condi-tioned responses during the different learning situations.

Results

First, we confirmed that electrode implantation in the upper eyelid didnot disturb reflexively evoked eyeblink responses. We found that theelectrical stimulation (2· threshold) of the supraorbitary nerve evokedan early (6–7 ms) activation of the orbicularis oculi muscle, followedby a second, more variable (15–25 ms) EMG activation. Thesesuccessive muscle activations corresponded to the R1 and R2components described in humans (Kugelberg, 1952), cats (Gruartet al., 1995) and mice (Domınguez-del-Toro et al., 2004).

In a first series of experiments, we compared the learningcapabilities of control (n ¼ 5), pseudoconditioned (n ¼ 5) andRo 25-6981-injected (n ¼ 5) rats, using a trace conditioning para-digm. Animals included in the Ro 25-6981 group were injected30 min before each conditioning session. Both control and pseudo-conditioned animals were injected with vehicle (DMSO). As illustra-ted in Fig. 2, control animals presented the normal learning curvepreviously described in mice when using a similar trace conditioningprocedure (Gruart et al., 2006). These animals presented a mean of30.3 ± 1.9% responses during the fourth conditioning session, andreached asymptotic values by the 9th)10th conditioning sessions(> 59% responses, see Fig. 2B). By contrast, both pseudoconditionedand Ro 25-6981-injected animals presented very poor learningperformances, never reaching values above those recorded duringthe habituation sessions (Fig. 2B). Ro 25-6981-injected animals neverreached > 7% of CRs during conditioning sessions, i.e. the same levelreached during habituation sessions. Given that they presented normalblink reflexes in response to electrical stimulation of the supraorbitarynerve, but were unable to develop noticeable eyelid CRs, the absenceof the latter responses was not due to any technical problem with theEMG recording system, nor to any motor impairment in facial motoror premotor pathways. Moreover, Ro 25-6981 administration did notevoke any observable abnormal behavior in the injected animals. The

percentages of CRs collected from controls as compared withpseudoconditioned and Ro 25-6981-injected animals were signifi-cantly different (P < 0.01, two-way anova, F36,144 ¼ 30.7) for allconditioning and extinction sessions.To confirm further the deficits presented by Ro 25-6981-injected

animals for the acquisition of CRs, we designed a second series ofexperiments. First, animals (n ¼ 12, divided into two groups:controls, open circles; experimental, closed circles, Fig. 3B) under-went a complete cycle of habituation, conditioning and extinctionsessions (Fig. 3B). Both groups of animals acquired CRs to a levelsimilar to that presented by the control group illustrated in Fig. 2B.One day after the fifth extinction session, the two groups of animalswere reconditioned, but in this case the experimental group wasinjected with Ro 25-6981 30 min before each of the first fiveconditioning sessions (shaded rectangle in Fig. 3B). As expected,reconditioned animals of the control group presented a fasteracquisition rate than during conditioning sessions. By contrast, duringthe five (first–fifth) reconditioning sessions in which animals of theexperimental group were injected with Ro 25-6981, they presentedpercentages of CRs similar to those reached during the habituationsessions. In fact, the percentage of CRs reached during the first fivereconditioning sessions by the experimental group was significantlylower than the values reached during the same sessions by the controlgroup (P < 0.001, repeated-measures anova, F9,45 ¼ 27.34;Fig. 3B). As soon as we stopped the administration of Ro 25-6981(sixth–tenth reconditioning sessions), animals acquired CRs at theexpected rate (Fig. 3B), but they were still unable to reach valuessimilar to those of the control group (F9,45 ¼ 27.34, P < 0.001) forthe same set of sessions.As explained in Fig. 3A, this second series of experiments included

the presentation of a single electrical pulse to the medial perforantpathway 300 ms after CS presentation. Figure 3A shows a singlerecording of the fEPSP evoked in a control animal during the eighthconditioning session. Although the stimulus presented to the perforantpathway disrupted the regular theta rhythm recorded in the localelectroencephalogram for � 200 ms, the rhythm reappeared in phaseafterwards. fEPSPs evoked in the dentate gyrus of the two groups(control and experimental) increased progressively in slope (taking theslope of fEPSPs collected during the four habituation sessions as100%) across conditioning to a maximum of � 125% during the tenthconditioning session (Fig. 3C). Thus, the fEPSP slopes recorded fromthe fourth to the tenth conditioning sessions were significantlydifferent from values collected during habituation sessions(F18,90 ¼ 54.32, P < 0.01). During extinction, the fEPSP slopedecreased to a minimum of � 90% during the fourth extinctionsession for both groups of animals, but values collected were notsignificantly different from those obtained during habituation sessions.Moreover, fEPSP slopes for the two groups (control and experimental)presented no significant differences for habituation, conditioning andextinction sessions (F18,90 ¼ 0.37, P ¼ 0.741; Fig. 3C). By contrast,fEPSP slopes recorded during the first five reconditioning sessions(shaded rectangle, Fig. 3C) for the experimental group (i.e. wheninjected with Ro 25-6981) were significantly smaller than thecorresponding values collected in the control group (F9,45 ¼ 83.04,P < 0.001). Significant differences in fEPSP slopes between thecontrol and experimental groups were still present for the sixth–ninthsessions (when no further Ro 25-6981 was administered).As illustrated in Fig. 4A, the slope of fEPSPs evoked by the

electrical stimulation of the medial perforant pathway at dentategranule cells was linearly related (r ‡ 0.75, P < 0.001) to thepercentage of CRs across sessions of conditioning (slope, 1.78),extinction (slope, 1.11) and reconditioning (slope, 1.04), but not

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habituation. As already reported for the CA3–CA1 synapse (Gruartet al., 2006), the fact that the slopes of the three regression lines weresimilar suggests that the activity-dependent plasticity at the perforantpathway–dentate gyrus synapse functions as a continuum for thesedifferent (conditioning, extinction, reconditioning) learning situations.Similar results were obtained from the experimental group in theabsence of Ro 25-6981. By contrast, Ro 25-6981 administration(during the first–fifth reconditioning sessions) to the experimentalgroup not only impeded the CR reacquisition and fEPSP potentiation,but also prevented any significant relationship between the percentage

of CRs and fEPSP slopes (r ¼ 0.36, P ¼ 0.689; Fig. 4B, shadedcircles).

Discussion

Based on the present results, NR2B-containing NMDARs play adefinite role both in the acquisition (and reacquisition after extinctionsessions) of associative learning in alert behaving adult rats and in theactivity-dependent synaptic plasticity at the medial perforant pathway–dentate gyrus synapse. These results confirm previous findingsregarding the involvement of the NR2B subunits in mechanismsunderlying the generation of LTP signals, as shown at the CA3–CA1synapse (Kohr et al., 2003; Berberich et al., 2005) and at the anteriorcingulate cortex (Zhao et al., 2005). In fact, a link between functionalsynaptic potentiation during the acquisition of associative learning andLTP processes has been convincingly demonstrated recently during invivo experiments carried out in mice (Gruart et al., 2006) and rats(Whitlock et al., 2006). In this regard, it has also been shown thatNR2B subunits seem to play a critical role in classical eyeblinkconditioning in GluRe2 (NR2B) heterozygous mutant mice (Takeharaet al., 2003).However, the present results cannot be related to the generation of

LTD signals, as demonstrated in vitro using hippocampal (Liu et al.,2004) and perirhinal cortex (Massey et al., 2004) slices, and in mutantmice defective for NMDA NR2B subunits (Kutsuwada et al., 1996).The main reason is that the slope of the fEPSP evoked in the dentategyrus by single pulses presented in the medial perforant pathwayduring the CS–US interval increased (i.e. did not decrease, as wouldbe expected in an LTD-related process) across conditioning andreconditioning sessions. Ro 25-6981 evoked a disfacilitation of thephysiological synaptic drive across conditioning. In this regard, it hasbeen recently reported that Ro 25-6981 reduces selectively LTP, butnot LTD, evoked in the CA1 region of hippocampal slices (Bartlettet al., 2007). Moreover, whereas LTP is easily evoked in vivo at theperforant pathway–dentate gyrus synapse (Fazeli et al., 1993), LTD isnot (Kemp & Bashir, 2001). It is also important to point out that thecerebellum cannot be involved in the learning deficits evoked byRo 25-6981, because in the adult state this structure is devoid ofNR2B subunits (Watanabe et al., 1993; Mori & Mishina, 1995). Infact, NR2B subunits are substituted in the adult cerebellum by NR2Csubunits (Watanabe et al., 1993; Mori & Mishina, 1995).The present results also indicate that the physiological potentiation

of the medial perforant pathway–dentate granule cell synapse isrelated to the process of acquisition of new learning abilities, as is LTP(Do et al., 2000; Abraham & Williams, 2003), and that NR2B-containing NMDARs seem to be necessary for this process to occur(Kohr et al., 2003; Berberich et al., 2005; Zhao et al., 2005). On theother hand, the present results cannot be reasonably ascribed to LTD-related processes (Liu et al., 2004). As discussed below, it is stillpossible that NR2B subunits play a dominant homeostatic and ⁄ orregulatory role in the adult brain, being preferentially involved indepotentiation processes following the activation of NR2A-containingNMDARs (Abraham & Williams, 2003; Perez-Otano & Ehlers, 2005).In a seminal study, Weisz et al. (1984) demonstrated a potentiation

of synaptic activation of dentate granule cells by perforant pathwayaxons during the acquisition of nictitating membrane CRs. Thismodulation in synaptic strength during the learning process has beenconfirmed here for the same synaptic pathway, as well as for theCA3–CA1 synapse (Gruart et al., 2006; Whitlock et al., 2006).Apparently, trace conditioning requires an activity-dependent modi-fication of synaptic responsivity for learning to occur (Weisz et al.,

Fig. 4. Quantitative analysis of the relationships between percentage ofconditioned responses and fEPSP slopes for the two groups (controls andRo 25-6981-injected) illustrated in Fig. 3. (A) Data collected from the controlgroup. Each point represents the mean value collected from a single animalduring the corresponding session: habituation (closed triangles), conditioning(closed circles), extinction (closed squares) and reconditioning (open circles).Regression lines and their corresponding equations are included only forcoefficient of correlation (r > 0.6). The P-values for each regression analysisare always indicated. (B) Data collected from the experimental group.Symbols and analysis are similar to data illustrated in A. Results obtained inthe first–fifth reconditioning sessions, during which Ro 25-6981 was injected,are indicated by the arrow (shaded circles). Data from the sixth–tenthreconditioning sessions are indicated by open circles. Note that there was nolinear relationship between conditioned responses and fEPSP slopes (r > 0.36,P ¼ 0.689) in Ro 6981-injected animals during the first–fifth reconditioningsessions.

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1984; Gruart et al., 2006), and could be linked to the activation ofNR2B-containing NMDARs, as Ro 25-6981 was able to block bothsynaptic potentiation and the acquisition of classically conditionedeyelid responses. In fact, the decrease in fEPSP amplitude duringRo 25-6981 application can be tentatively explained as a down-regulation of the AMPA receptor, resulting probably from thesustained blockage of the NMDA receptor (Zhong et al., 2006). Inaccordance, the NR2B-containing NMDARs located in selectivehippocampal postsynaptic sites could play a regulatory and ⁄ orhomeostatic role (Perez-Otano & Ehlers, 2005), contributing tosynaptic depotentiation (Abraham & Williams, 2003) or weakeningof synaptic transmission (Kim et al., 2005).

A parsimonious approach to the present results and to thecontradictory (Kutsuwada et al., 1996; Tang et al., 1999; Liu et al.,2004; Massey et al., 2004; Berberich et al., 2005) reports on theNR2B-containing NMDARs suggests that NR2B subunits playdifferent roles in synaptic development and plasticity, depending onthe developmental stage and on the synaptic circuits and brain areasinvolved. For example, mice overexpressing immature NR2B subunitspresent enhanced hippocampal LTP and higher learning capabilities(Tang et al., 1999), whereas mutant mice defective in NR2B subunitspresent an impairment for evoking LTD at the hippocampal CA3–CA1synapse. Nevertheless, the increased availability or the blocking ofNR2B subunits might produce different effects on LTD or LTP,depending on the neural sites or on the activation of differentintracellular pathways (Liu et al., 2004). Thus, the reported contra-dictions indicate the presence of many different homeostatic andregulatory processes involving the different types of NMDARs (Perez-Otano & Ehlers, 2005).

Acknowledgements

This study was supported by grants from the Spanish MCYT (BFU2005-01024and BFU2005-02512) and Junta de Andalucıa (CTS-168). M.V.-H. was avisiting predoctoral fellow. We thank Ms Marıa Esteban for animal care andhandling and Mr Roger Churchill for his editorial help.

List of abbreviations

CS, conditioned stimulus; CR, conditioned responses; EMG, electromyo-graphic; fEPSP, field excitatory postsynaptic potential; LTD, long-termdepression; LTP, long-term potentiation; NMDARs, NMDA receptors; US,unconditioned stimulus.

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