AguilarMoscoso L.desbloqueado

7/26/2019 AguilarMoscoso L.desbloqueado

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE MEDICINA

ESCUELA DE MEDICINA

COMPARACIN DEL EFECTO INHIBITORIO IN VITRO DEL EXTRACTO

ETANLICO CON EL ACEITE ESENCIAL DE CYMBOP HIERBA LUISASOBRE

UNA CEPA DE CANDIDA ALBICANS

TESIS PARA OPTAR EL GRADO DE

BACHILLER EN MEDICINA

AUTOR:

AGUILAR MOSCOSO, LUCERO AGUSTINA

ASESOR:

MEJA DELGADO, ELVA

TRUJILLO PER

2013

Biblioteca Digital. Oficina de Sistemas e Informatica - UNT

Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comecial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Per .Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/pe/


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AGRADECIMIENTOS

A Dios por ser mi Padre, amparo y refugio, que en su infinita bondad inspir en m la

vocacin de servicio.

A mis padres Justiniano y Vilma por su amor, dedicacin y empeo.

A mis hermanos Laura, Jos y Omar por su cario, apoyo y comprensin.

A mi asesora la Dra. Elva Meja Delgado por la confianza y ayuda que me ha

brindado de forma incondicional.

A todos mis profesores que guiaron mis pasos a lo largo de toda la carrera y me

dieron con su ejemplo valiosas enseanzas.


Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comecial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Per .

Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/2.5/pe/


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INDICE

I. INTRODUCCIN... 5

1.1

Antecedentes..5

1.2Justificacin.....11

1.3

Enunciado del problema......11

1.4Hiptesis......12

1.5

Objetivos......12

II.

MATERIALES Y MTODOS..13

2.1

Material de estudio...13

2.2Mtodos y tcnicas...14

2.3Definicin de variables operacionales.....15

2.4Diseo procedimental......16

2.5

Anlisis estadstico..........23

2.6tica.........23

2.7Diseo experimental.....24

III. RESULTADOS.....26

IV. DISCUSIN......35

V.

CONCLUSIONES.........39

VI. RECOMENDACIONES40

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS..41





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RESUMEN

El objetivo del presente estudio fue comparar el efecto inhibitorio in vitrodel extracto

etanlico con el aceite esencial de Cymbopogon citratussobre una cepa de Candida

albicans ensayando 13 repeticiones por cada concentracin al 5% (44mg/ml), 25%

(222mg/ml), 50% (443mg/ml), 75% (665mg/ml) y 100% (886mg/ml) de aceite

esencial y 5% (50mg/ml), 25% (250mg/ml), 50% (500mg/ml), 75% (750mg/ml) y

100% (1000mg/ml) de extracto etanlico.Mediante la Prueba de Difusin en Discos

o Kirby y Bauer se obtuvo con las cinco concentraciones del aceite esencial y slo al

100% del extracto etanlico un efecto mximo (40mm); mientras que las otras

concentraciones del extracto etanlico presentaron menores halos inhibitorios pero

con incremento conforme al aumento de la concentracin; encontrndose diferencia

significativa en este grupo. Con respecto a la Concentracin Inhibitoria Mnima

(CIM), se encontr disminucin de las Unidades Formadoras de Colonias (UFC)

conforme aumenta la concentracin. En el aceite esencial, a partir del 50% no se

contabiliz UFC; mientras que el extracto etanlico inhibi a Candida albicans a la

concentracin de 100%. Se concluye, que el extracto etanlico tiene menor efecto

inhibitorio in vitro sobre Candida albicans que elaceite esencial; y que la CIM del

aceite es 50% (443mg/ml) y el extracto etanlico inhibe a Candida albicansslo al

100% (1000mg/ml)

Palabras clave: Cymbopogon citratus, Hierba luisa, Candida albicans, Halo de

inhibicin, Concentracin Mnima Inhibitoria, Unidades Formadoras de Colonia





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ABSTRACT

The aim of this study was to compare the in vitro inhibitory effect of the ethanol

extract with the essential oil of Cymbopogon citratuson a strain of Candida albicans

tested 13 replicates for each concentration to 5 % ( 44mg/mL ), 25 % (222mg/ml) ,

50% (443mg/ml), 75% (665mg/ml) and 100% (886mg/ml) essential oil and 5%

(50mg/ml), 25% (250mg/ml), 50% (500mg/ml), 75% (750mg/ml) and 100%

(1000mg/ml) ethanol extract. By Disk Diffusion o Kirby and Bauer test was obtained

with the five concentrations of the essential oil and only 100% of the ethanol extract

maximum effect (40mm), while the other concentrations of ethanol extract halos

showed lower growth inhibitory but under increased concentration; significant

difference was found in this group. Regarding the Minimum Inhibitory Concentration

(MIC) found decreased colony forming units (CFU) with increasing concentration. In

the essential oil, from 50% was not accounted UFC, while the ethanol extract

inhibited Candida albicansat a concentration of 100%. It is

concluded that the ethanol extract has lower inhibitory effect on Candida albicansin

vitro essential oil, and that oil CIM is 50% (443mg/ml) and ethanol extract inhibits

Candida albicansonly 100% (1000 mg / ml)

Keywords:Cymbopogon citratus, lemongrass, Candida albicans, Halo of inhibition,

Minimum Inhibitory Concentration (MIC), Colony Forming Units (CFU)





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I. INTRODUCCIN

1.1 Antecedentes:

Las infecciones oportunistas continan siendo una causa mayor de morbilidad y

mortalidad en el mundo, presentndose con mayor frecuencia y gravedad en las

inmunodeficiencias, siendo la ms prevalente actualmente el VIH- SIDA. Al inicio de

la epidemia, la incidencia global de stas era muy alta, pero con la instauracin de la

Terapia Antirretroviral fue disminuyendo en gran manera; sin embargo, en pases

con deficiencias econmicas y baja cobertura del programa, stos continan

provocando problemas para su manejo.(1,2)

As mismo, existen otras condiciones que favorecen el desarrollo de estas infecciones

como alteracin en la fagocitosis (lupus eritematoso sistmico, diabetes mellitus),

granulocitopenia (citotxicos, radioterapia), inmunodepresin consecutiva al uso de

glucocorticoides, antibioticoterapia sistmica y quimioterapia, en especial en

receptores de trasplantes; adems de anomalas en la inmunidad humoral (leucemia,

mieloma).(3,4)

Se conoce que las infecciones oportunistas son procesos infecciosos invasivos

producidos por grmenes habitualmente no patgenos que se manifiestan en estados

de baja inmunidad; siendo los ms frecuentesPneumocystis jiroveci,Aspergillus spp,

Candida spp. Este ltimo, es la causa ms comn de infecciones fngicas en

pacientes inmunodeficientes, provocando infecciones que van desde trastornos





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mucocutneos hasta enfermedades invasivas. Es frecuente tambin en

inmunocompetentes en edades extremas de la vida como lactantes y ancianos, adems

de gestantes.

(2,3,4)

La candidiasis es producida por hongos del gnero Candida la cual incluye ms de

150 especies, de las cuales, slo algunas son patgenas para los seres humanos como

C.albicans, C.krusei, C.parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata; destacando la primera

por ser la ms frecuente. Estos microorganismos generalmente se encuentran en

objetos inanimados, alimentos, animales y como comensales en humanos, ya que

forman parte de la flora normal, habitando en el tubo digestivo, aparato reproductor

femenino (mucosa vaginal) y piel periorificial. Normalmente conviven en equilibrio

con otros microorganismos, pero se torna patgena al perderse ste y causa afeccin

local o sistmica.(3,4,5,6,7)

El tratamiento convencional de la candidiasis se basa en uso de agentes antifngicos

sistmicos y tpicos, siendo de eleccin los azoles por su efectividad; stos actan

inhibiendo la desmetilasa de 14-alfa-esterol, enzima del citocromo P450; impidiendo

la conversin del lanosterol a ergosterol, un componente vital de la membrana celular

de los hongos.(6,7,8,9,10)

A pesar de su eficacia, en los ltimos aos, se ha aislado con mayor frecuencia, cepas

de levaduras con susceptibilidad disminuida o resistente a los antifngicos. La





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resistencia puede ser clnica o in vitro, siendo la primera, consecuencia fundamental

del bajo nivel del frmaco en el tejido y/o sangre, debido a una interaccin entre

frmacos o al severo grado de inmunodepresin del paciente. La resistencia in vitropuede ser primaria, donde la levadura es naturalmente resistente o tambin puede ser

secundaria, donde cepas susceptibles se transforman en organismos resistentes debido

al contacto previo con el antimictico. En s, la resistencia antifngica depende de la

interaccin entre frmaco, hongo y paciente; siendo ms relevante ste ltimo.

Los mecanismos de resistencia a los azoles propuestos son: disminucin de la

permeabilidad de membrana citoplasmtica, sobreexpresin de enzimas y mutaciones

de compensacin.(11,12,13,14,15)

Adems de la resistencia, las interacciones y la toxicidad, especialmente heptica

estn ocasionando fallas en la teraputica antimictica, lo que est fomentado la

bsqueda de nuevas alternativas entre productos naturales; habiendo los ltimos aos

un considerable inters en el uso de extractos alcohlicos y aceites esenciales de

plantas aromticas por su potente actividad antimicrobiana y antifngica.(15,16,17)

Una planta muy estudiada es Cymbopogon citratus(C. citratus) conocida en nuestro

pas como hierba luisa; sta pertenece a la familia Poaceae, considerada hierba

perenne con hojas aromticas que alcanzan de 1 a 2 m de alto, originaria de la India,

pero adaptable a regiones tropicales como nuestro pas. Es reconocida como una





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planta medicinal, siendo la infusin hecha de sus hojas popularmente utilizada como

antiespasmdico, antinflamatorio y analgsico.(18,19)

Esta planta posee como metablico secundario el aceite esencial, el cual le sirve de

defensa contra animales herbvoros y en particular contra plagas de insectos y hongos

patgenos. La cantidad y calidad del aceite esencial estn en relacin con la calidad

de su cultivo determinada por factores genticos y ambientales. En C. citratus, el

momento de la cosecha ejerce una considerable influencia; conocindose que las

hojas nuevas, tiernas y cosechadas prematuramente dan un contenido bajo y fuera de

lo normal de monoterpenos y poca solubilidad. En diversos estudios se ha evaluado

las condiciones adecuadas para obtener un buen rendimiento del aceite esencial

llegndose a la conclusin de que cosechar cuatro veces en el ao da un mayor

rendimiento en masa vegetal con buenos contenidos de aceite esencial y de alta

calidad, siendo el rendimiento promedio del aceite esencial de 0.4 a 4% por cada

100g de materia vegetal fresca.(19,20,21,22)

La calidad del aceite est en relacin tambin a su composicin, destacando los

monoterpenos oxigenados, siendo citral el de mayor cantidad (65-85%); a stos se les

atribuye el efecto antibacteriano y antifngico contra dermatofitos y levaduras, el que

ha sido estudiado por diversos investigadores.





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Tangarife y col (2011), estudiaron la actividad contra C. albicansdel aceite esencial y

extracto de plantas en Colombia, evaluando inhibicin de formacin de tubos

germinales en comparacin a azoles; adems de citotoxicidad. La mayor actividad seobtuvo con aceites de Piper bredemeyeri y el extracto de Morinda royoc; el

C.citratus fue efectivo, pero en menor proporcin a los anteriores. Se concluy que

las muestras activas inhibieron a C. albicans y no fueron citotxica.(23)

Da Silva y col (2008) evaluaron el efecto in vitrodel aceite esencial del C. citratusy

citral, sobre hongos filamentosos no dermatofitos y levaduras usando discos de

difusin, demostrndose la potente accin del aceite contra levaduras especialmente

sobre C. albicans(dimetro del halo>40mm con 8ul de aceite esencial).(24)

Hammer col (1999) estudiaron a 52 plantas extrayendo aceites esenciales y extractos

y evaluando su actividad contra bacterias y hongos entre ellas aeromonas y C.

albicans, utilizando mtodo de microdilucin; determinando que el aceite esencial de

C. citratus, organo y laurel inhiban a todos los organismos siendo stos los ms

efectivos. Para C.albicans, el C. citratuspresenta un 0.06% en CIM.(25)

Tyasi y Malik (2010) compararon la actividad del aceite esencial de C. citratus en

fase lquida y vapor contra C. albicansdeterminando que la CIM de aceite esencial en

fase lquida (288 mg/l) fue mayor que en fase vapor (32,7 mg/l) y que exposicin de

4h es suficiente para causar 100% prdida en viabilidad de clulas de C. albicans.(26)





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Guerra y col (2004) evaluaron la actividad inhibitoria in vitro del aceite esencial y

una crema de C. citratus sobreC.albicans,siendo la CIM del aceite de 0.16mg/ml y

la crema, 2.5mg/ml, concluyendo que el aceite tiene una notable actividadantifngica.(27)

Alzamora y col (2001) investigaron la actividad antimicrobiana de aceites esenciales

de plantas de Medicina Tradicional en Per, entre ellas C.citratus, y se evalu su

eficacia frente a bacterias y hongos como C.abicans; hallando similar efecto entre

nistatina y C. citratus.(28)

Con respecto al extracto etanlico de C. citratus, hay estudios que demuestran su

actividad antiinflamatoria, por inhibicin en la produccin de citoquinas; en especial

est relacionado con el factor de transcripcin NF-B. Tambin se le atribuye una gran

capacidad como antioxidante pues tiene un alto contenido de fenoles, entre los que

destaca isoorientina, swertiajaponina e isoorientina 2-V-ramnsido. (29,30,31,32)

Se conoce que los fenoles son compuestos simples que contienen un anillo fenlico

sustituido y actan inhibiendo enzimticamente compuestos oxidados, mediante

reacciones de grupos sulfihidrilos o por interaccin con protenas. Adems, stos

tienen propiedades antispticas, por lo que se ha planteado una actividad

antibacteriana y antifngica. (33)





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1.2 Justificacin:

La aparicin de especies patgenas con resistencia clnica e in vitro, las interacciones

farmacolgicas significativas, biodisponibilidad insuficiente y toxicidad de los

antifngicos tradicionales, sobre todo en inmunodeprimidos con SIDA, quienes

reciben numerosos frmacos, ha fomentado la bsqueda de nuevos alternativas entre

productos naturales contra los patgenos oportunistas como C. albicans; y siendo

nuestro pas uno de los ms ricos en biodiversidad, es nuestro desafo vincular y

convertir el conocimiento de los recursos biolgicos en compuestos o productos tiles

en beneficio de nuestra sociedad.

Existen numerosas plantas utilizadas en la medicina alternativa pero no todas son

avaladas cientficamente, por ello se propone determinar el efecto inhibidor de C.

citratus hierba luisa para sobre una cepa de C. albicans comparando el aceite

esencial y el extracto etanlico, y conocer si este ltimo tiene efecto inhibitorio

similar al aceite esencial, considerando que su obtencin es ms sencilla, econmica

y rpida que del aceite esencial.

1.3 Enunciado del problema:

Tiene efecto inhibitorio in vitro el extracto etanlico de forma similar al efecto del

aceite esencial de Cymbopogon citratus hierba luisa sobre una cepa de Candida

albicans?





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1.4 Hiptesis:

El extracto etanlico tiene efecto inhibitorio in vitro similar al aceite esencial de

Cymbopogon citratushierba luisa sobre una cepa de Candida albicans

1.5 Objetivos:

1.5.1 Objetivos Generales:

Comparar el efecto inhibitorio in vitrodel extracto etanlico con el aceite esencial del

Cymbopogon citratushierba luisa sobre una cepa de Candida albicans

1.5.2 Objetivos Especficos:

- Determinar la concentracin inhibitoria mnima del aceite esencial de Cymbopogon

citratushierba luisa utilizando concentraciones al 5%, 25%, 50%, 75%, 100% sobre

una cepa de Candida albicans

- Determinar la concentracin inhibitoria mnima del extracto etanlico de Cymbopogon

citratushierba luisa utilizando concentraciones al 5%, 25%, 50%, 75%, 100% sobre

una cepa de Candida albicans

- Determinar el efecto inhibitorio del aceite esencial de Cymbopogon citratus hierba

luisa utilizando el mtodo de difusin en disco sobre una cepa de Candida albicans

- Determinar el efecto inhibitorio del extracto etanlico de Cymbopogon citratushierba

luisa utilizando el mtodo de difusin en disco sobre una cepa de Candida albicans.





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II. MATERIAL Y MTODOS

2.1 Material de estudio:

1.1. Material biolgico:

Cepa de Candida albicans ATCC 10231 obtenida del laboratorio MediMark R

Europe que fue enviada al laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Medicina

de la Universidad Nacional de Trujillo

1.2. Material botnico:

Hojas frescas de Cymbopogon citratus (hierba luisa), recolectada por la maana del

distrito de Usquil (1500 m.s.n.m.), provincia de Otuzco y departamento de La

Libertad, durante el mes de mayo; y recibidas en el laboratorio de Farmacognosia

de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad Nacional de Trujillo

donde se realiz la extraccin del aceite esencial y la obtencin del extracto etanlico.

Un ejemplar completo de la planta se llev al Herbarium Truxillense (HUT) de la

Universidad Nacional de Trujillo para su identificacin y posterior verificacin

taxonmica, donde se encuentra registrado como Cymbopogon citratus (hierba luisa)

con nmero de depsito 0054392.





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2.2 Mtodos y tcnicas:

Tipo de Investigacin:

El presente trabajo presenta un Diseo experimental en bloques completamente al

azar con una observacin por bloque en cada tratamiento

Muestra:

Fue creada de acuerdo a los parmetros microbiolgicos experimentales revisados,

quedando constituida por 260 placas Petri.

Clculo para el nmero de ensayos se har con la siguiente frmula:

n = (Z /2 + Z )22S2

(x1x2)2

Siendo n= el nmero de repeticiones a efectuar en cada investigacin

Z /2 = 1.96 para = 0.05

Z = 0.84 para = 0.20

S = 0.9 (x1x2) valor asumido por no haber estudios previos

Se determin una muestra de 13 observaciones para cada concentracin.





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2.3 Definicin de variables operacionales:

Definiciones operacionales:

Aceite esencial de C. citratus: lquido de color amarillo plido, con olor intenso a

limn, similar apariencia y consistencia de aceites grasos, voltil, no deja huella ni

mancha grasosa, que se obtiene de la destilacin por arrastre de vapor de las hojas.

Extracto etanlico de C. citratus: lquido con olor caracterstico a limn, obtenido

por percolacin en contacto con etanol, seguida de la eliminacin de dicho solvente

por procedimiento fsico.

Variable Indicador Tipo Escala

Variable independiente

Aceite esencial de

Cymbopogon citratus

Extracto etanlico de

Cymbopogon citratus

Concentraciones al 5%, 25%,

50%, 75%, 100% del aceite

esencial

Concentraciones al 5%, 25%,

50%, 75%, 100% del

extracto etanlico

Cuantitativa

Cuantitativa

Ordinal

Ordinal

Variable dependiente

Efecto inhibitorio in

vitro sobre una cepa de

Candida albicans

Dimetro del halo de

inhibicin

Unidades formadoras de

colonias (UFC)

Cuantitativa

Cuantitativa

Ordinal

Ordinal





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Efecto inhibitorio in vitro: Capacidad para detener la reproduccin del hongo en

condiciones experimentales. Resultado de medir el crecimiento del hongo mediante la

longitud del dimetro del halo de inhibicin (dimetro de disco = 6mm) en cada PlacaPetri.

Unidades Formadoras de Colonias (UFC): Crecimiento del hongo en forma de

colonias, las que se encuentran esparcidas por toda la superficie de la placa.

Concentracin inhibitoria mnima: menor concentracin en la cual no se observaron

UFC.

2.4 Diseo procedimental:

Preparacin de la muestra de Cymbopogon citratus(hierba luisa)

Lavado de la muestra:

Luego de la seleccin, se procedi a lavar las hojas con agua corriente, seguido de

una desinfeccin utilizando hipoclorito de sodio a una concentracin de 200ppm

durante 5 minutos. Posteriormente se realiz un enjuague con agua destilada para

retirar residuos de hipoclorito.(34,35,36)

Conservacin de la muestra:

Las hojas se conservaron bajo sombra a una temperatura aproximada de 21oC, en

los ambientes del laboratorio de Farmacognosia de la Facultad de Farmacia y

Bioqumica de la Universidad Nacional de Trujillo, durante 1 da, luego se fraccion

trozos pequeos y se conserv en bolsas de papel kraft.(34,35,36)





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Obtencin del aceite esencial:

Se realiz por el mtodo de destilacin por arrastre de vapor de agua(convencional). El aceite esencial fue extrado a partir de los trozos pequeos que se

colocaron en un baln de fondo plano y se sometieron a una corriente de vapor de

agua sobrecalentada; de esta manera se arrastr la esencia que posteriormente por

accin del refrigerante de bolas, fue condensada. El destilado se separ tomando en

cuenta sus propiedades de inmiscibilidad y diferencia de densidades entre el agua y el

aceite esencial, utilizando una pera de separacin de vidrio, se deshidrat las

impurezas de agua en el aceite esencial con sulfato de sodio anhidro, se filtr y luego

se guard en un frasco de vidrio color mbar (evita la descomposicin por la luz) y

bajo refrigeracin a una temperatura de 4 oC.(34,35,36)

Determinacin del rendimiento de aceite esencial:

La determinacin del porcentaje de rendimiento de aceite esencial (%RAE), se

realiz a escala laboratorio por el mtodo de arrastre por vapor de agua en un equipo

de destilacin de vidrio. A partir de 100 g de hojas de Cymbopogon citratus (hierba

luisa), se obtuvo un determinado volumen que fue medido con una probeta florentino.

Por el mtodo gravimetra-volumtrico se determin el %RAE, aplicando la siguiente

frmula:(34,35,36)





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%RAE = Vol. AE (mL)/ P.muestra (g) x 100

Donde:

Vol. AE : Volumen del aceite esencial obtenido en mililitros.

P.muestra: Peso de la muestra a destilar en gramos.

%RAE = Vol. AE (mL)/ P.muestra (g) x 100

%RAE =0.0048 / 0.60 x 100 %RAE= 0.8

El rendimiento del aceite esencial es de 0.8% por cada 100g de hojas de C.citratus.

Diluciones del aceite esencial:

Se obtuvo finalmente 2.6ml de aceite esencial, con una densidad de 0.8861 g/ml. Para

la prueba de difusin en discos, se prepararon 5 diluciones utilizando etanol de

96oG.L. como diluyente, obtenindose, concentraciones de 5% (44mg/ml), 25%

(222mg/ml), 50% (443mg/ml), 75% (665mg/ml) y 100% (886mg/ml).

Preparacin del extracto etanlico:

Se prepar el extracto etanlico mediante el mtodo de percolacin. Se pes 250 g de

las hojas previamente secadas y cortadas en pequeos trozos de C.citratusy se separ

en porciones equivalentes a 125 g, 75 g y 50 g de la muestra. Se coloc la porcin de

125g previamente humectada en el percolador y se macer con alcohol de 70GL por





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48 horas. Se prosigui a percolar y se recogi 50 ml del extracto, los cuales se

separaron y se guardaron en un frasco de vidrio de color mbar. Se continu

recibiendo 5 porciones sucesivas del percolado de 75 mL cada una enumerada segnel orden que se recibe. Se coloc la segunda porcin equivalente a 75 g de la

muestra en el percolador y se macer con las porciones de 75 mL del lote anterior

por 48 horas. Se percol hasta obtener 75 mL y se guard en el frasco de vidrio de

color mbar. Se prosigui percolando 5 porciones de 50 mL de extracto, cada uno

enumerado segn el orden que se recibe. Se coloc la tercera porcin equivalente a

50 g y se macer por 48 horas con las porciones de extracto del lote anterior. Luego

se procedi a percolar hasta obtener 125 ml de extracto, los cuales se pasaron al

frasco de vidrio de color mbar. La cantidad final de extracto etanlico fue de 250 ml

Este extracto se llev a secar en una cmara de secado al vaci a una presin

reducida y a una temperatura de 30 C; luego se pes el residuo seco y se guard en

refrigeracin a 4 C en frasco de vidrio de color mbar estril.

Diluciones del extracto etanlico:

A partir de este residuo seco, se prepararon las concentraciones disueltas en etanol de

70 G.L, de 5%, 25%, 50%, 75% y 100%.

Para la preparacin de la concentracin del 5% se aadi el residuo seco en una

proporcin de 5 g de residuo seco en 100 ml de etanol, determinando una

concentracin de 50 mg/ml, para la concentracin del 25 % se aadi 25 g de residuo





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seco en 100 ml de etanol determinando una concentracin de 250 mg/ml, de 50%,

500 mg/ml de 75%, 750mg/ml y 100%, 1000 mg/ml.(34,35)

Preparacin de cepa de Candida albicans:

La cepa se cultiv en tubos de ensayo con tapa rosca en medio agar Sabouraud

dextrosa 4% a 25C por 24 horas.

Sembrado:

Con un hisopo estril, el cual fue embebido en el tubo del cultivo preparado y a una

distancia de 10cm de la llama de un mechero, se sembr en placas Petri contenido

agar Sabouraud hisopando uniformemente sobre toda la superficie del agar y girando

cada placa 30C por 10 veces aproximadamente. (37,38,39)

Determinar el efecto inhibitorio (prueba de susceptibilidad):

Luego de realizar el sembrado de la cepa de C. albicansATCC 10231 en placas Petri

se realiz la prueba de susceptibilidad utilizando el mtodo de Kirby Bauer, difusin

en discos, para lo cual se prepar discos de papel filtro estriles (dimetro 6mm) y se

les sumergi dentro de cada una de las concentraciones de aceite esencial y extracto

etanlico; y despus, con aguja estril fueron colocados sobre los cultivos de





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C.albicans cepa ATCC 10231 en placas Petri, preparados previamente. Hubo dos

grupos controles, un control positivo con Clotrimazol solucin 1% y un control

negativo con solucin salina. Posteriormente las placas se incubaron a 35C durante24h. La siembra del microorganismo fue para cada concentracin de ambos grupos y

los controles. Finalmente la lectura se llev a cabo a las 24 horas; y se midi los halos

de inhibicin de cada una de las concentraciones incluyendo el rea del disco de

papel de filtro con una regla milimetrada procedindose de igual manera con ambos

controles.(37,38,39)

Determinar la Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM):

La determinacin de la CIM se realiz por el mtodo de diluciones en tubos en donde

se utiliza 10 tubos de ensayo para cada concentracin numerndose del 1 al 10. En el

nmero 1 se coloca la primera concentracin a trabajar, en el tubo N2, 0.2ml de la

concentracin y 0.2ml de solucin salina; en tubo N3, 0.2ml de la dilucin anterior y

0.2 ml solucin salina y as sucesivamente hasta el tubo 10. Luego se coloca 0.2ml

de la dilucin de la cepa (semejante al tubo N05 de Mac Farland que corresponde a

108 bacterias/m2) en cada uno de los 10 tubos, agitndolos para uniformizarlos.

Luego, los tubos son colocados en la estufa a 37C por 24 horas. Posteriormente, se

siembra 0.1ml de solucin de cada uno de los tubos en 13 placas con agar Sabouraud

(repeticiones) utilizando el asa de Driglasky para dispersar la muestra, realizndose

dentro del dimetro de 10cm de la llama de un mechero. Las placas se colocan en la





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estufa por 24 horas a 37C y luego se realiza el conteo de Unidades Formadoras de

Colonias (UFC), considerndose como CIM a la menor concentracin en la cual no se

observaron UFC.

Para el conteo, se emplea la siguiente frmula:

UFC= N/4 x A x D

Donde

N= nmero de colonias

A=rea

D= dilucin

Todo este procedimiento se debe realizar con cada una de las concentraciones de

ambos grupos, tanto aceite esencial como extracto etanlico, adems del control

positivo con Clotrimazol solucin 1% y negativo con solucin salina. Sin embargo,

antes de realizar este procedimiento se consider utilizar primero el mtodo de

dilucin en tubos abreviado, con el cual se obtenga la menor concentracin que

inhiba el crecimiento del hongo, y con sta, realizar el mtodo descrito al inicio, con

las 13 repeticiones para hallar la CIM. Para el mtodo de dilucin en tubos abreviado

se utiliz12 tubos de ensayo, 5 para cada concentracin del aceite esencial y 5 para el

extracto etanlico; se aadi 0.8 ml de cada concentracin (5%, 25%, 50%, 75%,

100%), luego se realiz la inoculacin de 0,2 ml del cultivo de C.albicans (en

concentracin semejante al tubo 0.5 de la escala de Mac Farland que corresponde a

108 bacterias/m2) en cada uno de los tubos correspondientes; el undcimo tubo





24/65


23

correspondi al control con Clotrimazol solucin al 1% aadindose 0.8 ml de este

frmaco y 0.2 ml del hongo; en el duodcimo tubo se realiz el control colocando

1ml de cultivo de C.albicanssin tratamiento. Los tubos fueron colocados en la estufaa 37C por 24 horas. Posteriormente, se determinaron las cuentas viables sembrando

0.1ml de solucin de cada uno de los tubos en 13 placas con agar Sabouraud por cada

concentracin y grupos controles, utilizando el asa de Driglasky para dispersar la

muestra. Las placas se colocaron en la estufa por 24 horas a 37C y luego se

contabiliz las UFC, considerndose como CIM a la menor concentracin en la cual

no se observaron UFC.

2.5 Anlisis estadstico e interpretacin de la informacin:

Los datos obtenidos fueron procesados de manera automatizada con el soporte del

paquete estadstico SPSS 15.0 y para analizar la informacin se construy tablas de

frecuencias de entrada con sus valores absolutos. Para determinar el efecto inhibitorio

de cada tipo de solucin se hizo un anlisis de varianza de un diseo completamente

aleatorizado, y a partir de este, se determin la conveniencia del uso de la prueba de

Duncan para comparaciones mltiples, ambos con un nivel de significancia del 95%.

2.6 tica:

La investigacin se realiz considerando los principios de bioseguridad, prestando

atencin adecuada a factores que puedan daar el medio ambiente y se consider los

principios de la Declaracin de Helsinki en investigaciones in vitro.(40)





25/65


24

2.7 Diseo experimental

UFC

Halo deinhibicin

UFC

Halo deinhibicin

UFC

Halo de

inhibicin

UFC

Halo deinhibicin

UFC

Halo deinhibicin

ACEITE ESENCIAL

5%

25%

50%

75%

100%

n=13

n=13

n=13

n=13

n=13

UFC

Halo deinhibicin

Clotrimazol 1%

n=13

44mg/ml

222mg/ml

10mg/ml

886mg/ml

665mg/ml

443mg/ml





26/65


25

UFC

Halo deinhibicin

UFC

Halo deinhibicin

UFC

Halo deinhibicin

UFC

Halo deinhibicin

UFC

Halo deinhibicin

EXTRACTO ETANLICO

5%

25%

50%

75%

100

n=13

n=13

n=13

n=13

n=13

UFC

Halo deinhibicin

Solucin salinan=13

50mg/ml

1000mg/m

750mg/ml

250mg/ml

500mg/ml





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26

III. RESULTADOS

Al analizar el efecto inhibitorio in vitro del aceite esencial y extracto etanlico del

Cymbopogon citratus sobre Candida albicans, se presentan en la Tabla N1 los

halos inhibitorios registrados en 13 repeticiones por cada una de las cinco

concentraciones del extracto etanlico y el aceite esencial de C.citratus.

En la Tabla N2 se muestra el anlisis de varianza de ambos grupos y se obtuvo

como resultado que existe una diferencia estadstica altamente significativa del

dimetro del halo de inhibicin del crecimiento del C. albicansa las concentraciones

del extracto etanlico y aceite esencial de C. citratusaplicado.

En la Tabla N 3, se presenta los promedios del dimetro de halo de inhibicin de

crecimiento de C. albicansdespus de la aplicacin de discos con extracto etanlico

y aceite esencial de C.citratus a diferentes concentraciones, se realiz la Prueba de

significancia de Duncan, que compar cada uno de los promedios de los halos,

demostrando que no existe diferencia significativa entre los dimetros promedios de

los halos inhibitorios del extracto etanlico al 5 %, 25%, 50% y 75%; pero si existe

diferencia significativa entre los dimetros promedios de los halos inhibitorios al

5%,25%, 50% y 75% con 100%. En el grupo del aceite esencial no se encuentra

diferencia estadstica significativa entre las concentraciones al 5%, 25%, 50%, 75% y





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27

100%; encontrndose a su vez que no hay diferencia estadstica significativa con el

extracto etanlico al 100%. (p=0.05).

En la Tabla N 4 se muestra las UFC registradas en las 13 repeticiones por cada

concentracin de extracto etanlico y aceite esencial de C. citratusy el promedio de

estas por concentracin.

En la Tabla N 5, se presenta el anlisis de varianza, el cual determina que existe una

diferencia estadstica altamente significativa en el crecimiento de UFC de C. albicans

con el extracto etanlico y aceite esencial de C.citratusde acuerdo a la concentracin

aplicada. (p = 0.00).

En la Tabla N 6, se muestra los promedios del nmero de UFC de C. albicans

despus de la aplicacin del extracto etanlico y aceite esencial de C.citratusa cinco

concentraciones cada uno; se realiz la Prueba de significancia de Duncan, que

determin la existencia de grupos estadsticamente diferentes en cuanto a la actividad

inhibitoria del crecimiento de C. albicans: (p=0.05).

Existe diferencia significativa en el crecimiento de UFC de C. albicansdel extracto

etanlico de C.citratusal 100% con el crecimiento de UFC del extracto etanlico a

5%, 25%, 50% y 75% de concentracin.





29/65


28

Existe diferencia significativa en el crecimiento de UFC de C. albicans del aceite

esencial de C. citratus al 100%, 75% y 50% con el crecimiento de UFC del aceite

esencial al 25% y 5% de concentracin.

No hay diferencia estadstica significativa en el crecimiento de UFC de C. albicans

del extracto etanlico deC. citratus al 100% de concentracin con el crecimiento de

UFC del aceite esencial de C. citratusal 100%, 75% y 50%.





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29

TABLA N 1: Dimetro de halo de inhibicin del aceite esencial y extracto

etanlico de Cymbopogon ci tratushierba luisa sobre una cepa de

Candida albicans

DIMETRO DEL HALO DE INHIBICIN (mm)

N/C

CONCENTRACIONES DE

EXTRACTO ETANLICO DE

Cymbopogon citr atus

CONCENTRACIONES DE

ACEITE ESENCIAL DE


5% 25% 50% 75% 100% 5% 25% 50% 75% 100% control

1 6 7 9 9 40 40 40 40 40 40 02 7 7 8 10 40 40 40 40 40 40 0

3 6 8 9 10 40 40 40 40 40 40 0

4 7 7 8 10 40 40 40 40 40 40 0

5 6 7 8 10 40 40 40 40 40 40 0

6 6 7 8 9 40 40 40 40 40 40 0

7 6 7 8 10 40 40 40 40 40 40 0

8 6 8 8 10 40 40 40 40 40 40 0

9 6 7 8 10 40 40 40 40 40 40 0

10 6 8 8 10 40 40 40 40 40 40 0

11 6 7 9 10 40 40 40 40 40 40 0

12 6 7 8 9 40 40 40 40 40 40 0

13 6 8 9 10 40 40 40 40 40 40 0

Prom6.15 7.31 8.31 9.77 40* 40 40 40 40 40 0

(mm.)

* Alcanza nivel mximo en la evaluacin de todas las repeticiones.

Fuente:Datos obtenidos por la investigadora, ao 2013

N: nmero de repeticionesC: Cepa Candida albicansControl: alcohol 70 (etanol)





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30

TABLA N 2: Anlisis de Varianza para evaluar los bloques (dimetros de halos

inhibitorios) y los tratamientos (actividad inhibitoria del extracto etanlico y

aceite esencial de Cymbopogon citr atus)

Origen de

las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio

de los

cuadrados F Probabilidad

Valor

crtico

para F

Tratamiento 32271.38 9 3585.71 45110.54 0 1.96

Error 9.54 120 0.08

Total 32280.92 129






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31

TABLA N 3: Prueba de Duncan de comparacin del dimetro del halo de

inhibicin (mm) segn concentracin del extracto etanlico y del aceite esencial

de Cymbopogon ci tratushierba luisa

Concentraciones ni Grupos alfa = 0.05

1 2 3

E5% 13 6.15

E25% 13 7.31

E50% 13 8.31

E75% 13 9.77

E100% 13 40

A5% 13 40

A25% 13 40

A50% 13 40

A75% 13 40

A100% 13 40






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32

TABLA N 4: Efecto inhibitorio in vitro en UFC del extracto etanlico y del

aceite esencial de Cymbopogon ci tratushierba luisa sobre

una cepa de Candida albi cans.

UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS DE Candida albi cans

N/C

CONCENTRACIONES DE

EXTRACTO ETANLICO DE

Cymbopogon ci tratus

CONCENTRACIONES DE

ACEITE ESENCIAL DE


5% 25% 50% 75% 100% 5% 25% 50% 75% 100%

1 16 10 14 12 0 2 0 0 0 0

2 8 12 12 10 0 1 0 0 0 0

3 15 10 10 7 0 2 0 0 0 0

4 10 10 11 10 0 0 0 0 0 0

5 16 14 14 8 0 2 1 0 0 0

6 9 10 10 11 0 0 2 0 0 0

7 18 6 16 9 0 2 2 0 0 0

8 14 10 9 10 0 0 0 0 0 0

9 15 18 10 10 0 0 0 0 0 0

10 12 12 10 8 0 0 1 0 0 0

11 11 17 10 9 0 2 3 0 0 0

12 14 16 10 10 0 1 1 0 0 0

13 18 12 8 9 0 1 2 0 0 0

Prom

13.54 12.08 11.08 9.46 0 1 0.92 0 0 0UFC






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33

TABLA N 5: Anlisis de Varianza para evaluar los bloques (UFC) y los

tratamientos (efecto inhibitorio in vitrodel extracto etanlico y aceite esencial de

Cymbopogon citr atushierba luisa sobre una cepa de Candida albi cans)

Origen de

las

variaciones

Suma de

cuadrados

Grados

de

libertad

Promedio

de los

cuadrados F Probabilidad

Valor

crtico

para F

Tratamiento 4056.96 9 450.77 144.93 0.00 1.96

Error 373.23 120 3.11

Total 4430.19 129






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34

TABLA N 6: Prueba de Duncan de comparacin del efecto inhibitorio in vitro

en UFC segn concentracin del extracto etanlico y del aceite esencial de

Cymbopogon ci tratushierba luisa sobre una cepa de Candida albi cans.

Concentraciones ni Grupos alfa = 0.05

1 2 3

E5% 13 13.5

E25% 13 12.1

E50%13 11.1

E75% 13 9.5

E100% 13 0

A5% 13 1

A25% 13 0.92

A50% 13 0

A75% 13 0

A100% 13 0






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35

IV. DISCUSION

El tratamiento para la candidiasis constituye un reto en pacientes

inmunodeprimidos pues ha surgido resistencia a los azoles de manera gradual

durante terapias prolongadas y en la poblacin general, por el uso indiscriminado

de los conocidos trifarmacos en cuyo composicin se encuentra antimicticos;

siendo los mecanismos demostrados, cambios en la lanosterol demetilasa y en la

D5-6 esterol desaturasa. Adems de la resistencia, la toxicidad heptica, las

interacciones farmacolgicas de antifngicos tradicionales, as como uso de

drogas esteroides, cirugas y trasplantes que generan estados inmunodeficientes;

est ocasionando fallas en la teraputica antimictica a diversos compuestos como

ketoconazol, fluconazol e incluso anfotericina B, lo que est fomentando la

bsqueda de nuevas alternativas entre productos naturales.(8,13,15)

Considerando que el Per presenta una gran variedad de plantas medicinales y

cuyo uso con fines curativos es una prctica ancestral, se ha motivado a

profundizar en el estudio y conocimiento de las especies vegetales que tienen

propiedades medicinales y desarrollar su experiencia en el empleo de las

sustancias que se extraen de ellas. La presente investigacin demostr el efecto

inhibitorio in vitro del aceite esencial y extracto etanlico del Cymbopogon

citratusfrente a una cepa de Candida albicans.

El aceite esencial de C. citratus gracias a su alta volatilidad y lipofilia puede

penetrar fcilmente y ejercer su efecto biolgico a nivel de la membrana celular,

donde altera su estructura provocando fugas y muerte celular, bloqueando





37/65


36

tambin la sntesis de membrana, inhibiendo la germinacin de esporas y la

respiracin celular. Existen varias investigaciones que avalan su eficacia como el

realizado por Irkin y col (2009) que utilizando el mtodo de difusin en disco

encontraron que 1ul/ml del aceite esencial de C. citratus tiene un halo de

inhibicin de 15+ 2.1 mm para C. albicans.(18,19,36)

Taweechaisupapong y col (2012), investigaron el efecto antifngico in vitrodel

aceite esencial de C.citratus contra C. albicans y C. krusei tanto en forma

planctnica y biofilm, encontrando que posee actividad anti biopelcula, como

probable modulador de la colonizacin por cndida,(37)

Al realizar la prueba de susceptibilidad con Difusin en discos se determin un

promedio de halo inhibicin de 40mm a las cinco concentraciones de aceite

esencial utilizados, similar efecto report Da Silva y col (2008) cuando analizaron

el efecto del aceite esencial en C.albicans. El efecto del aceite puede explicarse

sobre la base de la composicin qumica que presenta, pues en l se encuentran

altos niveles de monoterpenos oxigenados (78,2%) constituidos a su vez por

geranial (-citral) y neral (-citral). La accin del citral, mezcla de geranial y neral

fueron estudiados por Moleyar y Narasimhan (1986) quienes encontraron unabuena actividad sobre Aspergillus niger, Fusarium oxysporum y Penicillium

digitatum. As tambin se determin que en la composicin de C.citratus hay

monoterpenos hidrocarburos (7.9%) como canfeno (1,5%) y limoneno (4,2%) que

poseen accin antimictica y se sugiere que lo hacen por difusin en la membrana

celular.(24,45,46,47)





38/65


37

Al evaluar la sensibilidad con el extracto etanlico de C. citratus se hall un

promedio del halo de inhibicin de 14.31mm, menor al del aceite; sin embargo,

conforme aumenta la concentracin, los halos de inhibicin son mayores, llegando

a tener efecto mximo al 100%, siendo segn esta prueba, la concentracin

indicada para inhibir el crecimiento de C. albicans.

Orrego y Leyva (2008), Alvin (2012) y Montoya (2003) estudiaron al extracto

etanlico de C. citratusencontrando que los compuestos fenlicos mayoritarios y

responsables de su actividad biolgica son: isoorientina, swertiajaponina e

isoorientina 2-V-ramnsido. Los fenoles se caracterizan por su actividad biocida

ya que inducen una alteracin de la permeabilidad en la membrana citoplasmtica,

produciendo una progresiva salida de constituyentes intracelulares y con un

aumento de su concentracin, provocan la lisis y destruccin microbiana.(31,32,44)

Todas las concentraciones de aceite esencial utilizadas en el presente estudio

tuvieron buen efecto inhibitorio pues creci menos de 30 UFC, siendo la actividad

mayor a partir de la concentracin 50%; a partir del cual no se evidenci

crecimiento de UFC, considerndosele como la CIM. Adems, se determin que

existe diferencia estadstica significativa entre la concentracin de 50% con las del5 % y 25%; demostrndose que el efecto inhibitorio vara de acuerdo a la

concentracin aplicada. Con respecto al extracto etanlico, la concentracin

efectiva fue al 100% (1000mg/ml) mientras que las dems concentraciones, si

evidenciaron crecimiento del hongo, aunque disminuyen conforme aumenta la





39/65


38

concentracin. Adems todas estas presentaron diferencia estadstica significativa

entre ellas y con el extracto al 100%.

Considerando ambas pruebas, se demuestra que tanto aceite esencial como

extracto etanlico son activos frente a C. albicans, siendo ms efectivo el aceite

esencial, el cual desde una concentracin de 50% presenta buena actividad

mientras que para el extracto etanlico se requiere usar una concentracin al

100%.

Los resultados obtenidos abre nuevas posibilidades en el campo de la

investigacin clnica como farmacolgica, constituyendo as una alternativa

natural, eficiente y de bajo costo para el tratamiento de infecciones oportunistas

sobre todo en pacientes inmunodeficientes, considerndose la utilizacin del

extracto etanlico como una buena alternativa a utilizar como antimictico tpico

en forma de solucin para infecciones mucocutneas en dermatologa, as como su

uso por va oral, debindose demostrar su seguridad en seres humanos en

posteriores estudios.





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39

V. CONCLUSIONES

Al analizar el efecto inhibitorio in vitro del extracto etanlico y aceite esencial de

Cymbopogon citratusse concluye que:

La concentracin inhibitoria mnima del aceite esencial de Cymbopogon citratus

hierba luisa sobre Candida albicans es de 50% (443mg/ml)

A 100% (1000mg/ml) de concentracin del extracto etanlico de Cymbopogon

citratushierba luisa se inhibe el crecimiento de Candida albicans.

El aceite esencial de Cymbopogon citratushierba luisa tiene efecto inhibitorio in

vitro sobre Candida albicans, el cual es mayor cuando incrementa su

concentracin.

El extracto etanlico tiene menor efecto inhibitorio in vitroque el aceite esencial

de Cymbopogon citratus hierba luisasobre Candida albicans.





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40

VI. RECOMENDACIONES

Realizar estudios in vivo para valorar la efectividad y la toxicidad que puedan

proporcionar los componentes activos del aceite esencial y el extracto etanlico de

Cymbopogon citratus, as como la dosis teraputica para la poblacin humana.

Realizar otros estudios para ampliar el espectro de actividad antifngica y

antibacteriana de Cymbopogon citratus tanto del aceite esencial como extracto

etanlico.

Realizar estudios in vitroe in vivocon el extracto acuoso de Cymbopogon citratus

para determinar su espectro de actividad, ya que es popularmente utilizado.





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41

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

1. Gonzlez C Juan, Blanco P Francisco. Episodios oportunistas en pacientes

infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana durante los primeros 6

meses de la terapia antirretroviral de gran actividad. Med Clin Barc [internet].

2001; [consultado 24 set 2013] 117: 81-84. Disponible en:

http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=13016308&

2. Martn Lasso B. Diagnstico y tratamiento de infecciones oportunistas en el

paciente adulto con infeccin por VIH/SIDA. Rev Chil Infect [internet]. 2011;

[consultado 24 set 2013] 28 (5): 440-460. Disponible en:

http://www.scielo.cl/pdf/rci/v28n5/art10.pdf

3. Arenas G Roberto. Micologa mdica ilustrada. 4ta edicin. Mxico: Editorial Mc

Graw Hill; 2011.

4. Dan L. Longo, Dennis L. Kasper, J. Larry Jameson, Anthony S. Fauci, Stephen L.

Hauser, Joseph Loscalzo, Eds. Harrison Principios de Medicina Interna. 18ava

edicin. Mxico: Editorial Mcgraw-Hill, 2012

5. Moyes DL, Naglik JR. Mucosal Immunity and Candida albicans Infection. Clin

Dev Immunol. [internet]. 2011 [consultado 24 julio 2012] 9:1-9 Disponible en:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3137974/

6.

Laurence L. Brunton, Lazo S. John,Parker L Keith. Goodman y Gilman Las Bases

Farmacolgicas de la Teraputica.11ma edicin. Mxico: McGraw-Hill

Interamericana.

7. Ahmad S, Khan Z. Invasive candidiasis: A review of nonculture-based laboratory

diagnostic methods. Indian J Med Microbiol [internet]. 2012 [consultado 27

agosto 2012]; 30:264-9. Disponible en: http://www.ijmm.org/article.asp?issn0255



http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3137974/http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3137974/


43/65


42

8. Silva V. Vctor, Daz J. Cristina, Febr N. Vigilancia de la resistencia de

levaduras a antifngicos. Rev. Chil. Infectol. [revista en la Internet]. [citado

2013 Ago 20]. Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext

9. Gadea I, Cuenca-Estrella M. Recomendaciones para el diagnstico micolgico y

estudios de sensibilidad a los antifngicos. Enferm Infecc Microbiol Clin

[internet]. 2004 junio [consultado 15 agosto 2012] 22(1):32-9. Disponible en:

http://apps.elsevier.es/watermark/ctl_servlet?_f=10&pident_articulo=13056690

10. Aguirre J. Candidiasis orales. Rev Iberoam Micol [internet]. 2002 [consultado 23

julio 2012]; 19: 17-21.Disponible en: http://www.reviberoammicol.com/2002-

19/017021.pdf

11. Achkar JM, Fries BC. Candida Infections of the Genitourinary Tract. Clin.

Microbiol. Rev.[internet]. 2010 abril [consultado 3 agosto 2012]; 23 (2): 253273.

Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2863365/pdf/0076

12.

Jones JM. Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis. Clin. Microbiol. Rev.

[internet]. 1999 abril [consultado 1 mayo 2012];3 (1): 32-45 Disponible en:..

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC358139/pdf/cmr00046-0044.pdf

13. Gavald J, Ruiz I. Recomendaciones para el tratamiento de la infeccin fngica

invasiva. Infeccion fngica invasiva por Candida spp. Rev Enferm Infecc

Microbiol Clin [internet]. 2003 abril [consultado 13 julio 2012]; 21(9):498-508.Disponible en:http://www.elsevier.es/sites/default/files/elsevier/pdf/28/28v21n10a

14. Pimentel SB, Reynolds ME. Candidiasis vaginal. Rev Pacea Med Fam [internet].

2007 [consultado 12 junio 2012]; 4(6): 121-127. Disponible en: .

http://www.mflapaz.com/Revista_6/revista_6_pdf/6%20Candidiasis%20



http://www.reviberoammicol.com/2002-19/017021.pdfhttp://www.reviberoammicol.com/2002-19/017021.pdfhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC358139/pdf/cmr00046-0044.pdfhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC358139/pdf/cmr00046-0044.pdfhttp://www.reviberoammicol.com/2002-19/017021.pdfhttp://www.reviberoammicol.com/2002-19/017021.pdf


44/65


43

15. Espinel IA. Mechanisms of resistance to antifungal agents: Yeasts and

filamentous fungi. Rev Iberoam Micol [internet]. 2008 [consultado 30 julio 2012];

25: 101-106. Disponible en: http://www.reviberoammicol.com/2008-25/1011.pdf

16. Silva VV, Diaz JM, Febr N.Red de diagnstico en micologa mdica. Vigilancia

de la resistencia de levaduras a antifngicos. Rev. Chil. Infectol. [internet]. 2002

[citado 26 agosto 2012]. Disponible en:

http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0716-101820020192000

17. Manzano GP, Mndez TL, Hernndez HF, Lpez MR. La resistencia a los

antifngicos: un problema emergente en Mxico Gac Md Mx [internet]. 2008

[consultado 30 agosto 2012]; 144(1). Disponible en:.

http://www.imbiomed.com.mx/1/1/articulos.php?method=showDetail&id_articulo

18. Soto OR, Vega MG, Tamajn NA. Instructivo tcnico para el cultivo de

Cymbopogon citratus.(D.C.) Stapf (caa santa). Rev Cubana Plant Med [internet].

2002 [consultado 20 agosto 2012];7(2):89-95. Disponible en:

http://bvs.sld.cu/revistas/pla/vol7_2_02/pla07202.pdf

19. Soto O. Rafaela, Vega M. Gilberto, Tamajn N. Aldo. Frecuencia de las cosechas

en Cymbopogon citratus Stapf en las condiciones edafoclimticas de La Habana.

Rev Cubana Plant Med [revista en la Internet]. 2002 Ago [citado 2013 Jul 21] ;

7(2). Disponible en: http://bvs.sld.cu/revistas/pla/vol8_2_03/pla09203.htm20. Hernndez DL, Rodrguez JM, Garca D, Pino AJ. Actividad antidermatoftica in

vitro de aceites esenciales. Rev Cubana Plant Med [Internet]. 2003 [citado 01

setiembre 2012]; 8(2). Disponible en:

http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1028-479620030002000.





45/65


44

21. Vargas AR, Bottia ES. Estudio de la composicin qumica de los aceites

esenciales de seis especies vegetales cultivadas en los municipios de Bolvar y el

penSantander, Colombia. Revista de Salud UIS [internet]. 2008 [consultado

17 setiembre 2012]. Disponible en:

http://cenivam.uis.edu.co/cenivam/infraestructura/cibimol/tesis%20cibimol/Edwin

22. Wijesekera R. Practical manual on the essential oils industry thailand Institute of

scientific and technological research central institute of medical and aromatic

plants, India.1981

23. Tangarife CV, Correa RJ, Zapata LB, Durn C, Stanshenko E, Mesa AA. Anti-

Candida albicans activity, cytotoxicity and interaction with antifungal drugs of

essential oils and extracts from aromatic and medicinal plants. Infectio [internet].

2011 [consultado 17 julio 2012]; 15(3): 160-167. Disponible

en:http://www.scielo.org.co/scielo.php?pid=S012393922011000300004&script=s

24.

Da Silva CB, Guterres SS, Weisheimer V, Schapoval ES. Antifungal Activity of

the Lemongrass Oil and Citral Against Candida spp. Braz J Infect Dis [internet].

2008 febrero [consultado 7 junio 2012];12(1):63-66. Disponible en:

http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1413867020080001000

25. Hammer KA, Carson C http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3137974/

F, Riley TV. Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts.Journal of Applied Microbiology [internet].1999 febrero [consultado 04 junio

2012]; 86, 985990. Disponible en:

http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2672.1999.00780.x/pdf

26. Tyagi AK, Malik A. Liquid and vapour-phase antifungal activities of selected

essential oils against Candida albicans: microscopic observations and chemical



http://cenivam.uis.edu.co/cenivam/infraestructura/cibimol/tesis%20cibimol/Edwin%20Bottia%20y%20Adriana%20Vargas.pdfhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2672.1999.00780.x/pdfhttp://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-2672.1999.00780.x/pdfhttp://cenivam.uis.edu.co/cenivam/infraestructura/cibimol/tesis%20cibimol/Edwin%20Bottia%20y%20Adriana%20Vargas.pdf


46/65


45

characterization of Cymbopogon citratus. BMC Complementary and Alternative

Medicine [internet]. 2010 [consultado 2 agosto 2012],10:65 Disponible en:

http://www.biomedcentral.com/1472-6882/10/65 .

27. Guerra OM, Rodrguez JM, Garca SG, Llerena R C. Actividad antimicrobiana

del aceite esencial y crema de Cymbopogon citratus (DC). Stapf. Rev Cubana

Plant Med [internet]. 2004 [consultado 14 mayo 2012];9(2). Disponible en:

http://www.sld.cu/galerias/pdf/sitios/mednat/actividad_antimicrobiana_del_aceite

28. Alzamora L, Morales L, Armas L, Fernndez G. Medicina Tradicional en el Per:

Actividad Antimicrobiana in vitro de los Aceites Esenciales Extrados de Algunas

Plantas Aromticas. An. Fac. med. [internet]. 2001 [consultado 15 agosto 2012];

62(2): 156161. Disponible en: http://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/anales/v62

29. Bachiega, T. F y J.M. Sforci, Lemongrass and citral effect on cytokines

production by murine macrophages. J of Ethnopharmacology 137, 909-913 (2011)

30.

Cheel, J.C., J. Theoduluz, J. Rodriguez y Schmeda-Hirschmann, Free radical

scavengers and antioxidants of rom lemongrass (Cymbopogon citrates (DC)

Stapf). Journal Agricultural Food Chemestry, 53, 2511-2517 (2005)

31. Montoya, B., V. Lemeshko, J. Lpez, A. Pareja, A. Urrego y R. Torres, Actividad

antioxidante de algunos extractos vegetales. Vitae 10(2) 72-79 (2003)

32.

Orrego, C. y R. Leiva, Efecto de antioxidantes derivados de productos naturales,sobre la modificacin oxidativa in vitro, de lipoprotenas de baja densidad (LDL).

Tesis de maestra. Universidad de Talca, Talca. (2008)

33. Domingo D, Lpez B. Plantas con actividad antimicrobiana. Rev Esp

Quimioterap. Espaa 2003. 16(4):385-393





47/65


46

34. Miranda M. Mtodos de Anlisis de Drogas y Extractos. Instituto de Farmacia y

Alimentos. Universidad Habana de Cuba.2002.

35.

Bandoni, A. Los recursos vegetales aromticos en Latinoamrica, su

aprovechamiento industrial para la produccin de aromas y sabores. Edit. UNLP-

CYTED. Buenos Aires; 2000

36. Quintero, A., Gonzales N. y Vera A. Obtencin y anlisis cromatogrfico del

aceite esencial de Cymbopogon citratus (Limonaria mem). En Inst. Biol. Exper,

1999. 211-214

37. Pemn J, Martn ME, Rubio CM. Gua Prctica de Identificacin y Diagnstico en

Micologa Clnica.2da ed.Bilbao: Revista Iberoamericana de Micologa 2007.

38. Cantn LE, Martn ME, Espinel IA. Mtodos estandarizados por el CLSI para el

estudio de la sensibilidad a los anti fngicos (documentos M27-A3, M38-A y

M44-A). Rev Iberoam Micol [internet]2007 [consultado 2 de junio 2012]; 15

(6):121-130. Disponible en: http://www.guia.reviberoammicol.com/Capitulo15.pd

39. Garca RJ, Cantn R, Garca SE, Gmez LL, Martnez ML, Rodrguez AC, Vila J.

Mtodos Bsicos para el estudio de la sensibilidad a los antimicrobianos:

Procedimientos en Microbiologa Clnica. Sociedad Espaola de Enfermedades

Infecciosas y Microbiologa Clnica; 2000. Disponible en:

http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap11.htm40. Williams JR. The Declaration of Helsinki and public health. Bulletin of the World

Health Organization [internet]2008 [consultado 01 de noviembre 2012]; 86: 650-

651. Disponible en: http://www.who.int/bulletin/volumes/86/8/055/en/index.html

41. Irkin R, Korukluoglu M. Effectiveness of Cymbopogon citratus L. Essential Oil to

Inhibit the Growth of Some Filamentous Fungi and Yeasts. J Med Food [internet].



http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap11.htmhttp://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap11.htm


48/65


47

2009 mayo [consultado 20 junio 2012]; 12 (1), 193197. Disponible en:

http://www.who.int/whalecomonline.liebertpub.com/whalecom0/doi/pdf/10.1089/

42.

Taweechaisupapong S, Aieamsaard J, Chitropas P, Khunkitti W, Inhibitory effect

of lemongrass oil and its major constituents on Candida biofilm and germ tube

formation. South African Journal of Botany [internet]. 2012 julio [consultado 30

de agosto 2012] 81:95102. Disponible en:

http://hinarigw.who.int/whalecomwww.sciencedirect.com/whalecom0/science/arti

43. Merianos JJ. Surface-active Agents. In: Block SS, ed. Disinfection, Sterilization

and Preservation. 5th ed. Philadelphia, PA: : Lippincott Williams & Wilkins;

2001.p. 283-320

44. Alvis A, Martnez W, Arrazola G. Obtencin de Extractos Hidro-Alcohlicos de

Limoncillo (Cymbopogon citratus) como Antioxidante Natural. Informacin

tecnolgica [Internet]. 2012 mayo [consultado 1 de octubre 2013] 23(2), 3-10.

Disponible en: http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718

45. Moleyar V, Narasimham P: La actividad antifngica de algunos componentes del

aceite esencial. Food Microbiol 1986, 3: 331-6. Disponible en.

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0740002086900171

46. Wuryatmo E, Klieber A, Scott ES: La inhibicin de patgenos de postcosecha de

ctricos por el vapor de compuestos citral y afines en la cultura. J Agric FoodChem. 2003, 2637-40. Disponible en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1269

47. Tzortzakis NG, Economakis CD: actividad antifngica de lemongrass

(Cympopogon citratusL.) de aceite esencial contra los principales patgenos de

postcosecha. Inn Food Sci Technol Emerg 2007, 8 : 253-8. Disponible en:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1466856407000045





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ANEXOS





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49

Preparacin de la muestra de Cymbopogon citratus(hierba luisa)

Se fraccion en trozos pequeos y seconserv en bolsas de papel kraft

Seleccin y lavado de hojascon agua corriente





51/65


50

Obtencin delaceite esencial:

Destilacin porarrastre de vapor

de agua

Obtencin del extracto etanlico

Percolacin





52/65


51

Preparacin de cepade Candida albi cans

Agar Sabouraud

Sembrado en Placas Petri





53/65


52

Determinacin del efecto inhibitorio (Prueba de Susceptibilidad por mtodode Difusin en Discos)

Embeber discos con cada concentracin

Colocar con aguja estril sobre cultivos de C.albicans en placas Petri





54/65


53

Comparacin de halos de inhibicin del crecimiento de C. albicansconextracto etanlico y aceite esencial

Extracto etanlico 5% - Aceite esencial 5%

Extracto etanlico 100% - Aceite esencial 100%





55/65


54

Determinacin de Concentracin inhibitoria Mnima (CIM)

Prueba de Dilucin en tubos

Sembrar 0.1ml de solucin en cada uno de tubos en placas Petri





56/65


55

Placas Petri con 0 UFC de C. albicanscon extracto etanlico al 100% y

aceite esencial al 50%

Extracto etanlico 100%

UFC = 0

Aceite esencial 50%

UFC= 0





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ANEXO N1:

HOJA DE RECOLECCIN DE DATOS

Ttulo: Comparacin del efecto inhibitorio in vitro del extracto etanlico con elaceite esencial de Cymbopogon citratushierba luisa sobre una cepa de Candida

albicans

Cepa: Candida albicansATCC 10231

Medio de cultivo: Agar Sabouraud

Aceite esencial / Extracto etanlico deCymbopogon citratus

CONCENTRACIN

5% 25% 50% 75% 100%

Medida 1 (mm)

Medida 2 (mm)

Medida 3 (mm)

Medida 4 (mm)

Medida 5 (mm)

Medida 6 (mm)

Medida 7(mm)

Medida 8 (mm)

Medida 9 (mm)

Medida 10(mm)

Medida 11 (mm)

Medida 12 (mm)

Medida 13(mm)





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HOJA DE RECOLECCIN DE DATOS

Ttulo: Comparacin del efecto inhibitorio in vitro del extracto etanlico con el

aceite esencial de Cymbopogon citratushierba luisa sobre una cepa de Candidaalbicans

Cepa: Candida albicansATCC 10231

Medio de cultivo: Agar Sabouraud

Aceite esencial /Extracto etanlico deCymbopogon citratus

CONCENTRACIN

5% 25% 50% 75% 100%

Medida 1 (UFC)

Medida 2 (UFC)

Medida 3 (UFC)

Medida 4 (UFC)

Medida 5 (UFC)

Medida 6 (UFC)

Medida 7(UFC)

Medida 8 (UFC)

Medida 9 (UFC)

Medida 10(UFC)

Medida 11 (UFC)

Medida 12 (UFC)

Medida 13(UFC)





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ANEXO N2

TABLA N7 Comparacin de los promedios de halos de inhibicin del

aceite esencial y el extracto etanlico de Cymbopogon citratushierba

luisa, con el grupo control Clotrimazol solucin al 1%

sobre una cepa de Candida albicans.

Cymbopogon citr atushierba

luisa,

Grupo control

positivo

Extracto

etanlico

Aceite

Esencial*

Clotrimazol

solucin1%*

Media (mm) 14.31 40.00 40.00

Desv.

Estndar 15.82 0.00 0.00

*: Alcanza nivel mximo en la evaluacin de todas las repeticiones.

F = 151.3 p< 0.01






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ANEXO N3

TABLA N8: Comparacin del efecto inhibitorio in vitroen UFC del

extracto etanlico y del aceite esencial de Cymbopogon citratushierba luisa,

con el grupo control Clotrimazol solucin al 1% sobre una cepa de

Candida albicans.

Cymbopogon citratus hierba

luisa,

Grupo control

positivo

Extracto

etanlico

Aceite

Esencial* Clotrimazol sol. 1%*

Media9.23 0.31 0.23

Desv.Estndar

5.38 0.73 0.44

F = 35.25 p > 0.05






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ANEXO N4

EVALUACION DE LA TESIS

El Jurado deber:

a. Consignar las observaciones y objeciones pertinentes relacionados a los

siguientes items

b. Anotar el calificativo final

c.

Firmar los tres miembros del jurado

TESIS:...............................................................

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