Rev Mex Cienc Farm 43 (3) 2012

Trabajo Científico

Actividad antituberculosa del extracto de Carya illinoensis

Antituberculosis activity of a Carya illinoensis extract

Sáenz Esqueda María de los Angeles, i Álvarez Román Rocío,2 Castro Ríos Rocío,2Cómez Flores Ricardo," Nuñez Rodríguez María Adriana, i Calindo Rodríguez Sergio A., i

Chávez Montes Abelardo. i

i Departamento de Química, Cuerpo Académico de Químico-Biológica, Facultad de CiencíasBiológicas, Universidad Autónoma de Nuevo León

2Departamento de Química Analítica, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Nuevo León3Unidad de Inmunobiologia y Acarreadores de Drogas. Facultad de Ciencias Biológicas,

Universidad Autónoma de Nuevo León

ResumenSeevaluó la actividad antituberculosa del extracto hexánico de Carya i/linaensis (CIH) y dos de susfracciones, metanólica (CIFM)y no metanólica (CIFNM), identificando las moléculas responsables de esta actividad. Tanto CIH, como CIFM y CIFNMpresentaron actividad antituberculosa a una concentración de 125 ~g rnl.'. con SO, 50 Y 70 % de inhibición, respectivamente.Se encontró que los principales componentes del extracto y sus fracciones son tres fitoesteroles y un triterpenoidepentacíclico: P-sitosterol, D- amirina, sitostenona y ácido betulínico. La presencia de estos compuestos ofrece un nuevopanorama de las moléculas responsables de la actividad antituberculosa en la corteza de CIHy la posibilidad de explorar otrasaplicaciones farmacéuticas para esta planta.

AbstractAntituberculosis activity was assessed for a hexanic extract of Carya i/linaensis (CIH) and its methanolic (CIFM) andnon-methanolic (CIFNM) fractions. ClH,CIFMand CIFNM presented antimycobacterial activity at a concentration of 125 ~g mL-lwith inhibitions of SO, 50 and 70%, respectively. The main components in the extract and fractions were found to be threephytosterols and a pentacyclic triterpenoid: sitosterol, amyrin, sitostenone and betulinic acid. The presence of thesecompounds oflers a newview on the kind of molecules responsible for the antituberculosis activity in the cortex of C. i/linaensisand the possibility of exploring pharmaceutical applications for this plant.

Palabras clave: Tuberculosis, P-sitosterol, ácidobetulínico Carya i/linaensis.

Correspondencia:M. en C. María de los Angeles Sáenz EsquedaDepartamento de Química, Cuerpo Académico deQuímico-BiológicaFacultad de Ciencias BiológicasUniversidad Autónoma de Nuevo LeónPedro de Alba y M.L. Barragán s/n. Cd. Universitaria, SanNicolás de los Garza, N.L. C.P. 66450.e-mail: saenz_OO@hotmail.com

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Keywords: Tuberculosis, P-sitosterol, betulinic acid,Carya i/linaensis.

Fecha de recepción: 20 de diciembre de 2011Fecha de recepción de modificaciones: 3 de mayo de 2012Fecha de aceptación: 1 de junio de 2012

In troducción

La tuberculosis (TB) es una infección del sistema respiratorioque puede llegar a ser mortal y representa uno de los principalesretos de salud pública debido a su alta incidencia .1Más de 2000mIllones de personas, es decir un tercio de la poblaciónmun dia l, están infectadas con el bacilo de la TB : estaenfe rmedad es una de las principales causas de muerte en laspersonas infectadas con VIHzA pesa r de que el trata miento farmacológico para la TB haestado dispon ible desde hace SO años, esta enfermedad siguesiendo la primera causa de muerte por infecciones preven íbles.éAnualmente aparecen 9 millones de casos nuevos y cerca de 3millones de personas mueren por esta causa.4,5Actua lmente, el tratamiento más efectivo es una combinaciónde cuatro fárma cos ant ituberculosis de primera línea :isoniazida, rífam pícína, etambutol y píraztnam ída.s" Sinembargo, la prolongada farm acoterapia y las altas dosis de éstaafectan la ca lldad de vida del pacienle y dificu ltan elseguimIento estricto del tratamiento, lo cual contrIbuye aldesarrollo de cepas farmacorres istentes (TB-MDR).8Para el tratamiento de las cepas TB -MDR se emplean fármacosde segunda línea como la capreomicina, la kanarnicina, laarn íkac ína y las fluoroquínolonas, que tienen la desventaj a deser poco específicos, provocar severos efectos secundarios,inducir fáclImente resiste ncia y ser de elevado costo. Además,los tratamientos son aun más prolongados que los disponiblespara las cepas no resiste ntes y en consecuenc ia de escasoapego.9·11

Recien temente la Organización Mundial de la Salud (OMS) hareportado la apa rició n de ce pas de resistencia extendida(TB-XDR), para las cuales no ex iste alterna tíva de tratamientoy responden precartamente ante fármacos de primera y segundalínea, por lo cual la necesidad de descubrir nuevos compuestospara la terapia de la TB se ha tomado urgente.1O•12.l 3

Los produ ctos natural es y sus derivad os semisintétlcos, sonimportantes fuentes de nuev os fárma cos ant í- ínfecclosos. quej uegan un papel sign ifica tivo en la químíoterapía contra la TB .Como ejemplo de este tipo de compuestos pued e mencionarse aantibióticos amlnogl1cós ldos como la estreptomicina , aislada deStreptomyces griseus" y sus derivados kanam tctnat t yamtkaclna .P p éptídos cíc lícos como la vtomlctna ' ? y lascapreomlclnas 1A y 1B, aisladas de Stteptomyces capreolusNRRL 2773,18-19 la rlfami cina , rifabutlna y rlfapentlna,aná logos de la rtfampt ctna-" aislada de Streptomycesmeditarranei.21

Estos prod uctos naturales exhiben un amplio rango de actividadin vitro contra M tuberculosis con concentracion es mínimasinhibitori as (CM !) que va n desde 0.2 flg mL-I para la

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rifampi cina, 0.5 ug mL-I para estreptomicina, l pg mL-I para laamikacina, 4 pg mL-1 para la viomicina, 5 ¡.tg mL-1 para lascapreomicinas hasta 6 flg mL-! para la kanamicina.V

Los produ ctos naturales representan una ruta alterna en labúsqueda de nuevos agentes antituberculosos , la caracterizaciónde los compuestos presentes en los extractos naturales es elprimer paso para encontrar nuevos fitoq uímicos .23-27 Laactividad farma cológica de las plant as reside principalmente enlos metab olitos secundarios, que han llegado a un primer planode interés debido a su variada actividad biológica. Estassustancias comprenden más de 30 ,000 compuestos dife rentestdentiflcados hasta ahora , que se han clastficado como:triterpenos , saponinas , fitoestero les y/o sus precursores.28-30

Investigaciones previas han repor tado que las especies debacter ias pertenecientes al género Mycobacteriwn son sensiblesa algunos triterpenos, como el ácido betuímrco." La principalfuente del ácido betulínico son las plantas pertenecientes a lasfamilias BetuJaceae, Ebenceee y Ponisceee. El interés en estecompuesto ha crecido en los últi mos diez años , debido a suspropiedad es farm acológicas, como la actividad anticance rígena,anti-VIHy antttuberculosa.32-31Otras sus tancias perten ecientes al grupo de los triterpenos sonlos fitoe steroles, los cual es se encuentran en aceites ese nciales,frutas y verduras. Los fitoesteroles se sintetizan por la vía delácido mev alónico y están presentes en casi todas las partes delas plantas, pero sobre todo en las semlIIas y retoños . Debido alas propiedades benéficas que presentan sobre la salud suest udio se ha incrementado en los últimos años. 35-37

El f3-sitosterol es uno de los fitoesteroles más abundantes en lasplantas y su efectividad biológica ha sido demostrada enestudios prec1ínicos para tra tamientos de enfermedades como elcáncer de est ómago .P' colon,39 pr óstata'? y mama.' ! así comoen úlceras42 y en estudios clínicos para VIH43-45 ytuberculosis." Además, se han encontrado evidencias del efectoinmunomodulador de los esteroles, usando una mezcla debeta-sítostero'/s ítoster ína. En dicho estudio se plantea que elmecanismo de acción posiblemente está relacion ado con unefecto sobre el control de las cítoc ínas Inflamatorias. Estamcx::lulación en la produ cción y actividad de cítoc ínas, ejerceefectos beneficiosos en pacientes con enfermedadesinfecciosas.47-48

En el nogal se encuentran sustan cias fitoquímicas , como losfitoesteroles, a los cuales se les han atribuido diversasprop iedades biológicas como son protección frente a estrésoxida tívo, disminución en el riesgo de padecer enfermedadescoronarias, disminución del colesterol LDL, efectosant linflamatorios y protección frente a algunos tipos decáncer4 9-51 Además algunos estudios han demostrado laactividad anti microbiana de las hoj as y frutos de l nogal ,

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atribuyendo esta actividad hasta ahora a la juglona. 52-54 Sinembargo, existen pocos estudios acerca de la actividadbiológica de la corteza. 55-58

En ei estudio reaiizado por Cruz-Vega y coi. en ei 2008 59 sereportó la actividad antituberculosa de extractos hexánicos deJuglans mollis y C. illtnoensts. Ei presente trabajo presenta iaevaluación de la actividad contra M tuberculosis del extractohexánico de corteza C. tllmoensis y de dos fracciones.Adicionalmente, las muestras fueron caracterizadas porcromatografía iíquida de aita resoiución (HPLC) ycromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas(GC-MS), identificando ios componentes principaies.

Materiales y métodos

ReactivosEi ácido ursóiico (UA), ia ciofazimina (CLF), ei ácidobetulínico (AB) y ei [3-sitosteroi fueron adquiridos enSigma-Aidrich (EUA).

Recolección y preparación del extractoLa corteza de Carya tlltnoensts fue recolectada en el mes deseptiembre dei 2009 en ei municipio de Generai Terán, NuevoLeón, México. El material vegetal fue depositado en el herbariode ia Facuitad de Ciencias Bioiógicas de ia UANL para suidentificación (Voucher No. 025528). La corteza se iimpió y sesecó a temperatura ambiente por espacio de cinco días, paradespués ser molida en un molino manual. De éste material sepesaron 60 g Y se adicionaron 500 mL de hexano (JT Baker,México). La mezcla se colocó en reflujo continuo en un sistemasoxhlet por 20 h. Una vez obtenido el extracto, se eliminó elsoivente a presión reducida (Rotavapor Laborata 4003,Heidoiph Instruments, Aiemania). Los extractos sealmacenaron en frascos de vidrio protegidos de la luz y lahumedad hasta su uso.

Partición del extractoA partir dei extracto hexánico de C. tlltnoensts (CIH) se extrajola parte soluble en metanol, para lo cual se pesaron 500 mg deextracto y se adicionaron 25 mL de metanoi (CTR Scientific,México). Una vez realizada la partición, la fracción recuperadase llevó a sequedad y se guardó en frascos ámbar cerradosherméticamente en refrigeración hasta su uso. La fraccióninsoluble también fue pesada y almacenada en las condicionesmencionadas anteriormente.

Análisis cromatográfico por HPLCLa caracterización del extracto y sus fracciones se realizóutiiizando un cromatógrafo de iíquidos (Varian, E.U.A)equipado con un sistema de bombeo ternario 9012,automuestreador 9100, detector de arregio de diodos Poiychrom

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9065 Y una coiumna Microsorb C18 (150 x 4.6 mm, 5 ¡.un;Varian, E.U.A.). La fase móvil consistió en una mezcla demetanoi (grado HPLC; J.T. Baker, México) y una soiuciónacuosa de ácido fórmico (100 mM, pH 3.0) 55;45 v/v; con unflujo de 0.8 mL mín'. Ei voiumen de inyección fue de 20 ul. Yia iongitud de onda utiiizada fue de 254 nm. Ei extractohexánico de C. tllmoensis (CIH) y ias dos fracciones obtenidasde éste, fracción metanóiica (CIFM) y fracción no metanóiica(CIFNM) fueron disueitas en cioroformo (CTR Scientific,México) y filtradas usando membranas de filtración Durapore®de 0;45 ¡.un (Miiiipore, E.U.A). Para ei análisis de AU y CiFM,la fase móvil consistió en una mezcla metanol- ácido fórmico(100 mM, pH 3.0) 6535 v/v; con un fiujo de 1.0 ml, min'. Lasvariables modificadas para optimizar la separación fueron el pHy la proporción de buffer en la fase móvil.

Caracterización del extracto por GC-MSSe iievó a cabo empieando un cromatógrafo de gases 6890Ncon inyector spii/spiitiess y detector seiectivo de masas 5973(Agitent Technoiogies, Aiemania) con fuente de ionización deimpacto electrónico y analizador cuadrupolar. La separación serealizó con una coiumna HP 5MS (30 m x 0.25 mm x 0.25 ¡.un;Agitent Technoiogies, Aiemania). Ei gas acarreador fue heiiocon un flujo de 0.9 mL mín'. Ei programa de temperatura deihorno consitió en una etapa inicial a 70 "C por 2 min, subiendo15 "C mín! hasta 200 "C manteniendo 5 min a esta temperatura,finalmente la temperatura se incrementó a una velocidad de 10"C min-1 hasta iiegar a 320 "C y se mantuvo por 10 mino Latemperatura dei inyector fue de 270 "C y ia de ia iínea detransferencia de 270 "C.

La adquisición de los datos se realizó en modo de barridocompieto en un rango de 30-550 miz. La identificación de ioscompuestos se realizó por comparación de los espectros demasas obtenidos con los de la biblioteca de espectros de masasdei equipo (Witey Registry ofMass Spectrai Data, 7a Ed.). Parasu análisis, las muestras se disolvieron en cloruro de metileno yla derivatización se realizó con trimetilsilano.

Activación de la cepa Mycobacterlum tuberculosls H37RvLa cepa de M tuberculosis H37Rv fue proporcionada por eiInstituto de Investigaciones Biomédicas del Noroeste, enMonterrey, N.L. y se mantuvieron en tubos con medioLowenstein-]ensen (Remei, Lenexa, Kansas Cíty, MO). Lassuspensiones bacterianas se prepararon cultivando un inóculoiniciai en agar Middlebrook 7HIO (BBL, Becton-Dickinson;E.U.A.) y subcuitivando en caido Middiebrook 7H9 (DifcoLaboratories, E.U.A.) conteniendo 0.5 % de giiceroi(Boehringer Mannheim Biochemicais, E.U.A), 10 % deenriquecimiento OADC (ácido oleico, albúmina, dextrosa ycataiasa; Becton Dickinson and Company, E.U.A) y 0.05% deTween 80 (Poiisorbato 80, Sorbitan-Oieato y Poii-Oxietiieno;

Materiales y Abastos Especializados, México) por 72 h a 37 "C.Las suspensiones celulares se agitaron y sonlcaron por 10 mlnen baño de ultrasonidos (Laboratory Supplies Co., E.U.A.)hasta que los agregados visibles se disgregaron. La solución debacterias se centrifugó a 500 rpm por 10 mln y se recuperó elsobrenadante. Posteriormente, el cultivo se diluyó en el mismocaldo a la concentración de lx106bacterias mL-1utilizando unacámara de Neubauer (100X).60Esta suspensión se congeló a -80 "C hasta su uso.

Evaluación de la actividad antituberculosaLa evaluación de la actividad antituberculosa se realizó enplacas de 96 pozos estériles de fondo plano con tapa. Lasconcentraciones ensayadas del extracto y sus fraccionesestuvieron en un rango de 62 a 500 llg mL-1, mientras que laCLF, utilizada como control positivo se trabajó a unaconcentración de 0.5 llg mL-1. Para cada concentración de lasnuestras y del control se asignaron tres pozos por fila. A cadapozo, conteniendo la muestra o el control, se agregaron 50 ul,de medio Míddlebrook 7H9 suplementado con OADC.Fbsteriormente se añadieron 50 ul, de la suspensión de Mtuberculosis (lx105 bacterias mL-1). Se dejaron 2 pozos comocontrol de crecimiento de la bacteria. Los pozos del perímetrofueron llenados con agua estéril para minimizar la evaporaciónen la placa. Las placas fueron selladas con cinta adhesiva eIncubadas a 37 "C por 10 días en una atmósfera húmeda. Aldécimo día se añadieron 15 ul, de una mezcla de Azul deAlamar61-62 (Trek Sistemas Diagnóstico Ud, Reino Unido) 1:1con Tween 80 al 10 % a cada uno de los pozos. El Ingredienteactivo del Azul de Alamar es la resarzurlna, la cual es uncompuesto no tóxico, permeable a las células que es de colorazul y no fluorescente; la resarzurlna se convierte en resofurlnade color rojo brl1lante a través de las reacciones de reducción delas células metab6licamente activas. Las placas se incubaronpor 16 h Y después se leyeron a una longitud de onda deexcitación de 535 nm y a 595 nm de emisión.

Resultados y discusión

El método seleccionado para la obtención del CIH fue laextracción con soxhlet, debido a que en general este métodotiene una eficiencia de extracción alta.63 Con la utilización deeste método, la eficiencia de la extracción fue de 1.32 %,coincidiendo con lo reportado por Salinas Oonzález (2004)64para esta especie. En general los componentes químicos de lacorteza se dividen en lipofíllcos e htdroñltcos, la fracciónlipofílica está constituida por sustancias solubles en solventespoco polares (hexano, éter etílico, dtclorometano) comoterpenos, terpenoides, ceras, grasas y alcoholes altfáttcossuperiores. La fracción hidrofílica está constituida porsustancias extraíbles en agua o por solventes de alta polaridad

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(acetona, alcohol etílico) y contiene gran cantidad decompuestos fenólicos. La acurrulacton de compuestos pocopolares en la corteza es menor en comparación con loscompuestos encontrados en la fracción htdroñltca." Debido alo descrito anteriormente se explica el bajo rendimiento delextracto Cll-l, en comparación con una extracción realizada apartir de un solvente de alta polaridad, como lo reportaOrea-Igarza y col., en el 2006.66

Para su caracterización, el extracto y sus fracciones seanalizaron por HPLC utilizando una columna de de fase InversaC18 y un detector de arreglo de diodos. Las condiciones deseparación fueron optimizadas con el fin de obtener el mayornumero de señales posibles para el extracto hexántco. Seevaluaron distintas fases móviles, desde acetonitrilo puro hastamezclas de metanol o acetonltrilo con soluciones acuosas deacetato de amonio y ácido fórmico a diferentes concentracionesy valores de pH. Los mejores resultados se obtuvieron con eluso de una mezcla de metanol-áctdo fórmico (100 mM) 50:50(Fig. 1). Con estas condiciones, fue posible Identificar al AU,compuesto que ha sido encontrado en la corteza de otrasespecies de corteza como es el caso de Physocarpusintermedius.65

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"Figura 1. Cromatogramas obtenido por HPLC para el extractohexaníco de C. illinoensis (a), para la fracción metanólica (b) y lafracción no metanólica del extracto (c).

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Las fracciones CIFM y CIFNM fueron analizadas bajo lasmismas condiciones que el extracto completo. Como puedeobservarse en la figura 1, el numero las señales observadas paralas fracciones fue menor que las obtenidas para el extractocompleto y es reflejo de la partición realizada. En primerainstancia, se pensó que la fracción CIFM contenía AU, ya que elcromatograma mostró un pico con tiempo de retención yespectro de absorción similar. Su presencia en CIFM podríaexplicarse por la naturaleza polar de éste fitoquímico, la malpermite que sea afin por el solvente utilizado en la particiónBankeu y co1.69 reportaron la presencia de AU en extractosmetanólicos de la corteza de árboles de la familia Moraceae.Para confirmar la presencia de AU en CIFM, realizó un análisispor GC-MS. Para ello, todas las nuestras fueron derivatizadascon trimeltilsilano debido a la baja volatilidad esperada de loscompuestos en el extracto." El análisis del extracto hexántco yde CIFM mostró un pico con tiempo de retención similar al AUpero con espectro de masas muy diferente, por lo que sedescartó la presencia de este compuesto.

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Tanto el AB como el f3-sitosterol fueron encontrados tambiénen la fracción CIFM. Ambos compuestos han sido reportados eninvestigaciones previas por sus propiedades contra M.tuberculosisJI,72 Por otro lado, el análisis por GC-MS de lafracción CIFNM permitió identificar al y-sitosterol, c-amirina ysitostenona, de los cuales solamente la c-amirina cuenta conreportes sobre su acción biológica frente a M tuberculosis.

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Al cotejar los espectros de masas de todos los picos obtenidosen el cromatograma de CIH con los de la biblioteca de espectrosdel equipo, fue posible identificar al ácido betulínico (AB) y alf3-sitosterol.La presencia de estos dos compuestos en CIH fue confirmadamediante el análisis de estándares puros, los cromatogramasobtenidos se rmestran en la figura 2 mientras que los espectrosde masas se muestran en las figuras 3 y 4.

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Figura 3. Comparación de espectros de masas obtenidos para elestándar de ácido betulinico (a) y el extracto hexaníco de C.illinoensis (b).

.~-. " ,~ _ __-..~I._Figura 2. Cromatogramas obtenidos por GC-MS para el extractohexánico de C. illinoensis (a), para el estándar de ácido betulinico(b) y para el estándar de b-sitosterol (c).

La actividad antituberculosa de las fracciones se evaluó con elmétodo calorimétrico de azul de alamar a partir de dilucionesseriadas. Se empleó CLF como control positivo y laconcentración de trabajo se determinó evaluando un rango deconcentraciones de entre 0.312 a 5 f-Lg mLI. Se encontró unainhibición superior al 80 % en todos los niveles deconcentración y la concentración utilizada para los ensayos deactividad antituberculosa fue de 0.5 flg mL I. El uso de la CLFen todas las pruebas permitió controlar la variación intra einterensayo, con coeficientes de variación menores al 0.28 % entodos los casos.

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Figum 4. Comparación de espectros de masas obtenidos para elestándar de b-sitosterol (a) y el extracto hexaníco de C. illinoensis (b).

El objetivo de haber realizado el fraccionamiento eraincrementar la actividad, al concentrar la sustancias activas. Sinembargo, en este caso este proceso afectó la actividadantttuberculosa de cada una de las muestras, provocando undecremento de la misma.

A pesar de la alta inhibición conseguida a una bajaconcentración por parte de CIFNM, se aprecia que el porcentajede inhibición no guarda proporción con las diferentesconcentraciones ensayadas ya que la inhibición alcanzada notuvo variación; sugiriendo que los componentes activos sehayan presentes en una cantidad suficiente como paramanifestar una inhibición parcial en el intervalo deconcentraciones ensayado y que el mismo no estan amplio paraconseguir un efecto cuantal en una curva dosis respuesta.Asimismo, se observa que la actividad mostrada por CIFNMtiende a ser superada por la inhibición obtenida con CIH, razónpor la mal se plantea que existe una sinergia entre loscomponentes del CIH 10 que permite que esta muestra supere ala CIFNM. El análisis químico permitió determinar que enCIRvi se observó la presencia de estigmasterol, [3-sitosterol ysitostenona; y en la CIFN1v1 [3- sitosterol, a-amirina, sitostenonay a-amirenona. Si bien hay estudios que respaldan la actividadantituberculosa del ácido betulínico y [3-sitosterol por separado,también encontramos literatura donde se corrobora la actividadcon la sinergia de estos compuestos encontrados en los extractosde plantas. Un ejemplo de esta sinergismo es el trabajodesarrollado por Chen et al., en el 2005,73 donde se evaluó laactividad antituberculosa de varios compuestos aislados deCinnamomun kotoense, así como de mezclas de los mismos, losresultados mostraron que existe una mayor actividad mando loscomponentes se presentaban en mezcla.

Conclusiones

Finalmente, cabe resaltar que no existen reportes de la presenciade ácido betulínico en la especie C. illinoensis, como se habíamencionado anteriormente la actividad farmacológica de estaespecie se le atribuye ajuglonaJ4-75

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En la tabla 1 se muestran los resultados obtenidos para elextracto CIH y sus dos fracciones. Como puede observarse Cll-ly sus dos fracciones resultaron activas de acuerdo a laevaluación microbiológica que se realizó. El Cll-l mostró unrango de Inhibición entre 80 y 95 % en las tres concentracionesmás altas ensayadas 125, 250 Y 500 us rnL l; mientras queninguna de las concentraciones evaluadas para la fracciónCIFM mostró una Inhibición superior del 50 %.Por su parte la fracción CIFNM, exhibió un 70 % de Inhibicióna partir de 62 f-Lg rnLI. Sin embargo, las inhibiciones mostradaspor CIH y CIFNM no presentaron una diferencia significativa(p < 0.05). Al analizar los cromatogramas obtenidos por HPLCse observó que la información proporcionada por los mismos noes suficiente para relacionar el perfil cromatográñco con laactividad antituberculosa exhibida por las fracciones; por estarazón se procedió a analizar las maestras por GC-MS.

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Tabla 1: Evaluación de la actividad antítuberculosa."

Concentraci6n CIH I CIFM I CIFNM("g mL,I)

Porcentaje de Inhibicidn (%)

31 401 7+ 65 39.00 + 30.0 41.07 + 16.062 48 .35 + 9 9 47 .32 + 29 .0 72.26 + 14 .0

125 81.53+07 49.59 + 26.0 7117 + 18.8250 95.33+12 50.24 + 17.0 68 .45 + 17.9500 90.75 + 1 5 50 .85 + 35.8 70.5 1 + 18.3

"Inhibición del crecimiento de M tabercalosis H37Rv frente al extractohexánico (CIH), fracción metanólica del extracto (CIFM) y fracción no

metanólica de (CIFNM) C. illtncensis.

El extracto hexántco de corteza de C. illinoensis representa unapotencial alternativa para el tratamiento quimlterapeutlco de latuberculosts debido a la actividad antituberculosa que posee. Sesugiere que la acción contra M Tuberculosis se presenta con lasinergia de sus componentes ya que el fraccionamientodisminuye su actividad. Finalmente una vez evaluada suactividad antituberculosa, éste se analizó por GC-MS y seidentificó la presencia de ácido betulínico, no reportado en estaespecie, y [3-sitosterol, moléculas a las cuales se les atribuye laactvidad biológica que presenta el extracto.

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Referencias1. Kaufmann SH. MeMlehael A ] , Annulling a dangerous

liaison : vaeelnatlon strategies agalnst AIDS andtuberculosis. Nat Med. 2005: 11: S33-S44.

2. Hampton G. 10 datos sobre la tuberculosis. Temas de Salud.Tuberculosis . 2010 .http ://w\\w.who .int/topies/tuberculosis/es/.

3. Warld Health Organization. Treatment al. tuberculosis :guideltnes far national programmes. 3rd. Geneva WarldHealth Organtzatton, 2003.

4. Rtvers EC. Mancera RI. New antitubereulosis drugs Ineltnleal trlals w íth novel meeha nism a l.ae tion. Drug DtscovToday. 2008; 13: 1090-1098 .

5. Tomloka H. Namba K. Development a l. anlttubereu loslsdrugs: eurrent sta tus and future prospeets. Kekk aku. 2006;8 1:753-754.

6. Onyebujoh P, Zumla A, Ribeiro 1, Rustornjee R, Mwaba P,Gomes M, Grange JM. Treatment a l. tuberculosis : presentstatus and future prospects. Bull W HO. 2005; 83 : 857-865 .

7. Oye C. Global epldemlology al. tuberculosis. Laneet. 2006 ;367: 938-940.

8. Zager EM, MeNerney R. Multidrug-resistant tubercu losis.BMC Infectíous Díseases, 2008; 8: lO.

9. Su Wj. Extenslvely drug- resistant tuberculosis (XDR-TB)ralses ehallenges In TB control in Taiwan. J Formas MedAssoe. 2008; 107: 827:829.

lO.Yew WW, Leung CC. Update in tuberculosis 2007. Am JRespir Crlt Care Med. 2008; 177: 479-485.

11. O 'B r íen RJ, Sptgelman M. New drugs far tuberculosis:eurrent status and future prospeets. Clinles In ChestMedicine 2005; 26: 327-340.

12. Lenaerts AJ. Bltting C, Woolhlser L, Gruppo V, Marletta KS,Johnson CM, Orme 1M. Evaluation al. a 2-pyrldone,KRQ-100 18, agalnst Mycobaeterium tuberculosis In vltroand In vivo . Anti mlcrob Agents Chemother. 2008 ; 52:1513-1515.

13. Shu YZ. Reeent Natural Products Based Drug Developm ent :A Pharm aeeutieal lndustry Perspeetive. J Nat Prad o 1998;61: 1053.

14. Kuehl FA, Peek RL, Hoffh ine CE, Peel EW, Folkers K.Streptomyees antibloties. XIV The posillon al. the Itnkage al.streptoblosamlne to streptidlne In streptomyeln. J Am ChemSoe. 1947; 69: 1234.

15. Cron MJ. Fardlg OB , Johnson DL, Schmítz H. WhtieheadDF, Hooper IR, Lemleux RU. The ehemlstry al. Kanamyeln.J Am Chem Soe. 1958; 80: 2342.

16. Kawaguehl H, Nalto T, Nakagawa S, Fuíísawa K. BB-K 8, anew semlsynthetie amlnoglycoside antiblotie. J Antiblot.1972; 25: 695.

17. Hasketi TH, Fusari SA, Froh ardt RP, Bartz QR. Theehemlstry of vlo mycin. J Am Chem Soe. 1952; 74: 599-602.

42

18.Nomoto S, Teshlm a T, Wakamlya T. ShíbaT. Tota l syniheslsof eapreomyeln. Tetrahedron. 1978; 34: 92 1-92 7.

19. Herr EB, Redstone MO. Chemleal and physlealeharaeterization a l. eapreomyeln. Ann NY Aead Scí, 1966;135:940.

20. Burman WJ, Gallieano K, Peloquln C. Compara tivepharmacokineties and pharmacodynamles al. the rifamycinantibacterials. Clin Pharm acoklnet. 2001; 40: 327-341.

21. Pape H, Rehm H] . Mícrob íal Pradu eis . In : Rehm HJ, ReedG. (eds.) Biotechnology, VCH. 1985 ; 436-457

22. Barry III CE, SIayden RA, Sampson AE, Lee RE. Use al.genomles and comblnatorla l ehemlstry In the developmenta l.new antimycobaeterlal drugs. Bloehem Pharmacol. 2000;59:221-231.

23. Frame AD, Rios-Olivares E. De Iesus L, Ortíz O, Pagan J,Mendez S. Plan ts from Puerto Rico withant í-Mycobactenum tuberculosis properties. Puerto RicoHealth Sei j. 1998; 17: 243-252.

24. Slndambiwe JB, Calomme M, Cos P, Totté J , Pieters L,Vlietinck A, Vanden Berghe D. Sereenlng al. seve n selectedRwandan medicinal plants far antimleroblal and antiviralactivilies. J Ethnopharrn. 1999; 65: 71-77.

25.Lall N, Meyer JJM. In v ítro ínhíbítlon al.drug-resístant anddrug-sensitive strains of Mycobacterium tuberculosis byethnobotanlcally selected South Afrlean plants. JEthnopharrn. 1999; 66: 347-354.

26.Newton SM , Lau C, Wrlght Cw. A review al.antimycobacterial natural pradueis. Phytother Res. 2000;14: 303-322.

27. Usha K, Saroja S. Antitubereular potential a l. seleeted plantmaterlals. J Med Aromat Plant Sel. 200 1; 22: 182-184.

28. Krlsto TS, Terdy PP, Símandí B, Szoke E, Lem berkovles E,Kery A. Effleieney al. supererltiea l fluid extraetion for theproduetion al. non- volatí le terpenolds from Taraxaei radix .AetaPharm Hung. 2001; 71: 318-324 .

29.Urech K, Seher JM, Hostanska K, Beeker H. Apoptosisinduclng actív íty al. v ísc ín, a lipophllie extraet from Viseumalbum L J Pharm Pharmacol. 2005; 57: 101-109 .

30. Brieskorn CH, Suss HP. Trlterpenolds from ihe peels al. pearand apple. Arch Pharm (Welnhelm Ger.). 1974; 307;949-960.

31. Daffe M, Draper P. Th e enve lope layers al. mycobacteriawlt h referenee to thelr pathogenlelty. Adv MícrobíolPhyslol. 1988; 39: 131-203.

32. Elnznhamer DA, Xu ZQ. Drugs. 2004; 7: 359-373 .33.Tolstikova TG , Sorok ína IV, Tolsti kov GA, Flekhter OB.

Bíolog tcal aetiv lty and pharmacologleal prospeeis a l.lupaneterpenolds: I Natural lupane derlvatives. Russlan J BloargChem. 2006; 32: 37-49.

34. Gu JQ , Wang Y, Franzblau SG, Montenegro G, Yang O,Timmerman BN, Antltubereular constituents al. Valerianalaxiflara. Planta Med. 2004; 70: 509-514.

35. Pegel KH. The lmportance of sltosterol and sltosterolln Inhuman and anImal nutrltlon. South Afrlcan J Se. 1997; 93:263-267.

36. Adlercreutz H, Mazur W. Phytoestrogens and westerndlseases. The Fínísh Medlcal Soclety, DUODECIM. AnnMed. 1997; 29: 95-120.

37. Adlercreutz H. Epldemlology of phytoestrogens. Ba11l1ére 'sCllnlcal Endocrln Metab. 1998; 12: 605-623.

38. De Stefanl E, Boffeta P, Ronco AL, Brennan P,Deneo-Pellegrlnl H, Carzogllo JC, Mendllaharsu M. Plantsterols and risk of stomach cancer: a case-control study inUruguay. Nutr Cancer 2000; 37: 140-144.

39. Ralcht RF, Cohen El, Fazzlnl EP, Sarwal AN, Takahashl M.Protectlve Effect of Plant Sterols agalnst Chemlcallylnduced Colon Tumors In Rats. Cancer Res. 1980; 40:403-405.

40. Awad AB, Fínks CS, W11l1ams H, Kím U. In vltro and InvIvo (SCID mlce) effects of phytosterols on the growth anddissemination of human prostate cancer PC-3 cells. Eur JCancer Prev. 2001; 10: 507-513.

41. Awad AB, Downle A. Fínks CS, Kím U. Dletary phytosterolínhíbíts the growth and metastasls of MDA-MB-231 humanbreast cancer cell grown in SCID mice. Anticancer Res.2000; 20: 821-824.

42. Hanlfa Moursl SA, AI-Khatlb 1M. Effect of Mella azedarachfruíts on gipsing-restraint stress-induced ulcers in rats. ]pn JPharmacol. 1984; 36: 527-533.

43. Breytenbach U, Clark A, Lamprecht J. Boulc P. Flowcytometrlc analysls of the Thl1-Th2 balance In healthyindividuals and patients infected with the humanlmmunodeflclency vIrus (HIV) recelvlng a plantsterol!sterolln mIxture. Cell Blol Int. 2001; 25: 43-49.

44. Boulc PJd. Immunomodulatlon of HIVlAIDS: TheTygerberg/Stellenbosch Universlty experience. AIDS Bull.1997; 6: 18-20.

45. Hung-Llamos HR, Falero-Morejon A, Perez-Bolaños C,Tirado-Morales S, Balcinde-Quiñones Y, Pineda-RodriguezM. Fitoesteroles Parte 1 Tendencias actuales y aplicacionesbiomédicas. Revista CENIC Ciencias Biologicas. 2005; Vol.36 (1): 23-30.

46. Donald PR, Lamprecht JH, Freestone M, Albrecht CF, BouicPJD, Kotze D, Van Jaarsveld PP. A randomizedplacebo-controlled trial of the efficacy or beta-sltosterol andits glucoside as adjuvants in the treatment of pulmonarytuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis. 1997; 6: 518-522.

47. Bouic PJD. 2001. The role of phytosterols andphytosterolins in irnmunomodulation: a review of the past10 years. Curr Opin Clln Nutr Metab Care. 4: 471-475.

48. Bouic PJD, Lamprecht JH. 1999. Plant sterols and sterollns:a review of their irnmunomodulating properties. Altern MedRev. 4: 170-177.

DEMl¡~i¡ FARMACÉUTICAS

49. Secretaría de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural,Pesca y Alimentación. La nuez pecanera Mexicana "La reinade las frutas secas" Fruta de temporada. 2010.http://www.sagarpa.gob.mx/agricultura/productodetemporada/Paginas/Nuez.aspx. Acceso 20 Jul 2011.

50. Comité Mexicano del Sistema Producto Nuez A.C. La nuezy el Nogal. Beneficios para la salud. 2010.http://www.comenuez.org/ Acceso 20 Ju12011.

51 Middleton E Ir, Effect of plant flavonoids on immune andinflamatory cell function. Adv Exp Med Biol. 1998; 439:175-182.

52. Clark AM, Jurgens TM, Hufford CD. Antimicrobial activityofjuglone. Phytother Res. 1990; 4: 11-14.

53. Pereira JA, Oliveira 1, Sousa A, Valentáo P, Andrade PB,Ferreira ICFR, Ferreres F, Bento A, Seabra R, Estevinho L.Walnut (Juglans regia L) leaves: phenolic compounds,antimicrobial activity and antioxidant potential of differentcultivars. Food Chem. Toxicol. 2007; 45: 2287-2295.

54. Pereira JA, Oliveira 1, Sousa A, Ferreira ICFR, Bento A,Estevinho L. Bioactive properties and chemical compositionof six walnut (Juglans regia L.) cultivars. Food ChemToxicol. 2008; 46: 2103-2111.

55.Van Hellemont J. Compendium de phytotherapie.Association Pharmaceutique BeIge, Bruxelles 1986;214-216.

56. Bruneton ]. Pharmacogosie, phytochimie, plantesmédicinales. Tec. & Doc. 1993; 348.

57.Wichil M, Anton R. Plantes thérapeutiques. Tec. & Doc.1999; 291-293.

58. Dzubak P, Hajduch M, Vydra D, Hustova A, Kvasnica M,Biedermann D, Markova L, Urban M, Sarek J.Pharmacological activities of natural triterpenoids and theirtherapeutic implications. Nat Prod Rep. 2006; 23: 394-411.

59. Cruz-Vega DE, Verde-Star M], Salinas-González N,Rosales-Hernández B, Estrada-García 1, Mendez-Aragón P,Carranza-Rosales P, González-Garza MT, Castro-Garza J.Antimycobacterial activity of Juglans regia, Juglans mollis,Carya illinoensis and Bocconia frutescens. Phytother Res.2008; 4:557-559.

60. Collins L, Franzblau SG. Microplate alamar blue assayversus BACTEC-460 system for high-troughput screeningof compounds against Mycobacetrium tuberculosis and M.avium. Antimicrob Chemother. 1997; 41: 1004-1009.

61.Yajko DM, Madje J], Lancaster MV, Sanders CA, CawthonVL, Babst A, et al. Colorimetric method for determiningMICs of antimicrobial agents for Mycobacteriumtuberculosis. J Clin Microbiol. 1995; 33 (9): 2324-2327.

62. Franzblau SG, Witzig RS, McLaughlin JC, Torres P, MadicoG, Hernandez A, Degnan MT, Cook MB, Quenzer VK,Ferguson RM, Gilman RH. J Clin Microbiol. 1998; 36 (2):262-366.

43

Rev Mex Cienc Farm 43 (3) 2012

63. Furton KG, Perez MI. A sensual separation scienceexperiment: Solvent extraction and chromatographicseparation of menthol utilizing various consumer products. JChem Ed. 1991; 68: 946-947.

64. Saiinas G.N. Anáiisis de ia actividad de extractos crudos deJugians regia L, Jugians moiiis y Carya iiiinoensis contraMycobacterium tubercuiosis. 2004. FCB. DANL.

65. Álvarez-Codoy E. Los extractivos dei árbol Ecoiogíasocial Rebeiión, 2005.http://www. rebeiion. org/noticias/20051111 0669.pdf.

66.0rea-lgarza D, Cordero-Machado E, PerezDíaz N,Gomez-Marín R. Composición química de la corteza de tresespecies de Eucaliptos, a tres alturas del fuste comercial.Parte 1: Eucalyptus citriodora varo Citriodora. Rev FmestalVenezolana. 2006; 50 (1): 45-52.

67.Weber HA, Zart MK, HodgesAE, Moiioy HM, O''bríen BM,Moody LA, Clark AP, Roger KH, Overstreet JD, Smith CS.Chemical comparison of goldenseal (Hydrastis canadensisL.) root powder from three commercial suppiiers. J AgricFood Chem. 2003, 51: 7352-7358.

68. Kím JK, Yoon SK, Ryu SY. Cytotoxic triterpenes from stembark of Physocarpus intermedius. Planta Med. 2000, 66(5):485-486.

44

69. Bankeu JJK, Mustafa SAA, Gojayev AS, Lenta BD,Noungoué DT, Ngouela SA, Asaad K, Choudhary MI,Prigge S, Guiiyev AA, Nkengfack AE, Tsamo E, Shaiq AiiM. Ceramide and cerebroside from the steam bark of Ficuosmucuso (Moraceae). Chem Pharm Buii. 2010; 58:1661-1665.

70. Gutiérrez MC, Droguet M. La cromatografía de gases y laespectrometría de masas: Identificación de compuestoscausantes de mal olor. Boletín intexter. 2002, 122: 35-41

71.Tanachatchairatana T, Bremner JB, Ratchanaporn C,Suksarnrarn A. Antirnycobacterial activity ofcinnamate-based esters of the triterpenes betulinic, aleanalicand ursolic Acids. Chem Pharm Bull. 2008; 56: 194-198.

72. Saludes J. Garson M], Franzblau SG, Aguinaldo AM.Antitubercular canstituents fram the hexane fractian afMorinda citrifolia Linn. (Rubiacea). Phytother Res. 2002;16: 683-685.

73. Chen FC, Peng CF, Tsai IL, Chen IS. Antitubercularcanstituents fram the stem waad af Cinnamamum kataense.J Nat Prod. 2005; 68: 1318-1323.

74. Alkhawajah AM. Studies on the antimicrobial activity ofJuglans regia. Amer J Chin Med. 1997,25: 175-180.

75. Clark A. M., Jurgens T. M., Hufford C. D. Antimicrobialactivity ofjuglone. Phytother Res. 1990,4,11 -14.