Establecimiento de un protocolo para la Germinacin in vitro e Induccin a Callo embriognico de Cedro (Cedrela montana) a partir de embriones zigticos.

ANA LUCIA SANTAMARIA JIMNEZSangolgu, Junio 2012

JUSTIFICACINmoho Hypsipyla grandellaRamificacin excesiva Crecimiento atrofiadoDescortezar la base del troncoMuerte de los plantones Perdida extensa de frutos y semillas viables Presente investigacin Generar plntulas viables a nivel de laboratorio Restauracin del capital natural Regeneracin de la especieRecuperar el hbitat de muchas especies nativas de las zonas. Produccin masiva en lugares exclusivos de produccin de cedro .Aporte econmico para el Ecuador Evitar la tala de bosques protegidos

OBJETIVOSOBJETIVO GENERAL

Establecer un protocolo para la germinacin in vitro e Induccin a callo embriognico de cedro andino (Cedrela montana Moritz ex Turcz) a partir de embriones zigticos.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Establecer un procedimiento de desinfeccin para obtener embriones zigticos libres de agentes contaminantes.

Establecer la composicin adecuada de biorreguladores para el desarrollo de la germinacin in vitro de Cedrela montana Moritz ex Turcz.

Determinar la tasa y energa germinativa de Cedrela montana Moritz ex Turcz.

Determinar la concentracin apropiada de biorreguladores para inducir a callo embriognico a los embriones zigticos de Cedrela montana Moritz ex Turcz.

Verificar mediante tincin, clulas embrionarias obtenidas de los callos inducidos mediante biorreguladores.

HIPOTESISExiste un tipo de desinfectante y de fitohormona que al combinarse en concentraciones adecuadas, actan positivamente para la determinacin del establecimiento de un protocolo de germinacin in vitro e induccin a callo embriognico de Cedrela montana Moritz ex Turcz.

Introduccinrboles ms majestuosos y de mayor porte en los bosques de clima fro.Jardines de bromeliceas, helechos y orqudeas. Mejores materias primas, empleadas en la construccin de viviendas y en ebanisteraEs una especie de alto valor potencial:Captura bixido de carbono (CO2).Mejora el suelo, crecen en forma natural y en diversos pisos altitudinales (Guerra, 2009).

TaxonomaREINO PlantaeDIVISION MagnoliophytaCLASE MagnoliopsidaORDEN SapindalesFAMILIA MeliaceaeGENERO CedrelaESPECIE montana

NOMBRE COMN: cedro andino, cedro cebollo o cedro de montaaNOMBRE CIENTFICO: Cedrela montana Moritz Turcz.

Borja y Lasso en 1990, describen al Cedro en la siguiente Taxonoma:

25 m de altura. (Rodrguez et al., 2003).

Corteza externa es de color pardo griscea

Corteza interna posee un color crema con olor a ajo. CARACTERSTICAS GENERALESHojas alternas paripinadas stas hojas suelen despedir un olor a cebolla (Rodrguez, et al., 2003).

CARACTERSTICAS GENERALESSemilla, smara de color caf oscuro o claro, son aladas, aplanadas y lisas.Semillas Ortodoxas.Germinacin Epigea.Inflorescencia, en pancula terminal. Flores con cliz verde marrn, corola crema. Fruto capsular verde parduzco , lenticelado (Borja et al., 1990)

UBICACINCedrela montana, se lo puede ubicar en:

Bosques hmedo- Montano Bajo (bh-MB) entre los 1800-3200 msnm (Prado y Valdebenito, 2000),

En la provincia de Pichicha se lo puede ubicar:

En siete reas protegidas dentro de las cuales, el ms representativo es el Bosque Protector Cambugn.

http://www.cambugan.org

Cultivo in vitroDentro del cultivo in vitro existen varias tcnicas:

La micropropagacin o propagacin clonal.Germinacin in vitro de embriones inmaduro.Morfognesis.Germinacin in vitro Cuando la semilla en estado latente entra de pronto en actividad y origina una nueva planta, con condiciones controladas. De T, humedad entre otros.

MorfognesisFormacin de embriones desde el tejido en cultivo en forma de una masa desorganizada (callo).

Condiciones controladas.Bioreguladores

La embriognesis somtica

Organognesis Formacin de un embrin a partir de una clula o grupo de clulas no sexuales.Directa

IndirectaCultivo in vitro

Fase de InduccinEs el proceso por el que las clulas del explante (porcin de la planta donante cultivada in vitro) cambian su patrn de expresin y generan los embriones somticos inicialesEn esta fase de induccin, las clulas son receptivas al estmulo morfognico y hay una relacin directa entre el tipo, concentracin y combinacin de reguladores del crecimiento agregados al medio de cultivo y el rgano a desarrollar.Reguladores del crecimiento en el medio de cultivo, fundamentalmente auxinas y citoquininas

METODOLOGAEl proyecto de tesis se realiz en las instalaciones del Laboratorio de Micropropagacin Vegetal de la Empresa Pblica Municipal de Movilidad y Obras Pblicas de Quito (EPMMOP). Los embriones inmaduros obtenidos a partir de las cpsulas, fueron recogidas en los meses de febrero-marzo, en el Parque de Cumbay .El material vegetal utilizado en el proyecto fue recolectado, en el banco de semillas del Laboratorio de Micropropagacin Vegetal de la EPMMOP.

ETAPA DE PRE-ENSAYOSsta etapa inicio, con ensayos de diferentes soluciones para la desinfeccin y la evaluacin de material vegetal.

Otro proceso de desinfeccin fue perxido de hidrgeno a una concentracin del 3%(v/v). Por 10 minutos en agitacin, lavados seguidamente con agua estril.

HIPOCLORITO DE SODIOCONCENTRACIN 10.5% (V/V)CONCENTRACIN 21% (V/V)

ALCOHOLCONCENTRACIN 130% (V/V)CONCENTRACIN 270% (V/V)CONCENTRACIN 390% (V/V)

Etapa de DesinfeccinUnidad Experimental (UE): 30 tubos para cada tratamiento.Alcohol al 90 % por 30 segundos y se continu con el lavado utilizando agua estril. T0 a la concentracin 1% de hipoclorito de sodio.Valoracin de contaminacin:Se realiz una pre- germinacin de las semillas maduras de Cedro.

Ausencia0Presencia1Necrosis2

TratamientosConcentraciones de DesinfectantesT10.25%Hipoclorito de sodioT20.50%T30.75%T51%Perxido de HidrgenoT62%T73%

Etapa de GerminacinUnidad Experimental (UE): 30 tubos para cada tratamiento.Semillas pre- germinadas.

Desinfeccin de los embriones se realiz con perxido de hidrgeno al 3 % V/V.

Extrajo el embrinFueron sometidos a oscuridad por seis das y posteriormente se los coloc en un fotoperodo de 16 horas luz 8 horas oscuridad en la sala de incubacin a temperatura de 25-26 C, hasta su germinacin.(G0), para sta etapa ser medio bsico MS al 100%, sin reguladores

Etapa de Induccin a CalloUnidad Experimental (UE): 30 tubos para cada tratamiento.Se prosigui a llevarlos al cuarto de incubacin a una temperatura entre 25-26 C, estos frascos que contenan los embriones fueron incubados por dos meses en oscuridad Desinfeccin de los embriones se realiz con hipoclorito de sodio 0.5% V/V.

Extrajo el embrin

Mtodo de comprobacin Tincin de cido acetocarmnico descrito por Portillo, (2000).

RESULTADOSBasndose en el anlisis de varianza ANOVA para verificar el mejor tratamiento .Prueba Chi- cuadrado o un anlisis de medidas simetras.ETAPA DE DESINFECCIN

T2 (hipoclorito de sodio al 0.5%) y T7 (perxido de hidrgeno al 3%) carecen de un alto porcentaje de contaminacin y de necrosis de los embriones..

ETAPA DE GERMINACINAnlisis de varianza ANOVAPresencia de radcula y cotilednElongacinTamao final yNmero de hojasNivel de significancia de cada una de estos anlisis fue menor al establecido.Dentro de este anlisis se pudo establecer que en la germinacin se obtuvo 3 hojas por planta Por medio de la prueba Tukey se establece que el mejor tratamiento que se diferencia del grupo es el G5 (2mg.L-1 de brasinolida)Pruebas confirmatorias(prueba de Tukey y Chi- Cuadrado)

Anlisis de Varianza ANOVA ETAPA DE INDUCCIN A CALLO EMBRIOGNICO Nivel de significancia de cada una de estos anlisis fue menor al establecido.Pruebas confirmatorias(prueba de Tukey y Chi- Cuadrado)I3 (4mg.L-1 de cido 2,4-dichlorofenoxiactico) form la mayor cantidad de callo.

Presencia de calloColor y uniformidad del calloTamao y brillo

Anlisis para variables cualitativas

DISCUSINETAPA DE DESINFECCINHipoclorito de sodio

Perxido de hidrgeno.Muerte de microorganismos infecciosos Permitiendo que exista un mayor ndice de establecimiento en el material vegetalAgente de desinfeccin da buenos resultados en semillas forestales.Tiene ms capacidad de oxidacin, por sus fuertes propiedades oxidativasDegradar en agua y no es txico.

ETAPA DE GERMINACIN Perxido de hidrgeno Estimula la germinacin.

Involucrado en el crecimiento de la raz.Brasinolidacido giberlicoAgua de cocoUtilizado en la mircropropagacin de especies forestales.Crecimiento en embriones madurosPrincipal hormona para inducir la germinacinPermite mejorar la energa germinativa Muy rico en nutrientesContiene citoquininasEstimulan la elongacin de las clulas de los cotiledones

Se us al tratamiento de hipoclorito de sodio con concentracin del 0.5% v/v.ETAPA DE INDUCCIN A CALLO La fase de induccin.Relacionada directamente entre:

TipoConcentracin Combinacin de reguladores de crecimiento agregados al medio de cultivo rgano a desarrollarAuxinasEstimulan la iniciacin del callo embriognico Fuerte agente de desinfeccin, por perodos mas largos.

Tipo

Tamao de envase seleccionado.

Sistema de cobertura del mismoPrincipales factores limitantes Condiciones de luz Embriones sellados y bajo oscuridad permanente promueven la concentracin de CO2.Atmsfera gaseosa Puede ser txico para los embriones y la divisin celular

CONCLUSIONES

Los embriones desinfectados con hipoclorito de sodio al 0.5 % v/v y con perxido de hidrgeno al 3% v/v, presentaron un porcentaje de contaminacin del 2.3% y 3.9% respectivamente, permitiendo la desinfeccin de los embriones maduros de Cedrela montana Moritz ex Turcz, sin provocar perdida de material para investigar.

La utilizacin de Brasinolida y cido Giberlico como biorreguladores en la etapa de germinacin, permiti obtener un porcentaje de germinacin del 67 y 77%, lo cual favoreci para la obtencin de plantas completamente desarrolladas, con raz primaria, secundaria, tallo y hojas, permitiendo ser una planta capaz de llevar a cabo su fotosntesis.

La hormona brasinolida en presencia del medio bsico Murashige y Skoog (1962), dio los mejores resultados en la elongacin, formacin de hojas y presencia de races en la etapa de germinacin de Cedrela montana Moritz ex Turcz.

Los tratamientos G3 (3mg.L-1 de cido giberlico) y G5 (2 mg.L-1 de brasinolida) presentaron una energa germinativa del 12 y 14% respectivamente, lo cual permite que esta especie deje su estado de latencia a partir de los seis das de ser expuestos a estos biorreguladores.

En los tratamientos de induccin a callo embriognico las concentraciones de 4 mg.L-1 de 2,4-D conocido como cido 2,4-dichlorofenoxiactico, fueron las que presentaron una mayor induccin y proliferacin de callo, a diferencia de los tratamientos que posean ANA (cido naftalenactico) y la combinacin de las dos auxinas.

El color, el brillo y la uniformidad del callo, permiten distinguir a simple vista si es o no callo embriognico, el color que permite saber que se est formando la embriognesis es cuando presenta un callo de color verde o blanquecino pero siempre con presencia de brillo.CONCLUSIONES

RECOMENDACIONESEn la fase de germinacin se puede recomendar que una vez obtenidas las plantas stas sean micropropagadas para tener plantas libres de patgenos y de pesticidas, y con esto tener un banco de Cedrela montana Moritz ex Turcz el cual va a contribuir a preservar la especie.

Es importante continuar con la investigacin de la embriognesis somtica en forestales como el caso de Cedrela montana Moritz ex Turcz, ya que se podra obtener una gran cantidad de individuos a corto de tiempo, favoreciendo as a la reforestacin de especies vulnerables o en peligro de extincin.

En sta investigacin se obtuvo callos pero no todos fueron embriognicos, por lo que se recomienda analizar las condiciones fsicas y fisiolgicas responsables para la obtencin de callos embriognicos y con qu combinaciones de hormonas vegetales se puede obtener mayor cantidad de callos, para que a futuro se pueda obtener una semilla artificial de Cedrela montana Moritz ex Turcz.

*Estado de vida Latente: es un estado de reposo o de desarrollo suspendido, pero capaz de volverse activo en condiciones favorables (Diccionario Enciclopdico Vol 1. 2009 Larousse Editorial, S.L.).**